Summary
एक स्व-आयोजन विधि का उपयोग करते हुए, हम सीओसीओ के अतिरिक्त एक प्रोटोकॉल विकसित करते हैं जो फोटोरिसेप्टर की पीढ़ी में काफी वृद्धि कर सकता है।
Abstract
रेटिना सेल प्रत्यारोपण एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण है, जो रेटिना आर्किटेक्चर को बहाल कर सकता है और विकृत रेटिना को दृश्य क्षमताओं को स्थिर या सुधार सकता है। फिर भी, सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी में प्रगति वर्तमान में उच्च गुणवत्ता और मानकीकृत मानव रेटिना के ऑफ-द-शेल्फ स्रोत की आवश्यकता की चुनौतियों का सामना करती है। इसलिए, प्रयोगों के लिए एक आसान और स्थिर प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करते हैं, जो बहिर्जात अणुओं और अभिकर्मक ए के उपयोग के साथ-साथ तीन आयामी मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स (आरओ) उत्पन्न करने के लिए मैनुअल एक्सिशन के साथ एक स्व-आयोजन विधि पर आधारित है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) -व्युत्पन्न आरओ फोटोरिसेप्टर के लिए विशिष्ट मार्कर व्यक्त करता है। सीओसीओ, एक बहुक्रियाशील विरोधी के अलावा, फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और शंकु की भेदभाव दक्षता में काफी वृद्धि हुई है। इस प्रणाली का कुशल उपयोग, जिसमें सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के लाभ हैं, और उत्तरार्द्ध से जुड़े सोर्सिंग मुद्दों के बिना, कॉन्फ्लुएंट रेटिना कोशिकाओं, विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर का उत्पादन कर सकते हैं। इस प्रकार, आरओ में पीएससी का भेदभाव रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और सेल प्रत्यारोपण के लिए एक इष्टतम और जैव-प्रासंगिक मंच प्रदान करता है।
Introduction
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) को उनके आत्म-नवीकरण और सभी प्रकार की दैहिक कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता की विशेषता है। इस प्रकार, पीएससी से प्राप्त ऑर्गेनोइड पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण संसाधन बन गए हैं। रेटिना अपघटन को फोटोरिसेप्टर (छड़ और शंकु) और रेटिना वर्णक उपकला के नुकसान की विशेषता है। रेटिना सेल प्रतिस्थापन इस बीमारी के लिए एक उत्साहजनक उपचार हो सकता है। हालांकि, रोग अनुसंधान और चिकित्सा के लिए मानव रेटिना प्राप्त करना संभव नहीं है। इसलिए, पीएससी से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड्स (आरओ), जो बहु-स्तरीय देशी रेटिना कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से और सफलतापूर्वक पुन: व्यवस्थित करते हैं, बुनियादी और ट्रांसलेशनल अनुसंधान 1,2,3 के लिए फायदेमंद हैं। हमारा शोध रेटिना अपघटन 4 का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त और गुणवत्ता वाली कोशिकाएं प्रदान करने के लिए आरओ भेदभाव पर केंद्रितहै।
आरओ को अलग करने के तरीके लगातार उभर रहे हैं, 2012 में सासाई प्रयोगशाला द्वारा अग्रणी त्रि-आयामी (3 डी) निलंबन भेदभावके साथ। हमने विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में सीआरएक्स-टीडीटोमेटो टैग पेश किया और डब्ल्यूएनटी, टीजीएफ-β और बीएमपी मार्ग6 के बहुक्रियाशील विरोधी सीओसीओ के अतिरिक्त विधि को संशोधित किया। सीओसीओ को फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और शंकु 6,7 की भेदभाव दक्षता में कुशलतापूर्वक सुधार करने के लिए दिखाया गया है।
कुल मिलाकर, शास्त्रीय भेदभाव विधि को संशोधित करके, हमने प्रयोगशाला जांच के माध्यम से फोटोरिसेप्टर से जुड़े रेटिना रोग का विश्लेषण करने और आगे नैदानिक अनुप्रयोग / प्रत्यारोपण के लिए मानव आरओ से प्रचुर मात्रा में फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और शंकुओं की कटाई के लिए एक सुलभ प्रोटोकॉल विकसित किया है।
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Protocol
इस अध्ययन को बीजिंग टोंगरेन अस्पताल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी की संस्थागत आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। एच 9 एचईएससी को विसेल रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्राप्त किया गया था और आनुवंशिक रूप से टीडीटोमेटो-टैग सेल लाइन के लिए इंजीनियर किया गया था।
1. मानव आरओ का निर्माण
- फीडर-मुक्त परिस्थितियों के तहत एचईएससी की संस्कृति।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कम से कम आधे घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 मिलीग्राम / एमएल अभिकर्मक ए (सामग्री की तालिका) के 1 एमएल के साथ 6-वेल प्लेट के एक कुएं को कोट करें। 1x106 hESCs का एक एलिकोट पिघलें।
नोट: पूर्व-गर्म अभिकर्मक बी (सामग्री की तालिका) के 3 एमएल तैयार करें और क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं (1 एमएल) को 3 एमएल ताजा माध्यम में स्थानांतरित करें। एचईएससी को एकल कोशिकाओं में न डालें। - 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
- कोशिकाओं को अभिकर्मक ए-लेपित प्लेट में 2 एमएल अभिकर्मक बी के साथ बीज दें और प्रतिदिन 2 एमएल अभिकर्मक बी बदलें। मार्ग कोशिकाएं जब लगभग 80% कंफ्लुएंसी (आमतौर पर लगभग 4 दिन) तक पहुंचती हैं।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कम से कम आधे घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 मिलीग्राम / एमएल अभिकर्मक ए (सामग्री की तालिका) के 1 एमएल के साथ 6-वेल प्लेट के एक कुएं को कोट करें। 1x106 hESCs का एक एलिकोट पिघलें।
- दिन 0
- माध्यम I (तालिका 1) का उपयोग करके एचईएससी को एकल-सेल निलंबन से अलग करें। निम्नलिखित को मिलाकर माध्यम I तैयार करें: 20% (v/v) नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR), 0.1 mM MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (NEAA), 1 mM pyruvate, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL COCO, 100 U/mL पेनिसिलिन, 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (PS), 0.1 mM β-mercaptothanol, और ग्लासगो का ईगल का न्यूनतम आवश्यक माध्यम (GMEM)।
नोट: पृथक्करण की शुरुआत से पहले, मध्यम I तैयार करें और 1.5 एमएल ट्यूब में 20 μM Y-27632 के साथ 12 mL माध्यम I को 10 सेमी पेट्री डिश, 500 μL अभिकर्मक C (सामग्री की तालिका) में स्थानांतरित करें जिसमें अभिकर्मक D (सामग्री तालिका) और 20 μM Y-27632 होते हैं। उपरोक्त चरणों को अंधेरे में निष्पादित करें, क्योंकि माध्यम I में घटक IWR1e प्रकाश-संवेदनशील है। - एचईएससी को पहले से गर्म 1एक्स डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) बफर के साथ धोएं।
- तैयार 500 μL अभिकर्मक (1.5 mL में) ट्यूब जोड़ें और 37 °C और 5%CO2 पर 3.5 मिनट के लिए hESCs को इनक्यूबेट करें।
- प्लेट के किनारे और नीचे को कुछ सेकंड के लिए फ्लिक करके कोशिकाओं को अलग करें और पेट्री डिश से तैयार माध्यम I के 500 μL को एचईएससी प्लेट में जोड़ें।
नोट: 1x DPBS के 900 μL के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें और सेल गिनती के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें। - कोशिकाओं को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में काटें और सेल निलंबन को ऊपर और नीचे करें और फिर ट्यूब से 100 μL निकालें और फिर सेल गिनती के लिए डीपीबीएस के 900 μL के साथ ट्यूब में जोड़ें।
- बाएं 900 μL सेल निलंबन को फैलाएं और फिर पेट्री डिश में तैयार माध्यम I के साथ कोशिकाओं को 9 x 104 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
नोट: माध्यम की पूरी मात्रा 12 एमएल है; 1.08 x 10 कुल में6 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। - एक गैर-अनुयायी, वी-बॉटम, 96-वेल प्लेट (सामग्री की तालिका) के प्रत्येक कुएं में 100 μL सेल निलंबन जोड़ें।
नोट: समय को कम करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में एक समान सेल नंबर है। 100 μL भागों को हटाने से पहले हर बार पेट्री डिश को हिलाएं। यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाए। - हल्के से 96-वेल प्लेट को 5 मिनट के लिए कम गति वाले शेकर में घुमाएं और फिर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
नोट: प्लेट को अंधेरे में रखें। दिन को दिन 0 के रूप में सेट करें।
- माध्यम I (तालिका 1) का उपयोग करके एचईएससी को एकल-सेल निलंबन से अलग करें। निम्नलिखित को मिलाकर माध्यम I तैयार करें: 20% (v/v) नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR), 0.1 mM MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (NEAA), 1 mM pyruvate, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL COCO, 100 U/mL पेनिसिलिन, 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (PS), 0.1 mM β-mercaptothanol, और ग्लासगो का ईगल का न्यूनतम आवश्यक माध्यम (GMEM)।
- दिन 2
- 1% अभिकर्मक ए (सामग्री की तालिका) जोड़ें। माध्यम I के 2 एमएल में अभिकर्मक A के 133.4 μL जोड़कर अभिकर्मक A (10 mg/mL की प्रोटीन सांद्रता) तैयार करें।
नोट: पूर्ण और समान पिघलने को प्राप्त करने के लिए उपयोग करने से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक ए बनाए रखें। कृपया उत्पाद की जानकारी पर ध्यान दें और अभिकर्मक ए की प्रोटीन एकाग्रता के लिए कंपनी की आधिकारिक वेबसाइट में कैटलॉग नंबर और लॉट नंबर खोजें क्योंकि अभिकर्मक ए की प्रत्येक बोतल एक अलग प्रोटीन एकाग्रता पर है। यदि प्रोटीन एकाग्रता कम है, तो अभिकर्मक ए की बढ़ी हुई मात्रा सहायक होगी। - प्रत्येक कुएं में तैयार अभिकर्मक ए का 20 μL जोड़ें और मृत कोशिकाओं को बिखेरने के लिए केंद्र में दो बार पिपेट करें।
नोट: ठंडी परिस्थितियों में अभिकर्मक ए और 96-वेल प्लेट बनाए रखें और बर्फ पर सभी चरणों को पूरा करें। प्लेट को अंधेरे में रखें।
- 1% अभिकर्मक ए (सामग्री की तालिका) जोड़ें। माध्यम I के 2 एमएल में अभिकर्मक A के 133.4 μL जोड़कर अभिकर्मक A (10 mg/mL की प्रोटीन सांद्रता) तैयार करें।
- दिन 2-12
- 96-वेल प्लेट के निचले हिस्से को साफ करें और 6 वें दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। 6 वें दिन, प्रत्येक कुएं से माध्यम के 58 μL को हटाकर और माध्यम I के 60 μL जोड़कर माध्यम के आधे हिस्से को बदलें।
नोट: आधे मध्यम परिवर्तन को पूरा करने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को धीरे से संचालित करें कि कुएं से कोई सेल छर्रों को नहीं हटाया जाता है। माध्यम को एक साफ 10 सेमी पेट्री डिश में मिलाएं। यदि अंदर सेल छर्रों हैं, तो उन्हें 96-वेल प्लेट में वापस जोड़ें।
- 96-वेल प्लेट के निचले हिस्से को साफ करें और 6 वें दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। 6 वें दिन, प्रत्येक कुएं से माध्यम के 58 μL को हटाकर और माध्यम I के 60 μL जोड़कर माध्यम के आधे हिस्से को बदलें।
- दिन 12- 18
- 12 वें दिन मध्यम से मध्यम II (तालिका 1) में परिवर्तन करें। निम्नलिखित को मिलाकर 1% (वी / वी) अभिकर्मक ए का उपयोग करके मध्यम II तैयार करें: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 0.1 एमएम एनईएए, 1 एमएम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.1 mM β-मर्काप्टोएथेनॉल, 100 nM SAG डाइहाइड्रोक्लोराइड और जीएमईएम। इसे ठंडी और अंधेरी परिस्थितियों में स्टोर करें।
- सेल छर्रों को 96-वेल प्लेट से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में काटें और छर्रों को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्वाभाविक रूप से व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
नोट: बुलबुले से बचने के लिए माध्यम और छर्रों को सतह के नीचे धीरे से हटा दें। - ऑर्गेनोइड्स की देखभाल करते हुए सुपरनैटेंट को हटा दें। सेल समुच्चय को अभिकर्मक ए के साथ 18 एमएल तैयार माध्यम II वाले 10 सेमी निलंबन डिश में स्थानांतरित करें।
नोट: तैयार माध्यम II को पहले से 10 सेमी डिश में न जोड़ें, क्योंकि अभिकर्मक ए 4 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए। - 18 वें दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- 18 वें दिन से
- मध्यम से मध्यम III में परिवर्तित करें (तालिका 1)। निम्नलिखित को मिलाकर अंधेरे परिस्थितियों में मध्यम III तैयार करें: 10% एफबीएस, 1xसप्लीमेंट 1, 0.5 μM रेटिनोइक एसिड (आरए), 100 μM टॉरिन, 100 U/ mL पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन और Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM)/पोषक तत्व F-12 का 1: 1 मिश्रण।
- 18 वें दिन, जब एक अर्धपारदर्शी ऑप्टिक पुटिका उत्पन्न होती है, तो माइक्रोसर्जिकल चाकू का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स को काट लें।
नोट: ऑर्गेनॉइड को, आमतौर पर चार टुकड़ों में, मध्यम II के साथ पेट्री डिश में छोड़ दें। प्रत्येक टुकड़ा अगले हफ्तों में एक बरकरार ऑप्टिक कप में विकसित होना चाहिए। - पकवान के केंद्र में सभी छर्रों को एकत्रित करें। कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार फाल्कन ट्यूब में काटें और प्राकृतिक निपटान की अनुमति दें। फिर धीरे से सुपरनैटेंट को हटा दें।
नोट: उनके आकार के कारण, ऑर्गेनोइड्स को पेट्री डिश को एक दिशा में क्षैतिज विमान पर 90 डिग्री के लिए कुछ बार घुमाकर केंद्र में एकत्रित किया जा सकता है। - प्रति डिश 18 एमएल मध्यम III के साथ दो 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में छर्रों को निलंबित और फैलाएं, और सेल एकत्रीकरण से बचने के लिए धीरे से व्यंजनों को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। मध्यम III में 37 डिग्री सेल्सियस और 5%CO2 पर संवर्धन जारी रखें और साप्ताहिक माध्यम को बदलें। सीआरएक्स 45 वें दिन के बाद और 120 वें दिन तक व्यक्त किया गया था, हम फोटोरिसेप्टर के आउट-सेगमेंट का पता लगा सकते थे।
2. मानव आरओ का विश्लेषण
- FACS विश्लेषण
- कट 1 एमएल युक्तियों का उपयोग करके व्यंजनों से तीन सीआरएक्स-टीडीटोमेटो और तीन एच 9 ईएस-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स इकट्ठा करें। ऑर्गेनोइड्स को 1 एमएल प्री-वार्मेड (कमरे के तापमान) डीपीबीएस के साथ धोएं।
- अभिकर्मक डी के 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान को 0.05 मिलीग्राम / एमएल के साथ मिलाकर पाचन बफर तैयार करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए तैयार पाचन बफर का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स को एकल कोशिकाओं में अलग करें। फिर प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करने के लिए 10% एफबीएस और 0.05 मिलीग्राम / एमएल अभिकर्मक डी के साथ डीपीबीएस की समान मात्रा जोड़ें।
- कोशिकाओं को हल्के से निलंबित और बिखेरें और फिर 100 μm सेल छन्नी का उपयोग करके फ़िल्टर करें और CRX-tdTomato सकारात्मक संकेतों का विश्लेषण करने के लिए 561 nm उत्तेजना लेजर लाइन और 780/60 फ़िल्टर पर फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) प्रणाली का उपयोग करें।
नोट: सीआरएक्स शुरू में 45 वें दिन व्यक्त होता है और ऑर्गेनोइड्स की परिपक्वता के साथ बढ़ता है। प्रत्येक परीक्षण के लिए दस हजार कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए, कम से कम तीन दोहराव पूरे होते हैं।
- आरओ की प्रतिदीप्ति तीव्रता परिमाणीकरण
- इमेजिंग के लिए यादृच्छिक रूप से व्यवहार्य ऑर्गेनोइड तैयार करें।
नोट: पैरामीटर सेट करें और सभी प्रतिदीप्ति तीव्रता मॉनिटर के लिए समान फिल्टर और पैरामीटर का उपयोग करें। - छवियों को कैप्चर करें और उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे, इमेजजे) का उपयोग करके औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करें।
- छवियों को आयात करें और फिर छवि | का उपयोग करके 8-बिट में कनवर्ट करें प्रकार.
- छवि | द्वारा डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग कर के सीमा समायोजित करें | समायोजित करें दहलीज.
- मापा क्षेत्र निर्धारित करें और फिर विश्लेषण का उपयोग करके ग्रे मान का मूल्यांकन करें | माप.
नोट: परिणाम पैनल में माध्य मान मापा क्षेत्र की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता हैं।
- इमेजिंग के लिए यादृच्छिक रूप से व्यवहार्य ऑर्गेनोइड तैयार करें।
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Representative Results
योजनाबद्ध चित्रण सीओसीओ (चित्रा 1) के साथ अग्रदूत कोशिकाओं को बेहतर बनाने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल को दर्शाता है। पीएससी से लेकर आरओ तक, कई विवरण परिणाम भिन्नताओं का कारण बन सकते हैं। पूरी प्रक्रिया को ट्रैक करने के लिए हर चरण और यहां तक कि कैटलॉग नंबर और हर माध्यम की बहुत संख्या रिकॉर्ड करने की सिफारिश की जाती है।
यहां, हम 6, 12, 18 और 45 दिनों के लिए उज्ज्वल क्षेत्र छवियां प्रदान करते हैं (चित्रा 2)। दिन 6 पर, ऑर्गेनोइड्स आमतौर पर 96-वेल प्लेट में व्यास में लगभग 600 μm होते हैं, जिसमें अंदर घने कनेक्शन और उज्ज्वल रिम होते हैं (चित्रा 2 ए)। दिन 12 पर, ऑप्टिक पुटिका जैसी संरचनाएं शुरू में उत्पन्न होती हैं (चित्रा 2 बी)। दिन 12 से दिन 18 तक, ऑप्टिक पुटिका संरचनाओं की उपस्थिति स्पष्ट है, और वे 18 वें दिन के बाद बढ़ते रहे। पुटिका जैसी वास्तुकला के बिना ऑर्गेनोइड्स को छोड़ दिया जाता है (चित्रा 2 सी)। दिन 30 तक, पुटिका जैसी वास्तुकला अधिक स्पष्ट है, और बेहतर आरओ को हीन लोगों से अलग करना आसान है (चित्रा 2 डी-ई)। पारभासी संरचना (चित्रा 2 डी-ई में तारांकन) खोने वाले ऑर्गेनोइड्स को अगले दिनों में हटा दिया जाना चाहिए।
ऑर्गेनोइडसीआरएक्स को व्यक्त करते हैं, जो 45 वें दिन से फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों का एक मार्कर है (चित्रा 2 एफ, 2 आई)। अन्य फोटोरिसेप्टर अग्रदूत मार्कर, जैसे कि आरसीवीआरएन और ओटीएक्स 2, भी 45 वें दिन (चित्रा 2 जी-एच) में सकारात्मक रूप से पाए गए थे। सीओसीओ के अतिरिक्त फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों की पीढ़ी को बढ़ावा देता है।
चित्र 1. एचईएससी से आरओ भेदभाव के लिए चरणबद्ध उपचार के लिए समय सारिणी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2. मानव रेटिना ऑर्गेनॉइड पीढ़ी। (A-B) प्रारंभिक चरण ऑप्टिक पुटिका जैसी संरचना 96-वेल प्लेट में बनती है। काले तीर ऑप्टिक पुटिका जैसी संरचनाओं को इंगित करते हैं। (सी) 18 वें दिन पेट्री डिश में निलंबन संस्कृति का पहला दिन। (डी-ई) ऑप्टिक कप संरचनाएं इस स्तर पर देखी जाती हैं। तारे अवर ऑर्गेनोइड्स (एफ) 45 वें दिन उज्ज्वल क्षेत्र छवि दिखाते हैं। स्केल बार = 400 μm. (G-H) 45 वें दिन RCVRN (G) और OTX2 (H) के इम्यूनोस्टेनिंग परिणाम। स्केल सलाखों = 50 μm. (I) TdTomato-सकारात्मक संकेत (F) में 45 वें दिन CRX की अभिव्यक्ति को इंगित करते हैं। स्केल पट्टियाँ = 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| मध्यम I (50 mL) | ||||||||
| KSR | G-MEM | एनईएए | Pyruvate | b-ME | IWR1e | कोको | पुनश्च | |
| प्रतिशत % या अंतिम एकाग्रता | 20 | 78 | 0.1 mM | 1 mM | 0.1 mM | 3 μM | 30 ng/ | 1 |
| आयतन | 10 mL | 39 mL | 0.5 mL | 0.5 mL | 90.9 μL | 5 μL | 10 μL | 0.5 mL |
| IWR1e की स्टोर एकाग्रता 30 mM है। COCO 150 μg / mL है। | ||||||||
| मध्यम II (50 mL) | ||||||||
| FBS | G-MEM | एनईएए | Pyruvate | b-ME | झुकना | पुनश्च | ||
| प्रतिशत % या अंतिम एकाग्रता | 10 | 88 | 0.1 mM | 1 mM | 0.1 mM | 100 nM | 1 | |
| आयतन | 5 mL | 44 mL | 0.5 mL | 0.5 mL | 90.9 μL | 2.5 μL | 0.5 mL | |
| एसएजी की स्टोर एकाग्रता 2 एमएम है। | ||||||||
| मध्यम III (50 एमएल) | ||||||||
| FBS | DMEM/F12- ग्लूटामैक्स | पूरक 1 | रा | टॉरिन | पुनश्च | |||
| प्रतिशत % या अंतिम एकाग्रता | 10 | 88 | 1 | 0.5 μM | 100 μM | 1 | ||
| आयतन | 5 mL | 44 mL | 0.5 mL | 5 μL | 50 μL | 0.5 mL | ||
| आरए की स्टोर एकाग्रता 5 एमएम है, और टॉरिन 100 एमएम है। | ||||||||
तालिका 1: मध्यम I, II, और II व्यंजनों
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Discussion
रेटिना ऑर्गेनॉइड भेदभाव पर्याप्त कार्यात्मक रेटिना कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक वांछनीय विधि है। आरओ विभिन्न रेटिना कोशिकाओं का एक समग्र है, जैसे कि गैंग्लियन कोशिकाएं, द्विध्रुवी कोशिकाएं और फोटोरिसेप्टर, जो तंत्रिका रेटिना 4,5,8,9 की ओर प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न होते हैं। यद्यपि कंफ्लुएंट आरओ की कटाई की जा सकती है, यह समय लेने वाली है, जिसके लिए लंबी संवर्धन अवधि (180 दिनों तक) की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, फोटोरिसेप्टर प्रत्यारोपण के लिए, या शंकु-रॉड या रॉड-शंकु डिस्ट्रॉफी का अध्ययन करने के लिए, 3 डी संवर्धन प्रणाली10 में फोटोरिसेप्टर का अपेक्षाकृत उच्च प्रतिशत प्राप्त करना फायदेमंद है।
सामान्य विकास प्रक्रियाओं को बाधित किए बिना ऑर्गेनोइड्स के विकास की निगरानी करना भी चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, हमने सीआरएक्स, एक शंकु-रॉड होमोबॉक्स प्रोटीन का उपयोग किया, जो मुख्य रूप से फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों में व्यक्त किया जाता है, उनके 3 डी भेदभाव के दौरान फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक लक्ष्य जीन के रूप में। टीडीटोमेटो प्रणाली के साथ, सीआरएक्स-व्यक्त कोशिकाओं को उनके 3 डी भेदभाव के दौरान रेटिनाकरण को बाधित किए बिना लाल प्रतिदीप्ति द्वारा अस्थायी रूप से ट्रैक किया जा सकता है। सीआरएक्स-टीडीटोमेटो सिस्टम का उपयोग आरओ में फोटोरिसेप्टर अग्रदूत भेदभाव के लिए दवा स्क्रीनिंग की प्रक्रिया को तेज कर सकता है।
हमारी विधि का उपयोग करके, लगभग 70% ऑर्गेनोइड रेटिना ऑर्गेनोइड्स में विकसित हो सकते हैं, जो पुटिका जैसी संरचनाओं को प्रदर्शित करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, बेहतर ऑर्गेनोइड्स के चीरे के साथ, हम आमतौर पर 96-वेल प्लेट से लगभग 100 रेटिना ऑर्गेनोइड्स की कटाई कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सीओसीओ संस्कृति के साथ आरओ परिपक्वता के प्रारंभिक चरण में प्रचुर मात्रा में फोटोरिसेप्टर अग्रदूत उत्पन्न होते हैं, जो मार्ग विनियमन11,12 के माध्यम से कुछ कोशिकाओं के प्रत्यक्ष भेदभाव की ओर प्रगति में मदद करता है। अभिकर्मक ए की प्रोटीन एकाग्रता भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। कुल मिलाकर, शुरुआती दिनों में समुच्चय के साथ पर्याप्त अभिकर्मक ए के साथ-साथ 18 वें दिन ऑर्गेनोइड्स की कटाई उच्च गुणवत्ता वाले प्रचुर आरओ की कटाई के लिए महत्वपूर्ण है। यह विधि 3 डी ऑर्गेनोइड्स में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के दिशात्मक भेदभाव के विकास को भी बढ़ावा देती है और फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण में योगदान देती है।
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Acknowledgments
हम पांडुलिपि के बारे में उनके तकनीकी समर्थन और सहायक टिप्पणियों के लिए 502 प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। यह काम आंशिक रूप से बीजिंग म्यूनिसिपल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (जेड 200014) और चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2017वाईएफए0105300) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
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