Summary
自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。
Abstract
網膜細胞移植は有望な治療アプローチであり、網膜構造を回復し、変性した網膜の視覚能力を安定または改善する可能性があります。それにもかかわらず、細胞補充療法の進歩は現在、高品質で標準化されたヒト網膜の既製の供給源を必要とするという課題に直面しています。したがって、実験には簡単で安定したプロトコルが必要です。ここでは、外因性分子と試薬Aを用いた自己組織化法と、3次元ヒト網膜オルガノイド(RO)を作製するための手動切除法に基づいて、最適化されたプロトコルを開発します。ヒト多能性幹細胞(PSC)由来のROは、光受容体に特異的なマーカーを発現します。多機能アンタゴニストであるCOCOを添加すると、視細胞前駆体および錐体の分化効率が大幅に向上します。細胞株と初代細胞の利点を持ち、後者に関連する調達の問題なしに、このシステムを効率的に使用することで、コンフルエントな網膜細胞、特に光受容体を生成することができます。したがって、PSCからROへの分化は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および細胞移植のための最適で生物学的に関連するプラットフォームを提供します。
Introduction
多能性幹細胞(PSC)は、自己複製とあらゆる種類の体細胞への分化能力を特徴としています。このように、PSC由来のオルガノイドは再生医療研究において重要な資源となっています。網膜変性は、光受容体(桿体および錐体)および網膜色素上皮の喪失を特徴とする。網膜細胞置換は、この病気の有望な治療法になる可能性があります。しかし、疾患の研究や治療のためにヒト網膜を入手することは現実的ではありません。したがって、多層の天然網膜細胞を効果的かつ首尾よく再現するPSC由来の網膜オルガノイド(RO)は、基礎研究およびトランスレーショナル研究に有益です1,2,3。私たちの研究は、網膜変性を研究するための十分で質の高い細胞を提供するためにRO分化に焦点を当てています4。
ROを微分する方法は絶えず出現しており、2012年に笹井研究室によって3次元(3D)懸濁液分化が開拓されました5。ヒト胚性幹細胞(hESC)にCRX-tdTomatoタグを導入して視細胞前駆細胞を特異的に追跡し、Wnt、TGF-β、およびBMP経路の多機能アンタゴニストであるCOCOを添加して方法を変更しました6。COCOは、光受容体前駆体および錐体の分化効率を効率的に改善することが示されている6、7。
全体として、古典的な分化法を変更することにより、ヒトROから豊富な光受容体前駆体および錐体を収集し、実験室での調査を通じて光受容体に関連する網膜疾患を分析し、さらなる臨床応用/移植を行うためのアクセス可能なプロトコルを開発しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究は、首都医科大学北京同仁病院の施設倫理委員会によって承認されました。H9 hESCはWiCell研究所から入手し、tdTomatoタグ付き細胞株に遺伝子操作しました。
1. ヒトROの生成
- フィーダーフリー条件下でhESCを培養します。
- 6ウェルプレートの1ウェルに1 mLの0.1 mg/mL試薬A(材料表)を37°Cでコーティングし、製造元の指示に従って少なくとも30分間コーティングします。1x106 hESCのアリコートを解凍します。
注:3 mLの予熱した試薬B(材料表)を準備し、凍結保存された細胞(1 mL)を3 mLの新しい培地に移します。hESCを単一細胞にピペッティングしないでください。 - 200 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 細胞を2 mLの試薬Bで試薬Aコーティングプレートに播種し、2 mLの試薬Bを毎日交換します。継代細胞は約80%のコンフルエントに達したとき(通常約4日)。
- 6ウェルプレートの1ウェルに1 mLの0.1 mg/mL試薬A(材料表)を37°Cでコーティングし、製造元の指示に従って少なくとも30分間コーティングします。1x106 hESCのアリコートを解凍します。
- 0日目
- 培地Iを使用してhESCを単一細胞懸濁液に解離します(表1)。20%(v/v)ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1 mMピルビン酸、3 μM IWR-1-endo(IWR1e)、30 ng/mL COCO、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン(PS)、0.1 mM β-メルカプトエタノール、およびグラスゴーのイーグル最小必須培地(GMEM)を混合して、培地Iを調製します。
注:解離を開始する前に、培地Iを調製し、20 μM Y-27632を含む12 mLの培地Iを10 cmのペトリ皿に移し、500 μLの試薬C(材料の表)0.05 mg / mLの試薬D(材料の表)と20 μM Y-27632を1.5 mLチューブに移します。上記の工程を暗所で行うと、培地中の成分IWR1eが感光性となるようにする。 - 事前に温めた1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)バッファーでhESCを洗浄します。
- 調製した500 μL試薬(1.5 mL)チューブを追加し、hESCを37°Cおよび5%CO2で3.5分間インキュベートします。
- プレートの側面と底面を数秒間フリックして細胞を剥離し、ペトリ皿から調製した培地Iを500 μLずつhESCプレートに加えます。
注:900 μLの1x DPBSを含む1.5 mLチューブを準備し、血球計算盤を使用して細胞カウントを行います。 - 新しい1.5 mLチューブで細胞を回収し、細胞懸濁液を上下にピペットで動かし、チューブから100 μLを取り出し、細胞カウントのために900 μLのDPBSを入れたチューブに加えます。
- 残った900 μLの細胞懸濁液を分散させ、ペトリ皿で調製した培地Iで細胞を9 x 104 細胞/mLに希釈します。
注:培地の全容量は12mLです。1.08 x 10 合計6 個のセルが必要です。 - 非接着性V底96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの細胞懸濁液を追加します(材料表)。
注:マルチチャンネルピペットを使用して時間を短縮し、各ウェルに同等の細胞番号が含まれていることを確認してください。100μLの部分を取り除く前に、毎回ペトリ皿を振ってください。細胞が均一に分布していることが重要です。 - 96ウェルプレートを低速シェーカーで5分間軽く回転させた後、37°C、5%CO2でインキュベートします。
注意: プレートを暗所に保管してください。曜日を 0 日目に設定します。
- 培地Iを使用してhESCを単一細胞懸濁液に解離します(表1)。20%(v/v)ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)、1 mMピルビン酸、3 μM IWR-1-endo(IWR1e)、30 ng/mL COCO、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン(PS)、0.1 mM β-メルカプトエタノール、およびグラスゴーのイーグル最小必須培地(GMEM)を混合して、培地Iを調製します。
- 2日目
- 1%試薬A(材料表)を追加します。2 mLの培地Iに133.4 μLの試薬Aを加えて、試薬A(タンパク質濃度10 mg/mL)を調製します。
注:完全で均一な融解を達成するために、使用前に試薬Aを一晩4°Cに維持してください。製品情報に注意し、試薬Aのボトルごとに異なるタンパク質濃度であるため、試薬Aのタンパク質濃度を持っているために、会社の公式ウェブサイトでカタログ番号とロット番号を検索してください。タンパク質濃度が低い場合は、試薬Aの量を増やすと便利です。 - 調製した試薬Aを20 μLずつ各ウェルに加え、中央に2回ピペットで留めて死細胞を散布します。
注:試薬Aと96ウェルプレートを涼しい条件下で維持し、氷上ですべての手順を完了します。プレートを暗所に置きます。
- 1%試薬A(材料表)を追加します。2 mLの培地Iに133.4 μLの試薬Aを加えて、試薬A(タンパク質濃度10 mg/mL)を調製します。
- 2-12日目
- 96ウェルプレートの底部を洗浄し、37°C、5%CO2 で6日目までインキュベートします。6日目に、各ウェルから58 μLの培地を除去し、60 μLの培地Iを加えて、培地の半分を交換します。
注意: マルチチャンネルピペットを使用して、ハーフメディウム交換を完了します。このステップを穏やかに実行して、セルペレットがウェルから除去されないようにします。培地をきれいな10cmのペトリ皿に吸引します。内部にセルペレットがある場合は、96ウェルプレートに戻します。
- 96ウェルプレートの底部を洗浄し、37°C、5%CO2 で6日目までインキュベートします。6日目に、各ウェルから58 μLの培地を除去し、60 μLの培地Iを加えて、培地の半分を交換します。
- 12日目〜18日目
- 12日目に培地を培地II(表1)に変更します。1%(v/v)試薬Aを用いて、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.1 mM NEAA、1 mMピルビン酸、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、0.1 mM β-メルカプトエタノール、100 nM SAG二塩酸塩およびGMEMを混合して、培地IIを調製します。冷暗所に保管してください。
- 96ウェルプレートから15 mLのコニカルチューブで細胞ペレットを回収し、ペレットを室温で5分間自然に沈降させます。
注意: 気泡を避けるために、表面の下で培地とペレットをそっと取り除きます。 - オルガノイドの世話をしながら上清を取り除きます。細胞凝集体を、試薬Aを含む18 mLの調製培地IIを含む10 cmの懸濁皿に移します。
注:試薬Aは4°Cである必要があるため、準備した培地IIを事前に10cmディッシュに加えないでください。 - 37°C、5%CO2 で18日目までインキュベートします。
- 18日目以降
- 培地を培地IIIに変更します(表1)。10%FBS、1xサプリメント1、0.5 μMレチノイン酸(RA)、100 μMタウリン、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/栄養混合物F-12の1:1混合物と混合液を混合して、暗条件下で培地IIIを調製します。
- 18日目に、半透明の視神経小胞が生成されたら、顕微手術用ナイフを使用してオルガノイドを切断します。
注:オルガノイドを、通常は4つに、培地IIのペトリ皿で切断します。各ピースは、次の数週間で無傷の光学カップに成長するはずです。 - すべてのペレットを皿の中心に集約します。細胞を15 mLの円錐形の鷹管に収穫し、自然沈降させます。その後、上清をそっと取り除きます。
注:オルガノイドはサイズが大きいため、ペトリ皿を一方向に水平面上で90°数回回転させることにより、中心で凝集させることができます。 - ペレットを2つの10 cmペトリ皿に懸濁して分散させ、皿あたり18 mLの培地IIIを入れ、細胞凝集を避けるために皿をインキュベーターに静かに移します。培地IIIで37°Cおよび5%CO2 で培養を続け、毎週培地を交換する。発現したCRXを45日目以降および120日目まで、我々は光受容体のアウトセグメントを検出することができた。
2. ヒトROの解析
- FACS分析
- カットした1 mLチップを使用して、3つのCRX-tdTomatoと3つのH9 ES由来オルガノイドをディッシュから組み立てます。オルガノイドを1 mLの予熱(室温)DPBSで洗浄します。
- 0.25%トリプシン-EDTA溶液と0.05 mg/mLの試薬Dを混合して消化バッファーを調製します。
- 調製した消化バッファーを使用して、37°Cで8分間オルガノイドを単一細胞に解離します。 次に、10%FBSと0.05 mg/mLの試薬Dを含む同量のDPBSを加えて、反応を不活性化します。
- 細胞を軽く懸濁および散乱させた後、100 μmのセルストレーナーを使用してろ過し、561 nm励起レーザーラインと780/60フィルターで蛍光活性化セルソーティング(FACS)システムを使用してCRX-tdTomato陽性シグナルを分析します。
注:CRXは最初に45日目に発現し、オルガノイドの成熟とともに増加します。各テストには1万個のセルが使用され、各時点に対して少なくとも3回の繰り返しが完了します。
- ROの蛍光強度定量
- イメージング用に生存可能なオルガノイドをランダムに調製します。
注:パラメータを設定し、すべての蛍光強度モニターに同じフィルターとパラメータを使用します。 - 画像をキャプチャし、適切なソフトウェア(ImageJなど)を使用して平均蛍光強度を分析します。
- 画像をインポートし、画像|を使用して8ビットに変換します タイプ。
- 画像|によるデフォルトのパラメーターを使用してしきい値を調整します |を調整するしきい値。
- 測定された領域を決定し、分析を使用してグレー値を評価し |測定します。
注:結果パネルの平均値は、測定領域の平均蛍光強度です。
- イメージング用に生存可能なオルガノイドをランダムに調製します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
模式図は、COCOで前駆細胞を改善するための分化プロトコルを示しています(図1)。PSCからROまで、多くの詳細が結果のばらつきを引き起こす可能性があります。手順全体を追跡するために、すべてのステップ、さらにはすべての媒体のカタログ番号とロット番号を記録することをお勧めします。
ここでは、6、12、18、および45日目の明視野画像を提供します(図2)。6日目のオルガノイドは、通常、96ウェルプレート内の直径約600 μmで、内部に密集した接続と明るい縁があります(図2A)。12日目に、視神経小胞様構造が最初に生成されます(図2B)。12日目から18日目まで、視神経小胞構造の存在は明らかであり、それらは18日目以降も成長し続けた。小胞様構造を持たないオルガノイドは廃棄されます(図2C)。30日目までに、小胞のような構造がより明白になり、優れたROと下位のROを区別することが容易になります(図2D-E)。半透明の構造を失ったオルガノイド(図2D-Eのアスタリスク)は、翌日に除去する必要があります。
オルガノイドは、45日目以降、視細胞前駆体のマーカーであるCRXを発現します(図2F、2I)。RCVRNやOTX2などの他の感光体前駆体マーカーも45日目に陽性に検出されました(図2G-H)。COCOの添加は、光受容体前駆体の生成を促進する。
図 1.hESCからのRO分化のための段階的治療のスケジュール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ヒト網膜オルガノイドの生成。 (A-B)96ウェルプレートに形成された初期段階の視神経小胞様構造。黒い矢印は視神経小胞様構造を示す。(C)18日目のシャーレでの浮遊培養の初日。(D-E)この段階で光学カップ構造が観察されます。星は下オルガノイド(F)45日目の明視野画像を示す。スケールバー = 400 μm. (G-H) 45日目のRCVRN(G)およびOTX2(H)の免疫染色結果。スケールバー= 50μm。 (I)TdTomato陽性シグナルは、(F)における45日目のCRXの発現を示す。スケールバー= 400 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 培地 I (50 mL) | ||||||||
| ティッカー | ジーメム | ティッカー | ピルビン 酸 | ビーミー | IWR1e | ココ | 追伸 | |
| パーセント%または最終濃度 | 20 | 78 | 0.1ミリメートル | 1ミリリットル | 0.1ミリメートル | 3 μM | 30 ng/mL | 1 |
| 容積 | 10ミリリットル | 39ミリリットル | 0.5ミリリットル | 0.5ミリリットル | 90.9 μL | 5 μL | 10 μL | 0.5ミリリットル |
| IWR1eの保存濃度は30mMである。ココは150μg/mLです。 | ||||||||
| ミディアム II (50 mL) | ||||||||
| ティッカー | ジーメム | ティッカー | ピルビン 酸 | ビーミー | 垂れる | 追伸 | ||
| パーセント%または最終濃度 | 10 | 88 | 0.1ミリメートル | 1ミリリットル | 0.1ミリメートル | 100ナノメートル | 1 | |
| 容積 | 5ミリリットル | 44ミリリットル | 0.5ミリリットル | 0.5ミリリットル | 90.9 μL | 2.5 μL | 0.5ミリリットル | |
| SAGの保存濃度は2mMである。 | ||||||||
| ミディアム III (50 mL) | ||||||||
| ティッカー | DMEM/F12-グルタマックス | 補足1 | ティッカー | タウリン | 追伸 | |||
| パーセント%または最終濃度 | 10 | 88 | 1 | 0.5 μM | 100マイクロM | 1 | ||
| 容積 | 5ミリリットル | 44ミリリットル | 0.5ミリリットル | 5 μL | 50 μL | 0.5ミリリットル | ||
| RAの貯蔵濃度は5mMであり、タウリンは100mMである。 | ||||||||
表 1: ミディアム I、II、および II レシピ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
網膜オルガノイドの分化は、十分な機能的な網膜細胞を生成するための望ましい方法です。このROは、神経網膜に向かう多能性幹細胞によって生成される神経節細胞、双極細胞、および光受容体などの異なる網膜細胞の複合体である4、5、8、9。コンフルエントなROを採取することはできますが、時間がかかり、長い培養期間(最大180日)が必要になる場合があります。しかしながら、光受容体移植のためには、コーンロッドまたはロッドコーンジストロフィーを研究したり、3D培養システム10において比較的高い割合の光受容体を得ることが有利である。
また、通常の発生過程を中断することなくオルガノイドの発生を監視することも困難です。そこで、主に視細胞前駆体で発現するコーンロッドホメオボックスタンパク質であるCRXを標的遺伝子として使用し、光受容体前駆細胞の3次元分化を追跡しました。tdTomatoシステムを使用すると、CRX発現細胞は、3D分化中に網膜化を中断することなく、赤色蛍光によって時空間的に追跡できます。CRX-tdTomatoシステムを利用することで、ROにおける視細胞前駆体分化のための薬物スクリーニングのプロセスを加速することができます。
私たちの方法を使用すると、約70%のオルガノイドが網膜オルガノイドに成長し、小胞のような構造を示す可能性があります。重要なことに、優れたオルガノイドを切開することで、通常、96ウェルプレートから約100個の網膜オルガノイドを採取できました。さらに、COCO培養によるRO成熟の初期段階で豊富な光受容体前駆体が生成され、経路制御を介して特定の細胞の直接分化への進行を助けます11,12。試薬Aのタンパク質濃度は分化に不可欠です。全体として、初期の凝集体を含む十分な試薬Aと18日目のオルガノイドの切断は、高品質で豊富なROを収穫するために重要です。また、3Dオルガノイドにおける視細胞への指向性分化の発達を促進し、視細胞移植にも寄与する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
502研究室のメンバーの技術サポートと原稿に関する有益なコメントに感謝します。この研究の一部は、北京市自然科学基金会(Z200014)および中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
