Signal-til-støy-forholdet mellom data er et av de viktigste hensynene for å utføre røntgendiffraksjonsmålinger fra mikrokrystaller. VMXm-strålelinjen gir et miljø med lite støy og mikrostråle for slike eksperimenter. Her beskriver vi prøveforberedelsesmetoder for montering og kjøling av mikrokrystaller for VMXm og andre makrofokusmakromolekylære krystallografistråler.
Montering av mikrokrystaller (<10 μm) for enkeltkrystallokrystallografi utgjør en ikke-triviell utfordring. Forbedringer i datakvaliteten er sett for mikrokrystaller med utvikling av strålelinjeoptikk, strålestabilitet og variabel strålestørrelse med fokus fra submikron til mikron, for eksempel ved VMXm-strålelinjen ved Diamond Light Source1. Ytterligere forbedringer i datakvaliteten vil bli oppnådd gjennom forbedringer i prøvemiljø og prøvepreparering. Mikrokrystaller genererer iboende svakere diffraksjon, derfor er forbedring av signal-til-støy nøkkelen til å samle inn røntgendiffraksjonsdata av høy kvalitet og vil hovedsakelig komme fra reduksjoner i bakgrunnsstøy. Store kilder til røntgen bakgrunnsstøy i et diffraksjonseksperiment er fra deres interaksjon med luftbanen før og etter prøven, overflødig krystalliseringsløsning rundt prøven, tilstedeværelsen av krystallinsk is og spredning fra andre stråleinstrumentering eller røntgenvinduer. VMXm-strålelinjen består av instrumentering og en prøveforberedelsesprotokoll for å redusere alle disse støykildene.
For det første fjerner et in-vacuum-prøvemiljø på VMXm luftbanen mellom røntgenkilde og prøve. Deretter benytter prøveforberedelsesprotokoller for makromolekylær krystallografi ved VMXm en rekke prosesser og verktøy tilpasset fra kryoTEM. Disse inkluderer kobbergitter med hullete karbonstøttefilmer, automatisert blotting og dypdykkkjølingsrobotikk som bruker flytende etan. Disse verktøyene muliggjør tilberedning av hundrevis av mikrokrystaller på et enkelt cryoTEM-rutenett med minimal omkringliggende væske på en lavstøystøtte. De minimerer også dannelsen av krystallinsk is fra gjenværende væske rundt krystallene.
Vi presenterer prosessen for å forberede og vurdere kvaliteten på løselige proteinmikrokrystaller ved hjelp av synlig lys og skanning av elektronmikroskopi før vi monterer prøvene på VMXm-strålelinjen for røntgendiffraksjonsforsøk. Vi vil også gi eksempler på prøver av god kvalitet samt de som krever ytterligere optimalisering og strategier for å gjøre det.
En stor barriere for bestemmelse av høyoppløselige strukturer av biologiske molekyler ved makromolekylær krystallografi (MX) forblir produksjonen av godt diffracting krystaller i en mottagelig størrelse. Det er mange strategier for å oppnå dette målet fra rekombinant protein genkonstruksjon design gjennom til store sparsomme matrise søk etter kjemiske cocktailer som kan generere innledende krystaller2. For sistnevnte er det ofte slik at krystallografen må optimalisere eventuelle innledende treff for å oppnå krystaller med tilstrekkelig diffraksjonskvalitet og størrelse for strukturbestemmelsesstudier3. Til tross for disse alternativene kan noen målmolekyler aldri generere store (> 10 μm), godt diffracting krystaller og som et resultat må krystallografen holde ut med sine mikrokrystaller og utfordringene som slike prøver presenterer. Disse inkluderer passende montering og kryobeskytte krystallene, håndtere iboende svakere diffraksjon og økt strålingsfølsomhet. Mikrokrystaller dannes fra færre enhetsceller og molekyler enn større krystaller, og som sådan forsterkes diffraksjonen ikke i samme grad sammenlignet med større krystaller, noe som resulterer i iboende svakere diffraksjonsintensiteter. Det er viktig at bakgrunnssignalet ikke maskerer disse refleksjonene, spesielt ved høyere oppløsning der svake refleksjonsintensiteter kan gå tapt4. I tillegg er mikrokrystaller mer følsomme for strålingsskader, og til tross for registrering av diffraksjon ved flytende nitrogentemperaturer5, er det kanskje ikke mulig å samle inn komplette data fra en enkelt krystall, noe som gjør det nødvendig å samle inn data fra et svært stort antall krystaller for å produsere et enkelt komplett datasett6.
Den økende tilgjengeligheten av røntgenfrie elektronlasere (XFELer) og utviklingen av serielle krystallografimetoder (SFX)7 har gitt ruter til innsamling av data fra mindre mikrokrystaller. Dette er imidlertid skreddersydde prøveleveringsmetoder, som krever en betydelig mengde maskinvare- og programvareekspertise, der eksperimenter er begrenset til romtemperatur og vanligvis prøveforbruk er høyt (hundrevis av mikrolitere) og fortsatt kan kreve ytterligereoptimalisering 8. Som sådan er prosjekter der bare en begrenset mengde mikrokrystaller kan gjøres, ikke egnet for SFX.
I mellomtiden har synkrotronstrålelinjeteknologi de siste tiårene utviklet seg til å produsere mindre, mer stabilebjelker 9 med en glans som har tillatt datainnsamling fra stadig mindre krystaller10,11. Mikrofokus strålelinjer som FMX på NSLS-II og I24 på Diamond Light Source har vært i stand til å bestemme nye strukturer fra krystaller med maksimale dimensjoner på ~ 3 μm12 og demonstrere evnen til å samle brukbare data fra enda mindre krystaller som måler ~ 1 μm13. Strålelinjen må konfigureres nøyaktig, med utmerket optikk med høy oppløsning på aksen, en minimal forvirringssfære for prøverotasjon og en nøyaktig justert rotasjonsakse som sammenfaller med røntgenstrålen. Det er viktig å tilpasse røntgenstråleprofilen tett til krystallvolumet og sikre at krystallen er nøyaktig justert i røntgenstrålen – en utfordring for krystaller <5 μm14. Å møte disse eksperimentelle forholdene ved strålelinjen er viktig for å registrere data av beste kvalitet fra mikrokrystaller.
Det gjenværende og muligens viktigste aspektet ved datainnsamling fra mikrokrystaller er presentasjonen av krystallen til røntgenstrålen. Mikrokrystaller har ofte blitt montert på mikromesh prøvefester, produsert av polyimid, et lavt røntgenspredningsmateriale med blenderåpninger så små som 10 μm15,16. Polyimidnettet er montert på en standardpinne som er satt inn i en magnetisk SPINE-base, noe som gjør den kompatibel med de fleste MX-bjelkelinjer17. Nettingbraketten brukes til å fiske krystaller fra krystalliseringsfallet ofte etter samme prosedyre som montering av en 100 μm krystall ved hjelp av en standard sløyfestilbrakett. Mens krystallene kan fordeles over nettet, er en viktig ulempe at et relativt stort volum væske kan bæres av masken og pinnen under høsting (Figur 1C,D). Dette volumet av væske, som kan være mange ganger større enn krystallene selv, vil bidra til bakgrunnsstøy når det belyses med røntgenstråler. Denne bakgrunnsspredningen kan være enda sterkere hvis væsken danner krystallinsk is under blitskjøling, noe som reduserer signal-til-støy-forholdet mellom allerede svake intensiteter innenfor oppløsningene av isdiffraksjon. Derfor er det viktig at overflødig væske fjernes fra prøven, for å sikre at alle mulige signaler kan registreres. Denne utfordringen er enda større når det gjelder membranproteinkrystaller dannet i lipid kubikkfasen (LCP), hvor LCP genererer sterk bakgrunnsspredning og også er vanskelig å fjerne fra rundt krystallene 18.
Den nye allsidige macromolecular crystallography microfocus (VMXm) strålelinjen ved Diamond Light Source gir betingelsene for å samle inn data fra krystaller som potensielt måler mindre enn et mikron i størrelse. Strålelinjen er designet for å levere en stråleprofil som måler 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, et goniometer med en forvirringssfære som ikke er større enn 60 nm og et vacuo prøvemiljø. Disse designfunksjonene til VMXm-endestasjonen minimerer genereringen av røntgenstøy i bakgrunnen av stråleapparatet under datainnsamling med den største gjenværende bakgrunnskilden generert avprøven 14.
Spesifikke prøveforberedelsesmetoder designet for VMXm-strålelinjen gir en mulighet til å redusere denne bakgrunnen og ytterligere forbedre signal-til-støy av diffraksjonsdata, og maksimere kvaliteten på dataene som kan registreres fra mikrokrystaller som måler < 10 μm. Mange av kravene som er skissert her for lav bakgrunn diffraksjon fra mikrokrystaller er også vanlige for kryogene overføringselektronmikroskopi (cryoTEM)19 og mikrokrystallelektrondiffraksjon (microED)20. Som et resultat er mange av verktøyene som allerede er utviklet for fremstilling av cryoTEM-prøver egnet, med noen tilpasninger, for fremstilling av mikrokrystaller. Ved utarbeidelse av prøver for enkeltpartikkelkryoTEM er partiklene som undersøkes innebygd i svært tynne lag (vanligvis <100 nm) av glassaktig is slik at elektroner er i stand til å overføre gjennom prøven. Det tynne ensartede laget oppnås ved å blåse bort overflødig væske og vitrifisering av prøven oppnås ved rask kjøling av prøven (~ 104 K s-1)21 gjennom å stupe inn i flytende etan holdt ved ~ 93 K22. Flytende nitrogen, som brukes rutinemessig til MX-prøvepreparering, er derimot et mindre effektivt kryoogen enn etan og har større tilbøyelighet til krystallinsk isdannelse iprøven 21. Dannelsen av krystallinsk is, som kan forringe diffraksjon og generere bakgrunnsstøy, reduseres normalt ved bruk av kryo-beskyttede forbindelser23. Lavmolekylære polymerer som polyetylenglykol (PEG) 400 og metyl-2,4-pentandiol (MPD), sukker, oljer eller mettede salter kan tilsettes til et aliquot av krystalliseringsløsning i lave konsentrasjoner24– det er ikke en “en størrelse passer alle” -løsning for å velge det mest hensiktsmessige kryoprektantet, og dette krever ofteoptimalisering 25 . Krystallen gjennomgår også flere manipulasjoner under høsting og kryobeskyttende prosess som kan føre til skade på krystallen, muligheten til å bruke flytende etan tillater utelatelse av dette trinnet og bidrar til å beskytte krystallens integritet.
Mens flytende etan er et effektivt kryogen for mikrokrystaller (<10 μm) på grunn av tynnheten i prøven, er det alternative metoder for å forhindre krystallinsk isdannelse, spesielt i større krystaller, inkludert å redusere vanninnholdet i krystallet ved hjelp av et tett kontrollert fuktig miljø26, eller gjennom fukting av overflødig væske bort fra både sløyfen og overflaten avkrystallen 27 , men disse krever igjen større manipulering av prøven. Bruken av automatisert blotting og dykkfrysing med flytende etan, som i cryoTEM, fjerner sammen overflødig krystalliseringsløsning og gir et middel til å blinke kjølige mikrokrystaller på en kontrollert måte mens du prøver å minimere manipulering.
Her presenterer vi en protokoll som ikke bare kan brukes av både brukere av VMXm-strålelinjen og ved andre mikrofokusstrålelinjer for å samle inn høye signal-til-støy-diffraksjonsdata, men kan også være nyttige for de som forbereder løselige proteinkrystall- og vaskemiddelbaserte membranproteinkrystallprøver for mikroED-eksperimenter. Mens alle anleggene for å forberede og vurdere prøver er tilgjengelige på VMXm, er mange strukturelle biologilaboratorier i økende grad utstyrt for kryoTEM prøvepreparering. Som et resultat ser vi for oss at noen brukere kan ønske å bruke sine egne fasiliteter for å forberede sine prøver for stråletid på VMXm.
Denne protokollen viser hvordan verktøy fra cryoTEM prøvepreparering kan brukes til fremstilling av mikrokrystaller for røntgendiffraksjonsforsøk ved mikrofokusbjelker. Standard strålelinjeinstrumentering er sentrert rundt en pinnemontert prøve, og selv om det er gjort en innsats for å gi prøvestøtte på disse monteringene for mikrokrystaller, er de ofte utfordrende å laste med prøve samtidig som de sikrer at det høyeste signal-til-støy oppnås (Figur 1C,D). Mange av disse prøvene kan også kreve optimalisering av kryobeskyttelsesforholdene for å sikre at prøven er glasslegemet. Frysingsmetoden gir en repeterbar måte å fjerne overflødig væske og blitskjøle prøven i et effektivt kryoogen (Figur 1A,B). Mens gitteret deretter kan monteres på en standard bjelkelinje med en pin-basert pinbrakett, er VMXm-prøveholdere spesielt designet for å akseptere gitter og holde dem under glassovergangstemperaturen i et vakuummiljø via ledende kjøling. Eksempelmiljøet i VMXm muliggjør innsamling av data med lav bakgrunn, der prøven er den gjenværende bakgrunnskilden, og gir et mikrostråle som kan brukes til å matche krystaller med dimensjoner som er mindre enn 10 μm. Denne prøveprepareringsmetoden kan også brukes til å forberede nanokrystaller for elektrondiffraksjon der det også er krav om svært lite overflødig væske og en glassaktig prøve på grunn av svak penetrasjon av elektroner. Mens cryoTEM-rutenettene er skjøre, vil de som oppleves i høsting av krystaller i løkker raskt tilpasse seg håndteringen av rutenettene. Med litt erfaring vil få rutenett gå tapt i løpet av blotting, frysing og lasting av protokollen. Optimaliseringstrinnene er imidlertid avgjørende for denne suksessen, og forsiktig forberedelse vil redusere sjansene for å miste krystaller eller redusere krystallintegriteten.
CryoTEM-rutenett gir en relativt stor enkeltbrakett som kan inneholde mange hundre krystaller, og dermed forbedre gjennomstrømningen der det bare kan være mulig å registrere en liten kile med diffraksjonsdata. Et enkelt rutenett kan også gi nok krystaller til å bestemme proteinstrukturen, spesielt i krystaller med høy symmetri. Der bare en eller to enkelt krystalliseringsdråper har generert mikrokrystaller, kan prøveblussing av krystalliseringstilstanden alene bidra til å sikre at når mikrokrystallene er flekkete, er tidene som brukes så nært som mulig for de som trengs for å generere innledende prøver av god kvalitet. Karbonfilmstøttene er usynlige for røntgenstråler og er tilgjengelige med forskjellig hullavstand, som kan brukes til å passe til en bestemt morfologi. Vi bruker oftest støttefilmer med 2 μm hull med en avstand på 2 μm, men mindre hull med større avstand kan være mer passende for krystaller mindre enn 2 μm. Andre støttefilmer som de med 1 μm hull med en avstand på 4 μm samt støttefilmer med forskjellige formede hull er tilgjengelige, som alle vil påvirke blottingstiden. En rutenett firkantet maskestørrelse på 200 (200 kvadrater per tomme) gir også nok plass (~ 100 μm) mellom kobbergitterstengene slik at røntgenstrålen ikke sterkt samhandler med kobberet samtidig som den gir nok strukturell støtte til karbonfilmen lastet med krystaller. Bruken av flytende etan negerer behovet for kryoprektanter, noe som igjen reduserer kravet til prøvevolum som ville ha blitt brukt til optimalisering av kryotopektantforhold.
Hovedparametrene som skal optimaliseres under prosessen er blottingstidene og prøvefortynning. Blotting ganger bør være lange nok til å observere “popping” effekten over hele rutenettet før du stuper fryse. Over blotting kan føre til dehydrering av krystallene, men kontroll av fuktigheten i prøvekammeret brukes til å minimere denne effekten. Selv om det foreslås at en relativ fuktighet på 90% brukes, kan noen prøver ha nytte av optimalisering av fuktigheten. Fuktigheten kan påvirke blottingseffektiviteten til blottingspapiret som sakte kan bli mettet med vann. I tillegg kan fuktighetskontroll i prøvekammeret brukes til å forbedre diffraksjonskvaliteten til krystallene30. Det anbefales at små endringer (<5 %) i luftfuktigheten gjøres før du kontrollerer diffraksjonsintegriteten for å sikre at diffraksjonskvaliteten ikke forringes.
Optimalisering av ikke-dyrebare prøver kan utføres ved hjelp av et lysmikroskop i stedet for en SEM. Selv om det er destruktivt, er det nyttig å vurdere tettheten av krystaller over hele rutenettet og for å muliggjøre beslutningstaking om en prøve skal fortynnes eller konsentreres for bedre å spre krystaller over rutenettet. Dette trinnet er mest nyttig når det er et stort antall krystaller tilgjengelig og spesielt høyt konsentrerte prøver. Sammen klumping av krystaller bør unngås (Figur 3), da det ikke er et betydelig problem hvis to krystaller lyser samtidig under datainnsamling6, vil det sannsynligvis være et større volum væske rundt klumpen, og dermed redusere signal-til-støy (Figur 5). Selv om det er mulig å observere store mengder væske globalt over hele rutenettet ved hjelp av et lysmikroskop, kan vurdering av væskevolumet rundt mikrokrystallene og tilstedeværelsen av krystallinsk is bare gjøres ved hjelp av et elektronmikroskop utstyrt med et kryogent vakuumoverføringssystem og stadium. Noen ganger, etter påføring av krystallene til rutenettet og før blotting oppstår, kan krystaller i lav viskositetsløsninger slå seg ned langs den ene kanten av rutenettet. Vi har funnet ut at å legge opp til en 50% endelig konsentrasjon av etylenglykol kan bremse bevegelsen av krystaller gjennom dråpen, sikre en bedre fordeling av mikrokrystaller over rutenettet, samt gi større kontroll over blotting ved å øke blottingstiden (Figur 3D).
Noen krystalliseringsløsninger som inneholder viskøse utfellingsmidler som høymolekylære PEG-er kan vise seg utfordrende å blotte, noe som krever stadig lengre blottingstider (>10 s). I slike tilfeller kan det være nyttig å redusere volumet av væske avsatt på baksiden av rutenettet, samt volumet av krystallen som inneholder løsning på støttefilmsiden av rutenettet. Strategier som å bruke 2 lag med blotting papir eller glassfibre kan også hjelpe blotting i disse vanskelige tilfellene31.
Mens denne rørledningen er egnet til oppløselige proteinkrystaller, presenterer de som dannes i svært viskøse medier som membranproteiner i LCP en annen utfordring som denne protokollen ikke passer for. Det dukker imidlertid opp strategier for å forberede LCP-krystaller på cryoTEM-rutenett for microED, som inkluderer å redusere viskositeten til prøvene ved å indusere en faseendring til LCP. Dette gjør at prøvene kan brukes på rutenett på samme måte som det som er beskrevet i denne artikkelen. Til slutt kan prøven freses med en fokusert ionstråle for å fjerne overflødig ikke-krystallmateriale32,33,34.
Totalt sett vil denne rørledningen generelt ta 1-2 timer (inkludert utstyrsoppsettstid) å følge fra prøven som ankommer VMXm for å gi optimaliserte rutenett med godt spredte, vitrifiserte prøver, avhengig av prøvetilgjengelighet, konsentrasjonen av krystaller og viskositeten til krystalliseringsløsningen. Disse metodene har allerede blitt brukt til fremstilling av mikrokrystaller for røntgendiffraksjonsforsøk som utforsker strålingsskader på mikrokrystaller der et minimalt volum væske rundt prøven var viktig28,35. Det skal bemerkes at protokollen kan brukes på alle oppløselige mikrokrystallprøver, ikke bare for godt diffracting prøver som allerede er optimalisert. Et krystalliseringseksperiment som produserer mikrokrystallinsk materiale vil tradisjonelt være et mål for optimalisering med sikte på å oppnå større krystaller, men denne prøveforberedelsesmetoden og egenskapene til VMXm kan tillate tilstrekkelige data å bli samlet inn fra slike prøver uten ytterligere optimalisering. Alternativt, hvis slike mikrokrystallinske prøver diffract dårlig, kan dataene som samles inn fra VMXm ved hjelp av denne prøveforberedelsesmetoden fortsatt fungere som en nyttig guide for videre optimalisering av krystalliseringsforhold. Verktøyene for å forberede rutenett, inkludert glødutladning og dypfrysing, er nå allment tilgjengelige i forskningsinstitutter utstyrt for cryoTEM-eksperimenter og vil være tilgjengelige for mange brukere, slik at de kan forberede prøver i forkant av stråletid på VMXm.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton og Dave Stuart, STRUBI University of Oxford og Rachel Bolton, University of Southampton for vennlig å gi mikrokrystallprøver for utvikling og demonstrasjon av prøveforberedelsesmetoder for VMXm-strålelinjen i tillegg til å muliggjøre igangkjøring av strålelinjen. Forfatterne vil også takke iNEXT-Discovery (prosjektnummer 871037) for muligheten og støtten til å publisere dette manuskriptet.
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |