Summary
ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。
Abstract
脊椎動物の眼の発達は、胚の胃形成の終わり近くに始まる複雑なプロセスであり、細胞移動、増殖、および分化の正確な調整を必要とする。タイムラプス想像は、生体内での眼形成を視覚化できるため、目の発達中の細胞の挙動に独自の洞察を提供します。ゼブラフィッシュは、高度に保存された脊椎動物の目と、光学的に透明でありながら迅速かつ外部的に発達する能力のために、このプロセスを視覚化するための優れたモデルです。ゼブラフィッシュ眼球の発達に関するタイムラプスイメージング研究は、トランスジェニックゼブラフィッシュ系統Tg(rx3:GFP)の使用によって大幅に促進される。発達中の前脳では、rx3:GFP発現は片眼球の細胞をマークし、GFPは眼野が回避して視小胞を形成し、その後侵入して視杯を形成するにつれてGFPが発現し続けます。したがって、rx3:GFP発現の高解像度タイムラプスイメージングにより、眼の原基が網膜に発達するにつれて、時間の経過とともに眼原基を追跡することができます。ライトシート顕微鏡は、蛍光イメージングのために厚いサンプルを透過し、フォトブリーチングと光毒性を最小限に抑え、高速でイメージングできるため、時間の経過とともに眼の形態形成をイメージングするのに理想的な方法です。ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。得られたデータセットは、眼の形態形成の過程、ならびに遺伝子変異、薬理学的薬剤への曝露、または他の実験的操作の結果としてのこのプロセスへの摂動に関する貴重な洞察を提供することができる。
Introduction
胚発生は、多くの異なる事象の正確な調整を必要とする複雑なプロセスである。脊椎動物の眼の形成は、細胞の一部が眼野として特定される発達中の前脳で始まります。これらの細胞は、表面外胚葉に向かって蒸発し、2つの両側視小胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10を生じる。表面外胚葉との接触は、次いで、視神経小胞の視神経カップへの侵入を誘発する。表面外胚葉は水晶体や角膜などの眼の前部構造を生じさせ、眼杯は神経網膜および網膜色素沈着上皮を生じさせる1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12.このプロセスの中断は、小眼球症、無眼球症、コロボーマ(MAC)などの先天性欠損につながる可能性があります。現時点では、これらの欠陥3、5、6、7、9、10、11、12を修正するオプションはありません。眼の形態形成のメカニズムとMACにつながる可能性のある問題のさらなる研究は、潜在的に治療につながる知識の基礎を提供するでしょう。目の発達中の細胞の動的挙動を調査するための強力なツールの1つは、このプロセスを生体内およびリアルタイムで視覚化および特徴付けることを可能にするタイムラプス想像である。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、タイムラプスイメージングを使用して初期の眼科発達を視覚化するための優れたモデルです。彼らは高度に保存された脊椎動物の目を持ち、光学的に透明なまま迅速かつ外部的に発達する能力を持っています1。ゼブラフィッシュは、哺乳類モデルに欠けているこれらの特性のために、タイムラプスイメージングのための素晴らしいリソースを提供します。ゼブラフィッシュ眼球の発達に関するタイムラプスイメージング研究は、トランスジェニックゼブラフィッシュ系統Tg(rx3:GFP)13の使用によって大幅に促進される。Rx3(網膜ホメオボックスタンパク質3)は、眼の発達に必須の転写因子である14。Rx3は、ゼブラフィッシュの3つのrx遺伝子のうち最初に発現され、受精後約8時間(hpf)の胃胞形成の半ばにその発現を開始する15、16。rx3:GFP導入遺伝子は、1ソマイト段階(ss)、約10hpf 15、17、18、19、20から開始して、発達中の前脳で視覚化することができる。発達中の前脳では、rx3:GFP発現は片眼野の細胞をマークし、GFP(緑色蛍光タンパク質)は残りの眼形態形成を通して発現し続けている。したがって、rx3:GFP発現の高解像度タイムラプスイメージングにより、網膜17、18、20に発達する単一の眼球を時間とともに追跡することができます。
ゼブラフィッシュの発生に関するタイムラプスイメージング研究は、主に共焦点顕微鏡またはライトシート顕微鏡を用いて行われてきた。共焦点顕微鏡は、z軸に沿ったサンプルの正確なイメージングを可能にし、蛍光バックグラウンドシグナルを低減する点で有利である。ただし、画像を取得するのにかかる時間、サンプル位置の剛性、およびライブサンプルのフォトブリーチングおよび光毒性に対する傾向によって制限されます。ライトシート顕微鏡は、蛍光イメージングのために厚いサンプルに浸透する能力、サンプル配向の柔軟性の向上、フォトブリーチングおよび光毒性の最小化、および高速でのイメージング21、22、23、24、25、26、27、28、29、30のために、時間の経過とともに眼の形態形成を画像化する理想的な方法です。,31.現在のライトシート顕微鏡システムで達成可能な空間分解能は約250〜500ナノメートル(nm)です。これは共焦点顕微鏡で得られるものと有意に異ならないが、サンプルを複数の角度から自由に回転および画像化することができ、画像化深度および解像度の両方を改善し、共焦点プラットフォーム27、32よりもはるかに大きな柔軟性をin vivoタイムラプス画像化実験に提供する。.これらの理由から、ライトシート顕微鏡は、ゼブラフィッシュの発生のタイムラプスイメージング研究に急速に好まれる方法になりつつあります。このプロトコルは、市販のライトシート顕微鏡33を用いたRx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュのイメージングを通じて眼球形成を定量化するステップを説明し、arivisソフトウェアプラットフォームを用いた画像解析のためのパイプラインを詳述する。
Protocol
ゼブラフィッシュの使用を含むすべての実験は、ケンタッキー大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって確立されたプロトコルに従って実施された。
1. サンプル調製
- イメージングが計画される前夜に、ゲート付きのクロスタンクにTg(Rx3:GFP)ゼブラフィッシュの交配ペアを設定します。翌朝、魚類施設34,35の明かりが灯ると門を引く。
注:選択された魚の交配ペアは、生後4ヶ月から2歳の間である必要があり、体型および着色35に基づいて男性または女性として容易に区別される。 - 30分ごとに胚の十字架をチェックし、胚が最初にクロスタンクの底に視覚化される時間を書き留めます。胚をシャーレに移し、胚を28.5°Cで約10時間維持して、1〜2ソマイト段階(ss)に発達させる。1-2ソマイト段階(ss)でイメージを開始します。
- ソマイトの存在をスクリーニングするには、10hpfの立体鏡の下で胚を観察し、ソマイトの数を数えます1。
注:単一のソマイト段階を超える胚は、この実験に使用しないでください。 - 単一ソマイト段階にある胚のうち、実体顕微鏡と組み合わせて蛍光アダプターを用いてGFP発現をスクリーニングし、Rx3:GFP導入遺伝子の存在を確認した。3〜5人のGFP陽性個体が同定されたら、微細な鉗子を使用して胚を脱絨毛し、ガラスピペット35を用いてE3胚緩衝液を含む小さなペトリ皿に移す。
- 微量遠心チューブ35,36内の0.168 mg/mLトリカイン(MS222)を含む0.5 mL E3胚バッファー(pH 7)に移植することによって胚を麻酔する。自発的な筋肉の動きは、早くも17 hpf37で始まります。胚がこの時点を超えて画像化されるように麻酔をかけるようにします。
- 胚を0.168 mg/mLのトリカインおよびE3中の1%低融解温度アガロースに埋め込む。
注:これは、胚を所定の位置に保持することを可能にするが、画像化時間経過30、31にわたって胚の成長を可能にするのに十分な柔軟性を維持するための、低融解温度アガロースの最適濃度である。 - E3緩衝液中の2%低融点アガロースの10mL溶液を調製する。電子レンジで加熱し、15秒間隔でアガロースを溶かし、溶液が沸騰するのを防ぎます。溶液を不快感なく保持するのに十分なほど冷やすが、固化させず、胚に害を及ぼさないようにする。アガロースが十分に冷えたら、E3のトリカインのチューブ内の胚に0.5mLを加え、溶液と胚を穏やかにピペッティングして混合する。
- 1mmガラスキャピラリーとポリテトラフルオロエチレン(PTFE)プランジャーを使用して、アガロース溶液中の胚をキャピラリー内に引き上げる。合計3〜5個の胚(複数の胚)を毛細血管に引き込んで、良好な位置にある胚を有する可能性を高めるようにしてください。
注:この時点での胚の丸い性質のために、毛細血管内の特定の向きを保証することは困難である。理想的には、胚の体は毛細血管内で横方向に配置され、顕微鏡内で最も容易な位置決めを可能にする。 - アガロースを室温で30〜60秒かけて固化させる。毛細血管をE3バッファー中の0.168 mg/mLトリカインのビーカーに入れ、画像化の準備が整うまで入れます(図1A)。
注:過剰の2%の低融点アガロース溶液を固化させ、その後将来の実験で再加熱することができる。 - ステップ2.5の説明に従って、キャピラリーをサンプルホルダー(図1B-F)に置きます。
2. ツァイスライトシートZ.1セットアップ
- 顕微鏡とコンピュータの各コンポーネントを次の順序でオンにします:1)システム、2)PC、3)インキュベーション(図2A)。
- 20倍のイメージング対物レンズと10倍の照明対物レンズを顕微鏡チャンバーに入れます。[ メンテナンス ]タブの[Zen Software]インターフェイスの目的設定と一致します。
- チャンバー(図2C)をトラック上のハウジング(図2B)にスライドさせ、チューブを外側に向けます。チューブは、 図2Eに示すように、右側の適切なポートに接続します。
- 延長線をルアーロック機構でシリンジに取り付けます(図2D)。E3にトリカインを充填し、顕微鏡35の右側に取り付けたホルダーに入れる。E3のトリカインを充填したシリンジに取り付けられたエクステンションを、ルアーロック機構でチャンバーの右下に接続します。プランジャーを押してチャンバーをトリカイン/E3バッファーで満たします。部屋のドアを閉めます。
- サンプルを含むキャピラリーをキャピラリーサンプルホルダーに入れます。キャピラリーサンプルホルダーは、2つのゴムスリーブ、金属サンプルホルダーディスク、金属ステム、および金属キャップで構成されています(図1B)。金属製のシースをクリックして、金属製のディスクの中央に差し込みます(図1C)。2つのゴム栓をシースに入れ、スリットがシースの端に向いていて、その後に毛細血管が続きます。キャピラリーをゴム栓の中央にスライドさせます。マーカーが金属シースの基部に着いたら、金属製のキャップで所定の位置に固定します(図1D)。
- キャピラリーサンプルホルダーを顕微鏡の上部に置き、白いマークを合わせます(図1E、F)。蓋を閉めます。
- ソフトウェアインタフェースの [キャピラリーの位置を特定 ]ボタンをクリックします(図3A)。キャピラリーの向きを制御する手動デバイスであるErgoDriveコントロールパネル(図3E)を使用して、キャピラリーを動かし、対物レンズのすぐ上に配置します(図3B)。
- 蓋を開き、胚を含むアガロースの断面が毛細血管底部の下に垂れ下がって対物レンズの前に来るまでプランジャーを静かに押します(図3C)。
- [ キャピラリーの検索 ]をオフにして、[ サンプルの位置を特定] ボタンをクリックします(図3A)。これにより、サンプルチャンバーのウェブカメラから顕微鏡対物レンズにビューが切り替わります(図3D)。このビューを使用して、サンプルの位置をより正確に調整します。「 サンプルを探す」 をオフにします(図3A)。
- 「 取得」 タブに切り替えます。「 Z スタック 」と「 時系列」のチェックボックスをオンにします。
- 「集録モードパラメータ」ウィンドウで、「デュアルサイドライトシート」設定を選択し、「オンラインデュアルサイドフュージョン」および「ピボットスキャン」のチェックボックスをオンにします。
- [チャンネル]ウィンドウで、[488チャンネル]を選択し、レーザー出力を1、露光時間を7.5ミリ秒に設定します。
- 次に、[ 連続] ボタンをクリックして、胚のライブビューを取得します。ErgoDriveコントロールパネルを使用して、眼球がカメラに直接向くまで胚の位置を調整します。[チャンネル]パラメータの左右のライトシートを、目のフィールドが十分に焦点を合わせるまで調整し続けます。
- ErgoDrive コントロール パネルを使用して Z スタック パラメータを設定し、Z 平面内を移動します。最初と最後のZポジションを、最後の検出可能な蛍光シグナルから約500μm超えて設定します。これにより、タイムラプスイメージングセッション全体を通して胚が成長するにつれて、眼野がフレーム内にとどまる余地が残る。Zスタックの範囲を設定した後、最適ボタンをクリックしてステップサイズを最適な設定である0.477μmに設定します。
- ペルチェユニットのチェックボックスをオンにして インキュベーション パラメータを設定し、温度を28°Cに保ちます。 [時系列] ウィンドウで、画像を取得する頻度と時間間隔を選択します。このプロトコルでは、パラメータは5分ごとに合計166の間隔で画像化するように設定されました。
- [ 実験の開始] ボタンをクリックします。イメージセットを保存するフォルダを選択します。画像接頭辞を設定し、[ 保存] をクリックしてイメージングを開始します。
メモ: 顕微鏡は、指定された間隔で各画像セットを駆け抜けます。 - タイムラプスイメージングセッションが完了したら、ステージを負荷位置に送り、キャピラリーサンプルホルダーを取り外します。キャピラリーサンプルホルダーを一緒に置いたのと逆の順序で分解し、プランジャーを使用してサンプルと余分なアガロースをキャピラリーから取り出します。部屋のドアを開けます。シリンジを使用してチャンバーからチャンバー液体を取り出し、チャンバーを取り外して取り外してから、水ですすぎ、空気乾燥させます。
3. 画像解析
- arivis Vision4Dソフトウェアプログラムを開きます。
- 「 ファイル」をクリックし、「 ファイルのインポート」を選択します。タイムラプスイメージングセッションからすべての.csiファイルを選択し、開きます。次のウィンドウが開き、ファイルのインポート方法に関するオプションが表示されます。 「フレーム」として「Z スタック」 を選択して、Z スタックを取得した順序で順序付けします。ファイルがインポートされると、ソフトウェアは単一の.sisファイルとして保存します。保存するファイルの場所を指定するには、[ インポート] をクリックする前にフォルダを選択します。
- ファイルがインポートされると、arivis はタイムラプス画像のビデオをレンダリングする準備が整いました。左下隅にある4D ビューアキューブとスケールバーアイコンをクリックします(図4D-E)。ビデオアイコンをクリックして、ストーリーボードタスクバーを画面の一番下に移動します(図4C)。
- ストーリーボードタスクバーで、「キーフレームシーケンスを追加」を選択します(図4F)。ビデオの継続時間を秒単位で指定し、[回転を作成] ボックスのチェックを外し、[時間の進行状況を使用] をオンにして、ビデオに特定のタイムポイントを含めます。ソフトウェアは、これらのパラメータをストーリーボードタスクバーの右側に表示し、いつでも調整できます。ストーリーボードを保存して、同じパラメーターを複数のイメージ セットに適用します (図 4F)。
- [ムービーのエクスポート]をクリックして、タイムラプスイメージングのビデオを保存します(図4F)。ファイル名と場所、ビデオ形式(.mp4)、ビデオ解像度(1,080 p)、フレームレート(60 FPS)、データ解像度(1,297 x 1,297 x 784)など、ムービーの書き出し設定を指定します。必要に応じて、ここにタイムスタンプを追加します。これらのパラメータを設定したら、[記録]を選択します(図4F)。
- ステップ3.4と3.5を繰り返して、ステップ3.4に変更して、特定の時点で回転ビデオを作成できます。ストーリーボードにキーフレームシーケンスを追加するときは、「 回転を作成 」ボックスにチェックを入れ、「 時間の進行を使用」のチェックを外します。次に、ステップ 3.5 と同じ指示に従います。
- 個々の時点で任意の向きで高解像度の画像をレンダリングするには、4D Viewerでカメラ アイコンを選択して高解像度の画像を取得します(図4C)。
- 分析用のパイプラインを作成するには、[フラスコ] アイコンを選択して [分析] パネルにアクセスします (図 4B)。[解析]パネルで、[解析操作]ドロップダウンメニューをクリックします。例として、このプロトコルは、ボリューム分析パイプラインの一連の操作を以下に示します。パイプラインの各ステップを個別に実行または元に戻して、各パラメーターを微調整します (表 1)。
- パイプラインの上部にある青い三角形をクリックして、パイプラインを実行できるようにします。
