Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.
Abstract
מודלים תלת-ממדיים (3D) במבחנה של שריר השלד הם התקדמות חשובה במחקר הביו-רפואי מכיוון שהם מאפשרים את ההזדמנות ללמוד רפורמציה בשרירי השלד ולתפקד במתכונת מדרגית הניתנת למניפולציות ניסיוניות. מערכות תרבית שרירים תלת-ממדיות רצויות מכיוון שהן מאפשרות למדענים לחקור את שרירי השלד אקס ויו בהקשר של תאים אנושיים. מודלים במבחנה תלת-ממדית מחקים מקרוב היבטים של מבנה הרקמה המקומי של שריר השלד הבוגר. עם זאת, היישום האוניברסלי שלהם מוגבל על ידי הזמינות של פלטפורמות כי הם פשוטים לפברק, עלות וידידותי למשתמש, ולהניב כמויות גבוהות יחסית של רקמות שריר השלד האנושי. בנוסף, מכיוון ששריר השלד ממלא תפקיד תפקודי חשוב הפוגע לאורך זמן במדינות מחלה רבות, פלטפורמה ניסיונית למחקרי מיקרוטיסו היא המעשית ביותר כאשר מדידות כוח סידן חולפות וצמצמות זעיר פולשניות יכולות להתבצע ישירות בתוך הפלטפורמה עצמה. בפרוטוקול זה, ייצור של פלטפורמה 96-well המכונה 'MyoTACTIC', וייצור המוני של microtissues שריר השלד האנושי 3D (hMMTs) מתואר. בנוסף, השיטות ליישום זעיר פולשני של גירוי חשמלי המאפשר מדידות חוזרות ונשנות של כוח שריר השלד וטיפול בסידן של כל מיקרוטיסה לאורך זמן מדווחות.
Introduction
שריר השלד הוא אחת הרקמות הנפוצות ביותר בגוף האדם ותומך בתפקודי גוף מפתח כגון קטר, הומאוסטזיס חום ומטבוליזם1. מבחינה היסטורית, מודלים של בעלי חיים ומערכות תרבית תאים דו-ממדיות (2D) שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים ופתוגנזה של מחלות, כמו גם לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות בטיפול במחלות שרירי השלד2,3. בעוד מודלים של בעלי חיים שיפרו מאוד את הידע שלנו על שרירי השלד בבריאות ובמחלות, השפעתם התרגומית נפגעה על ידי עלויות גבוהות, שיקולים אתיים והבדלים בין המינים2,4. בפנייה למערכות מבוססות תאים אנושיים כדי לחקור את שרירי השלד, מערכות תרבית תאים דו-פעמיות הן חיוביות בשל הפשטות שלהן. עם זאת, יש מגבלה. תבנית זו לעתים קרובות נכשלת לשחזר את התא-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ תאית המתרחשות באופן טבעי בתוך הגוף5,6. במהלך השנים האחרונות, מודלים תלת ממדיים (תלת-ממדיים) של שרירי השלד התגלו כחלופה רבת עוצמה למודלים של בעלי חיים שלמים ומערכות תרבות דו-ממדיות קונבנציונליות על ידי מתן אפשרות למודלים של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ופתולוגית ex vivo7,8. ואכן, שפע של מחקרים דיווחו על אסטרטגיות למודל שריר השלד האנושי בפורמט תרבות תלת-ממדית ביו-ארטיפיאלית1. מגבלה אחת לרבים ממחקרים אלה היא שכוח פעיל כומת בעקבות הסרת רקמות השריר מפלטפורמות התרבות וההצמדה למתמר כוח, שהוא הרסני ומכאן מוגבל לשמש כנקודת קצה9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. אחרים עיצבו מערכות תרבות המאפשרות שיטות לא פולשניות למדידת כוח פעיל, אך לא כולן מקובלות על יישומים לבדיקת מולקולות תוכן גבוה7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לפברק מיקרוטיסות שריר אנושי (hMMTs) בשריר השלד (Myo) microTissue Array סטייה כדי לחקור forCe (MyoTACTIC) פלטפורמה; התקן צלחת 96 היטב התומך בייצור בתפזורת של מיקרוטיסוסות שריר השלד30. שיטת ייצור הלוח MyoTACTIC מאפשרת ייצור של צלחת תרבות 96 טוב polydimethylsiloxane (PDMS) וכל התכונות המתאימות היטב בשלב יציקה אחד, לפיה כל באר דורשת מספר קטן יחסית של תאים להיווצרות microtissue. Microtissues שנוצר בתוך MyoTACTIC מכילים myotubes מיושר, מפוספס, רב גרעיני כי הם לשחזור מבאר לבאר של המכשיר, ועל ההתבגרות, יכול להגיב לגירויים כימיים וחשמליים במקום30. להלן, הטכניקה לייצור התקן לוח תרבות MyoTACTIC PDMS משכפול פוליאוריטן (PU), שיטה ממוטבת ליישום תאי אבות מיוגניים אנושיים מונצחים כדי לפברק hMMTs, ואת ההערכה התפקודית של ייצור כוח hMMT מהונדס תכונות טיפול בסידן מתוארים ונדונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור צלחת מיוטקטית PDMS
הערה: ייצור צלחת MyoTACTIC PDMS דורש עובש PU שלילי, אשר ניתן לייצר כפי שתואר בעבר30. קובץ SolidWorks של עיצוב בעזרת מחשב (CAD) עבור עיצוב הלוחות MyoTACTIC הפך לזמין ב- GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- הכן ~ 110 גרם של פתרון פולימר PDMS בכוס פלסטיק חד פעמית ביחס של 1:15 של מונומר לסוכן ריפוי באמצעות הרכיבים בערכת אלסטומר הסיליקון. מערבבים את תמיסה פולימרית במשך 2-3 דקות באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית 5 מ"ל עד מעורב לחלוטין הומוגני.
אזהרה: הימנע ממגע פתרון פולימר PDMS עם העור והעיניים; ולהימנע משאיפה. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות חד פעמיות בעת טיפול תערובת PDMS נוזלית ולהתייחס גיליון נתוני בטיחות (SDS) עבור פרוטוקולי בטיחות ספציפיים.
הערה: הגן על משטחי ציוד (לדוגמה, קנה מידה, ספסל עליון וכו ') עם כיסוי חד פעמי במקרה של דליפת פתרון פולימר PDMS. - מסירים את התערובת בטמפרטורת החדר על ידי הנחת הכוס בתוך תא ואקום ספסל המחובר למשאבת ואקום יבשה סטנדרטית למשך כ-30 דקות, או עד להסרת כל הבועות. לשבור את הוואקום כל 5-10 דקות כדי לסייע בהתנתקות. השתמש בחבית מזרק ריקה של 50 מ"ל כדי לצלול אוויר ולפוצץ את כל הבועות הנותרות על פני השטח של תערובת הפולימר לפי הצורך.
הערה: חתיכה של צינורות מזהה 6.35 מ"מ יכולה לשמש לחיבור קצה פיפטה P1250 לחבית כדי לשפר את המהירות והדיוק של זרם האוויר. - בעוד תמיסת הפולימר PDMS מרוקנת את הניצוצות, הסר את שאריות ה-PDMS המודבקות בתבנית השלילית PU על-ידי ניגוב עדין של הקצוות והמשטח במגבת נייר יבשה. השתמש באוויר דחוס מתקן, להגדיר 70-100 kPag כדי להסיר חלקיקים עדינים הנותרים.
הערה: להגן על עובש PU שלילי מפני נזק מפני הצטברות חלקיקים על ידי הצבתו בשקית ניילון אטומה ואחסן אותו בתוך מגירה כי הוא מוגן מפני תנועה במעבדה. - מניחים את תבנית PU במכסה המנוע הכימי שהיה מוגן בכיסוי חד פעמי. עמדו את התבנית אופקית ב-~75° ורססו את המשטח הפעיל בשכבה אחידה של חומר שחרור. מרססים את התבנית מלמעלה למטה, ואז משמאל לימין, תוך החזקת הפחית 15-20 ס"מ מהתבנית ושימוש בנוזל קדימה ואחורה בתנועה גורפת. לסובב את התבנית 180° ולחזור על תרסיסים, ולאחר מכן לתת עובש PU לשבת בשכונה הכימית במשך 10-15 דקות לייבוש.
אזהרה: ודאו שסוכן שחרור משמש בתוך מכסה המנוע של אדים כימיים, הימנעו ממגע עם העור והעיניים והתייחסו לגיליון נתוני הבטיחות (SDS) לקבלת פרוטוקולי בטיחות ספציפיים
הערה: סרט דק צריך לכסות באופן מלא את המשטח הפעיל, אבל ציפוי מוגזם יכול להיות מועבר PDMS בשלב הבא, אשר בתורו יכול להשפיע לרעה זריעת hMMT. המשטח צריך להרגיש חלקלק למגע אבל לא רטוב. - יוצקים 100 גרם PDMS באופן שווה לתבנית PU ומניחים בתוך תא ואקום המחובר למשאבת ואקום בשבייה סיבובית. Degas התבנית מלא PDMS במשך ~ 45 דקות, שבירת חותם ואקום כל 5-10 דקות במשך 20 הדקות הראשונות כדי להאיץ את התהליך. השאירו בתוך תא הוואקום עד שתערובת ה-PDMS ריקה לחלוטין מכל הבועות.
הערה: משאבת ואקום בשבייה סיבובית משמשת להשגת ואקום נמוך יותר ולצמצום הזמן הנדרש לשלב זה. Degassing של עובש מלא PDMS יכול להתבצע באמצעות תא הוואקום ספסל ואת משאבת ואקום יבש החובה הסטנדרטית, עם זאת, הזמן לבטל את התערובת של כל הבועות יהיה ארוך יותר. מה שחיוני הוא הסרת כל הבועות מפתרון הפולימר PDMS, במיוחד באזורים אלה שנועדו להפוך לעמדות עיגון hMMT. בועות באזור זה יגרמו לשבר פוסט עוגן, אובדן בארות תרבות, ובתורו לגרום חתיכה קטנה של PDMS נשאר תקוע בתבנית. - מעבירים את תבנית PU ממולאת PDMS מגושם לתנור 65 מעלות צלזיוס, מדגירה לילה כדי לרפא את הגומי הנוזלי.
- מוציאים מהתנור את הצלחת החיובית PDMS שנרפאה ומצננים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות.
- עם אזמל ללא להב, ניתקו בעדינות PDMS נרפאו מתבנית PU על ידי הפעלת החלק האחורי של הידית בין PDMS לקירות התבנית. התחל לאורך הקצה העליון והפרד את כל 4 הצדדים, לפני דוחף למטה לבסיס התבנית וניתוק חלק זה. שלב זה הושלם כאשר החלק האחורי של הידית פועל בצורה חלקה בין ה- PDMS לבין כל 4 הקירות של תבנית PU.
הערה: עבוד לאט ובזהירות עם האזמל ללא להב כדי למנוע פיצוח תבנית PU או קריעת PDMS. שלב זה צריך לקחת 15-20 דקות. - החל מקצה אחד, השתמשו באזמל ללא להב כדי להרים את קצה ה-PDMS ולעבוד באצבעות בין צלחת התרבות PDMS שנרפאה ועובש PU. לאחר מכן, באמצעות שתי הידיים, לדחוף אצבעות עוד יותר מתחת לצלחת, לאט קילוף למעלה ומחוץ לתבנית PU.
הערה: לעבוד לאט ולהשתמש בשתי הידיים כדי לקלף את הצלחת באופן שווה. מזער כיפוף כדי להפחית את הסבירות של שבירת פוסט עוגן. שלב זה צריך לקחת 5-10 דקות. - השתמש בסכין גילוח קצה יחיד כדי לחתוך את הצלחת לקבוצות של 6 ± 2 בארות MyoTACTIC (איור 1) למטרות זריעת רקמות. מניחים צלחות MyoTACTIC מלאות, או חלקים צלחת, לתוך שקית עיקור מכשיר autoclave עבור מחזור יבש 25 דקות (20 דקות של זמן עיקור, ו 5 דקות של זמן יבש) ב 120 °C (100-140 kPag.
2. תרבות של תאי מיובלסט אנושיים מונצחים
הערה: myoblasts המונצח המשמש בפרוטוקול זה התקבלו מן המכון דה מיולוגי (פריז, צרפת)31.
- להשיג מחמתנה אחת של תאים קפואים מן dewar חנקן נוזלי להפשיר במהירות את המשחקון באמבט מים 37 °C (בפחות מ 1 דקות). תאים קפואים בצפיפות של 7.5 x 105 תאים לכל 1 מ"ל של מדיה הקפאה המורכבת 90% סרום בקר עוברי (FBS) ו 10% דימתיל גופרתיקס (DMSO).
- העבר בעדינות את תוכן הקרבון לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום שטיפה מחומם מראש המורכב מ-89% DMEM 1x, 10% FBS ו-1% Pen/Strep כדי לדלל את ה-DMSO. לסובב את הצינור חרוטי 15 מ"ל ב 400 x g במשך 10 דקות ולאחר מכן לשאוף את התקשורת דואגת למנוע את גלולה התא.
- Resuspend הכדור ב 1 מ"ל של מדיה צמיחה המורכב 84% שריר שריר שריר שלד תאי בזאלי מדיום עם 29 מ"ל של צמיחה של תאי שריר תערובת תוספת בינונית, 15% FBS ו 1% עט / סטרפטופט ולאחר מכן לעבור צינור חרוטי 50 מ"ל עם 29 מ"ל של מדיה צמיחה.
- העבר 10 מ"ל של מדיה המכילה כ 2.5 x 105 תאים לתוך צלחת תרבית תאים 100 מ"מ x 20 מ"מ. חזור על שלב זה עם 20 מ"ל הנותרים של פתרון התא. לאחר מכן העבר מנות תרבית תא לאינקובטור תרבית תאים לח להגדיר 37 °C (5%) ו 5% CO2.
- רענן את המדיה התרבותית כל יומיים. תרבית את התאים עד שהם משיגים ~ 70%-80% השפעה (בדרך כלל 4-5 ימים), ובשלב זה התאים מוכנים לזרוע. 1.5 x 105 תאים נדרשים כדי ליצור כל hMMT. לכן, מעבר התאים לפי הצורך כדי להשיג את מספר התאים הנדרש.
הערה: קווי תאי מיובלסט האב המונצחים לעולם לא יעלו על 80% השפעה לפני זריעת תאים לתוך בארות MyoTACTIC, העברת התאים, או הכנת מלאי מקפיא. hmmTs מפוברקים מתאים שחרגו מ-80% מההתכנסות לעתים קרובות אינם מצליחים להגיע לבגרות מכווצת. הליכי המעבר זהים לשיטות המתוארות להלן בשלב 3.
3. זריעה מהונדסת hMMTs עם MyoTACTIC
- הכנת בארות תרבות MyoTACTIC ריאגנטים עבור זריעת hMMT.
הערה: פרוטוקול זה מספק פרטים ספציפיים להפקת 6 hMMTs.- 2-3 שעות לפני זריעת התא, מניחים 6 טוב צלחת MyoTACTIC לתוך צלחת תרבית תאים 10 ס"מ. הכן כל תרבות MyoTACTIC בודדים היטב על ידי הוספת 100 μL של 5% פתרון F-127 פלורוני לכל באר. מניחים את המכסה על צלחת התרבות 10 ס"מ, להחיל פרפין כדי לאטום את החלל בין צלחת 10 ס"מ למכסה, ולאחר מכן מניחים את צלחת 10 ס"מ המכיל את החלק MyoTACTIC לתוך צנטריפוגה מצויד מתאם ספינר צלחת.
הערה: אם מתאם ספינר צלחת צנטריפוגה אינו זמין, קצה פיפטה p20 יכול לשמש כדי להסיר בזהירות בועות מאחורי העמודים, ובכך להבטיח כי כל פני השטח התרבות מצופה באופן שווה. - צנטריפוגה ב 1,550 x g במשך 1 דקות כדי להסיר את כל הבועות בתוך בארות תרבות, במיוחד מאחורי ההודעות. לאחסן את צלחת תרבית התא 10 ס"מ המכילה את חלק צלחת MyoTACTIC המכיל פתרון F-127 Pluronic ב 4 °C (70 °F) עד התאים מוכנים לזרוע.
הערה: ציפוי F-127 פלורוני ניתן להחיל עבור קטן ככל 2 שעות עד 24 שעות. לדוגמה, בארות ניתן למלא עם פתרון F-127 Pluronic בסוף היום לשימוש למחרת. אין לחרוג מ- 24 שעות מכיוון שהדבר ישפיע לרעה על שיפוץ hMMT ולא יצליח ליצור רקמות בריאות המגיעות לבגרות התכווצות. - להפשיר לאט אחד 50 μL קרום קרום aliquot ואחד 10 μL תרומבין aliquot (פתרון מלאי 100 U / ML) על קרח בתוך מכסה המנוע התרבותי.
הערה: אין להקפיא מחדש עליקוטים של תמצית קרום המרתף. הם לשימוש יחיד. עלי ת'רבין ניתנים לשימוש חוזר, ולכן, להקפיא מחדש עד 5 פעמים לאחר השימוש. - שוקלים ~7 מ"ג אבקת פיברינוגן בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ולאחר מכן עוברים למכסה המנוע של תרבית התא. הוסף 700 μL של 0.9% (wt/vol) פתרון NaCl במים (או תמיסת מלח) כדי להגיע לפתרון ריכוז סופי 10 מ"ג / מ"ל. אין מערבולת פיברינוגן להתמוסס, במקום למקם את הצינור בחממה תרבית תאים 37 °C במשך 3-5 דקות.
- הסר והעיף את הצינור בעדינות, ולאחר מכן הדופק לסובב את התמיסה מומסת צנטריפוגה מיני ספסל (microfuge) ולחזור מכסה המנוע התרבות. סנן את פתרון הפיברינוגן באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד במסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. מעבירים את תמיסת הפיברינוגן המומסת לקרח לצד תמצית קרום המרתף ואליקוט תרומבין.
- לבסוף, להכין את המדיה זריעה hMMT כי יהיה הציג את בארות התרבות לאחר זריעת הרקמות. מדיה זו מכילה מדיום תאי שריר שלד בתוספת 20% FBS, 1% P/S ו-3% חומצה אמינוקפרואית 6(ACA; ריכוז סופי של 1.5 מ"ג/מ"ל מושג על ידי דילול מפתרון מלאי של 50 מ"ג/מ"ל; % מתבטא כ- v/v). יש לחמם מראש את המדיה ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- 2-3 שעות לפני זריעת התא, מניחים 6 טוב צלחת MyoTACTIC לתוך צלחת תרבית תאים 10 ס"מ. הכן כל תרבות MyoTACTIC בודדים היטב על ידי הוספת 100 μL של 5% פתרון F-127 פלורוני לכל באר. מניחים את המכסה על צלחת התרבות 10 ס"מ, להחיל פרפין כדי לאטום את החלל בין צלחת 10 ס"מ למכסה, ולאחר מכן מניחים את צלחת 10 ס"מ המכיל את החלק MyoTACTIC לתוך צנטריפוגה מצויד מתאם ספינר צלחת.
- הכנת תאים לזריעת hMMT.
- לאסוף את לוחות תרבית התא מן אינקובטור התרבות. שאפו את המדיה מכל צלחת, ולאחר מכן לשטוף תאים פעם אחת עם D-PBS על ידי הוספת 5 מ"ל של D-PBS לכל צלחת תרבות. הבא לשאוף D-PBS ולנתק את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל צלחת תרבות. מניחים באינקובטור תרבית התאים למשך 3 דקות.
- עצרו את טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל לשטוף בינוני (89% של 1x DMEM + 10% FBS + 1% עט / סטרפטופון) למנת התרבות. העבר את פתרון התא לצינור חרוטי בגודל המתאים, ולאחר מכן גלולה את התאים על ידי centrifuging ב 400 x g במשך 10 דקות. שאפו את התקשורת דואגים להימנע מכדור התא. ואז respend גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיום לשטוף.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer וצבע כחול טריפן תחת מיקרוסקופיה Brightfield.
אם משתמשים בלוחות מרובים של תאים, השעיית תא זה תהיה מרוכזת מאוד. לדלל את ההשעיות של התא לפני הספירה לפי הצורך. - מאז כל רקמה דורשת 150,000 תאים resuspended ב 15 μL של תערובת מטריצה חוץ תאית (ECM), 900,000 תאים ב 90 μL של תערובת ECM נדרש עבור 6 רקמות. כדי להסביר אובדן פתרון cell-ECM המתרחש במהלך תהליך ההכנה עקב היווצרות בועה או אובדן pipette, להכין תערובת תא-ECM נוספת (כלומר, 8 רקמות, או 1,200,000 תאים ב 120 μL של ECM). העבר את נפח ההשעיה של התא המכיל 1,200,000 תאים לתוך צינור חרוטי חדש. הגדל את עוצמת הקול ל 10 מ"ל עם לשטוף בינוני לסובב ב 400 x g במשך 10 דקות.
- בזמן שהתאים מסתובבים למטה, להכין 150 תערובת ECM μL בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל באמצעות המתכון הבא. ראשית להוסיף 60 μL של DMEM (40% נפח), ולאחר מכן להוסיף 60 μL של פיברינוגן 10 פתרון מ"ג / מ"ל (40% נפח) ולבסוף להוסיף 30 μL של תמצית קרום המרתף (20% נפח). יש לאחסן את תערובת ה-ECM על הקרח עד לשימוש.
הערה: השתמש תמיד טיפים מראש מקורר ב -20 °C בעת עבודה עם פתרונות המכילים תמצית קרום המרתף. תערובת ECM מכילה 4 מ"ג/מ"ל של פיברינוגן.
- זריעת hMMTs
- לאסוף את הצינור חרוטי המכיל את התאים המסתובבים ולשאוף את התקשורת דואגת למנוע את גלולה התא. מזיז במרץ את קצה הצינור עם אצבע בכפפה כדי לסלק את הכדור ולהמשיך להבהב עד שהכדור מופיע כתרנגולת תא.
הערה: חשוב לשאוף כמה שיותר מדיה לשטוף כדי להבטיח את השעיית התא-ECM הוא בדילול הרצוי. השתמש בצינור כדי להסיר את מדיית הכביסה הנותרת במידת הצורך. - העבר 120 μL של פתרון ECM לצינור המכיל את גלולה התא. Pipette למעלה ולמטה כדי resuspend ביסודיות את התאים בתוך ECM כדי ליצור השעיה תא יחיד. Pipette לאט ובזהירות כדי למנוע החדרת בועות, אשר יפחית את נפח העבודה. לאחר מכן, מניחים את פתרון התא-ECM על קרח עד לשימוש.
- אחזר מנות צלחת MyoTACTIC המכיל F-127 מצופה Pluronic מבארות MyoTACTIC מהמקרר 4 °C ומניחים את צלחת 10 ס"מ המכיל בארות MyoTACTIC על גבי חבילת קרח בתוך מכסה המנוע תרבות התא.
- שאפו את פתרון ה-F-127 הפלורוני מכל באר. ה- PDMS נקבובי ויספוג את פתרון ה- F-127 הפלורוני, במיוחד אם הלוחות סובבו למטה עם צנטריפוגה. אפשר פתרון F-127 Pluronic שיורית לשחרר ולהסתפק בתחתית הבאר על ידי מתן בארות לשבת במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשאוף שוב.
הערה: השתמש בפיפטה פסטר עם קצה p1250 מחובר בסוף, וטיפ p200 מעל קצה p1250 בעת שאיפה פתרון F-127 Pluronic. זה ישפר את הדיוק כדי למנוע שאיפה מקרית של מבני הפוסט. הימנע גירוד אזור זריעת תאים בצורת הבריכה הסגלגל בתחתית הבאר עם pipette כמו זה משבש את ציפוי F-127 Pluronic ומפריע לתהליך הארגון העצמי hMMT. הטכניקה הנכונה היא לרחף קצה פיפטה ממש מעל הבריכה הסגלגלה תוך שאיפה פתרון F-127 Pluronic. - Pipette השעיה תא-ECM בזהירות כדי resuspend כל התאים שאולי שקעו לתחתית הצינור. לאחר מכן להעביר 105 μL של השעיית תא-ECM לתוך צינור 1.5 מ"ל טרי, מקורר מראש. יש להצטיין בצינור קרוב לפסגה כדי למנוע מהפתרון להתחמם.
- הוסף 0.84 μL של פתרון מלאי 100 U /mL תרומבין השעיה 105 μL תא-ECM להגיע לריכוז סופי של 0.2 U / מ"ג של פיברינוגן. Pipette במהירות, בזהירות, ביסודיות לערבב, תוך הימנעות הקדמה של בועות.
הערה: תרומבין יוזם את ההמרה המהירה של פיברינוגן לקריש פיברין. ככזה, יש זמן מוגבל לזרוע את הרקמות על תוספת תרומבין. כדי למנוע קרישה מוקדמת לפני תערובת תא-ECM מועבר לתוך בארות התרבות, להגדיר p20 pipette ל 15 μL לפני הוספת תרומבין. השתמש טיפים מצוננים מראש או לטבול את קצה פיפטה לתוך DMEM קר כקרח במשך כמה שניות לפני איסוף והעברת 15 μL של תערובת תא-ECM לתוך כל באר. זוהי תרגול מומלץ להכין aliquots תערובת תא-ECM, כך שלא יותר מ 6 hMMTs הם זרעים בכל פעם. - כדי לזרוע את הרקמות, להוסיף 15 μL של תערובת תא-ECM (כלומר, 150,000 תאים) לכל אחד הבאר. מוסיפים בזהירות את תערובת התא-ECM למרכז הבריכה הסגלגלה ונמנעים מלחיצה על קצה הפיפטה לתחתית הבאר. לאחר מכן, בשתי תנועות אור, פרשו את מתלה התא מאחורי כל עמוד בבאר. ברגע שהמשטח מצופה באופן שווה במתלה תא-ECM, עברו לבאר הבאה.
הערה: לעבוד ביעילות כדי למנוע gelation מוקדם של תערובת התא-ECM בצינור לפני כל הרקמות הם זרעים. בעת זריעת בארות, חשוב מאוד להימנע מהעברת בועות כמו הבועה תפריע שיפוץ של hMMT, הפיכת hMMT שמיש. - מניחים את המכסה על צלחת התרבות 10 ס"מ המכילה את הבארות זרעים ולהעביר לחממה תרבית 37 °C במשך כ 5 דקות.
הערה: מניחים את צינור microcentrifuge עם תערובת תא-ECM שיורית לתוך האינקובטור כאישור של תהליך פילמור ג'ל. - לאחר תערובת התא-ECM יש פולימר, להוסיף 200 μL של מדיה זריעת hMMT מחמם מראש לכל באר MyoTACTIC. מחליפים את המכסה על צלחת 10 ס"מ ומחזירים את מנות הצלחת MyoTACTIC בתוך צלחת 10 ס"מ לאינקובטור. נקודת זמן זו מכונה יום -2. אין להפריע לרקמות עד לשלב הבא.
- לאסוף את הצינור חרוטי המכיל את התאים המסתובבים ולשאוף את התקשורת דואגת למנוע את גלולה התא. מזיז במרץ את קצה הצינור עם אצבע בכפפה כדי לסלק את הכדור ולהמשיך להבהב עד שהכדור מופיע כתרנגולת תא.
- הבחנה בין hMMTs
- לאחר יומיים של דגירה, להסיר את מדיה זריעת hMMT בזהירות באמצעות pipette ולהחליף עם 200 μL של מדיה בידול מחמם מראש המכיל 2% סרום סוס, 1% עט / סטרפטוקופטרופ, 4% ACA (כלומר, 2 מ"ג / מ"ל ריכוז סופי מריכוז מלאי של 50 מ"ג / מ"ל; % מבוטא כ- v / v) ו 10 מיקרוגרם / mL אינסולין רקומביננטי אנושי ב- DMEM. נקודת זמן זו מכונה יום 0 של בידול.
- מדי יומיים לאחר מכן, החליפו מחצית מהתקשורת במדיה חדשה עד היום ה-12 של הבידול, היום האחרון של התרבות (איור 2א).
הערה: פרטי פרוטוקול לפברק hMMTs באמצעות myoblasts אנושי ראשוני פורסמו במקום אחר30. אם יש חששות עבור כדאיות התא לאחר זריעה, דגירה hMMTs עם קלצין ו propidium יודיד כדי לכמת את הכדאיות.
4. גירוי חשמלי וניתוח של הסטה לאחר ההסטה הנגרמת על ידי hMMT
- הגדר זכוכית תחתונה שקופה או הרכבה על במה מפלסטיק על מיקרוסקופ הפוך וחבר מצלמת סמארטפון לעין המיקרוסקופ באמצעות הרכבה על מצלמת מיקרוסקופ. ייעשה שימוש במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10 (איור 3a).
הערה: כל מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה המצויד במטרה הגדלה של פי 10 יהיה מתאים. מבנה באר PDMS יוסר מן צלחת 10 ס"מ וממוקם ישירות על הר השלב התחתון הצלול, ולכן, פתוח לאוויר. לחטא את כל המשטחים והציוד עם 70% אתנול ולמזער את התנועה באזור במהלך הניסויים. - כדי להכין את אלקטרודות גירוי חשמלי, לחתוך ~ 30 ס"מ של חוט נחושת מצופה פח. לאחר מכן, החל מהרכזת של מחט משופעת רגילה 25 גרם, לעטוף ~ 10 ס"מ של החוט בחוזקה סביב החצי העליון, משאיר ~ 20 ס"מ של חוט עודף. חזור על המחט השנייה ולאחר מכן לחתוך את הרכזת את כל מחט.
הערה: החוט חייב להיות הדוק סביב המחט כדי להבטיח שהוא לא זז ואת החלק עטוף חוט של האלקטרודה אסור לגעת PDMS כמו זה יכול לעכב את ייצור שדה חשמלי. - חבר BNC לכבל מחבר קליפ תנין לערוץ פלט על מחולל צורת הגל והגדר את הערוץ לפולסים מרובעים עם מחזור חובה של 20%, משרעת V 5 (חוזק שדה חשמלי של 10 V / ס"מ). התדר ישתנה בין 0.5 הרץ ל-20 הרץ עבור התכווצויות עווית וטטנוס, בהתאמה.
הערה: הגדרות מחולל צורת גל עשויות לדרוש מיטוב ספציפי לניסוי - הנח חלק לוח MyoTACTIC המכיל hMMTs על שלב המיקרוסקופ והכנס בעדינות כל קצה משופע אלקטרודה לתוך PDMS ישירות מאחורי כל עמדה בבריכה הסגלגלה. הדביקו בזהירות את החלקים של חוט עודף בגובה 20 ס"מ לשלב המיקרוסקופ כך שהמחטים יישארו אנכיות וכ-10 ס"מ מכל חוט יישארו חופשיים לחיבור(איור 3a).
זהירות: לעולם אל תציב אצבע חשופה על שני קצות האלקטרודה. ודאו שהאצבעון משוחק על האצבע המורה כדי להפעיל לחץ אור על האלקטרודה בהחדרה ל-PDMS. - מקד את שדה הראייה של המיקרוסקופ באחד משני פוסטים, כך שההתמקדות היא חדה בקצה הפוסט הקרוב ביותר לאלקטרודה. לאחר מכן, נעל את המוקד של מצלמת הטלפון החכם לאזור הברור ביותר של הפוסט. זה חשוב לניתוח במורד הזרם כשינוי במיקוד בזמן שההקלטה תפריע לניתוח.
- חברו את הקצוות החופשיים של החוטים המודבקים למחולל צורת הגל באמצעות מלחצי תנין(איור 3a).
- התחל הקלטת וידאו במצלמת הטלפון החכם ולאחר מכן הפעל את פלט הערוץ כדי ליזום גירוי. לגרום hMMT לעבור 3 עוויתות ו 3 התכווצויות טטנוס, עם 2 דקות של מנוחה בין סדרת גירוי עווית וטטנוס.
- כבה את פלט הערוץ, נתק את קליפי התנין מחוטי הנחושת מצופים הפח, הסר את הקלטת מהכבלים ומחק כל אלקטרודה עם 70% אתנול לפני הכניסה לבארות hMMT הבאות. חזור על הליך החל בשלב 4.5 עבור כל hMMTs.
הערה: להגביל את הזמן כי hMMTs לבלות מחוץ אינקובטור על ידי גירוי לא יותר מ 3 רקמות בכל פעם. אם hMMTs נוספים בתוך חלק צלחת MyoTACTIC להישאר לנתח, להחזיר את הצלחת לחממה במשך 10 דקות כדי לאפשר hMMTs לחזור 37 °C (50 °F). - כדי לנתח הסטה לאחרים כדי לחשב יצירת כוח hMMT, השתמש בקובץ ה- Script המותאם אישית, שהפך לזמין ב- GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). בצע את ההוראות README.md כדי להגדיר ולהפעיל את התסריט, ולאחר מכן פתח כל סרטון מעקב אחר פוסטים כדי לבצע את ניתוח הכוח.
- בחר אזור עניין (ROI) לאורך קצה הפוסט שיש לעקוב אחריו עבור תזוזה לאחר. הקש Enter כדי לאשר את ההחזר על ההחזר והקש Enter שוב כדי להפעיל את קובץ ה- Script (וידאו משלים 1).
הערה: הסטיות גדולות גורמות לכשל של הגשש. אם הגשש נכשל במהלך ההתכווצות, ניתן להגדיל את גודל ההפחתה על תנאי כדי להפוך את המעקב לפחות רגיש אך מאפשר מעקב אחר הסטיות גדולות. שלושה גדלים מסופקים בקוד וניתן לכוונן על-ידי התאמת הערות התסריט. - קובץ ה- Script מסתיים בשתי דרישות קלט. ראשית, הזן y כדי לאשר שהסרטון הכיל התכווצויות מרובות. שנית, הזן y (כן) או n (לא) לייצוא תוצאות ל. קובץ CSV (וידאו משלים 1).
- ודא שתוצאות הסטה לאחר הדיווחים הן כהעתקה בפיקסלים עבור כל התכווצות. המר פיקסלים לערכי מיקרומטר עבור הגדרת ההגדלה של מיקרוסקופ פי 10. לאחר מכן, המר מספרי תזוזה לאחר כוחות התכווצות מוחלטים (μN) על-ידי הכפלת ערכים (μm) על-ידי גורם ההמרה של עקירת כוח של 2.36 μN / μm, התואם לסוכן הריפוי של 1:15 ליחס מונומר של ה- PDMS המשמש בייצור MyoTACTIC30.
5. ניתוח חולף סידן באמצעות גירוי חשמלי
הערה: לניסויים לטיפול בסידן, myoblasts מונצחים הועברו ביציבות עם כתב MHCK7-GCAMP6 כפי שתואר בעבר11,12. תאים שהועברו היו FACS ממוינים עבור GFP כדי להשיג את האוכלוסייה החיובית, ולאחר מכן שימשו לייצור hMMTs. שיטות חלופיות להדמיית סידן כגון שימוש בצבעי יחס-מטרי כמו Fura-2 AM ו- Indo-1 או הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות של אינדיקטורים לסידן (לדוגמה, Fluo-4 או ORegon Green BAPTA1) עשויות להיות מקובלות על המערכת שלנו.
- הגדר את שלב המיקרוסקופ וציוד הגירוי (אלקטרודות, גנרטור צורת גל וכו ') כפי שתואר בעבר בשלב 4. לניסוי זה, השתמש בהגדלה של פי 4.
הערה: יהיה צורך בחדר חשוך ובמיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD. - הפעל תוכנת הדמיית מיקרוסקופ, בחר בערוץ המסנן FITC (אור כחול) ובחר פונקציית הקלטת סרטים. מוגדר בחשיפה של 500 אלפיות שני ורזולוציה של 680 x 510 (Binning 2x2).
הערה: תוכנת ההדמיה עשויה להשתנות והחשיפה מוגדרת באופן ידני על-ידי המשתמש. יש להצטמר מחשיפה ל-hMMT לפני הגירוי. במנוחה, חלוקה לרמות/צל של רקמות כהות עם פלואורסצנטיות ספונטנית היא נורמלית בעוד שתמונת רקמה ברורה היא מעלחשיפה (וידאו משלים 2). ודא שהחשיפה עקבית עבור כל hMMTs במסגרת ניסוי. - סגור את תריס המיקרוסקופ והרחיק את ערוץ FITC עד שיהיה מוכן להקלדת הטיפול בסידן.
- כאשר כל הציוד והתוכנה מוגדרים, לאחזר את חלק הלוח MyoTACTIC המכיל את hMMTs להיות מנותח ולהגדיר אותו ישירות על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, הכנס וחבר אלקטרודות כפי שתואר בעבר בשלב 4.
- השתמש ב-brightfield כדי למקד את שדה הראייה במרכז hMMT שנבחר. לאחר מכן, כבה את המנורה.
- פתח את תריס ערוץ המיקרוסקופ FITC, אשר שהאור הכחול דולק ולאחר מכן בחר רשומת סרט בתוכנה.
- הפעל את הפלט על מחולל צורת הגל כדי ליזום את הגירוי החשמלי. לגרום hMMT לעבור 8 עוויתות ו 8 התכווצויות טטנוס. אפשר 2 דקות של מנוחה בין סדרת גירוי עווית וטטנוס, שבמהלכה תריס FITC נמצא במצב סגור.
הערה: אפשר 10 s של פעילות ספונטנית לפני ואחרי גירוי חשמלי כדי לרשום פלואורסצנטיות מינימלית למטרות חישוב וניתוח נתונים. - כבה את פלט הערוץ, נתק את קליפי התנין מחוטי הנחושת מצופים הפח, הסר את הקלטת מהכבלים ונגב כל אלקטרודה עם 70% אתנול לפני הכניסה לבארות hMMT הבאות. חזור על גירוי והליך הקלטה עבור כל hMMTs.
- שמור סרטים בתבנית קובץ TIFF לניתוח ב- ImageJ, או בתוכנת הדמיה חלופית.
הערה: להגביל את הזמן כי hMMTs לבלות מחוץ אינקובטור על ידי גירוי לא יותר מ 3 רקמות בכל פעם. אם hMMT נוסף בתוך חלק צלחת MyoTACTIC להישאר להיות מנותח, להחזיר את המכשיר לחממה במשך 10 דקות כדי לאפשר hMMTs לחזור 37 °C (50 °F). - כדי לנתח נתונים ארעיים סידן, הראשון לפתוח ImageJ. בחרו 'נתח'ולאחר מכן קבעו 'מדידות'ובחרו בערך אפור ממוצע וביטול הבחירה בכל שאר האפשרויות. לאחר השלמת, פתח סרטון סידן (.tiff) (וידאו משלים 2).
- חלוקה לרמות של הגבול של microtissue באמצעות כלי בחירת מצולע ולשמור אזור זה כמו ROI (וידאו משלים 2). תחת עוד בחלון מנהל ההבגות, בחר ריבוי מודדים ומדוד עוצמה פלואורסצנטית עבור כל פרוסות הקבצים בשורה אחת לפרוסה (וידאו משלים 2).
- העתק את כל המידות, כולל מספר פרוסה (מסגרת), לגיליון אלקטרוני והשווה את עוצמת הפלואורסצנטי של כל פרוסה לעוצמת הפלואורסצנטית הספונטנית המינימלית מהקובץ באמצעות ΔF/F0 = (Fמיידי -מינימוםF )/Fמינימום (וידאו משלים 2).
- חשב את הזמן עבור כל מסגרת על ידי הכפלת מהירות מסגרת הקלטת הסרט במספר פרוסה (מסגרת), והתוויה ΔF / F0 נגד הזמן עבור התגובה החולפת של הסידן hMMT לגירוי (וידאו משלים 2).
- בחר את שיא הסידן חולף אות עבור כל אחד מ 6 התכווצויות רצופות וערכים ממוצעים כדי לחשב את השינוי הממוצע יחסית שיא עוצמה פלואורסצנטית של כל hMMT (וידאו משלים 2).
הערה: אל תכלול תמיד נתונים הנובעים מהתכווצות העווית הראשונה מהניתוח הכולל. גיליון אלקטרוני שכותרתו "תבנית טיפול בסידן.xlsx" סופק ב- GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) כדי להקל על ניתוח חולף של סידן hMMT. תאים הניתנים למילוי שבהם יש להזין ערכים ותשומות מסומנים באפור. הקפד להתאים מספרי בחירת שיא כמו זה רק מדריך כדי לסייע בבחירת שיא(וידאו משלים 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מתוארות כאן שיטות להטיל פלטפורמת תרבות MyoTACTIC מבוססת PDMS בת 96 טוב מתבנית PU, לפברק מערכים של רקמות העתק hMMT, ולנתח שני היבטים של פונקציית hMMT בתוך ייצור ייצור כוח התקן התרבות וטיפול בסידן. איור 1 מציע סקירה סכמטית של הכנת בארות התרבות MyoTACTIC לפני זריעת hMMT. PDMS הוא פולימר מבוסס סיליקון בשימוש נרחב, שניתן לעצב בקלות כדי ליצור התקנים מורכבים32. פרוטוקול מבוסס PDMS תוכנן להטיל מספר בלתי מוגבל של התקני תרבות 96-well מתוך עובש PU שלילי מיוצר30. הצלחת החיובית הסופית של PDMS גמישה וניתן לחתוך אותה בקלות ליחידות פונקציונליות קטנות יותר בעזרת סכין גילוח חד-פעמי(איור 1). פעולה זו מאפשרת למשתמש לשנות את קנה המידה של ההתקן כדי לענות על הצרכים המשוכפלים של hMMT ספציפיים לעיצוב הניסיוני שלהם. יחידות פונקציונליות קטנות אלה מועילות גם להתגברות על מגבלה של עבודה עם פיגום ECM כי פולימר במהירות, כגון הידרוג'ל פיברין, על ידי כוונון בקלות את מספר הבארות כדי להתאים את מהירות זריעת התא של המשתמש. יתר על כן, PDMS הוא עבדות אוטומטית בקלות וזה יכול להיות מאוחסן לתקופה בלתי מוגבלת. לבסוף, מנקודת מבט לוגיסטית, צלחת MyoTACTIC מלאה יכולה להיות מכוסה על ידי כל מכסה צלחת סטנדרטי 96-well, ואת הממד והפרופיל של מנות צלחת MyoTACTIC הם נוחים לדגורה בתוך צלחת תרבות 10 ס"מ, כדי להבטיח סטריליות תרבות hMMT. ציפוי תמיסת F-127 פלורוני לפני זריעת תאים משמש תפקיד כפול של מתן מידה נוספת של עיקור טוב של תרבות, וכפעיל לא יוני, המונע הידבקות תאים לטובת תא אחיד - שיפוץ ECM(איור 1).
כאשר אוכלוסיית תאי האב המיוגניים המונצחת מוכנה לניסויים, התאים עטוף אז בהידרוג'ל המורכב מפיברינוגן ותמצית קרום המרתף. תערובת התא-ECM מופקסת באופן שווה בבריכה הסגלגלה בתחתית כל באר MyoTACTIC, ולאחר מכן במהלך תקופת תרבית של 14 יום, התאים מתארגנים באופן מרחבי על פני שני פוסטים אנכיים אלה כדי ליצור מיקרוטיסואה תלת-ממדית המאוכלסת במיטה של מיוטיובים מיושרים, רב-גרעיניים ומפוספסים הדומים להיבטים של ארגון רקמות מקומי (איור 2a, ז,ח). במהלך תהליך השיפוץ, מתח יוניאקסיאלי נוצר בין שתי נקודות העיגון, וזה מנחה את תהליך הארגון העצמי של הרקמה כדי להניע את היווצרותה של רקמה קומפקטית. במהלך תקופת הבידול, רוחב hMMTs שנבנה myoblasts נגזר חולים בריאים נשאר עקבי למדי. עם זאת, באירועים של שגיאות המפריעות לשיפוץ hMMT, אחידות זו אובדת (איור 2a-f), מה שהופך מדד פשוט זה לשימושי בהערכת בקרת האיכות של hMMT. לדוגמה, ערבוב נלהב מדי של התא - השעיית ECM יכול לגרום להיווצרות של בועות. בועות נישאו לשיפוץ hMMT MyoT. במקרים כאלה, בועות מזיזות חלק מה-myoblasts או את כולם מהאזור שנכבש על ידי הבועה, ובסופו של דבר יוצרות בקיע ב-hMMT הסופי (איור 2b;ראו חץ אדום). דוגמה נוספת מתייחסת לשלמות ציפוי F-127 Pluronic בבארות. F-127 פלורוני הוא פעילי שטח לא יוניים המונעים מהתאים להיצמד לבאר MyoTACTIC. אם הציפוי מגרד במהלך השאיפה, myoblasts ידבק על פני השטח של בארות MyoTACTIC, יצירת נקודות עיגון חדשות וכתוצאה מכך myotubes שאינם מיושרים על פני שני הפוסטים (איור 2c). שגיאות נוספות עלולות גם לגרום לשיפוץ חריג של hMMT, כפי שניתן לראות באיור 2d-f. חיוניות התא לאחר זריעה ניתן גם להעריך באמצעות קלצין / propidium יוד מבוסס בדיקות מכתימים. כאשר נמנעות שגיאות טכניות אלה, hMMTs מאוכלסים במיטה של מיוטיובים מיושרים ורב-גרעיניים הנמתחים לאורך כל hMMT (איור 2g). המיוטיובים אחידים למדי בגודלם לאורך ובין hMMTs שונים(איור 2h-i). Myotubes מאופיינים על ידי נוכחות של פסים sarcomere אשר דמיינו על ידי חיסון עבור α סרקומרי - actinin (SAA; איור 2h).
תכונות פונקציונליות ניתן לבחון גם hMMTs החל סביב 7 ימים של בידול. הניסוי שהוקם כדי להשלים את המחקרים התפקודיים האלה מומחש באיור 3a. הגדרת המיקרוסקופיה מוצגת על גבי שולחן רטט; עם זאת, אין בכך כדי להשלים חקירות פונקציונליות. במחקרים פונקציונליים, אלקטרודות שנוצרו כמתואר בסעיף הגירוי החשמלי של הפרוטוקול מוכנסות ל- PDMS, כך שאלקטרודות שוכנות מאחורי העמודים. חשוב שתהיה הדמיה טובה של אזור הפוסט לפני החדרת האלקטרודה שכן הצורך להכניס מחדש עלול לגרום לעקירה של הרקמה מהפוסט. החדרה נכונה של האלקטרודות חשובה גם כדי לקבל מיקוד חד של הפוסט, כך שלאחר הסטה ניתן לעקוב אחר לאחר מכן עם סקריפט פיתון. איור 3b מציג תזוזה מייצגת של לוחית הבאר MyoTACTIC בתגובה לגירוי חשמלי hMMT בתדר נמוך (עווית, 0.5 הרץ) ובתדר גבוה (טטנוס, 20 הרץ). ניתן להשתמש לכימות של תזוזה לאחר ההעתקה כדי לחשב את הכוח התכווצות המושרה של hMMTs (איור 3c). כאשר מידע זה משולב עם אזור חתך hMMT, ניתן לקבוע כוח ספציפי30. יתר על כן, סידן ארעי לשחק תפקיד חשוב התכווצות שרירים. טרנסולציה יציבה של שריר השלד myoblasts עם אינדיקטור סידן מקודד גנטית כגון GCaMP612,30,33,34, מאפשר מעקב חי של סידן ארעי12,30,34. סידן ארעי נותח באמצעות הגדרת גירוי חשמלי המתואר לעיל כדי לעורר את היום 12 hMMTs שנוצר עם myoblasts מונצח מבטא את כתב MHCK7-GCAMP6 (איור 4a),וכימת כעוצמה פלואורסצנטית שיא ממוצעת במהלך נמוך (עווית, 0.5 הרץ) גבוה (טטנוס, 20Hz) גירוי חשמלי בתדר (איור 4b). הוא ציין כי תכונות טיפול בסידן hMMT נמדד על פני ניסויים שונים הם עקביים יחסית(איור 4b). שיטות כימות לטיפול לאחר הסטה וסידן מפורטות בסרטון משלים 1 ובסרטון משלים 2.
איור 1: הכנת צלחת PDMS מיומטקטית לפני זריעת hMMT. הפלטפורמה בת 96 הבאר המכונה MyoTACTIC מפוברקת על ידי ריפוי ראשון של פולידימתילסילוקסן (PDMS) בתוך עובש פוליאוריטן שלילי (PU). פלטפורמת התרבות המבוססת על PDMS מקולפת בקפידה מתבנית PU השלילית. בהגדרה אקדמית, התקן PDMS נחתך ליחידות קטנות יותר המכילות 6 ± 2 בארות פונקציונליות. בארות אלה ממוקמות לאחר מכן בכיס עיקור, autoclaved ומאוחסנים עד השימוש. עד יום לפני השימוש, המספר הרצוי של מנות המכשיר ממוקמים בתוך צלחת תרבות 10 ס"מ ו F-127 Pluronic מתווסף לכל באר. מכסה הכלה 10 ס"מ מתווסף, הקצה אטום עם parafilm לפני דגירה את הצלחת ב 4° עבור 2-24 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: MyoTACTIC תומך בארגון עצמי של hMMT ובהיווצרות מיוטיוב מיושר. (א)(למעלה) ציר זמן סכמטי של ארגון עצמי hMMT והבשלת myotube לאחר מכן על פני תקופת תרבות של 14 יום. (למטה) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות 4x כדי להמחיש את הקינטיקה של הארגון העצמי מונצח myoblasts על פני שני הפוסטים האנכיים שגורמים להיווצרות של hMMT תלת-ממדי. סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. (b-f) נציג 4x תמונות פאזה-ניגודיות של hMMTs ביום 12 של בידול המציג תוצאות hMMT הנגרמות על ידי (b) בועה בתוך התא - ECM בזמן זריעה (נקודות חץ אדום לגרום נזק hMMT בועה), (ג) שאיפה שגויה של ציפוי פתרון F-127 פלורוני, ו -( d-f ) hMMT שיפוץ יתר שיכול לאותת על ג'לציה ECM לא נכונה, היעדר פעילות ACA במדיה תרבותית, טיפול לא תקין בקו ההורים myoblast, וכו '. סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. (g)תמונה קונפוקלית אריחים ושטחית של יום 12 hMMT שצולמה בהגדלה של פי 10. hMMTs קבועים ישירות בתבנית PDMS, ולאחר מכן מוסרים בקפידה ומונחים בצלחת תרבות 96 היטב להכתמה. Sarcomeric α-actinin (SAA) המוצג במגנטה, ו Hoechst 33342 כתם גרעיני מוצג ציאן. סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. (h)תמונה קונפוקלית מייצגת של יום 12 hMMT בהגדלה של פי 40. hMMT myotubes וגרעין הם דמיוניים על ידי חיסון עבור SAA (מגנטה) ונגד עם Hoechst 33342 (ציאן). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (i) גרף התוויית נקודה של קוטר מיוטיוב ממוצע hMMT ביום 12 של בידול. ערכים מדווחים כממוצע ± SEM. n = 8 hMMTs מ 3 שכפולים ביולוגיים, נבדל על ידי צורות סמל, לפי מינימום של 30 myotubes לכל hMMT מנותחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: במדידת כוח התכווצות בתוך פלטפורמת MyoTACTIC. (א)ייצוג של סידור הגירוי החשמלי (משמאל). למרות שמצולמים בהתקנה זו, אין צורך בטבלת רטט. מצלמת סמארטפון והרכבה צוידו לעין של מיקרוסקופ הפוך המצויד במנורת פלואורסצנטיות להקלטות וידאו של תזוזות פוסט גירוי חשמלי hMMTs (משמאל). מחטי 25 G היו עטופים בחוטי נחושת מצופים פח (מימין למטה), מחוברים לכבל מחבר קליפ BNC לתנין (מימין למעלה) והודבקו לגנרטור צורת גל שרירותי. מיקום אלקטרודות במהלך גירוי חשמלי מוצג בפינה הימנית התחתונה. (ב)תמונות מייצגות שנלקחו סרטוני הסטה לאחר ההסטה שנרכשו מ- hMMTs ביום ה - 12 של בידול. סרטונים צולמו בהגדלה של פי 10. קווים אנכיים לבנים מלאים מציגים מיקום פוסט כאשר hMMTs רגועים, בעוד קווים אנכיים לבנים מנוקדים מראים תזוזה לאחר תזוזה גבוהה (טטנוס 20 הרץ) או גירוי תדר נמוך (0.5 הרץ). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (ג)גרף התוויית נקודות של עווית hMMT ממוצעת (0.5 הרץ)- וכוח התכווצות המושרה על-ידי טטנוס (20 הרץ) ביום 12 של בידול. ערכים מדווחים כממוצע ± SEM. n = 9 hMMTs מ- 3 שכפולים ביולוגיים, המובחנים באמצעות צורות סמלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: במדידת סידן בתוך פלטפורמת MyoTACTIC. (א)תמונות מייצגות מהקלטת וידאו של הגדלה פי 4 של GCaMP6+ חולפי סידן וחולפים סידן בתגובה לגירוי חשמלי נמוך (התכווצות עוויתות, 0.5 הרץ) וגבוה (התכווצות טטנוס, 20 הרץ) גירוי חשמלי בתדר. hMMTs מסומנים בקו צהוב מנוקד. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. (b)גרף התוויית נקודות המציג כימות של עוצמת פלואורסצנטית שיא ממוצעת לכל hMMT בעקבות התכווצות נמוכה (התכווצות עווית, 0.5 הרץ) וגבוה (התכווצות טטנוס, 20 הרץ) גירוי חשמלי בתדר. ערכים מדווחים כממוצע ± SEM. n = 9 hMMTs מ- 3 שכפולים ביולוגיים, המובחנים באמצעות צורות סמלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון משלים 1: הדגמת שיטות לניתוח נתונים לאחר הסטה. סרטון מייצג של ניתוח הסטה לאחר ביום 12 של בידול במעקב על ידי התסריט המותאם אישית במהלך גירוי טטנוס. תחילה, גודל ההשתתפות ב- ROI נבחר ישירות בתוך קובץ ה- Script של מעקב אחר פוסטים. לאחר מכן, הווידאו נפתח על-ידי בחירת לחצן ההפעלה כדי להפעיל את קובץ ה- Script. אזור ממוקד חד של הפוסט נבחר כאשר ה- ROI והתיבה למעקב אחר פוסט כחול ממוקמת. Enter נלחץ כדי לנעול את ההחזר על ההחזר ולחץ שוב כדי להפעיל את קובץ ה- Script. "y" מוזן כתגובה לבקשה "סרטון התכווצות מרובה? [Y/N]", ואז 'n' מוזן כתגובה לבקשה "לייצא מיקומי פוסט כקובץ .csv? [Y/N]". הסטה לאחר ההסטה כהעתקה יחסית בפיקסלים היא הפלט הסופי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו משלים 2: הדגמת שיטות לניתוח נתונים ארעיים של סידן GCaMP6. וידאו מייצג של ניתוח טיפול בסידן אפיפלואורסצנטי ביום 12 של בידול במהלך גירוי טטנוס. ראשית, וידאו של סידן ארעי (נשמר כסדרה של תמונות tiff) נפתח ב- ImageJ והמשתמש ניווט דרך מסגרות עד hMMT גלוי. לאחר מכן, מדידת הניתוח הנדרשת "ערך אפור ממוצע" מאושרת ומתואר hMMT באמצעות כלי הציור המצולעים. קו מתאר זה נשמר כאזור העניין ועוצמת הפלואורסצנטיות של כל פרוסת וידאו מנותחת באמצעות ריבוי מידות. מדידות אלה מועתקות לגיליון האלקטרוני "תבנית טיפול בסידן" עם נתוני מסגרת וערכי שיא חולפים סידן מלאים ומאושרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר שיטות לפברק ולנתח מודל תרבות hMMT תלת-ממדי שניתן ליישם במחקרים של ביולוגיה בסיסית של שרירים, מידול מחלות או לבדיקת מולקולות מועמדות. פלטפורמת MyoTACTIC ידידותית לעלות, קלה לייצור, ודורשת מספר קטן יחסית של תאים כדי לייצר מיקרוטיסות שרירי השלד. h hMMTs שנוצר בתוך פלטפורמת התרבות MyoTACTIC מורכבים ממיוטיובים מיושרים, רב-גרעיניים ומפוספסים, ומגיבים לגירויים חשמליים על ידי ייזום סידן ארעי המפעיל התכווצות (איור 2, איור 3, איור 4). מחקרים קודמים הראו כי hMMTs מציעים תגובה דומה לגירויים ביוכימיים ויכולים להגיע לרמות התבגרות התואמות לאלה שדווחו בדגמי שרירי השלד בתלת-ממד בפורמט גדול יותר12,30.
נושא קריטי לאורך ייצור הלוחות MyoTACTIC ויצירת hMMT מבטיח למנוע בועות, ואם נוצרו הוסרו. כדי להקל על יציקת צעד אחד של תבנית PDMS לניתוח, נוצרה תבנית PU במורד הזרם של תבנית הפלסטיק הראשונית בהדפסה תלת-ממדית שתוארה בעבר על ידי Afshar et al.30. עובש PU שנוצר מאפשר למשתמשים לייצר טביעת רגל 96 היטב של עובש PDMS לפיה מקסימום של 96 בארות פונקציונליות (מכילות שני עמודים), כפי שהוכתב על ידי שלב ייצור עובש PU. במהלך ייצור של צלחת PDMS MyoTACTIC, משתמשים חדשים לעתים קרובות לפספס בועות קטנות יותר שנותרו מאחור PDMS נוזלי, גם לאחר הסרת גזל. בועות המאפשרות לוקליזציה לאזורים בתבנית PU המתאימים למבני פוסט גמישים העוגנים יגרמו לשבירה לאחר הפרדת תבנית PU מצלחת התרבות PDMS, ותוך כדי כך, משאירה מאחור חתיכה קטנה של PDMS נרפא בתבנית PU. ניתן להשתמש באוויר דחוס כדי להסיר את שרידי PDMS שנרפאו, וכישלון לעשות זאת יפחית ביעילות את מספר בארות פונקציונליות הזמינות עבור יציקות צלחת עתידיות. לכן, זה קריטי כדי להבטיח את כל הבועות הוסרו לפני צלחת PDMS נרפא כיתרון של פלטפורמה זו היא שזה מכשיר עצמאי, לפיה כל התכונות של הצלחת יצוקים בצעד אחד במקום לדרוש כל נקודת עיגון microtissue בודדים להיות הציג את בארות התרבות באופן ידני35, 36,37. רוב מחקרי המעבדה האקדמית אינם דורשים לוח תרבות מיוטקטי שלם. כדי למקסם את השימוש בכל צלחת PMDS, הוא נחתך באופן ידני לקבוצות של 6 ± 2 בארות MyoTACTIC. כדי לשפר את התהליך הזה תבנית PU המאפשר למשתמשים לקלף יחידות פונקציונליות של 6 ± 2 בארות MyoTACTIC יכול לחלוטין לחסל את שלב חיתוך צלחת זה. יתר על כן, בועות גדולות שהוכנסו לתמיסת התא-ECM תוך ערבוב או במהלך הליך זריעת הרקמות יפגעו בהיווצרות רקמות נכונה. בועות גדולות אלה לעקור תאים מהאזור הבועה תופסת, לעתים קרובות וכתוצאה מכך hMMTs עם אזורים עם כמה myotubes כי ייכנע ללחץ התכווצות ולהישבר במהלך גירוי חשמלי.
יתרון בולט של MyoTACTIC הוא היכולת לכמת תכונות ייצור כוח פעיל וטיפול בסידן במקום. זהו אתגר העומד בפני מערכות תרבית תלת-ממדיות רבות אחרות, בהן חקירת כוח התכווצות רקמות תלת-ממדי מיושם כנקודת קצה לאחר הסרת הרקמה ממכשיר התרבות12,37. לכן, MyoTACTIC מתאים היטב לתמיכה במחקרי אורך, למשל, הבנת ההשפעות הזמניות של טיפול תרופתי על שריר השלד. מגבלה אחת של השיטה המתוארת כאן כדי לכמת תכונות ייצור כוח פעיל וטיפול בסידן במקום היא המיקום הידני של אלקטרודות, אשר מגביל את השימוש במערכת זו עבור יישומים בדיקת מולקולות תוכן גבוה. פתרון אפשרי יהיה להנדס מכסה ברור של אלקטרודות להגדיר כמעגל מקביל שניתן להכניס ישירות לתוך קבוצה סטנדרטית של בארות פונקציונליות המאפשר גירוי חשמלי של רקמות מרובות בבת אחת. לחלופין, שימוש בקו תא מיוגניים מבע ביציבות מבנה channelrhodopsin יאפשר דה-קוטביות של קרום תאי השריר, ומכאן, התכווצות רקמות הנגרמת על ידי חשיפה לאור כחול. יתר על כן, כוח פעיל נלכד בסרטונים כמו הסטה פוסט וכימות של כוח התכווצות פעיל יכול להתנהל באופן לא משוחד באמצעות סקריפט פיתון חצי אוטומטי מותאם אישית כדי לעקוב אחר הסטה פוסט בסרטונים קצרים. לכן, הערכה אורך משוחדת של כוח התכווצות מגורה מופעלת על ידי MyoTACTIC30. כדי לשפר את היעילות של ניתוח נתונים, יישומי טלפון חכם שנועדו למדוד כוח ובו זמנית לכידת קטעי וידאו של הסטה לאחר, הם אידיאליים כדי להגדיל את התפוקה.
לבסוף, הערך של פלטפורמה זו תואר גם בעבר ביכולתה לחזות במדויק את תגובת התרופה. בדומה לתוצאות קליניות, דיווחנו בעבר כי הטיפול ב- hMMTs (נעשה עם myoblasts ראשוני) עם תרכובות מיוטוקסיות (דקסמתזון, cerivastatin) גרם ניוון myotube וירידה כוח התכווצות פעיל30. יתר על כן, הערך החזוי של MyoTACTIC שנוצר hMMTs אומת על ידי מראה כי מינון רלוונטי קלינית של chemotherapeutic המשמש לטיפול בסרטן הלבלב, מחלה הקשורה לעתים קרובות cachexia2, מופחת באופן משמעותי איכות hMMT וכוח התכווצות30. לכן, הייצור הפשוט של MyoTACTIC וקלות השימוש שלה בייצור של hMMTs תלת-ממדיים מראה יתרונות רבים ללכידת נתונים בעלי תוכן גבוה כפי שהוכח על ידי האמינות שלו לגבי יציאות מבניות ותפקודיות. מגבלה כללית של התקני תרבית תאים מבוססי PDMS היא שחלבונים של PDMS ספיחים. השיטה המתוארת במסמך זה עושה שימוש במדיה תרבותית המכילה סרום, אשר מתגברת על מגבלה זו על ידי שירות "לחסום" את המכשיר ולאפשר את ההשפעות של מולקולות וטיפולים תרופתיים להיות נצפו. עם זאת, בשל מגבלה זו, יש להימנע ממסקנות סופיות לגבי מינוני מולקולות, ועקומות תגובת מינון מעודדות. לעומת זאת, פלטפורמה זו אינה מתאימה לתרבות מיקרוטיסו נטולת סרום שכן התוספים יסרפו ל- PDMS, ובכך יפגעו בבריאות ובהתפתחות הרקמות. בעתיד, שילוב טכניקות כגון הדפסה ביולוגית תלת-ממדית ו/או טיפול אוטומטי בנוזל ישפר את התפוקה בייצור תרביות hMMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למוחמד אפשר, הבן אברהא, מוחסן אפשר-בקושלי וסאדה דאבודי על תרומתם להמצאת פלטפורמת התרבות המיומטקטית והקמת שיטות הייצור והניתוח המתוארות כאן. HL קיבלה מימון מתוכנית הכשרה של המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) במלגת הנדסה ויזמות של אוניברסיטת טורונטו וילדקט. PMG הוא יו"ר המחקר בקנדה בתיקון אנדוגני וקיבל תמיכה למחקר זה ממכון אונטריו לרפואה רגנרטיבית, רשת תאי הגזע, ומרפואה על ידי עיצוב, תוכנית מצוינות מחקר ראשונה בקנדה. דיאגרמות סכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
