نسبة الإشارة إلى الضوضاء من البيانات هي واحدة من أهم الاعتبارات في إجراء قياسات الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يوفر خط الحزم VMXm بيئة منخفضة الضوضاء والميكروبات لمثل هذه التجارب. هنا، ونحن نصف أساليب إعداد عينة لتركيب وتبريد البلورات الدقيقة لVMXm وغيرها من الخطوط شعاعية البلورات الجزيئية الدقيقة.
تركيب البلورات الدقيقة (<10 ميكرومتر) لبلورة واحدة بلورية بلورية يمثل تحديا غير تافهة. وقد شوهدت تحسينات في جودة البيانات للبلورات الدقيقة مع تطوير البصريات الحزمة، والاستقرار شعاع وحجم شعاع متغير مع التركيز من submicron إلى ميكرون، كما هو الحال في خط الحزم VMXm في مصدر ضوء الماس1. وسيكتسب المزيد من التحسينات في نوعية البيانات من خلال إدخال تحسينات على بيئة العينة وإعداد العينات. تولد البلورات الدقيقة بطبيعتها حيود أضعف ، وبالتالي فإن تحسين الإشارة إلى الضوضاء هو المفتاح لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة وسيأتي في الغالب من انخفاض في ضوضاء الخلفية. المصادر الرئيسية للضوضاء الخلفية بالأشعة السينية في تجربة الحيود هي من تفاعلها مع مسار الهواء قبل وبعد العينة ، محلول التبلور الزائد المحيط بالعينة ، وجود الجليد البلوري والتشتت من أي أجهزة شعاعية أخرى أو نوافذ الأشعة السينية. يتضمن خط الحزم VMXm أجهزة وبروتوكول إعداد عينة لتقليل جميع مصادر الضوضاء هذه.
أولا، تزيل بيئة عينة في الفراغ في VMXm مسار الهواء بين مصدر الأشعة السينية والعينة. بعد ذلك ، تستخدم بروتوكولات إعداد العينة للبلورات الجزيئية الكلية في VMXm عددا من العمليات والأدوات المكيفة من cryoTEM. وتشمل هذه الشبكات النحاسية مع أفلام دعم الكربون هولي، النشاف الآلي والروبوتات التبريد يغرق الاستفادة من الإيثان السائل. تمكن هذه الأدوات من إعداد مئات البلورات الدقيقة على شبكة cryoTEM واحدة مع الحد الأدنى من السائل المحيط على دعم منخفض الضوضاء. كما أنها تقلل من تكوين الجليد البلوري من أي سائل متبقي يحيط بالبلورات.
نقدم عملية إعداد وتقييم جودة البلورات الدقيقة للبروتين القابلة للذوبان باستخدام الضوء المرئي ومسح المجهر الإلكتروني قبل تركيب العينات على خط الحزم VMXm لتجارب حيود الأشعة السينية. كما سنقدم أمثلة على عينات ذات نوعية جيدة وكذلك تلك التي تتطلب المزيد من التحسين والاستراتيجيات للقيام بذلك.
يبقى الحاجز الرئيسي لتحديد الهياكل عالية الدقة للجزيئات البيولوجية بواسطة علم البلورات الجزيئية الكلية (MX) هو إنتاج بلورات منتشرة بشكل جيد بحجم قابل. هناك العديد من الاستراتيجيات لتحقيق هذا الهدف من بناء الجينات البروتين المؤتلف تصميم من خلال البحث مصفوفة متناثرة كبيرة عن الكوكتيلات الكيميائية التي قد تولد بلوراتالأولية 2. بالنسبة لهذا الأخير ، غالبا ما يكون الحال أن البلور سوف تحتاج إلى تحسين أي يضرب الأولية للحصول على بلورات مع جودة الحيود كافية وحجم لدراسات تحديد الهيكل3. على الرغم من هذه الخيارات، قد لا تولد بعض الجزيئات المستهدفة أبدا بلورات كبيرة (>10 ميكرومتر)، وبلورات منتشرة جيدا، ونتيجة لذلك يجب على عالم البلورات المثابرة مع البلورات الدقيقة والتحديات التي تمثلها هذه العينات. وتشمل هذه التركيب المناسب وحماية البلورات، وإدارة الحيود الأضعف بطبيعته وزيادة حساسية الإشعاع. تتشكل البلورات الدقيقة من خلايا وجزيئات أقل من البلورات الكبيرة ، وعلى هذا النحو ، لا يتم تضخيم الحيود بنفس القدر مقارنة بالبلورات الأكبر ، مما يؤدي إلى كثافة حيود أضعف بطبيعتها. من المهم أن إشارة الخلفية لا يخفي هذه الانعكاسات، لا سيما في دقة أعلى حيث يمكن أن تضيع كثافة انعكاس ضعيفة4. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البلورات الدقيقة أكثر حساسية للتلف الإشعاعي وعلى الرغم من تسجيل الحيود في درجات حرارة النيتروجين السائل5، فقد لا يكون من الممكن جمع بيانات كاملة من بلورة واحدة ، مما يجعل من الضروري جمع البيانات من عدد كبير جدا من البلورات لإنتاج مجموعة بيانات كاملة واحدة6.
وقد وفرت زيادة توافر أشعة الليزر الإلكترونية الحرة بالأشعة السينية (XFELs) وتطور أساليب البلورات التسلسلية (SFX)7 طرقا لجمع البيانات من البلورات الدقيقة الأصغر. ومع ذلك ، هذه هي طرق تسليم العينات حسب الطلب ، والتي تتطلب قدرا كبيرا من الخبرة في الأجهزة والبرامج ، حيث تقتصر التجارب على درجة حرارة الغرفة وعادة ما يكون استهلاك العينة مرتفعا (مئات الميكرويتر) ولا يزال قد يتطلب المزيد من التحسين8. على هذا النحو، المشاريع التي يمكن أن تكون فيها كمية محدودة فقط من البلورات الدقيقة غير مناسبة لSFX.
وفي الوقت نفسه، تقدمت تكنولوجيا خط الحزم السنكروترون على مدى العقود الأخيرة لإنتاج أصغر وأكثر استقرارا الحزم9 مع تألق التي سمحت لجمع البيانات من بلورات أصغر من أي وقتمضى 10،11. وقد تمكنت خطوط الحزم Microfocus مثل FMX في NSLS-II و I24 في Diamond Light Source من تحديد هياكل جديدة من بلورات ذات أبعاد قصوى تبلغ ~ 3 ميكرومتر12 وإظهار القدرة على جمع البيانات القابلة للاستخدام من بلورات أصغر قياس ~ 1 ميكرومتر13. يجب تكوين خط الحزم بدقة ، مع بصريات ممتازة وعالية الدقة على المحور ، ومجال أدنى من الارتباك لدوران العينة ومحور دوران متوائم بدقة يتزامن مع شعاع الأشعة السينية. من المهم أن تتطابق عن كثب مع ملف شعاع الأشعة السينية إلى حجم الكريستال وضمان محاذاة الكريستال بدقة في شعاع الأشعة السينية – وهو تحد للبلورات <5 ميكرومتر14. تلبية هذه الشروط التجريبية في خط الحزم ضروري لتسجيل أفضل البيانات جودة من البلورات الدقيقة.
الجانب المتبقي وربما الأكثر أهمية لجمع البيانات من البلورات الدقيقة هو عرض الكريستال على شعاع الأشعة السينية. وغالبا ما شنت Microcrystals على يتصاعد عينة ميكروميش، المصنعة من البوليميد، وانخفاض المواد التشتت الأشعة السينية مع فتحات صغيرة مثل 10 ميكرومتر15،16. يتم تركيب شبكة البوليميد على دبوس قياسي يتم تعيينه في قاعدة العمود الفقري المغناطيسي ، مما يجعله متوافقا مع معظم خطوط شعاع MX17. يتم استخدام جبل شبكة لصيد بلورات من قطرة تبلور غالبا ما تتبع نفس الإجراء كما تصاعد الكريستال 100 ميكرومتر باستخدام جبل نمط حلقة القياسية. في حين أن بلورات يمكن توزيعها عبر شبكة، عيب رئيسي هو أن حجم كبير نسبيا من السائل يمكن أن يتم بواسطة شبكة ودبوس أثناء الحصاد(الشكل 1C،D). هذا الحجم من السائل، التي يمكن أن تكون أكبر عدة مرات من البلورات نفسها، وسوف تسهم في الضوضاء الخلفية عندما تضيء مع الأشعة السينية. يمكن أن يكون هذا التشتت الخلفية أقوى إذا شكل السائل الجليد البلوري أثناء التبريد فلاش، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء من كثافة ضعيفة بالفعل داخل قرارات الحيود الجليد. لذلك، من المهم إزالة السائل الزائد من العينة، لضمان إمكانية تسجيل جميع الإشارات الممكنة. هذا التحدي هو أكبر في حالة بلورات البروتين الغشاء تشكلت داخل مرحلة مكعب الدهون (LCP)، حيث يولد LCP مبعثر خلفية قوية وأيضا من الصعب إزالتها من جميع أنحاء بلورات 18.
يوفر خط الحزمة الجديد متعدد الجزيئات البلورية البلورية (VMXm) في Diamond Light Source الظروف التي يمكن من خلالها جمع البيانات من بلورات يحتمل أن يكون حجمها أقل من ميكرون. وقد تم تصميم خط الحزم لتقديم صورة شعاع قياس 0.3 ميكرومتر × 0.5 ميكرومتر (VxH)1، وهو مقياس ال غونيمتر مع مجال من الارتباك لا يزيد عن 60 نانومتر وفي بيئة عينة vacuo. هذه الميزات تصميم محطة نهاية VMXm تقليل توليد الخلفية الأشعة السينية الضوضاء من قبل جهاز الحزمة أثناء جمع البيانات مع أكبر مصدر المتبقية من الخلفية التي تم إنشاؤها بواسطة العينة14.
وتتيح أساليب إعداد العينة المحددة المصممة لشعاع VMXm فرصة للحد من هذه الخلفية وزيادة تحسين الإشارة إلى الضوضاء لبيانات الحيود، مما يزيد من جودة البيانات التي يمكن تسجيلها من البلورات الدقيقة التي تبلغ قوتها <10 ميكرومتر. العديد من المتطلبات المبينة هنا للانعراج منخفض الخلفية من البلورات الدقيقة شائعة أيضا في المجهر الإلكتروني الإرسال المبرد (cryoTEM)19 والكفر الإلكتروني microcrystal (microED)20. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الأدوات التي تم تطويرها بالفعل لإعداد عينات cryoTEM مناسبة، مع بعض التعديلات، لإعداد البلورات الدقيقة. في إعداد عينات لكريوتيم الجسيمات واحد، يتم تضمين الجسيمات قيد التحقيق في طبقات رقيقة جدا (عادة <100 نانومتر) من الجليد الزجاجي بحيث الإلكترونات قادرة على نقل من خلال العينة. ويتحقق طبقة موحدة رقيقة عن طريق النشاف بعيدا السائل الزائد ويتحقق التزجيج من العينة عن طريق التبريد السريع للعينة (~ 104 K ق-1)21 من خلال الغطس في الإيثان السائل الذي عقد في ~ 93 K22. في المقابل، النيتروجين السائل، كما تستخدم بشكل روتيني لإعداد عينة MX، هو cryogen أقل كفاءة من الإيثان ولديه ميل أكبر لتشكيل الجليد البلوري داخل العينة21. تشكيل الجليد البلوري ، الذي يمكن أن يتحلل الحيود وتوليد الضوضاء الخلفية ، وعادة ما يتم تخفيفها من خلال استخدام المركبات المبردة23. يمكن إضافة البوليمرات منخفضة الوزن الجزيئي مثل بولي إيثيلين غليكول (PEG) 400 وميثيل-2,4-pentanediol (MPD) والسكريات والزيوت أو الأملاح المشبعة إلى محلول التبلور في تركيزات منخفضة24– لا يوجد حل “مقاس واحد يناسب الجميع” لاختيار أكثر المبردات ملاءمة وهذا يتطلب في كثير من الأحيان التحسين25 . الكريستال يخضع أيضا التلاعب متعددة خلال عملية الحصاد وحماية التبريد والتي قد تؤدي إلى تلف الكريستال، وفرصة للاستفادة من الإيثان السائل يسمح إغفال هذه الخطوة ويساعد على حماية سلامة الكريستال.
في حين أن الإيثان السائل هو cryogen فعالة للبلورات الدقيقة (<10 ميكرومتر) بسبب نحافة العينة، وهناك طرق بديلة لمنع تشكيل الجليد البلوري، لا سيما في بلورات أكبر، بما في ذلك الحد من محتوى المياه من الكريستال عن طريق استخدام بيئة رطبة تسيطر عليها بإحكام26،أو من خلال فتل السائل الزائد بعيدا عن كل من حلقة وسطح الكريستال27 ، ومع ذلك، تتطلب هذه مرة أخرى معالجة أكبر للعينة. استخدام النشاف الآلي ويغرق تجميد مع الإيثان السائل، كما هو الحال في cryoTEM، معا إزالة محلول التبلور الزائد وتوفير وسيلة لوميض البلورات الدقيقة بارد بطريقة تسيطر عليها في حين تحاول تقليل التلاعب.
هنا، نقدم بروتوكولا يمكن استخدامه ليس فقط من قبل كل من مستخدمي خط الحزم VMXm وفي خطوط الحزم microfocus الأخرى لجمع بيانات حيود عالية من إشارة إلى ضوضاء ولكن قد تكون مفيدة أيضا لأولئك الذين يعدون عينات بلورية البروتين القابلة للذوبان والمنظفات القائمة على بروتين الغشاء لإجراء تجارب microED. في حين أن جميع المرافق لإعداد وتقييم العينات متوفرة في VMXm ، فإن العديد من مختبرات البيولوجيا الهيكلية مجهزة بشكل متزايد لإعداد عينات cryoTEM. ونتيجة لذلك، نتصور أن بعض المستخدمين قد يرغبون في استخدام مرافقهم الخاصة لإعداد عيناتهم لوقت البث في VMXm.
يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام أدوات إعداد عينة cryoTEM لإعداد البلورات الدقيقة لتجارب حيود الأشعة السينية في خطوط الحزم البؤرية الدقيقة. وتتركز الأجهزة الحزمة القياسية حول عينة مثبتة دبوس وبينما بذلت جهود لتوفير دعم عينة على هذه يتصاعد للبلورات الدقيقة، فإنها غالبا ما تكون صعبة لتحميل مع عينة مع ضمان أن يتم تحقيق أعلى إشارة إلى الضوضاء(الشكل 1C، D). قد تتطلب العديد من هذه العينات أيضا تحسين ظروف الحماية من التبريد لضمان أن تكون العينة ذات حيوية. طريقة تجميد يغرق يوفر طريقة قابلة للتكرار لإزالة السائل الزائد وفلاش تبريد العينة في cryogen كفاءة (الشكل 1A, B). في حين يمكن بعد ذلك تركيب الشبكة على خط شعاعي قياسي مع جبل دبوس قائم على ملاقط ، فقد تم تصميم حاملي عينات VMXm خصيصا لقبول الشبكات والاحتفاظ بها تحت درجة حرارة انتقال الزجاج في بيئة فراغ عبر التبريد التوصيلي. تتيح بيئة العينة في VMXm جمع بيانات الخلفية المنخفضة ، حيث تكون العينة هي المصدر المتبقي للخلفية ، وتوفر ميكروبا يمكن استخدامه لمطابقة البلورات ذات الأبعاد الأقل من 10 ميكرومتر. يمكن أيضا استخدام طريقة إعداد العينة هذه لإعداد البلورات النانوية للانعراج الإلكتروني حيث يوجد أيضا شرط لسائل فائض قليل جدا وعينة حيوى بسبب ضعف اختراق الإلكترونات. في حين أن شبكات cryoTEM هشة ، فإن تلك التي شهدت في حصاد البلورات في الحلقات سوف تتكيف بسرعة مع التعامل مع الشبكات. مع كمية صغيرة من الخبرة، سيتم فقدان شبكات قليلة خلال مراحل النشاف والتجميد والتحميل من البروتوكول. خطوات التحسين، ومع ذلك، حاسمة لهذا النجاح وإعداد دقيق سوف يقلل من فرص فقدان بلورات أو الحد من سلامة الكريستال.