メモ: コンピュータの速度によっては、この処理に時間がかかります。パイプラインが最適化されると、パイプラインを簡単に arivis にエクスポートおよびインポートし、バッチ分析で複数のデータセットに適用できます。 - バッチ分析にアクセスするには、[分析] タブの [バッチ分析] をクリックします。
- パイプラインの実行後、ウィンドウがプルアップされ、見つかったすべてのオブジェクトが表示されます。 テーブル アイコンから手動でアクセスします(図4B)。このウィンドウの上部にある [ フィーチャ列] というラベルの付いたボックスをクリックして、目的のオブジェクトに関する情報を提供できるフィーチャのリストを表示します。眼球体積分析では、これらの機能には、表面積、体積 (体積、ボクセルカウント)、強度 #1 (平均)、属性 (Id、タイプ)、およびタイム ポイント (最初) が含まれます。[エクスポート ] をクリックして、データをスプレッドシートにエクスポートします。
Representative Results
ここに表示されるデータセットは、上記のプロトコルを使用してイメージ化されています。Tg(Rx3:GFP)胚を、1ソマイト期(ss)から24hpfまで、合計14時間、5分間隔で画像を取得して画像化した。タイムラプスイメージングは、目的の表現型を示す任意の時点を容易に選択および比較することを可能にする。図 5 は、選択した発達時点の背側の視点からレンダリングされた高解像度イメージのセットを示しています。arivis Vision4Dで実行されるパイプラインは、蛍光シグナルによって識別される発達中の目を表すマスクを構築します。図5とビデオ1-6では、マスクを発育眼の蛍光レンダリングと比較して視覚化することができます。さらに、表2は、すべてのイメージングポイントで現像眼からのボリュームデータを表示します。このデータセットには、セグメント名、id、μm3とボクセル数の両方の体積、オブジェクトの平均蛍光強度、オブジェクトが特定された時点、およびオブジェクトの表面積(μm2)が含まれます。眼野が2つの視小胞に分離すると(タイムポイント64から開始)、前脳にRx3:GFP陽性の第3の領域が残り、視床下部38、39、40に寄与することに注意することが重要です(図5D-M)。これは、表2(タイムポイント71から黄色で強調表示)に表される体積データに現れ、どちらの光学小胞よりもはるかに体積が小さいため、視神経小胞から容易に分離することができる。
図1:サンプル調製。 (A)ガラス細管内の胚の位置決め。矢印は毛細血管内の胚を指しています。(B)ガラスキャピラリーおよびキャピラリーホルダー部品。(C)部分的に組み立てられたキャピラリーホルダー。(D)完全に組み立てられたキャピラリーホルダー。(E)ライトシート取り付け室。矢印は、キャピラリーホルダーの向き付けに使用される白い線を示しました。(F)ライトシートに正しく取り付けられたキャピラリーホルダー。矢印は一致する白線を示し、キャピラリーホルダーの適切な向きを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ライトシートイメージングのセットアップ。(A)ライトシート、コンピュータ、およびインキュベーションユニットをオンにする配電盤。数字は操作の順序を示します。(B)ライトシート対物室。(c)イメージングチャンバ。(d)イメージングチャンバに接続されるシリンジおよびチューブ。(E) イメージングチャンバは、すべてのチューブが右側の適切なポートに接続された対物チャンバ内に適切に配置されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サンプルの位置決め。 (A)矢印で示されているように、Zenソフトウェアの[ 毛細血管 の位置]ボタンと[ サンプルの位置を特定する] ボタン。(b)ガラス細管上の位置決め。矢印は、対物レンズの真上に位置するガラス細管の縁を示す。(c)ガラス細管を超えた胚懸濁液。矢印は、対物レンズの前のガラス細血管の下のアガロースに懸濁した胚を示した。(D)目的を通した胚の眺め。(E) エルゴドライブのコントロールパネル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アリビスVison4Dをナビゲートするための重要なアイコン。 各パネルには、左から右に識別されるアイコン機能があります。(A) 開く、保存する、閉じる。(B) 分析パネル、オブジェクトテーブルの表示、トラックエディタのオープン。(C)現在のビューアのコンテンツを画像としてクリップボードにコピーする、ブックマークを切り替える、現在のビューの高解像度画像を作成する、ストーリーボードを切り替える。(D) メジャーボックスの表示、方向十字の表示、凡例の表示、スケールバーの表示。(E) 2Dビューアとして表示、ギャラリービューアとして表示、4Dビューアとして表示、情報ビューアとして表示、プロジェクションビューアとして表示。 F)すべてのキーフレームの更新、キーフレームの追加、キーフレームシーケンスの追加、キーフレームの挿入、すべてのキーフレームの削除、ムービーのエクスポート、ストーリーボードの読み込み、ストーリーボードの保存、ムービー全体のターゲット時間の調整、最初のキーフレーム、再生、一時停止、停止、最後のキーフレーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 高解像度画像とアイ フィールド マスク。(A-M) 背側の視点からレンダリングされた高解像度画像のセット。(A'-M')アイフィールドは、対応する各タイムポイントのマスクを行う。各画像セットは、画像化の開始から取得された時間およびソマイト段階(ss)または受精後時間(hpf)のいずれかにおける対応する発達段階によって記記される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:1 ss-24 hpfからのTg(rx3:GFP)ゼブラフィッシュ胚のタイムラプスビデオ。ここを右クリックしてビデオをダウンロードしてください(リンクを名前を付けて保存してください)。
ビデオ2:アリビスVision4Dパイプラインによって識別された眼球を有する1 ss-24 hpfからのTg(rx3:GFP)ゼブラフィッシュ胚のタイムラプスビデオ。ここを右クリックしてビデオをダウンロードしてください(リンクを名前を付けて保存してください)。
ビデオ3:Tg(rx3:GFP)ゼブラフィッシュ胚を1秒で360°回転させる。 ここを右クリックしてビデオをダウンロードしてください(リンクを名前を付けて保存してください)。
ビデオ4:Tg(rx3:GFP)ゼブラフィッシュ胚眼野マスクを1秒で360°回転させる。 ここを右クリックしてビデオをダウンロードしてください(リンクを名前を付けて保存してください)。
ビデオ5:24馬力でのTg(rx3:GFP)ゼブラフィッシュ胚の360°回転。 ここを右クリックしてビデオをダウンロードしてください(リンクを名前を付けて保存してください)。
ビデオ6:24馬力でのTg(rx3:GFP)ゼブラフィッシュ胚眼野マスクの360°回転。 ここを右クリックしてビデオをダウンロードしてください(リンクを名前を付けて保存してください)。
表1:発達中の眼球の体積分析のためのarivis Vision4Dパイプライン。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:arivis Vision4Dによって取得された発育中眼野の体積および表面積。推定視床下部に関連する行は、視床と区別するために黄色で強調表示されている。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルでは、ライトシート顕微鏡を使用して眼の発達のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを分析した。得られたデータセットは、眼の形態形成の過程、ならびに遺伝子変異、薬理学的因子への曝露、または他の実験パラメータの結果としてのこのプロセスへの摂動に関する貴重な洞察を提供することができる。ここでプロトコルは、このデータセットを取得する方法を示し、早期開発を通じて眼球の体積を分析する方法の例を提供しました。このデータは、実行開始前の胚の病期分類のわずかな違いが最終的な体積測定にいくらかの変動をもたらす可能性があることを念頭に置いて、生物学的反復にわたって再現性と一貫性(体積の10%未満の変動)であることが判明した。
毛細血管内の胚の初期位置決めおよび埋め込まれた胚を目標の前に配置する際には注意が必要である。オリエンテーションは、胚が成長し、目的の視界から外れるのを防ぐ上で重要な役割を果たします。胚は10馬力で丸い形をしており、毛細血管内の特定の向きを保証することは困難です。理想的には、胚の体は毛細血管内で横方向に配置される。毛細血管に複数の胚をロードすると、良好な位置にある胚を有する可能性が高まる。
この手順では、胚をアガロースに埋め込み、イメージングおよび照明対物レンズの前に懸濁させる。低融点アガロースの正しい濃度を選択することは非常に重要です。濃度が高すぎると、胚が収縮し、適切に発達するのを妨げる。濃度が低すぎると、アガロースがバラバラになり、胚を保持しなくなります。このプロトコールに最適な濃度は、1%の低融点温度アガロース30、31の最終濃度である。
考慮すべきもう1つの要素は、彩度のレベルです。眼球が成長し、微分するにつれて、Rx3:GFP信号の強度は強まる。したがって、初期イメージングパラメータを設定するときは、露出とレーザーパワーを下げて画像を過小化する必要があります。これにより、Rx3:GFP が時間の経過とともに明るくなるにつれてイメージが過飽和になるのを防ぐことができます。画像処理で過小彩度を補正するように修正することはできますが、画像の取得後に過飽和を補正することはできません。
このプロトコルには、このホワイト ペーパーで説明されていない一部のプロジェクトにとって有利な、いくつかの追加変更が加えられる場合があります。例えば、画像取得設定で多眼撮像を設定することができる。このパラメータにより、y軸に沿った異なる位置にある複数の胚を、各時間間隔で順次画像化することができる。データ・セットに複雑さが増す一方で、データ収集の速度は向上します。さらに、画像処理の面では、他のパラメータによって眼球を定量化することができる。ここで、眼球体積に換算してデータを定量化する方法について説明した。あるいは、個々の細胞を定量化して追跡したり、視胞の蒸発速度を決定したりするためのパイプラインを作ることもできます。
前述のように、共焦点顕微鏡とライトシート顕微鏡の両方が、ゼブラフィッシュのタイムラプスイメージング研究を行うために使用されてきました。ライトシートがこのプロジェクトのために特別に選ばれたのは、厚い(>1mm)サンプルを通して画像化する優れた能力、ゼブラフィッシュ胚にとって理想的な温度環境を維持するためのインキュベーションユニットが装備されていること、および共焦点顕微鏡よりも速い速度で画像化する能力が、胚21の損傷または光退色を伴うことなく、このプロトコルに必要な多数の時間間隔で画像取得を可能にするため、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31。また、ライトシート顕微鏡には、複数の蛍光色素分子からのシグナルを画像化するための機能が装備されていることにも注意することも重要です。この研究で用いたライトシート顕微鏡は、405、445、488、515、561、および638nmに固体レーザー励起線を有し、複数の蛍光レポーター導入遺伝子を発現するトランスジェニック胚のイメージングに有用である可能性がある。
このプロトコルは、特にLightsheet Z.1デュアル照明顕微鏡システムとarivis Vision4D解析ソフトウェアを使用した画像取得解析の手順を詳述していますが、ライカ、オリンパス、ルクセンド製の他の市販のライトシート顕微鏡、およびImarisの画像解析ソフトウェアがあり、同様の結果を達成するために使用できます。このプロトコルのための機器とソフトウェアの選択は、私たちの機関での可用性によって決定されました。
要約すると、このプロトコルは、Lightsheet顕微鏡法を用いたタイムラプスイメージングの実施、およびゼブラフィッシュにおける早期眼科発達の画像定量化のための確固たる出発点を提供することが期待されている。
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、賞番号S10OD020067の下で国立衛生研究所(NIH)の所長室とNIH賞R01EY021769(A.C.M.まで)によって支援されました。ケンタッキー大学のArts & Sciences Imaging CenterのDoug HarrisonとJim Begley、そしてZebrafish Careの専門家であるLucas Vieira FranciscoとEvelyn M. Turnbaughの支援に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
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