Summary
자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.
Abstract
망막 세포 이식은 망막 구조를 복원하고 퇴화 된 망막의 시각 능력을 안정화 시키거나 향상시킬 수있는 유망한 치료 접근법입니다. 그럼에도 불구하고 세포 대체 요법의 발전은 현재 고품질의 표준화 된 인간 망막의 기성품 공급원을 요구하는 문제에 직면 해 있습니다. 따라서 실험을 위해서는 쉽고 안정적인 프로토콜이 필요합니다. 여기에서 우리는 외인성 분자와 시약 A를 사용하는 자가 조직화 방법과 3차원 인간 망막 오가노이드(RO)를 생성하기 위한 수동 절제를 기반으로 최적화된 프로토콜을 개발합니다. 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 유래 RO는 광 수용체에 대한 특정 마커를 발현합니다. 다기능 길항제 인 COCO를 첨가하면 광 수용체 전구체 및 원뿔의 분화 효율이 크게 증가합니다. 세포주와 일차 세포의 이점이 있고 후자와 관련된 소싱 문제 없이 이 시스템을 효율적으로 사용하면 합류성 망막 세포, 특히 광수용체를 생성할 수 있습니다. 따라서, RO로의 PSC의 분화는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 이식을 위한 최적의 생체관련성 플랫폼을 제공한다.
Introduction
만능 줄기 세포 (PSC)는자가 재생과 모든 종류의 체세포로 분화하는 능력이 특징입니다. 따라서 PSC에서 파생된 오가노이드는 재생 의학 연구에서 중요한 자원이 되었습니다. 망막 변성은 광 수용체 (막대 및 원뿔)와 망막 색소 상피의 손실을 특징으로합니다. 망막 세포 대체는이 질병에 대한 고무적인 치료법이 될 수 있습니다. 그러나 질병 연구 및 치료를 위해 인간 망막을 얻는 것은 불가능합니다. 따라서 다층 천연 망막 세포를 효과적이고 성공적으로 재현하는 PSC에서 파생된 망막 오가노이드(RO)는 기초 및 중개 연구에 유익합니다1,2,3. 우리의 연구는 망막 변성4를 연구하기에 충분하고 양질의 세포를 제공하기 위해 RO 분화에 중점을 둡니다.
RO를 차별화하는 방법은 2012 년 Sasai 실험실에서 개척 한 3 차원 (3D) 서스펜션 차별화와 함께 지속적으로 등장하고 있습니다5. 광수용체 전구체 세포를 특이적으로 추적하기 위해 인간 배아 줄기세포(hESC)에 CRX-tdTomato 태그를 도입하고 Wnt, TGF-β 및 BMP 경로6의 다기능 길항제인 COCO를 추가하여 방법을 수정했습니다. COCO는 광수용체 전구체 및 원뿔 6,7의 분화 효율을 효율적으로 향상시키는 것으로 나타났습니다.
전체적으로 고전적인 분화 방법을 수정함으로써 실험실 조사를 통해 광 수용체와 관련된 망막 질환을 분석하고 추가 임상 적용 / 이식을 위해 인간 RO에서 풍부한 광 수용체 전구체 및 원뿔을 수확하는 접근 가능한 프로토콜을 개발했습니다.
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Protocol
이 연구는 수도 의과 대학 베이징 퉁렌 병원의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. H9 hESC는 WiCell 연구소에서 얻었으며 td토마토 태그가 부착된 세포주로 유전자 조작되었습니다.
1. 인간 RO의 생성
- 피더가 없는 조건에서 hESC를 배양합니다.
- 6웰 플레이트의 한 웰을 1mL의 0.1mg/mL 시약 A(재료 표)로 37°C에서 제조업체의 지침에 따라 최소 30분 동안 코팅합니다. 1x106 hESC의 분취량을 해동합니다.
참고: 예열된 시약 B 3mL(재료 표)를 준비하고 냉동 보존 세포(1mL)를 3mL의 새 배지로 옮깁니다. hESC를 단일 세포에 피펫팅하지 마십시오. - 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다.
- 시약 B 2mL가 포함된 시약 A 코팅 플레이트에 세포를 시둡고 매일 시약 B 2mL를 교체합니다. 패시지 세포는 대략 80 % 컨플루언시 (보통 약 4 일)에 도달합니다.
- 6웰 플레이트의 한 웰을 1mL의 0.1mg/mL 시약 A(재료 표)로 37°C에서 제조업체의 지침에 따라 최소 30분 동안 코팅합니다. 1x106 hESC의 분취량을 해동합니다.
- 0 일째
- 배지 I을 사용하여 hESC를 단일 세포 현탁액에 해리시킵니다(표 1). 20 % (v / v) 녹아웃 혈청 대체 (KSR), 0.1 mM MEM 비 필수 아미노산 용액 (NEAA), 1 mM 피루 베이트, 3 μM IWR-1- 엔도 (IWR1e), 30 ng / mL COCO, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신 (PS), 0.1 mM β- 메르 캅토 에탄올 및 글래스고 이글 최소 필수 배지 (GMEM).
참고: 해리를 시작하기 전에 배지 I을 준비하고 20μM Y-27632가 포함된 배지 I 12mL를 10cm 페트리 접시, 0.05mg/mL의 시약 D(재료 표) 및 20μM Y-27632가 포함된 시약 C(재료 표) 500μL를 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 매체 I의 성분 IWR1e는 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 위의 단계를 수행하십시오. - 예열된 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 완충액으로 hESC를 세척합니다.
- 준비된 500 μL 시약 (1.5 mL 내에)을 첨가하고 37 °C 및 5 %CO2에서 3.5 분 동안 hESCs를 배양한다.
- 플레이트의 측면과 바닥을 몇 초 동안 튕겨서 세포를 분리하고 페트리 접시로부터 준비된 배지 I 500μL를 hESC 플레이트에 첨가한다.
참고: 900μL의 1x DPBS가 포함된 1.5mL 튜브를 준비하고 세포 계수를 위해 혈구계를 사용합니다. - 새로운 1.5mL 튜브에서 세포를 수확하고 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅한 다음 튜브에서 100μL를 꺼낸 다음 세포 계수를 위해 900μL의 DPBS와 함께 튜브에 추가합니다.
- 남은 900 μL 세포 현탁액을 분산시킨 다음, 준비된 배지 I로 세포를 페트리 접시에 9 x 104 cells/mL로 희석한다.
참고: 배지의 전체 부피는 12mL입니다. 1.08 x 10 총6 개의 셀이 필요합니다. - 100μL의 세포 현탁액을 비부착성 V 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다(재료 표).
알림: 멀티채널 피펫을 사용하여 시간을 단축하고 각 웰에 동일한 셀 번호가 포함되어 있는지 확인하십시오. 100 μL 부분을 제거하기 전에 매번 페트리 접시를 흔든다. 세포가 균일하게 분포되는 것이 중요합니다. - 저속 쉐이커에서 96웰 플레이트를 5분 동안 가볍게 스핀다운한 다음 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.
알림: 접시를 어두운 곳에 보관하십시오. 날짜를 0일로 설정합니다.
- 배지 I을 사용하여 hESC를 단일 세포 현탁액에 해리시킵니다(표 1). 20 % (v / v) 녹아웃 혈청 대체 (KSR), 0.1 mM MEM 비 필수 아미노산 용액 (NEAA), 1 mM 피루 베이트, 3 μM IWR-1- 엔도 (IWR1e), 30 ng / mL COCO, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신 (PS), 0.1 mM β- 메르 캅토 에탄올 및 글래스고 이글 최소 필수 배지 (GMEM).
- 2일차
- 1 % 시약 A (재료 표)를 첨가하십시오. 2mL의 배지 I에 133.4μL의 시약 A를 첨가하여 시약 A(단백질 농도 10mg/mL)를 준비합니다.
참고: 완전하고 균일한 용융을 달성하기 위해 사용하기 전에 시약 A를 밤새 4°C로 유지하십시오. 제품 정보를 확인하고 회사 공식 웹 사이트의 카탈로그 번호와 로트 번호를 검색하여 시약 A의 각 병이 다른 단백질 농도에 있기 때문에 시약 A의 단백질 농도를 확인하십시오. 단백질 농도가 낮으면 시약 A의 부피를 늘리는 것이 도움이 될 것입니다. - 준비된 시약 A 20μL를 각 웰에 넣고 중앙에 2회 피펫팅하여 죽은 세포를 분산시킵니다.
알림: 시약 A와 96웰 플레이트를 서늘한 상태로 유지하고 얼음 위에서 모든 단계를 완료하십시오. 접시를 어두운 곳에 두십시오.
- 1 % 시약 A (재료 표)를 첨가하십시오. 2mL의 배지 I에 133.4μL의 시약 A를 첨가하여 시약 A(단백질 농도 10mg/mL)를 준비합니다.
- 2-12 일
- 96-웰 플레이트의 바닥을 세척하고 6일째까지 37°C 및 5%CO2 에서 배양한다. 6일째에 각 웰에서 배지 58μL를 제거하고 배지 I 60μL를 추가하여 배지의 절반을 변경합니다.
알림: 멀티채널 피펫을 사용하여 중간 절반 교체를 완료합니다. 이 단계를 부드럽게 수행하여 웰에서 세포 펠릿이 제거되지 않도록 합니다. 매체를 깨끗한 10cm 페트리 접시에 흡인합니다. 내부에 셀 펠릿이 있으면 96웰 플레이트에 다시 추가합니다.
- 96-웰 플레이트의 바닥을 세척하고 6일째까지 37°C 및 5%CO2 에서 배양한다. 6일째에 각 웰에서 배지 58μL를 제거하고 배지 I 60μL를 추가하여 배지의 절반을 변경합니다.
- 12-18 일
- 12일째에 배지를 배지 II(표 1)로 변경합니다. 10% 태아 소 혈청(FBS), 0.1mM NEAA, 1mM 피루브산염, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 0.1mM β-메르캅토에탄올, 100nM SAG 디하이드로클로라이드 및 GMEM을 혼합하여 1%(v/v) 시약 A를 사용하여 배지 II를 준비합니다. 서늘하고 어두운 곳에서 보관하십시오.
- 96웰 플레이트에서 15mL 원뿔형 튜브에 있는 세포 펠릿을 수확하고 펠릿이 실온에서 5분 동안 자연적으로 가라앉도록 합니다.
알림: 기포를 피하기 위해 표면 아래의 매체와 펠릿을 부드럽게 제거하십시오. - 유기체를 관리하는 동안 상청액을 제거하십시오. 세포 응집체를 시약 A와 함께 준비된 배지 II 18mL가 들어 있는 10cm 현탁액 접시에 옮깁니다.
알림: 시약 A는 10°C에 있어야 하므로 준비된 배지 II를 4cm 접시에 미리 추가하지 마십시오. - 18일까지 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다.
- 18일차부터
- 배지를 중간 III으로 변경합니다(표 1). 10% FBS, 1xsupplement 1, 0.5μM 레티노산(RA), 100μM 타우린, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 둘베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)/영양소 혼합물 F-12의 1:1 혼합물을 혼합하여 어두운 조건에서 배지 III을 준비합니다.
- 18일째에 반투명 시신경 소포가 생성되면 미세 수술 칼을 사용하여 오가노이드를 절단합니다.
참고: 중간 II가 있는 페트리 접시에 유기체를 일반적으로 4개로 쪼릅니다. 각 조각은 다음 주에 손상되지 않은 광학 컵으로 성장해야 합니다. - 모든 펠릿을 접시 중앙에 모으십시오. 세포를 15mL 원뿔형 팔콘 튜브에 수확하고 자연 침전을 허용합니다. 그런 다음 상층액을 부드럽게 제거하십시오.
알림: 크기 때문에 오가노이드는 페트리 접시를 수평면에서 90° 동안 한 방향으로 몇 번 회전하여 중앙에서 응집할 수 있습니다. - 접시당 배지 III 18mL와 함께 두 개의 10cm 페트리 접시에 펠릿을 현탁하고 분산시키고 세포 응집을 방지하기 위해 접시를 인큐베이터로 부드럽게 옮깁니다. 배지 III에서 37°C 및 5%CO2 에서 배양을 계속하고 배지를 매주 교체한다. 발현된 CRX는 45일 이후 및 120일까지, 우리는 광수용체의 아웃세그먼트를 검출할 수 있었다.
2. 인간 RO 분석
- FACS 분석
- 절단된 1mL 팁을 사용하여 접시에서 3개의 CRX-tdTomato와 3개의 H9 ES 유래 오가노이드를 조립합니다. 1mL의 예열된(실온) DPBS로 오가노이드를 세척합니다.
- 0.25% 트립신-EDTA 용액과 0.05mg/mL의 시약 D를 혼합하여 분해 완충액을 준비합니다.
- 제조된 소화 완충액을 사용하여 37°C에서 8분 동안 오가노이드를 단일 세포로 해리시킨다. 그런 다음 동일한 부피의 DPBS를 10% FBS 및 0.05mg/mL의 시약 D와 함께 추가하여 반응을 비활성화합니다.
- 세포를 가볍게 현탁 및 산란시킨 다음 100μm 세포 스트레이너를 사용하여 필터링하고 561nm 여기 레이저 라인 및 780/60 필터에서 형광 활성화 세포 분류(FACS) 시스템을 사용하여 CRX-tdTomato 양성 신호를 분석합니다.
참고: CRX는 처음에 45일에 발현되며 오가노이드의 성숙과 함께 증가합니다. 각 테스트에는 1 만 개의 셀이 사용되며 각 시점마다 최소 3 회 반복이 완료됩니다.
- RO의 형광 강도 정량화
- 이미징을 위해 실행 가능한 유기체를 무작위로 준비합니다.
참고: 파라미터를 설정하고 모든 형광 강도 모니터에 동일한 필터와 파라미터를 사용합니다. - 이미지를 캡처하고 적절한 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 평균 형광 강도를 분석합니다.
- 이미지를 가져온 다음 이미지 | 사용하여 8 비트로 변환 유형.
- 이미지 |의 기본 매개 변수를 사용하여 임계값 조정 | 조정 임계값.
- 측정된 영역을 결정한 다음 분석 | 사용하여 회색 값을 평가합니다. 측정.
참고: 결과 패널의 평균값은 측정된 영역의 평균 형광 강도입니다.
- 이미징을 위해 실행 가능한 유기체를 무작위로 준비합니다.
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Representative Results
개략도는 COCO로 전구체 세포를 개선하기 위한 분화 프로토콜을 보여줍니다(그림 1). PSC에서 RO에 이르기까지 수많은 세부 사항으로 인해 결과 변동이 발생할 수 있습니다. 전체 절차를 추적하기 위해 모든 단계와 모든 매체의 카탈로그 번호 및 로트 번호를 기록하는 것이 좋습니다.
여기에서는 6일, 12일, 18일 및 45일에 대한 명시야 이미지를 제공합니다(그림 2). 6일째에 오가노이드는 일반적으로 96웰 플레이트에서 직경이 약 600μm이며 내부에 조밀한 연결과 밝은 테두리가 있습니다(그림 2A). 12일째에, 시신경 소포-유사 구조가 초기에 생성된다(도 2B). 12 일부터 18 일까지 시신경 소포 구조의 존재는 분명하며 18 일 이후에도 계속 성장했습니다. 소포형 아키텍처가 없는 오가노이드는 폐기됩니다(그림 2C). 30 일째에는 소포와 같은 아키텍처가 더 분명 해지고 우수한 RO와 열등한 RO를 구별하기가 더 쉽습니다 (그림 2D-E). 반투명 구조를 잃은 유기체(그림 2D-E의 별표)는 다음 날에 제거해야 합니다.
오가노이드는 45일부터 광수용체 전구체의 마커인 CRX를 발현합니다(그림 2F,2I). RCVRN 및 OTX2와 같은 다른 광수용체 전구체 마커도 45일째에 양성으로 검출되었습니다(그림 2G-H). COCO의 첨가는 광 수용체 전구체의 생성을 촉진합니다.
그림 1. hESC에서 RO 차별화를 위한 단계적 처리를 위한 시간표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 인간 망막 오가노이드 생성. (A-B) 초기 단계의 광학 소포 형 구조는 96 웰 플레이트에 형성되었습니다. 검은 색 화살표는 시신경 소포와 같은 구조를 나타냅니다. (C) 18일째에 페트리 접시에서 현탁 배양의 첫날. (D-E) 이 단계에서 광학 컵 구조가 관찰됩니다. 별은 열등한 유기체 (F) 45 일째의 명시야 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 = 400 μm. (G-H) 45일째에 RCVRN(G) 및 OTX2(H)의 면역염색 결과. 스케일 바 = 50 μm. (I) Td토마토 양성 신호는 (F)에서 45일째에 CRX의 발현을 나타낸다. 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 배지 I (50 mL) | ||||||||
| 증권 시세 표시기 | 지엠엠 | 네아 | 피루브산 | 비미 | IWR1e | 코코야자 | 추신 | |
| 백분율 % 또는 최종 농도 | 20 | 78 | 0.1 밀리미터 | 1 밀리미터 | 0.1 밀리미터 | 3 마이크로미터 | 30 응/밀리람베르트 | 1 |
| 음량 | 10 밀리리터 | 39 밀리리터 | 0.5 밀리리터 | 0.5 밀리리터 | 90.9 μL | 5 μL | 10 μL | 0.5 밀리리터 |
| IWR1e의 저장 농도는 30mM입니다. 코코는 150 μg / mL입니다. | ||||||||
| 중간 II (50 mL) | ||||||||
| 증권 시세 표시기 | 지엠엠 | 네아 | 피루브산 | 비미 | 처짐 | 추신 | ||
| 백분율 % 또는 최종 농도 | 10 | 88 | 0.1 밀리미터 | 1 밀리미터 | 0.1 밀리미터 | 100 nM | 1 | |
| 음량 | 5 밀리리터 | 44 밀리리터 | 0.5 밀리리터 | 0.5 밀리리터 | 90.9 μL | 2.5 μL | 0.5 밀리리터 | |
| SAG의 저장 농도는 2mM입니다. | ||||||||
| 배지 III (50 mL) | ||||||||
| 증권 시세 표시기 | DMEM / F12- 글루타맥스 | 부록 1 | ᄏᄏ�� | 황소자리 | 추신 | |||
| 백분율 % 또는 최종 농도 | 10 | 88 | 1 | 0.5 마이크로미터 | 100 마이크로미터 | 1 | ||
| 음량 | 5 밀리리터 | 44 밀리리터 | 0.5 밀리리터 | 5 μL | 50 μL | 0.5 밀리리터 | ||
| RA의 저장 농도는 5 mM이고, 타우린은 100 mM이다. | ||||||||
표 1: 배지 I, II 및 II 레시피
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Discussion
망막 오가노이드 분화는 충분한 기능성 망막 세포의 생성을 위한 바람직한 방법이다. RO는 신경절 세포, 양극성 세포 및 광 수용체와 같은 다양한 망막 세포의 복합체로, 신경 망막 4,5,8,9쪽으로 다 능성 줄기 세포에 의해 생성됩니다. 합류 RO를 수확할 수 있지만 시간이 많이 걸리므로 긴 배양 기간(최대 180일)이 필요할 수 있습니다. 그러나, 광수용체 이식, 또는 콘-로드 또는 로드-콘 이영양증을 연구하기 위해, 3D 배양 시스템(10)에서 비교적 높은 비율의 광수용체를 수득하는 것이 유리하다.
또한 정상적인 발달 과정을 방해하지 않고 오가노이드의 발달을 모니터링하는 것도 어렵습니다. 따라서 우리는 주로 광수용체 전구체에서 발현되는 원뿔 막대 호메오박스 단백질인 CRX를 3D 분화 동안 광수용체 전구체 세포를 추적하기 위한 표적 유전자로 사용했습니다. tdTomato 시스템을 사용하면 CRX 발현 세포가 3D 분화 중에 망막화를 방해하지 않고 적색 형광으로 시공간적으로 추적할 수 있습니다. CRX-tdTomato 시스템의 활용은 RO에서 광수용체 전구체 분화를 위한 약물 스크리닝 프로세스를 가속화할 수 있습니다.
우리의 방법을 사용하면 약 70 %의 유기체가 소포와 같은 구조를 나타내는 망막 유기체로 발전 할 수 있습니다. 중요한 것은 우수한 오가노이드를 절개하면 일반적으로 100웰 플레이트에서 약 96개의 망막 오가노이드를 수확할 수 있다는 것입니다. 또한, 풍부한 광 수용체 전구체는 COCO 배양과 함께 RO 성숙의 초기 단계에서 생성되며, 이는 경로 조절11,12를 통해 특정 세포의 직접 분화로의 진행을 돕습니다. 시약 A의 단백질 농도는 분화에 매우 중요합니다. 전체적으로 초기에 응집체가 포함된 충분한 시약 A와 18일째에 오가노이드를 절단하는 것은 고품질의 풍부한 RO를 수확하는 데 중요합니다. 이 방법은 또한 3D 오가노이드에서 광수용체 세포의 방향성 분화 발달을 촉진하고 광수용체 세포의 이식에 기여합니다.
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Acknowledgments
원고에 대한 기술 지원과 유용한 의견을 주신 502 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
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