توفر شبكات CryoTEM جبلا واحدا كبيرا نسبيا يمكن أن يحتوي على مئات البلورات ، وبالتالي تحسين الإنتاجية حيث قد يكون من الممكن فقط تسجيل إسفين صغير من بيانات الحيود. شبكة واحدة قد توفر أيضا ما يكفي من بلورات لتحديد بنية البروتين، لا سيما في بلورات من التماثل العالي. حيث واحد فقط أو اثنين من قطرات تبلور واحد قد ولدت microcrystals، النشاف المحاكمة من حالة التبلور وحدها يمكن أن تساعد على ضمان أنه عندما يتم مسح البلورات الدقيقة، والأوقات المستخدمة هي أقرب ما يمكن لتلك اللازمة لتوليد عينات ذات نوعية جيدة الأولية. تدعم أفلام الكربون غير مرئية للأشعة السينية وتتوفر مع تباعد الثقوب المختلفة ، والتي يمكن استخدامها لتناسب مورفولوجيا معينة. نحن الأكثر شيوعا الاستفادة من أفلام الدعم مع ثقوب 2 ميكرومتر في تباعد 2 ميكرومتر، ولكن ثقوب أصغر مع تباعد أكبر قد تكون أكثر ملاءمة للبلورات أصغر من 2 ميكرومتر. تتوفر أفلام دعم أخرى مثل تلك التي بها ثقوب 1 ميكرومتر مع تباعد 4 ميكرومتر بالإضافة إلى أفلام الدعم ذات الثقوب المختلفة الشكل ، وكلها ستؤثر على وقت النشاف. شبكة مربعة حجم شبكة من 200 (200 مربع لكل بوصة) كما يوفر مساحة كافية (~ 100 ميكرومتر) بين قضبان شبكة النحاس بحيث شعاع الأشعة السينية لا تتفاعل بقوة مع النحاس في حين توفير الدعم الهيكلي الكافي لفيلم الكربون محملة بلورات. استخدام الإيثان السائل ينفي الحاجة إلى المبردات، مما يقلل بدوره من المتطلبات على حجم العينة التي كانت ستستخدم في تحسين ظروف البروتين المبرد.
المعلمات الرئيسية التي سيتم تحسينها أثناء العملية هي أوقات النشاف وتخفيف العينة. يجب أن تكون أوقات النشاف طويلة بما يكفي لمراقبة تأثير “الظهور” عبر الشبكة بأكملها قبل الهبوط في التجمد. يمكن أن يؤدي النشاف الزائد إلى جفاف البلورات ، ومع ذلك ، يتم استخدام التحكم في الرطوبة داخل غرفة العينة لتقليل هذا التأثير. في حين يقترح أن الرطوبة النسبية من 90٪ المستخدمة، قد تستفيد بعض العينات في الاستفادة الأمثل من الرطوبة. قد تؤثر الرطوبة على كفاءة النشاف لورق النشاف الذي يمكن أن يصبح مشبعا بالماء ببطء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التحكم في الرطوبة داخل غرفة العينة لتحسين جودة الحيود من بلورات30. من المستحسن إجراء تغييرات صغيرة (<5٪ في الرطوبة قبل التحقق من سلامة الحيود لضمان عدم تدهور جودة الحيود.
يمكن إجراء تحسين العينات غير الثمينة باستخدام مجهر خفيف بدلا من SEM. على الرغم من أنها مدمرة ، فمن المفيد لتقييم كثافة البلورات عبر الشبكة وتمكين اتخاذ القرار بشأن ما إذا كان ينبغي تخفيف العينة أو تركيزها لتفريق بلورات بشكل أفضل عبر الشبكة. هذه الخطوة هي الأكثر فائدة عندما يكون هناك عدد كبير من بلورات المتاحة وخاصة العينات عالية التركيز. يجب تجنب تجميع بلورات معا(الشكل 3)،كما في حين أنها ليست مشكلة كبيرة إذا كانت بلورتين مضيئة في نفس الوقت أثناء جمع البيانات6،سيكون هناك على الأرجح حجم أكبر من السائل المحيطة كتلة، وبالتالي تقليل إشارة إلى الضوضاء (الشكل 5). في حين أنه من الممكن مراقبة تجاوزات كبيرة من السائل على الصعيد العالمي عبر الشبكة باستخدام المجهر الخفيف ، لا يمكن إجراء تقييم لحجم السائل المحيط بالبلورات الدقيقة ووجود الجليد البلوري إلا باستخدام المجهر الإلكتروني المزود بنظام نقل فراغ المبردة والمرحلة. في بعض الأحيان، بعد تطبيق بلورات على الشبكة وقبل أن يحدث النشاف، بلورات في حلول اللزوجة منخفضة قد يستقر على طول حافة واحدة من الشبكة. لقد وجدنا أن إضافة ما يصل إلى تركيز نهائي بنسبة 50٪ من جلايكول الإيثيلين يمكن أن يبطئ حركة البلورات من خلال القطيرات ، مما يضمن توزيعا أفضل للبلورات الدقيقة عبر الشبكة بالإضافة إلى توفير تحكم أكبر في النشاف عن طريق زيادة وقت النشاف(الشكل 3D).
يمكن أن تكون بعض حلول التبلور التي تحتوي على عوامل لزجة مثل PEGs عالية الوزن الجزيئي صعبة لللطخة ، مما يتطلب أوقات النشا طويلة بشكل متزايد (>10 s). في مثل هذه الحالات، يمكن أن يكون من المفيد تقليل حجم السائل المودع على الجزء الخلفي من الشبكة، فضلا عن حجم الكريستال التي تحتوي على حل إلى جانب دعم الفيلم من الشبكة. استراتيجيات مثل استخدام 2 طبقات من الورق النشاف أو الألياف الزجاجية قد تساعد أيضا النشاف في هذه الحالات الصعبة31.
في حين أن خط الأنابيب هذا مناسب لبلورات البروتين القابلة للذوبان ، فإن تلك التي تتشكل في وسائل لزجة للغاية مثل بروتينات الأغشية في LCP تمثل تحديا مختلفا لا يناسبه هذا البروتوكول. ومع ذلك، تظهر استراتيجيات لإعداد بلورات LCP على شبكات cryoTEM للميكروED والتي تشمل الحد من لزوجة العينات عن طريق إحداث تغيير مرحلي في LCP. يسمح هذا العينات ليتم تطبيقها على شبكات بطريقة مشابهة لتلك الموضحة في هذه المقالة. وأخيرا، يمكن طحن العينة مع شعاع أيون مركزة لإزالة المواد الزائدة غير الكريستال32،33،34.
وعموما، فإن خط الأنابيب هذا يستغرق عموما 1-2 ساعة (بما في ذلك وقت إعداد المعدات) لمتابعة من العينة التي تصل إلى VMXm لتوفير الشبكات الأمثل مع عينات مشتتة جيدا، وvitrified، اعتمادا على توافر العينة، وتركيز بلورات و لزوجة الحل تبلور. وقد استخدمت هذه الأساليب بالفعل بنجاح لإعداد البلورات الدقيقة لتجارب الحيود بالأشعة السينية استكشاف الأضرار الإشعاعية على البلورات الدقيقة حيث كان الحد الأدنى من حجم السائل المحيطة العينة الأساسية28،35. وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يمكن تطبيقه على جميع عينات البلورات الدقيقة القابلة للذوبان، وليس فقط على عينات منتشرة جيدا التي تم تحسينها بالفعل. تجربة التبلور التي تنتج المواد microcrystalline تقليديا أن يكون هدفا للتحسين بهدف الحصول على بلورات أكبر، ومع ذلك، فإن هذه الطريقة إعداد العينة وقدرات VMXm قد تسمح بجمع البيانات الكافية من هذه العينات دون مزيد من التحسين. بدلا من ذلك، إذا كانت هذه العينات microcrystalline diffract سيئة، والبيانات التي تم جمعها من VMXm باستخدام هذه الطريقة إعداد العينة لا يزال يمكن أن تكون بمثابة دليل مفيد لمزيد من التحسين من ظروف التبلور. أدوات لإعداد الشبكات، بما في ذلك تفريغ توهج وتجميد يغرق متاحة الآن على نطاق واسع في معاهد البحوث مجهزة لتجارب cryoTEM وسوف تكون متاحة لكثير من المستخدمين تمكينهم من إعداد عينات قبل وقت الحزم في VMXm.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون أن يشكروا جيريمي كيون وجون غرايمز وجيف ساتون وديف ستيوارت وجامعة ستروبي في أكسفورد وراشيل بولتون من جامعة ساوثهامبتون على التكرم بتقديم عينات من البلورات الدقيقة لتطوير وعروض طرق إعداد العينات لشعاع VMXm بالإضافة إلى تمكين التكليف بخط الحزم. كما يود المؤلفون أن يشكروا iNEXT-Discovery (رقم المشروع 871037) على الفرصة والدعم في نشر هذه المخطوطة.
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |