Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

Published: April 5, 2021 doi: 10.3791/62296
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Kentucky

Summary

כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

Abstract

התפתחות עיניים של בעלי חוליות היא תהליך מורכב שמתחיל לקראת סוף התפשטות העובר ודורש תיאום מדויק של נדידת תאים, התפשטות והתמיינות. דמיון בהילוך מהיר מציע תובנה ייחודית להתנהגות התאים במהלך התפתחות העין מכיוון שהוא מאפשר לנו לדמיין אוקולוגנזה in vivo. דגי זברה הם מודל מצוין להמחשת תהליך זה בשל עינו של בעלי החוליות השמורים ביותר שלהם ויכולתם להתפתח במהירות ובאופן חיצוני תוך שמירה על שקוף אופטי. מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות העין של דגי זברה מתאפשרים מאוד על ידי שימוש בקו דגי הזברה המהונדסים Tg(rx3:GFP). במוח הקדמי המתפתח, ביטוי rx3:GFP מסמן את התאים של שדה העין הבודדת, ו- GFP ממשיך לבוא לידי ביטוי כאשר שדה העין מתרבה ויוצר שלפוחית אופטית, אשר לאחר מכן משתנה ליצירת אופטית. הדמיית קיטועי זמן ברזולוציה גבוהה של ביטוי rx3:GFP, אם כן, מאפשרת לנו לעקוב אחר פרימורדיום העין לאורך זמן כשהוא מתפתח לרשתית. מיקרוסקופיית יריעות אור היא שיטה אידיאלית לצילום מורפוגנזה עינית לאורך זמן בשל יכולתה לחדור דגימות עבות יותר להדמיה פלואורסצנטית, למזער את ההלבנה והפוטוטוקסיות, ולדמות במהירות גבוהה. כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. מערך הנתונים המתקבל יכול לספק תובנות חשובות על תהליך המורפוגנזה של העין, כמו גם הפרעות לתהליך זה כתוצאה ממוטציה גנטית, חשיפה לסוכנים פרמקולוגיים או מניפולציות ניסיוניות אחרות.

Introduction

התפתחות עוברית היא תהליך מורכב הדורש תיאום מדויק של אירועים רבים ושונים. היווצרות העין של בעלי החוליות מתחילה במוח הקדמי המתפתח, שם חלק מהתאים מוגדרים כשדה העין. תאים אלה יתנשאו לכיוון האקטודרם של פני השטח, ויולידו שתי בועיות אופטיות דו-צדדיות 1,2,3,4,5,6,6,7,8,9,10. לאחר מכן, מגע עם האקטודרם של פני השטח גורם לאינווגינציה של השלפוחית האופטית לכוס אופטית. אקטודרם פני השטח יוליד את המבנים הקדמיים של העין, כגון העדשה והקרנית, ואילו הכוס האופטית תוליד את הרשתית העצבית ואת האפיתל בעל פיגמנט הרשתית 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . שיבושים בתהליך זה עלולים להוביל לפגמים מולדים כגון מיקרופתלמיה, אנופתלמיה וקולובומה (MAC). בשלב זה, אין אפשרויות לתקן פגמים אלה 3,5,6,7,9,9,10,11,12. מחקרים נוספים על המנגנונים של מורפוגנזה עינית והבעיות שיכולות להוביל ל- MAC יספקו בסיס של ידע שעשוי להוביל לטיפולים. אחד הכלים החזקים לחקור את ההתנהגויות הדינמיות של תאים במהלך התפתחות העין הוא דמיון בהילוך מהיר, המאפשר לדמיין ולאפיין את התהליך הזה ב-vivo ובזמן אמת.

דגי זברה (Danio rerio) הם מודל מצוין להמחשת התפתחות עיניים מוקדמת באמצעות הדמיה של קיטועי זמן. יש להם עין בעלת חוליות שמורה מאוד ויש להם את היכולת להתפתח במהירות ובאופן חיצוני תוך שמירה על שקוף אופטי1. דגי זברה מספקים משאב נהדר להדמיה בהילוך מהיר בשל מאפיינים אלה שחסרים למודלים של יונקים. מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות העין של דגי זברה מתאפשרים מאוד על ידי שימוש בקו דגי הזברה המהונדסים Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (חלבון הומיאובוקס רשתית 3) הוא גורם שעתוק החיוני להתפתחות העין14. Rx3 הוא הראשון מבין שלושת הגנים rx בדג הזברה שמתבטא, ומתחיל את הביטוי שלו באמצע גסטרולציה, כ-8 שעות לאחר ההפריה (hpf)15,16. ניתן לדמיין את הטרנסג'ן rx3:GFP במוח הקדמי המתפתח החל משלב הסומייט 1 (ss), כ-10 כ-10 כ"ס 15,17,18,19,20. במוח הקדמי המתפתח, ביטוי rx3:GFP מסמן את התאים של שדה העין הבודדת, ו-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ממשיך לבוא לידי ביטוי דרך שארית מורפוגנזה עינית. הדמיית הקפאת זמן ברזולוציה גבוהה של ביטוי rx3:GFP, אם כן, מאפשרת לנו לעקוב אחר שדה העין הבודדת לאורך זמן כשהוא מתפתח לרשתית 17,18,20.

מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות דגי זברה בוצעו בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או אור. למיקרוסקופיה קונפוקלית יש יתרון בכך שהיא מאפשרת הדמיה מדויקת של דגימות לאורך ציר ה-z ומפחיתה את אות הרקע הפלואורסצנטי. עם זאת, הוא מוגבל על ידי כמות הזמן שלוקח לרכוש תמונה, קשיחות מיקום המדגם, והנטייה שלו כלפי פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות של דגימות חיות. מיקרוסקופיית יריעות אור היא שיטה אידיאלית לצילום מורפוגנזה של עיניים לאורך זמן בשל יכולתה לחדור דגימות עבות יותר להדמיה פלואורסצנטית, גמישות מוגברת בכיוון הדגימה, הלבנת תמונות מינימלית ופוטוטוקסיות, והדמיה במהירות גבוהה 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. הרזולוציה המרחבית הניתנת להשגה עם מערכות מיקרוסקופיות יריעות אור נוכחיות היא כ-250-500 ננומטר (ננומטר). למרות שזה לא שונה באופן משמעותי ממה שניתן להשיג במיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לסובב את הדגימה באופן חופשי ולדמות אותה ממספר זוויות, מה שמשפר הן את עומק ההדמיה והן את הרזולוציה, ומציע גמישות רבה יותר לניסויי הדמיה בהילוך מהיר בזמן in vivo מאשר הפלטפורמה הקונפוקלית27,32 . מסיבות אלה, מיקרוסקופיית Lightsheet הופכת במהירות לשיטה המועדפת למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות דגי זברה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים של כימות אוקולוגנזה באמצעות הדמיה של דג זברה מהונדס Rx3:GFP באמצעות מיקרוסקופ Lightsheet33 הזמין מסחרית ומפרט צינור לניתוח תמונה באמצעות פלטפורמת התוכנה arivis.

Protocol

כל הניסויים שכללו שימוש בדגי זברה בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קנטקי (IACUC).

1. הכנה לדוגמה

  1. הציבו זוג זיווג של דגי זברה מסוג Tg(Rx3:GFP) במיכל צלב מגודר בלילה שלפני תכנון ההדמיה. למחרת בבוקר למשוך את השער כאשר האורות נדלקים במתקן הדגים34,35.
    הערה: זוג הדגים המזדווגים שנבחרו צריך להיות בין 4 חודשים לשנתיים, והם נבדלים בקלות כזכר או נקבה על סמך צורת הגוף וצבעו35.
  2. בדקו את הצלבים כל חצי שעה לאיתור עוברים ושימו לב באיזו שעה עוברים מוצגים לראשונה בתחתית מיכל הצלב. העבירו את העוברים לצלחת פטרי ושמרו על העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס במשך כ-10 שעות כדי להתפתח לשלב הסומיטים 1-2 (ss). התחילו לצלם בשלב הסומייט 1-2 (ss).
  3. כדי לסנן נוכחות של somites, להתבונן בעוברים תחת סטריאוסקופ ב 10 hpf ולספור את מספר somites1.
    הערה: אין להשתמש בעוברים שהם מעבר לשלב הסומייט הבודד לניסוי זה.
  4. מתוך העוברים שנמצאים בשלב הסומיטי היחיד, יש לסנן ביטוי GFP באמצעות מתאם פלואורסצנציה בשילוב עם סטריאומיקרוסקופ כדי לאשר את נוכחותו של טרנסגן Rx3:GFP. לאחר שזוהו 3-5 אנשים חיוביים ל-GFP, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לנטרל את העוברים ולהעביר אותם לצלחת פטרי קטנה המכילה מאגר עוברים E3 עם פיפטהמזכוכית 35.
  5. הרדמה את העוברים על ידי העברתם למאגר עוברים E3 של 0.5 מ"ל (pH 7) המכיל 0.168 מ"ג/מ"ל טריקאין (MS222) בצינור מיקרוצנטריפוגה35,36. תנועות שרירים ספונטניות מתחילות כבר ב-17 כ"ס37. ודא שהעוברים מורדמים כדי להצטלם מעבר לנקודת זמן זו.
  6. הטמיעו את העוברים באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה של 1% ב-0.168 מ"ג/מ"ל טריקאין ו-E3.
    הערה: זהו הריכוז האופטימלי של אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה כדי לאפשר את החזקת העובר במקומו אך להישאר גמיש מספיק כדי לאפשר את צמיחת העובר לאורך זמן ההדמיה- 30,31.
  7. הכינו תמיסה של 10 מ"ל של אגרוז טמפרטורת התכה נמוכה ב-2% ב-E3 buffer. מחממים אותו בתנור מיקרוגל כדי להמיס אגרוז במרווחים של 15 שניות, כדי למנוע מהתמיסה לרתוח. אפשרו לתמיסה להתקרר מספיק כדי להחזיק ללא אי נוחות אך לא עד כדי כך שהיא מתמצקת, ולא תגרום נזק לעוברים. ברגע שהאגרוז קריר מספיק, מוסיפים 0.5 מ"ל לעוברים בצינור של טריקאין ב- E3 ומקטרים בעדינות את התמיסה והעוברים כדי לערבב.
  8. באמצעות נימי זכוכית בקוטר 1 מ"מ ובוכנה מסוג polytetrafluoroethylene (PTFE), משכו את העוברים בתמיסת האגרוז לתוך הנימים. הקפידו למשוך בסך הכל 3-5 עוברים (עוברים מרובים) לתוך הנימים כדי להגדיל את הסבירות לבעלות על עובר ממוקם היטב.
    הערה: בשל האופי העגול של העוברים בנקודת זמן זו, קשה להבטיח אוריינטציה מסוימת בנימים. באופן אידיאלי, גוף העובר ימוקם לרוחב בנימי, מה שיאפשר את הקלות הגדולה ביותר של מיקום בתוך המיקרוסקופ.
  9. תנו לאגרוזה להתמצק במשך תקופה של 30-60 שניות בטמפרטורת החדר. מניחים את הנימים בכוס של 0.168 מ"ג/מ"ל טריקאין במאגר E3 עד שהם מוכנים לתמונה (איור 1A).
    הערה: ניתן לאפשר לתמיסת אגרוז טמפרטורת ההיתוך הנמוכה העודפת של 2% להתמצק ולאחר מכן לחמם אותה מחדש בניסויים עתידיים.
  10. מקם את הנימים במחזיק הדגימה (איור 1B-F) כמתואר בשלב 2.5.

2. הגדרת גיליון אור Z.1 של Zeiss

  1. הפעל כל רכיב במיקרוסקופ ובמחשב בסדר הבא: 1) מערכת, 2) מחשב, ואז 3) דגירה (איור 2A).
  2. מקם את מטרת ההדמיה פי 20 ואת מטרת ההארה פי 10 לתוך תא המיקרוסקופ. התאם את הגדרות המטרה בממשק תוכנת Zen תחת הכרטיסיה שמירה .
  3. החליקו את התא (איור 2C) לתוך המארז שעל המסילה (איור 2B) כשהצינורות פונים החוצה. הצינורות מתחברים ליציאות המתאימות בצד ימין, כפי שמוצג באיור 2E.
  4. חבר את קו ההרחבה למזרק באמצעות מנגנון נעילת הלואר (איור 2D); מלאו אותו בטרקאין ב-E3 והניחו אותו במחזיק המחובר מימין למיקרוסקופ35. חברו את השלוחה המחוברת למזרק המלא בטרקאין ב-E3 בפינה הימנית התחתונה של התא באמצעות מנגנון נעילת הלואר. דחפו את הבוכנה כדי למלא את התא בחיץ Tricaine/E3. סגרו את דלת החדר.
  5. מכניסים את הנימים עם הדגימה למחזיק הדגימה הנימית. מחזיק הדגימה הנימית כולל שני שרוולי גומי, דיסק מחזיק דגימת מתכת, גבעול מתכת ומכסה מתכת (איור 1B). לחץ על נדן המתכת למרכז דיסק המתכת (איור 1C). מניחים את שני פקקי הגומי לתוך הנדן, כאשר החריצים פונים לקצות הנדן ואחריהם לנימים. החלק את הנימים דרך אמצע פקקי הגומי. הדקו אותו למקומו עם מכסה המתכת ברגע שהסמן נמצא בבסיס נדן המתכת (איור 1D).
  6. הניחו את מחזיק הדגימה הנימית על החלק העליון של המיקרוסקופ, כשהסימנים הלבנים מתיישרים (איור 1E,F). סגור את המכסה.
  7. לחץ על הלחצן אתר נימי בממשק התוכנה (איור 3A). השתמשו בלוח הבקרה של ErgoDrive, התקן ידני השולט בכיוון הנימי (איור 3E), כדי להזיז את הנימים ולמקם אותו בדיוק מעל המטרה (איור 3B).
  8. פתחו את המכסה ודחפו בעדינות את הבוכנה עד שמקטע האגרוז המכיל את העובר תלוי מתחת לתחתית הנימית ונמצא לפני המטרה (איור 3C).
  9. כבה את אתר נימי ולחץ על הלחצן אתר דגימה (איור 3A). פעולה זו מעבירה את הנוף ממצלמת האינטרנט של תא הדגימה אל מטרת המיקרוסקופ (איור 3D). השתמש בתצוגה זו כדי להתאים את מיקום הדגימה בצורה מדויקת יותר. כבה את אתר הדגימה (איור 3A).
  10. עבור לכרטיסיה 'רכישה '. סמן את התיבות עבור Z-Stack וסדרת זמן.
  11. בחלון הפרמטרים של מצב רכישה, בחר את ההגדרה של גליון תאורה דו-צדדית וסמן את התיבות עבור סריקת היתוך וציר צד דו-צדדית מקוונת.
  12. בחלון ערוצים , בחר ערוץ 488, הגדר את עוצמת הלייזר ל- 1 ואת זמן החשיפה ל- 7.5 אלפיות השנייה.
  13. לאחר מכן, לחץ על הלחצן רציף כדי לקבל תצוגה חיה של העובר. השתמש בלוח הבקרה של ErgoDrive כדי להתאים את מיקום העובר עד ששדה העין פונה ישירות למצלמה. המשך לכוונן את גליונות האור השמאלי והימני בפרמטרים 'ערוצים' עד ששדה העין יהיה מספיק במיקוד.
  14. הגדר את הפרמטרים Z-Stack באמצעות לוח הבקרה של ErgoDrive כדי לעבור דרך מישור Z. הגדר את מיקומי ה-Z הראשונים והאחרונים סביב 500 מיקרומטר מעבר לאות הפלואורסצנטי האחרון הניתן לזיהוי. זה משאיר מקום לשדה העין להישאר במסגרת כשהעובר גדל לאורך כל סשן ההדמיה בהילוך מהיר. לאחר הגדרת הטווח של Z-Stack, לחץ על לחצן אופטימלי כדי להגדיר את גודל הצעד ל- 0.477 מיקרומטר, ההגדרה האופטימלית.
  15. הגדר את הפרמטרים של הדגירה על ידי סימון התיבה עבור יחידת פלטייה כדי לשמור על הטמפרטורה ב- 28 °C (76 °F). בחלון סדרת זמן , בחר את התדירות ואת מרווח הזמן כדי להשיג תמונות. בפרוטוקול זה, הפרמטרים הוגדרו לתמונה כל 5 דקות, בסך הכל 166 מרווחים.
  16. לחץ על לחצן התחל ניסוי . בחר את התיקיה כדי לשמור את ערכת התמונות. הגדר את קידומת התמונה ולחץ על שמור כדי להתחיל את ההדמיה.
    הערה: המיקרוסקופ יעבור כעת דרך כל תמונה שנקבעה במרווח הזמן שצוין.
  17. לאחר השלמת סשן ההדמיה של קיטועי הזמן, שלח את השלב למצב העומס, והסר את בעל הדגימה הנימית. מפרקים את מחזיק הדגימה הנימי בסדר ההפוך שהוא הורכב והשתמשו בבוכנה כדי להסיר את הדגימה ואת האגרוז העודף מהנימיות. פתחו את דלת החדר. השתמש במזרק כדי להסיר את נוזל החדר מהתא, לנתק ולהסיר את החדר, ולאחר מכן לשטוף עם מים ואוויר יבש.

3. ניתוח תמונות

  1. פתח את תוכנת arivis Vision4D.
  2. לחץ על קובץ ולאחר מכן בחר יבא קובץ. בחר את כל קבצי ה- .czi מהפעלת ההדמיה של קיטועי הזמן ופתח. החלון הבא נפתח עם האפשרויות כיצד לייבא את הקבצים; בחר Z-stacks כמסגרות כדי להזמין את ערימות z בסדר המתקבל. לאחר ייבוא הקבצים, התוכנה נשמרת כקובץ .sis יחיד. כדי לציין את המיקום לשמירת הקובץ, בחר את התיקיה לפני הלחיצה על ייבוא.
  3. לאחר ייבוא הקובץ, arivis מוכן כעת לעבד וידאו של התמונות בהילוך מהיר. לחץ על קוביית הצופה 4D בפינה הימנית התחתונה ועל סמל סרגל קנה המידה (איור 4D-E). לחץ על סמל הווידאו כדי להביא את שורת המשימות של Storyboard לתחתית המסך (איור 4C).
  4. בשורת המשימות של לוח התכנון , בחר /י ״הוסף רצף מסגרת מרכזית״ (איור 4F). ציין את משך הזמן של הסרטון בשניות, בטל את הסימון בתיבה צור סיבוב וסמן את השימוש בהתקדמות הזמן כדי לכלול את נקודות הזמן הספציפיות בסרטון. התוכנה מציגה פרמטרים אלה מימין לשורת המשימות של Storyboard עבור כל התאמות בכל עת. שמור את ה-Storyboard כדי להחיל את אותם פרמטרים על ערכות תמונות מרובות (איור 4F).
  5. לחץ על ייצוא סרט כדי לשמור סרטון של הדמיית קיטועי הזמן (איור 4F). ציין את הגדרות ייצוא הסרט, כולל שם הקובץ והמיקום שלו, פורמט הווידאו (.mp4), רזולוציית הווידאו (1,080 p), קצב הפריימים (60 FPS) ורזולוציית הנתונים (1,297 x 1,297 x 784). הוסף חותמות זמן כאן, אם תרצה בכך. לאחר הגדרת פרמטרים אלה, בחרו ' רשומה' (איור 4F).
  6. ניתן לחזור על שלבים 3.4 ו- 3.5 עם שינוי לשלב 3.4 כדי ליצור סרטוני סיבוב בנקודות זמן ספציפיות. בעת הוספת רצף מסגרת מפתח ללוח התכנון, סמן את התיבה צור סיבוב ובטל את הסימון השתמש בהתקדמות זמן. לאחר מכן, בצע את אותן הוראות כמו בשלב 3.5.
  7. כדי לעבד תמונה ברזולוציה גבוהה בכל כיוון שהוא בכל נקודת זמן בודדת, בחרו בסמל המצלמה במציג 4D כדי לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה (איור 4C).
  8. כדי לבנות צינור לניתוח, בחרו בסמל Flask כדי לגשת ללוח הניתוח (איור 4B). בחלונית 'ניתוח' , לחצו על התפריט הנפתח ' פעולות ניתוח '. כדוגמה, הפרוטוקול מדגים מתחת לרצף הפעולות עבור צינור ניתוח נפח. הפעל או בטל כל שלב בצינור בנפרד כדי לכוונן כל פרמטר (טבלה 1).
  9. לחץ על המשולש הכחול שבראש הצינור כדי לאפשר לצינור לפעול.
    הערה: פעולה זו תיקח זמן מה בהתאם למהירות המחשב. לאחר אופטימיזציה של הצינור, ניתן לייצא ולייבא את הצינור ל- arivis בקלות ולהחיל אותו על מערכי נתונים מרובים בניתוח אצווה.
  10. כדי לגשת לניתוח אצווה, לחץ על ניתוח אצווה תחת הכרטיסיה ניתוח .
  11. לאחר שהצינור פועל, חלון עוצר עם כל האובייקטים שנמצאו. גש לכך באופן ידני דרך סמל הטבלה (איור 4B). בחלק העליון של חלון זה, לחץ על התיבה שכותרתה עמודות תכונה כדי למשוך רשימה של תכונות שיכולות לספק מידע על מושא העניין. עבור ניתוח נפח שדה העין, תכונות אלה כוללות שטח פנים, נפח (נפח, VoxelCount), עוצמות #1 (ממוצע), תכונות (מזהה, סוג) ונקודת זמן (ראשונה). לחץ על ייצוא כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.

Representative Results

מערך הנתונים המוצג כאן צולם באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. עובר Tg(Rx3:GFP) צולם החל משלב סומיט אחד (ss) ועד 24 hpf, פרק זמן כולל של 14 שעות, כאשר התמונות נרכשו במרווחים של 5 דקות. הדמיה של קיטועי זמן מאפשרת בחירה קלה והשוואה של כל נקודת זמן המציגה פנוטיפ של עניין. איור 5 מדגים קבוצה של תמונות ברזולוציה גבוהה שעובדו מנקודת התצפית הגבית בנקודות זמן התפתחותיות נבחרות. הפעלת הצינור ב-arivis Vision4D בונה מסכה המייצגת את העין המתפתחת כפי שזוהתה על ידי אות פלואורסצנטי. באיור 5 ובסרטונים 1-6 ניתן לדמיין את המסכה בהשוואה לעיבוד הפלואורסצנטי של העין המתפתחת. בנוסף, טבלה 2 מציגה את נתוני עוצמת הקול מהעין המתפתחת בכל נקודת הדמיה. ערכת נתונים זו כוללת את שם המקטע, המזהה, הנפח הן בספירת μm3 והן בספירת ווקסל, את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של האובייקט, את נקודת הזמן שבה זוהה האובייקט ואת שטח הפנים של האובייקט ב- μm2. חשוב לציין שכאשר שדה העין מתפצל לשתי בועיות אופטיות (החל מ-Timepoint 64), נותר אזור שלישי שהוא Rx3:GFP חיובי במוח הקדמי, מה שיתרום להיפותלמוס 38,39,40 (איור 5D-M). זה מופיע בנתוני הנפח המיוצגים בטבלה 2 (מודגשים בצהוב החל מנקודת זמן 71) וניתן להפריד אותם בקלות מהבועיות האופטיות, מכיוון שהם קטנים בהרבה בנפחם מאשר כל שלפוחית אופטית.

Figure 1
איור 1: הכנת דגימה. (A) מיקום עוברים בנימי זכוכית. החץ מצביע על עובר בנימים. (B) חלקי נימי זכוכית ומחזיק נימים. (ג) בעל נימים שהורכב חלקית. (ד) בעל נימי הרכבה מלאה. (E) תא הרכבה של יריעת אור. החץ הצביע על הקו הלבן ששימש להכוונת מחזיק הנימים. (ו) מחזיק נימי המותקן כראוי בגליון התאורה. החץ מציג את הקווים הלבנים התואמים, המציין כיוון נכון של מחזיק הנימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הגדרת הדמיית גיליון אור. המספרים מציינים את סדר הפעולות. (ב) תא המטרה של גיליון האור. (ג) תא הדמיה. (ד) מזרק וצינורות שיחוברו לתא ההדמיה. (ה) תא ההדמיה ממוקם כראוי בתוך תא המטרה כאשר כל הצינורות מחוברים ליציאות המתאימות מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מיקום דגימה. (A) אתר נימים ואתר לחצני דגימה בתוכנת Zen כפי שמציינים החצים. (ב) המיקום על נימי הזכוכית. החץ מציין את קצה נימי הזכוכית הממוקמים ממש מעל עדשת המטרה. (C) השעיית העובר מעבר לנימי הזכוכית. החץ הצביע על העובר התלוי באגרוז מתחת לנימי הזכוכית מול עדשת המטרה. (ד) מבט על העובר דרך המטרה. (E) לוח הבקרה של ErgoDrive. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סמלים חשובים לניווט ב-arivis Vison4D. לכל חלונית יש את פונקציית הסמל המזוהה משמאל לימין. (א) פתח, שמור, סגור. (B) לוח ניתוח, הצגת טבלת אובייקטים, עורך מסלול פתוח. (C) העתק את תוכן הצופה הנוכחי כתמונה לתוך הלוח, החלף סימניות, צור תמונה ברזולוציה גבוהה עבור התצוגה הנוכחית, החלף סטוריבורד. (D) הצג תיבת מדידה, הצג צלב כיוון, הצג מקרא, הצג סרגל קנה מידה. (E) הצג כמציג דו-ממדי, הצג כמציג גלריה, הצג כמציג 4D, הצג כמציג מידע, הצג כמציג הקרנה. ו) רענן את כל המסגרות המרכזיות, הוסף Keyframe, הוסף רצף Keyframe, הוסף Keyframe, הסר את כל המסגרות המרכזיות, ייצא סרט, טען סטוריבורד, שמור סטוריבורד, שמור סטוריבורד, התאם את זמן היעד של הסרט כולו, מסגרת מפתח ראשונה, הפעל, השהה, עצור, מסגרת מפתח אחרונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תמונות ברזולוציה גבוהה ומסכות שדה עיניים. (A-M) קבוצה של תמונות ברזולוציה גבוהה שעובדו מנקודות התצפית הגביות; (A'-M') מסכות שדה העין עבור כל נקודת זמן מתאימה. כל ערכת תמונות מסומנת על ידי הזמן שבו היא נרכשה מתחילת ההדמיה והשלב ההתפתחותי המתאים בשלב סומיט (ss) או שעות לאחר ההפריה (hpf). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

וידאו 1: סרטון בהילוך מהיר של עובר דג זברה Tg (rx3:GFP) מ-1 ss-24 hpf. אנא לחץ כאן לחיצה ימנית כדי להוריד את הסרטון (שמור קישור בשם).

וידאו 2: סרטון בהילוך מהיר של עובר דג זברה Tg (rx3:GFP) מ-1 ss-24 hpf עם שדה העין כפי שזוהה על ידי צינור arivis Vision4D. אנא לחץ כאן לחיצה ימנית כדי להוריד את הסרטון (שמור קישור בשם). 

וידאו 3: סיבוב של 360° של עובר דג זברה Tg (rx3:GFP) ב-1 שניות. אנא לחץ כאן לחיצה ימנית כדי להוריד את הסרטון (שמור קישור בשם). 

וידאו 4: סיבוב 360° של מסכת שדה עין עוברית של דג זברה Tg (rx3:GFP) ב-1 שניות. אנא לחץ כאן לחיצה ימנית כדי להוריד את הסרטון (שמור קישור בשם). 

סרטון 5: סיבוב של 360° של עובר דג זברה Tg (rx3:GFP) ב-24 כ"ס. אנא לחץ כאן לחיצה ימנית כדי להוריד את הסרטון (שמור קישור בשם). 

וידאו 6: סיבוב 360° של מסכת שדה עין עוברית של דג זברה Tg (rx3:GFP) ב-24 כ"ס. אנא לחץ כאן לחיצה ימנית כדי להוריד את הסרטון (שמור קישור בשם). 

טבלה 1: צינור arivis Vision4D לניתוח נפח של שדה העין המתפתח. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: נפח ושטח הפנים של שדה העין המתפתח שנרכש על ידי arivis Vision4D. השורות הנוגעות להיפותלמוס המשוער מודגשות בצהוב כדי להבדיל אותן מהבועיות האופטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

בפרוטוקול זה, מיקרוסקופ Lightsheet שימש לביצוע הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות העיניים והנתונים שהתקבלו נותחו. מערך הנתונים המתקבל יכול לספק תובנות חשובות על תהליך המורפוגנזה של העין, כמו גם הפרעות לתהליך זה כתוצאה ממוטציה גנטית, חשיפה לחומרים פרמקולוגיים או פרמטרים ניסיוניים אחרים. כאן הפרוטוקול הדגים כיצד ניתן להשיג מערך נתונים זה וסיפק דוגמה כיצד לנתח את נפח שדה העין באמצעות פיתוח מוקדם. נתונים אלה נמצאו ניתנים לשחזור ועקביים (פחות מ-10% שונות בנפח) על פני שכפולים ביולוגיים, תוך התחשבות בכך שהבדלים קלים בהיערכות העוברים לפני תחילת הריצה יכולים להוביל לשונות מסוימת במדידות הנפח הסופיות.

יש להקפיד על המיקום הראשוני של העובר בנימים ובמיקום העובר המוטבע מול המטרה. האוריינטציה ממלאת תפקיד חשוב במניעת צמיחת העובר ויציאה מתוך השקפת המטרה. לעוברים יש צורה עגולה של 10 כ"ס, מה שמקשה על הבטחת כיוון מסוים בנימים. באופן אידיאלי, גוף העובר ימוקם לרוחב בנימים. העמסת עוברים מרובים בנימים תגדיל את הסבירות לבעלות על עובר ממוקם היטב.

בהליך זה, העובר מוטבע באגרוז על מנת להשעות אותו מול מטרות ההדמיה וההארה. בחירת הריכוז הנכון של אגרוז טמפרטורת ההיתוך הנמוכה היא קריטית. ריכוז גבוה מדי יגביל את העובר וימנע ממנו להתפתח כראוי; ריכוז נמוך מדי יגרום לכך שהאגרוז יתפרק ולא יחזיק את העובר. הריכוז האופטימלי לפרוטוקול זה הוא ריכוז סופי של 1% טמפרטורת התכה נמוכה של אגרוז30,31.

אלמנט נוסף שיש לקחת בחשבון הוא רמת הרוויה. ככל ששדה העין גדל ומבדיל, עוצמת האות Rx3:GFP מתעצמת. לכן, בעת הגדרת פרמטרי ההדמיה הראשוניים, יש להפחית את החשיפה ואת עוצמת הלייזר כדי להמעיט בתמונה. פעולה זו תמנע מהתמונה להפוך לרווית יתר ככל שה-Rx3:GFP יתבהר עם הזמן. ניתן לבצע שינויים כדי לתקן את התת-קרקעיות בעיבוד תמונה, אך לא ניתן לתקן את ה-oversaturation לאחר רכישת התמונות.

ישנם כמה שינויים נוספים שניתן לבצע בפרוטוקול זה שעשויים להיות יתרון לפרויקטים מסוימים שאינם מתוארים במאמר זה. לדוגמה, ניתן להגדיר הדמיה Multiview בהגדרת רכישת התמונה. פרמטר זה יאפשר למספר עוברים במיקומים שונים לאורך ציר ה-y להצטלם באופן רציף בכל מרווח זמן. תוך הוספת מורכבות למערך הנתונים, זה יגדיל את קצב איסוף הנתונים. בנוסף, במונחים של עיבוד תמונה, ניתן לכמת את שדה העין על ידי פרמטרים אחרים. כאן תיארנו כיצד לכמת את הנתונים במונחים של נפח שדה העין. לחלופין, ניתן ליצור צינור כדי לכמת ולעקוב אחר תאים בודדים או לקבוע את קצב התאדות השלפוחית האופטית.

כפי שצוין קודם לכן, הן מיקרוסקופיה קונפוקלית והן מיקרוסקופיית Lightsheet שימשו לביצוע מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של דגי זברה. Lightsheet נבחר במיוחד לפרויקט זה בשל יכולתו המעולה לצלם דרך דגימה עבה (>1 מ"מ), משום שהוא מצויד ביחידת דגירה כדי לשמור על סביבת טמפרטורה אידיאלית לעובר דג הזברה, ומכיוון שיכולתו לצלם בקצב מהיר יותר ממיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת רכישת תמונה במרווחי הזמן הרבים הנדרשים לפרוטוקול זה ללא נזק נלווה או הלבנת תמונות של העובר21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. חשוב גם לציין כי מיקרוסקופ Lightsheet מצויד כדי לדמות את האות ממספר פלואורופורים. למיקרוסקופ Lightsheet המשמש במחקר זה יש קווי עירור לייזר במצב מוצק ב-405, 445, 488, 515, 561 ו-638 ננומטר, שיכולים להיות שימושיים להדמיית עוברים מהונדסים המבטאים יותר מדיווח פלואורסצנטי אחד טרנסגן.

בעוד שפרוטוקול זה מפרט הוראות לניתוח רכישת תמונות באופן ספציפי באמצעות מערכת מיקרוסקופ התאורה הכפולה של Lightsheet Z.1 ותוכנת הניתוח arivis Vision4D, ישנם מיקרוסקופים אחרים של Lightsheet הזמינים מסחרית המיוצרים על ידי לייקה, אולימפוס ולוקסנדו, כמו גם תוכנת ניתוח תמונות על ידי אימריס, שיכולים לשמש להשגת תוצאות דומות. בחירת הציוד והתוכנה לפרוטוקול זה נקבעה על ידי הזמינות במוסד שלנו.

לסיכום, הצפי הוא שפרוטוקול זה יספק נקודת התחלה מוצקה לביצוע הדמיה של קיטועי זמן באמצעות מיקרוסקופיית Lightsheet, ולכימות תמונה של התפתחות עיניים מוקדמת בדגי זברה.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי משרד מנהל המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת פרס מספר S10OD020067 ועל ידי פרס NIH R01EY021769 (ל- A.C.M.). אנו אסירי תודה על עזרתם של דאג הריסון וג'ים בגלי במרכז ההדמיה לאמנויות ומדעים באוניברסיטת קנטקי, וללוקאס ויירה פרנסיסקו ואוולין מ. טורנבאו על טיפול מומחה בדגי זברה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60mL Syringe Luer-Lok Tip BD 309653
Agarose, Low Melting Temperature Promega V2111
arivis Vision4D Software arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps Dumont 0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) Zeiss Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm B. Braun 4097262
Light & Filter Set – Royal Blue Night Sea SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2 Zeiss #701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222) Sigma A-5040
Z.1 Lightsheet Zeiss
Zen Software Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  2. Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
  3. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  4. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Developmental Cell. 6 (2), 167-181 (2004).
  5. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
  6. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  7. Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  8. Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
  9. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
  10. Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
  11. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
  12. Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
  13. Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
  14. Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
  15. Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
  16. Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
  17. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  18. Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
  19. Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
  20. Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  24. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
  25. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  26. Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
  27. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
  28. Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
  29. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  30. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  31. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  32. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  33. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
  34. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  35. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
  36. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
  37. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
  38. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
  39. Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
  40. Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 170 הדמיה בהילוך מהיר מיקרוסקופיה של יריעת אור הדמיה חיה דגי זברה התפתחות עיניים רשתית
הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, R. A., Morris, A. C.… More

Petersen, R. A., Morris, A. C. Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62296, doi:10.3791/62296 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter