Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.
Abstract
Los modelos tridimensionales (3D) in vitro del músculo esquelético son un avance valioso en la investigación biomédica, ya que brindan la oportunidad de estudiar la reforma y la función del músculo esquelético en un formato escalable que es susceptible de manipulaciones experimentales. Los sistemas de cultivo muscular 3D son deseables, ya que permiten a los científicos estudiar el músculo esquelético ex vivo en el contexto de las células humanas. Los modelos 3D in vitro imitan de cerca aspectos de la estructura del tejido nativo del músculo esquelético adulto. Sin embargo, su aplicación universal está limitada por la disponibilidad de plataformas que son fáciles de fabricar, costosas y fáciles de usar, y producen cantidades relativamente altas de tejidos musculares esqueléticos humanos. Además, dado que el músculo esquelético desempeña un papel funcional importante que se ve afectado con el tiempo en muchos estados de enfermedad, una plataforma experimental para estudios de microtejidos es más práctica cuando las mediciones mínimamente invasivas de la fuerza transitoria y contráctil del calcio se pueden realizar directamente dentro de la propia plataforma. En este protocolo, se describe la fabricación de una plataforma de 96 pocillos conocida como 'MyoTACTIC', y la producción en masa de microtisones musculares esqueléticos humanos (hMMTs) en 3D. Además, se informan los métodos para una aplicación mínimamente invasiva de estimulación eléctrica que permite mediciones repetidas de la fuerza del músculo esquelético y el manejo del calcio de cada microtejido a lo largo del tiempo.
Introduction
El músculo esquelético es uno de los tejidos más abundantes en el cuerpo humano y apoya funciones clave del cuerpo como la locomoción, la homeostasis por calor y el metabolismo1. Históricamente, los modelos animales y los sistemas de cultivo celular bidimensional (2D) se han utilizado para estudiar procesos biológicos y patogénesis de enfermedades, así como para probar compuestos farmacológicos en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético2,3. Si bien los modelos animales han mejorado en gran medida nuestro conocimiento del músculo esquelético en la salud y en la enfermedad, su impacto traslacional se ha visto obstaculizado por los altos costos, las consideraciones éticas y las diferencias entre especies2,4. Al recurrir a los sistemas basados en células humanas para estudiar el músculo esquelético, los sistemas de cultivo celular 2D son favorables debido a su simplicidad. Sin embargo, hay una limitación. Este formato a menudo no logra recapitular las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular que ocurren naturalmente dentro del cuerpo5,6. En los últimos años, los modelos tridimensionales (3D) del músculo esquelético han surgido como una poderosa alternativa a los modelos animales completos y los sistemas de cultivo 2D convencionales al permitir el modelado de procesos fisiológica y patológicamente relevantes ex vivo7,8. De hecho, una gran cantidad de estudios han reportado estrategias para modelar el músculo esquelético humano en un formato de cultivo 3D bioartificial1. Una limitación para muchos de estos estudios es que la fuerza activa se cuantifica después de la eliminación de los tejidos musculares de las plataformas de cultivo y la unión a un transductor de fuerza, que es destructivo y, por lo tanto, se limita a servir como un ensayo de punto final9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Otros han diseñado sistemas de cultivo que permiten métodos no invasivos de medición de la fuerza activa, pero no todos son susceptibles de aplicaciones de prueba de moléculas de alto contenido7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Este protocolo describe un método detallado para fabricar microtejidos musculares humanos (hMMTs) en la plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del músculo esquelético (MyoTACTIC); un dispositivo de placa de 96 pocillos que soporta la producción a granel de microtisones musculares esqueléticos30. El método de fabricación de placas MyoTACTIC permite la generación de una placa de cultivo de polidimetilsiloxano (PDMS) de 96 pocillos y todas las características correspondientes del pozo en un solo paso de fundición, por lo que cada pozo requiere un número relativamente pequeño de células para la formación de microtejivas. Los microtejidos formados dentro de MyoTACTIC contienen miotubos alineados, estriados y multinucleados que son reproducibles de pozo a pozo del dispositivo, y al madurar, pueden responder a estímulos químicos y eléctricos in situ30. Aquí, se describe y discute la técnica para fabricar un dispositivo de placa de cultivo MIOTÁCTICO PDMS a partir de una réplica de poliuretano (PU), un método optimizado para implementar células progenitoras miogénicas humanas inmortalizadas para fabricar hMMT, y la evaluación funcional de la generación de fuerza hMMT diseñada y las propiedades de manejo de calcio.
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Protocol
1. Fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS
NOTA: La fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS requiere un molde negativo de PU, que se puede fabricar como se describió anteriormente30. El archivo solidWorks de diseño asistido por ordenador (CAD) para el diseño de placas MyoTACTIC se ha puesto a disposición en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Prepare ~ 110 g de solución de polímero PDMS en un vaso de plástico desechable en una proporción de 1:15 de monómero a agente de curado utilizando los componentes del kit de elastómero de silicona. Revuelva la solución de polímero durante 2-3 min con una pipeta serológica desechable de 5 ml hasta que esté completamente mezclada y homogénea.
PRECAUCIÓN: Evite el contacto de la solución de polímero PDMS con la piel y los ojos; y evitar la inhalación. Siempre use una bata de laboratorio y guantes desechables cuando manipule la mezcla líquida de PDMS y consulte la Hoja de datos de seguridad (SDS) para conocer los protocolos de seguridad específicos.
NOTA: Proteja las superficies del equipo (por ejemplo, báscula, sobremesa, etc.) con una cubierta desechable en caso de derrame de solución de polímero PDMS. - Desgasifica la mezcla a temperatura ambiente colocando la taza dentro de una cámara de vacío de sobremesa conectada a una bomba de vacío seca de servicio estándar durante ~ 30 minutos, o hasta que se eliminen todas las burbujas. Rompa el vacío cada 5-10 minutos para ayudar en la desgasificación. Use un barril de jeringa vacío de 50 ml para sumergir el aire y expulsar las burbujas restantes en la superficie de la mezcla de polímeros según sea necesario.
NOTA: Se puede utilizar una pieza de tubo id de 6,35 mm para conectar una punta de pipeta P1250 al cañón para mejorar la velocidad y la precisión de la corriente de aire. - Mientras la solución de polímero PDMS se está desgasificando, retire los trozos sobrantes de PDMS adheridos al molde negativo de PU limpiando suavemente los bordes y la superficie con una toalla de papel seca. Utilice aire comprimido de la instalación, ajustado a 70-100 kPag para eliminar las partículas finas restantes.
NOTA: Proteja el molde negativo de PU del daño y de la acumulación de partículas colocándolo en una bolsa de plástico sellable y almacenándolo dentro de un cajón que esté protegido del tráfico del laboratorio. - Coloque el molde de PU en una campana química que haya sido protegida con una cubierta desechable. Coloque el molde horizontalmente a ~ 75 ° y rocíe la superficie activa con una capa uniforme de agente desmoldante. Rocíe el molde de arriba a abajo, luego de izquierda a derecha, mientras mantiene la lata a 15-20 cm del molde y usa un movimiento de barrido fluido hacia adelante y hacia atrás. Gire el molde 180 ° y repita los aerosoles, luego deje que el molde de PU se asiente en la campana química durante 10-15 minutos para que se seque.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que se use un agente desmoldante dentro de una campana de humos químicos, evite el contacto con la piel y los ojos, y consulte la Hoja de datos de seguridad (SDS) para conocer los protocolos de seguridad específicos
NOTA: Una película delgada debe cubrir completamente la superficie activa, pero el recubrimiento excesivo se puede transferir al PDMS en el siguiente paso, lo que a su vez puede afectar negativamente la siembra de hMMT. La superficie debe sentirse resbaladiza al tacto pero no mojada. - Vierta 100 g de PDMS uniformemente en el molde de PU y colóquelo dentro de una cámara de vacío conectada a una bomba de vacío de paletas rotativas. Desgasificar el molde lleno de PDMS durante ~ 45 minutos, rompiendo el sello de vacío cada 5-10 minutos durante los primeros 20 minutos para acelerar el proceso. Deje dentro de la cámara de vacío hasta que la mezcla de PDMS esté completamente vacía de todas las burbujas.
NOTA: Se utiliza una bomba de vacío de paletas rotativas para lograr un vacío más bajo y reducir el tiempo requerido para este paso. La desgasificación del molde lleno de PDMS se puede realizar utilizando la cámara de vacío de sobremesa y la bomba de vacío seco de servicio estándar, sin embargo, el tiempo para vaciar la mezcla de todas las burbujas será más largo. Lo que es esencial es la eliminación de todas las burbujas de la solución de polímero PDMS, especialmente en aquellas regiones destinadas a convertirse en postes de anclaje hMMT. Las burbujas en esta región resultarán en la rotura del poste del ancla, la pérdida de pozos de cultivo y, a su vez, darán como resultado que una pequeña pieza de PDMS permanezca encajada en el molde. - Transfiera el molde de PU lleno de PDMS desgasificado a un horno de 65 ° C, incubándolo durante la noche para curar el caucho líquido.
- Retire la placa positiva PDMS curada del horno y enfríe la placa a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
- Con un bisturí sin cuchillas, separe suavemente los PDMS curados del molde de PU pasando la parte posterior del mango entre el PDMS y las paredes del molde. Comience a lo largo del borde superior y separe los 4 lados, antes de empujar hacia abajo hasta la base del molde y separar esta porción. Este paso se completa cuando la parte posterior del mango funciona sin problemas entre el PDMS y las 4 paredes del molde de PU.
NOTA: Trabaje lenta y cuidadosamente con el bisturí sin cuchillas para evitar que se rompa el molde de PU o se rompa el PDMS. Este paso debería tomar 15-20 min. - Comenzando desde un extremo, use el bisturí sin cuchillas para levantar el borde del PDMS y trabaje los dedos entre la placa de cultivo PDMS curada y el molde de PU. Luego, usando ambas manos, empuje los dedos más debajo de la placa, pelando lentamente hacia arriba y fuera del molde de PU.
NOTA: Trabaje lentamente y use ambas manos para pelar uniformemente el plato. Minimice la flexión para reducir la probabilidad de rotura del poste del anclaje. Este paso debería tomar de 5 a 10 minutos. - Use una cuchilla de afeitar de un solo filo para cortar la placa en grupos de 6 ± 2 pocillos Miotácticos (Figura 1) para fines de siembra de tejidos. Coloque las placas MyoTACTIC completas, o porciones de placa, en una bolsa de esterilización de instrumentos y en autoclave durante un ciclo seco de 25 minutos (20 minutos de tiempo de esterilización y 5 minutos de tiempo de secado) a 120 °C y 100-140 kPag.
2. Cultivo de células progenitoras de mioblastos humanos inmortalizados
NOTA: Los mioblastos inmortalizados utilizados en este protocolo fueron obtenidos del Institut de Myologie (París, Francia)31.
- Obtenga un vial de células congeladas del dewar de nitrógeno líquido y descongele rápidamente el vial en un baño de agua a 37 °C (en menos de 1 min). Las células se congelan a una densidad de 7,5 x 105 células por 1 ml de medio de congelación que consiste en un 90% de suero bovino fetal (FBS) y un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Transfiera suavemente el contenido del vial a un tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de medio de lavado precalentado que consiste en 89% dmEM 1x, 10% FBS y 1% Pen/Strep para diluir el DMSO. Gire el tubo cónico de 15 ml a 400 x g durante 10 minutos y luego aspire los medios teniendo cuidado de evitar la bolita celular.
- Resuspender el pellet en 1 mL de medios de crecimiento que consisten en 84% de Medio Basal de Células Musculares Esqueléticas con Mezcla de Suplemento de Medio de Crecimiento de Células Musculares Esqueléticas, 15% fbS y 1% de Pluma / Estreptococo y luego transferir a un tubo cónico de 50 ml con 29 ml de medios de crecimiento.
- Transfiera 10 ml de medios que contengan aproximadamente 2,5 x 105 células a una placa de cultivo celular de 100 mm x 20 mm. Repita este paso con los 20 ml restantes de la solución celular. A continuación, transfiera las placas de cultivo celular a una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
- Refresque los medios culturales cada dos días. Cultive las células hasta que logren ~ 70% -80% de confluencia (típicamente 4-5 días), momento en el cual las células se preparan para la siembra. 1.5 x 10 Se requieren5 celdas para generar cada hMMT. Por lo tanto, pase las células según sea necesario para lograr el número requerido de células.
NOTA: Las líneas celulares progenitoras de mioblastos inmortalizadas nunca deben exceder el 80% de confluencia antes de sembrar células en pozos miotácticos, pasar las células o preparar existencias de congeladores. Las hMMT fabricadas a partir de células que han superado el 80% de confluencia a menudo no alcanzan la madurez contráctil. Los procedimientos de paso son idénticos a los métodos que se describen a continuación en el paso 3.
3. Siembra de hMMTs diseñados con MyoTACTIC
- Preparación de pocillos de cultivo MyoTACTIC y reactivos para la siembra de hMMT.
NOTA: Este protocolo proporciona detalles específicos para producir 6 hMMTs.- 2-3 h antes de la siembra celular, coloque una porción de placa MyoTACTIC de 6 pocillos en una placa de cultivo celular de 10 cm. Prepare cada pozo de cultivo Miotáctico individual agregando 100 μL de una solución Plurónica F-127 al 5% en cada pozo. Coloque la tapa en el plato de cultivo de 10 cm, aplique parafina para sellar el espacio entre el plato de 10 cm y la tapa, y luego coloque la placa de 10 cm que contiene la porción MyoTACTIC en una centrífuga equipada con un adaptador de hilandera de placa.
NOTA: Si no se dispone de un adaptador giratorio de placa centrífuga, se puede utilizar una punta de pipeta p20 para eliminar cuidadosamente las burbujas de detrás de los postes, asegurando así que toda la superficie de cultivo esté recubierta uniformemente. - Centrifugar a 1.550 x g durante 1 min para eliminar todas las burbujas dentro de los pozos de cultivo, especialmente detrás de los postes. Guarde la placa de cultivo celular de 10 cm que contiene la porción de la placa MyoTACTIC que contiene la solución Pluronic F-127 a 4 °C hasta que las células estén preparadas para la siembra.
NOTA: El recubrimiento Pluronic F-127 se puede aplicar durante tan solo 2 h a 24 h. Por ejemplo, los pozos se pueden llenar con la solución Pluronic F-127 al final del día para su uso al día siguiente. No exceda las 24 h ya que esto impactará negativamente en la remodelación de hMMT y no podrá formar tejidos sanos que alcancen la madurez contráctil. - Descongele lentamente una alícuota de extracto de membrana basal de 50 μL y una alícuota de trombina de 10 μL (solución madre de 100 U/ml) en hielo dentro de la campana de cultivo.
NOTA: No vuelva a congelar las alícuotas de extracto de membrana basal. Son de un solo uso. Las alícuotas de trombina son reutilizables, por lo tanto, vuelvan a congelarse hasta 5 veces después de su uso. - Pesar ~ 7 mg de fibrinógeno en polvo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y luego transferir a la campana de cultivo celular. Añadir 700 μL de solución de NaCl al 0,9% (en peso/vol) en agua (o solución salina) para llegar a una solución de concentración final de 10 mg/ml. No vórtice el fibrinógeno para disolverse, en su lugar coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular de 37 ° C durante 3-5 min.
- Retire y mueva el tubo suavemente, luego haga girar por pulso la solución disuelta en una mini centrífuga de sobremesa (microfuge) y vuelva a la campana de cultivo. Filtre la solución de fibrinógeno con una jeringa de 1 ml equipada con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Transfiera la solución de fibrinógeno disuelto al hielo junto con el extracto de la membrana basal y las alícuotas de trombina.
- Por último, prepare los medios de siembra hMMT que se introducirán en los pozos de cultivo después de la siembra de los tejidos. Este medio contiene Medio Basal de Células Musculares Esqueléticas suplementado con 20% de FBS, 1% de P/S y 3% de ácido 6-aminocaproico (ACA; la concentración final de 1,5 mg/mL se alcanza diluyendo a partir de una solución madre de 50 mg/mL; % se expresa como v/v). Precaliente el medio a 37 °C antes de su uso.
- 2-3 h antes de la siembra celular, coloque una porción de placa MyoTACTIC de 6 pocillos en una placa de cultivo celular de 10 cm. Prepare cada pozo de cultivo Miotáctico individual agregando 100 μL de una solución Plurónica F-127 al 5% en cada pozo. Coloque la tapa en el plato de cultivo de 10 cm, aplique parafina para sellar el espacio entre el plato de 10 cm y la tapa, y luego coloque la placa de 10 cm que contiene la porción MyoTACTIC en una centrífuga equipada con un adaptador de hilandera de placa.
- Preparación de células para la siembra de hMMT.
- Recoger las placas de cultivo celular de la incubadora de cultivo. Aspire los medios de cada placa, luego lave las células una vez con D-PBS agregando 5 ml de D-PBS en cada placa de cultivo. A continuación, aspire el D-PBS y separe las células agregando 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% en cada plato de cultivo. Colocar en la incubadora de cultivo celular durante 3 min.
- Detenga la tripsina agregando 3 ml de medio de lavado (89% de 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen / Strep) al plato de cultivo. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de tamaño adecuado y luego gholeing de las células centrifugando a 400 x g durante 10 min. Aspirar el medio teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Luego vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml del medio de lavado.
- Cuente las células usando un hemocitómetro y un tinte azul tripano bajo microscopía de campo brillante.
Si se utilizan múltiples placas de células, esta suspensión celular estará muy concentrada. Diluya las suspensiones celulares antes de contar según sea necesario. - Dado que cada tejido requiere 150,000 células resuspendidas en 15 μL de la mezcla de matriz extracelular (ECM), se requieren 900,000 células en 90 μL de mezcla de ECM para 6 tejidos. Para tener en cuenta la pérdida de solución célula-ECM que ocurre durante el proceso de preparación debido a la formación de burbujas o la pérdida de pipeta, prepare una mezcla adicional de células-ECM (es decir, 8 tejidos o 1,200,000 células en 120 μL de ECM). Transfiera el volumen de suspensión celular que contiene 1.200.000 células a un nuevo tubo cónico. Aumente el volumen a 10 ml con medio de lavado y gire a 400 x g durante 10 min.
- Mientras las células están girando, prepare una mezcla de ECM de 150 μL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando la siguiente receta. Primero agregue 60 μL de DMEM (40% de volumen), luego agregue 60 μL de solución de Fibrinógeno 10 mg / ml (40% de volumen) y finalmente agregue 30 μL de extracto de membrana basal (20% de volumen). Guarde la mezcla de ECM en hielo hasta su uso.
NOTA: Utilice siempre puntas preenfriadas a -20 °C cuando trabaje con soluciones que contengan extracto de membrana basal. La mezcla de ECM contiene 4 mg/ml de fibrinógeno.
- Siembra de hMMTs
- Recoge el tubo cónico que contiene las células hiladas y aspira los medios teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Mueva vigorosamente el extremo del tubo con un dedo enguantado para desalojar el gránulo y continúe moviendo hasta que el gránulo aparezca como una suspensión celular.
NOTA: Es importante aspirar la mayor cantidad posible de medios de lavado para garantizar que la suspensión de ECM celular esté en la dilución deseada. Use una pipeta para quitar el medio de lavado restante si es necesario. - Transfiera 120 μL de la solución de ECM al tubo que contiene el gránulo celular. Pipete hacia arriba y hacia abajo para resuspendir completamente las células dentro del ECM para generar una suspensión de una sola célula. Pipetear lenta y cuidadosamente para evitar la introducción de burbujas, lo que reduciría el volumen de trabajo. Luego, coloque la solución de ECM celular en hielo hasta su uso.
- Recupere las porciones de la placa MyoTACTIC que contienen los pocillos MyoTACTIC recubiertos con Pluronic F-127 del refrigerador de 4 ° C y coloque el plato de 10 cm que contiene los pocillos MyoTACTIC encima de una bolsa de hielo dentro de la campana de cultivo celular.
- Aspire la solución Pluronic F-127 de cada pozo. El PDMS es poroso y absorberá la solución Pluronic F-127, especialmente si las placas se hicieron girar con una centrífuga. Permita que la solución residual de Pluronic F-127 se libere y se asiente en el fondo del pozo dejando que los pozos se asienten durante 5 minutos, luego aspire nuevamente.
NOTA: Use una pipeta Pasteur con una punta p1250 unida en el extremo y una punta p200 sobre la punta p1250 al aspirar la solución Pluronic F-127. Esto mejorará la precisión para evitar la aspiración accidental de las estructuras de postes. Evite raspar el área de siembra de células ovaladas en forma de piscina en el fondo del pozo con la pipeta, ya que esto interrumpe el recubrimiento Pluronic F-127 e interfiere con el proceso de autoorganización hMMT. La técnica adecuada es colocar la punta de la pipeta justo sobre la piscina ovalada mientras se aspira la solución Pluronic F-127. - Pipetee la suspensión de la célula-ECM con cuidado para resuspendir cualquier célula que pueda haberse hundido en la parte inferior del tubo. Luego transfiera 105 μL de suspensión de ECM celular a un tubo fresco de 1,5 ml preenfriado. Tenga cuidado de agarrar el tubo cerca de la parte superior para evitar que la solución se caliente.
- Añadir 0,84 μL de la solución madre de trombina de 100 U/ml a la suspensión de ECM de células de 105 μL para llegar a una concentración final de 0,2 U/mg de fibrinógeno. Pipetear rápidamente, con cuidado y a fondo para mezclar, evitando la introducción de burbujas.
NOTA: La trombina inicia la conversión rápida de fibrinógeno en un coágulo de fibrina. Como tal, hay un tiempo limitado para sembrar los tejidos tras la adición de trombina. Para evitar la coagulación prematura antes de que la mezcla célula-ECM se transfiera a los pozos de cultivo, ajuste una pipeta p20 a 15 μL antes de agregar la trombina. Use puntas preenfriadas o sumerja la punta de la pipeta en DMEM helado durante unos segundos antes de recolectar y transferir 15 μL de la mezcla de célula-ECM a cada pozo. Es una buena práctica preparar alícuotas de mezcla de células y ECM de tal manera que no se seplanten más de 6 hMMT a la vez. - Para sembrar los tejidos, agregue 15 μL de mezcla célula-ECM (es decir, 150,000 células) a cada pozo individual. Agregue cuidadosamente la mezcla de celda-ECM al centro de la piscina ovalada y evite presionar la punta de la pipeta en el fondo del pozo. Luego, con dos movimientos ligeros, extienda la suspensión celular detrás de cada poste en el pozo. Una vez que la superficie esté recubierta uniformemente con la suspensión de ECM celular, pase al siguiente pozo.
NOTA: Trabaje de manera eficiente para evitar la gelificación prematura de la mezcla célula-ECM en el tubo antes de que se siembren todos los tejidos. Al sembrar los pozos, es extremadamente importante evitar la transferencia de burbujas, ya que la burbuja interferirá con la remodelación del hMMT, haciendo que el hMMT sea inutilizable. - Coloque la tapa en la placa de cultivo de 10 cm que contiene los pocillos sembrados y transfiérala a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante aproximadamente 5 min.
NOTA: Coloque el tubo de microcentrífuga con mezcla residual de células y ECM en la incubadora como confirmación del proceso de polimerización en gel. - Después de que la mezcla célula-ECM se haya polimerizado, agregue 200 μL de medios de siembra hMMT precalentados a cada pozo MyoTACTIC. Reemplace la tapa del plato de 10 cm y devuelva las porciones del plato MyoTACTIC dentro del plato de 10 cm a la incubadora. Este punto de tiempo se conoce como Día -2. No perturbe los tejidos hasta el siguiente paso.
- Recoge el tubo cónico que contiene las células hiladas y aspira los medios teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Mueva vigorosamente el extremo del tubo con un dedo enguantado para desalojar el gránulo y continúe moviendo hasta que el gránulo aparezca como una suspensión celular.
- Diferenciación de hMMTs
- Después de 2 días de incubación, retire el medio de siembra hMMT cuidadosamente usando una pipeta y reemplace con 200 μL de medios de diferenciación precalentados que contengan 2% de suero de caballo, 1% de Pen/Strep, 4% de ACA (es decir, 2 mg/ml de concentración final de una concentración de stock de 50 mg/mL; % se expresa como v/v) y 10 μg/mL de insulina recombinante humana en DMEM. Este punto de tiempo se conoce como Día 0 de diferenciación.
- Cada dos días a partir de entonces, intercambie la mitad de los medios con medios de diferenciación frescos hasta el día 12 de diferenciación, el último día de la cultura(Figura 2a).
NOTA: Los detalles del protocolo para fabricar hMMT utilizando mioblastos humanos primarios se han publicado en otra parte30. Si hay preocupaciones sobre la viabilidad celular después de la siembra, incube hMMT con calceína y yoduro de propidio para cuantificar la viabilidad.
4. Estimulación eléctrica y análisis de la postdespinción inducida por hMMT
- Configure un soporte de escenario de vidrio o plástico de fondo transparente en un microscopio invertido y conecte una cámara de teléfono inteligente al ocular del microscopio utilizando un soporte de cámara de microscopio. Se utilizará microscopía de contraste de fase con un aumento de 10x (Figura 3a).
NOTA: Cualquier microscopio de contraste de fase invertida equipado con un objetivo de aumento de 10x será apropiado. Las construcciones del pozo PDMS se retirarán del plato de 10 cm y se colocarán directamente sobre el soporte de la etapa inferior transparente y, por lo tanto, se abrirán al aire. Esterilizar todas las superficies y equipos con etanol al 70% y minimizar el tráfico en el área durante la experimentación. - Para preparar los electrodos de estimulación eléctrica, corte ~ 30 cm de alambre de cobre recubierto de estaño. Luego, comenzando en el cubo de una aguja biselada regular de 25 G, envuelva ~ 10 cm del cable firmemente alrededor de la mitad superior, dejando ~ 20 cm de exceso de alambre. Repita durante una segunda aguja y luego corte el cubo de cada aguja.
NOTA: El cable debe estar apretado alrededor de la aguja para garantizar que no se mueva y la parte envuelta en alambre del electrodo no debe tocar el PDMS, ya que esto puede impedir la generación de campo eléctrico. - Conecte BNC al cable conector del clip del cocodrilo a un canal de salida en el generador de forma de onda y configure el canal para pulsos cuadrados con un ciclo de trabajo del 20%, amplitud de 5 V (intensidad del campo eléctrico de 10 V / cm). La frecuencia se alterará entre 0,5 Hz y 20 Hz para las contracciones de contracción y tétanos, respectivamente.
NOTA: La configuración del generador de forma de onda puede requerir una optimización específica del experimento - Coloque una porción de placa Miotáctica que contenga hMMT en el escenario del microscopio e inserte suavemente cada extremo de bisel de electrodo en el PDMS directamente detrás de cada poste en la piscina ovalada. Pegue con cuidado las secciones de 20 cm de exceso de alambre hasta la etapa del microscopio para que las agujas permanezcan verticales y ~ 10 cm de cada cable permanezcan libres para la conexión(Figura 3a).
PRECAUCIÓN: Nunca coloque un dedo desnudo sobre cualquiera de los extremos del electrodo. Asegúrese de que se use un dedal en el dedo índice para aplicar una ligera presión al electrodo al insertarlo en el PDMS. - Enfoque el campo de visión del microscopio en uno de los dos postes, de modo que el enfoque sea nítido en el borde del poste más cercano al electrodo. Luego, bloquee el enfoque de la cámara del teléfono inteligente en el área más clara de la publicación. Esto es importante para el análisis posterior, ya que un cambio en el enfoque, mientras que la grabación interferirá con el análisis.
- Conecte los extremos libres de los cables con cinta adhesiva al generador de forma de onda a través de abrazaderas de cocodrilo (Figura 3a).
- Inicie la grabación de video en la cámara del teléfono inteligente y luego encienda la salida del canal para iniciar la estimulación. Inducir a la hMMT a someterse a 3 contracciones de contracción y 3 contracciones de tétanos, con 2 min de descanso entre la contracción y la serie de estimulación del tétanos.
- Apague la salida del canal, separe los clips de cocodrilo de los cables de cobre recubiertos de estaño, retire la cinta de los cables y limpie cada electrodo con etanol al 70% antes de insertarlo en los pozos hMMT posteriores. Repita el procedimiento del paso 4.5 para todos los hMMT.
NOTA: Limite el tiempo que los hMMT pasan fuera de la incubadora estimulando no más de 3 tejidos a la vez. Si quedan por analizar hMMT adicionales dentro de la porción de la placa MyoTACTIC, devuelva la placa a la incubadora durante 10 minutos para permitir que las hMMT vuelvan a 37 °C. - Para analizar la deflexión posterior para calcular la generación de fuerza hMMT, use el script personalizado, que se ha puesto a disposición en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Siga las instrucciones de README.md para configurar e iniciar el script, luego abra cada video de seguimiento de publicaciones para realizar el análisis de fuerza.
- Seleccione una región de interés (ROI) a lo largo del borde de la publicación para realizar un seguimiento del desplazamiento de la publicación. Pulse Intro para confirmar el ROI y pulse Intro de nuevo para ejecutar el script ( Vídeocomplementario 1).
NOTA: Las grandes deflexiones hacen que el rastreador falle. Si el rastreador falla durante la contracción, el tamaño del ROI se puede aumentar para que el seguimiento sea menos sensible, pero permite el seguimiento de grandes desviaciones. En el código se proporcionan tres tamaños y se pueden ajustar ajustando los comentarios del script. - El script termina con dos requisitos de entrada. Primero, ingrese y para confirmar que el video contenía múltiples contracciones. En segundo lugar, escriba y (sí) o n (no) para exportar los resultados a un archivo . Archivo CSV (Video Suplementario 1).
- Asegúrese de que los resultados posteriores a la deflexión se informen como desplazamiento en píxeles para cada contracción. Convierta píxeles a valores de μm para la configuración de aumento de 10x del microscopio. Luego, convierta los números de desplazamiento posterior a fuerzas contráctiles absolutas (μN) multiplicando los valores (μm) por el factor de conversión fuerza-desplazamiento de 2.36 μN / μm, que corresponde a la relación agente de curado a monómero 1:15 del PDMS utilizado en la fabricación Miotáctica30.
5. Análisis transitorio de calcio mediante estimulación eléctrica
NOTA: Para los experimentos de manejo de calcio, los mioblastos inmortalizados se transdujeron de manera estable con el reportero MHCK7-GCAMP6 como se describió anteriormente11,12. Las células transducidas se clasificaron FACS para GFP para obtener la población positiva, y luego se utilizaron para fabricar hMMT. Los métodos alternativos para la obtención de imágenes de calcio, como el uso de colorantes métricos de proporción como Fura-2 AM e Indo-1 o imágenes de fluorescencia de por vida de indicadores de calcio (por ejemplo, Fluo-4 o Oregon Green BAPTA1) pueden ser susceptibles de nuestro sistema.
- Configure la etapa del microscopio y el equipo de estimulación (electrodos, generador de forma de onda, etc.) como se describió anteriormente en el paso 4. Para este experimento, utilice un aumento de 4x.
NOTA: Se necesitará una habitación oscura y un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara CCD. - Inicie el software de imágenes de microscopio, seleccione el canal de filtro FITC (luz azul) y seleccione la función de grabación de películas. Ajuste a una exposición de 500 ms y una resolución de 680 x 510 (Binning 2x2).
NOTA: El software de imágenes puede variar y la exposición es configurada manualmente por el usuario. Tenga cuidado de evitar la hMMT sobre la exposición antes de la estimulación. En reposo, un contorno / sombra de tejido oscuro con fluorescencia espontánea es normal, mientras que una imagen de tejido claro está sobreexposición(Video suplementario 2). Asegúrese de que la exposición sea consistente para todos los hMMT dentro de un experimento. - Cierre el obturador del microscopio y mantenga el canal FITC apagado hasta que esté listo para registrar el manejo del calcio.
- Cuando todo el equipo y el software estén configurados, recupere la porción de la placa MyoTACTIC que contiene los hMMT que se van a analizar y colóquela directamente en el escenario del microscopio. Luego, inserte y conecte los electrodos como se describió anteriormente en el paso 4.
- Utilice campo brillante para enfocar el campo de visión en el centro de la hMMT seleccionada. Luego, apague la lámpara.
- Abra el obturador de canal FITC del microscopio, confirme que la luz azul está encendida y, a continuación, seleccione Grabación de película en el software.
- Encienda la salida en el generador de forma de onda para iniciar la estimulación eléctrica. Inducir a la hMMT a sufrir 8 contracciones de contracción y 8 contracciones del tétanos. Permita 2 minutos de descanso entre la contracción y la serie de estimulación del tétanos, tiempo durante el cual el obturador FITC está en la posición cerrada.
NOTA: Permita 10 s de actividad espontánea antes y después de la estimulación eléctrica para registrar la fluorescencia mínima para fines de cálculo y análisis de datos. - Apague la salida del canal, separe los clips de cocodrilo de los cables de cobre recubiertos de estaño, retire la cinta de los cables y limpie cada electrodo con etanol al 70% antes de insertarlo en los pozos hMMT posteriores. Repetir el procedimiento de estimulación y registro para todos los hMMTs.
- Guarde películas en formato de archivo TIFF para su análisis en ImageJ o en un software de imágenes alternativo.
NOTA: Limite el tiempo que los hMMT pasan fuera de la incubadora estimulando no más de 3 tejidos a la vez. Si queda por analizar hMMT adicional dentro de la porción de la placa MyoTACTIC, devuelva el dispositivo a la incubadora durante 10 minutos para permitir que los hMMT vuelvan a 37 °C. - Para analizar los datos transitorios de calcio, primero abra ImageJ. Seleccione Analizar, luego Establecer medidas, luego seleccione el valor gris medio y anule la selección de todas las demás opciones. Cuando haya terminado, abra un video de calcio (.tiff) (Video suplementario 2).
- Describa el borde de la microtejida utilizando una herramienta de selección de polígonos y guarde esta área como el ROI (Video suplementario 2). En Más en la ventana administrador de ROI, seleccione Multimedición y mida la intensidad fluorescente para todos los segmentos de archivo en una fila por segmento (Vídeo suplementario 2).
- Copie todas las mediciones, incluido el número de rebanada (fotograma), en una hoja de cálculo y compare la intensidad fluorescente de cada rebanada con la intensidad fluorescente espontánea mínima del archivo utilizando ΔF / F0 = (Finmediato - Fmínimo) / Fmínimo ( Videosuplementario 2).
- Calcule el tiempo para cada fotograma multiplicando la velocidad del fotograma de grabación de vídeo por el número de segmento (fotograma), y trace ΔF/F0 contra el tiempo para la respuesta transitoria de calcio hMMT a la estimulación (Video suplementario 2).
- Seleccione la señal transitoria de calcio máximo para cada una de las 6 contracciones consecutivas y los valores promedio para calcular el cambio de intensidad fluorescente pico medio relativo de cada hMMT(Video suplementario 2).
NOTA: Siempre excluya los datos que surjan de la primera contracción de contracción del análisis general. Se ha proporcionado una hoja de cálculo titulada "Plantilla de manejo de calcio.xlsx" en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) para facilitar el análisis transitorio de calcio hMMT. Las celdas rellenables donde se van a introducir los valores y las entradas se resaltan en gris. Asegúrese de ajustar los números de selección de picos, ya que esta es solo una guía para ayudar en la selección de picos (Video suplementario 2).
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Representative Results
Aquí se describen métodos para fundir una plataforma de cultivo MyoTACTIC basada en PDMS de 96 pocillos desde un molde de PU, fabricar matrices de tejidos de réplica de hMMT y analizar dos aspectos de la función de hMMT dentro de la generación de fuerza del dispositivo de cultivo y el manejo de calcio. La Figura 1 ofrece una visión general esquemática de la preparación de los pocillos de cultivo MyoTACTIC antes de la siembra de hMMT. PDMS es un polímero a base de silicona ampliamente utilizado, que se puede moldear fácilmente para crear dispositivos complejos32. Se diseñó un protocolo basado en PDMS para fundir un número ilimitado de dispositivos de cultivo de 96 pocillos a partir de un molde de PU negativo fabricado30. La placa positiva PDMS curada final es flexible y se puede cortar fácilmente en unidades funcionales de menor tamaño con la ayuda de una cuchilla de afeitar de un solo borde (Figura 1). Esto permite al usuario escalar el dispositivo para satisfacer las necesidades de réplica hMMT específicas de su diseño experimental. Estas unidades funcionales más pequeñas también son beneficiosas para superar la limitación de trabajar con un andamio ECM que polimeriza rápidamente, como los hidrogeles de fibrina, al ajustar fácilmente el número de pozos para que coincida con la velocidad de siembra celular del usuario. Además, el PDMS es fácilmente esterilizable en autoclave y se puede almacenar durante un período indefinido. Finalmente, desde un punto de vista logístico, una placa MyoTACTIC completa puede ser cubierta por cualquier tapa de placa estándar de 96 pocillos, y la dimensión y el perfil de las porciones de la placa MyoTACTIC son susceptibles de incubación dentro de una placa de cultivo de 10 cm, para garantizar la esterilidad del cultivo hMMT. El recubrimiento de la solución Plurónica F-127 antes de la siembra celular cumple una doble función de proporcionar una medida adicional de la esterilización del pozo de cultivo, y como surfactante no iónico, evitando la adhesión celular a favor de la remodelación uniforme de la célula - ECM (Figura 1).
Cuando la población de células progenitoras miogénicas inmortalizadas está lista para la experimentación, las células se encapsulan en un hidrogel compuesto de fibrinógeno y extracto de membrana basal. La mezcla célula-ECM se deposita uniformemente en la piscina ovalada en el fondo de cada pozo myotáctico, y luego, durante un período de cultivo de 14 días, las células se autoorganizan espacialmente a través de estos dos postes verticales para formar un microtiso 3D poblado con un lecho de miotubos alineados, multinucleados y estriados que se asemejan a aspectos de la organización del tejido nativo (Figura 2a, g,h). Durante el proceso de remodelación, se genera tensión uniaxial entre los dos puntos de anclaje, y esto guía el proceso de autoorganización del tejido para a su vez impulsar la formación de un tejido compacto. Durante el período de diferenciación, el ancho de los hMMT construidos a partir de mioblastos derivados de pacientes sanos sigue siendo bastante consistente. Sin embargo, en casos de errores que interfieren con la remodelación de hMMT, esta uniformidad se pierde (Figura 2a-f), lo que hace que esta métrica simple sea útil en la evaluación del control de calidad de hMMT. Por ejemplo, la mezcla demasiado entusiasta de la suspensión de la célula - ECM puede resultar en la formación de burbujas. Las burbujas trasladadas al pozo MyoTACTIC impiden la remodelación de hMMT. En tales casos, las burbujas desplazan algunos o todos los mioblastos del área ocupada por la burbuja, formando eventualmente una grieta en el hMMT final(Figura 2b;ver flecha roja). Otro ejemplo se relaciona con la integridad del recubrimiento Pluronic F-127 en los pozos. Pluronic F-127 es un surfactante no iónico que evita que las células se adhieran al pozo miotáctico. Si el recubrimiento se raspa durante la aspiración, los mioblastos se adherirán a la superficie de los pozos Miotácticos, formando nuevos puntos de anclaje y dando como resultado miotubos que no están alineados a través de los dos postes(Figura 2c). Los errores adicionales también pueden resultar en una remodelación aberrante de hMMT, como se ve en la Figura 2d-f. La vitalidad celular después de la siembra también se puede evaluar utilizando ensayos de tinción basados en yoduro de calceína / propidio. Cuando se evitan estos errores técnicos, los hMMT se rellenan con un lecho de miotubos alineados y multinucleados que se extienden a lo largo de cada hMMT(Figura 2g). Los miotubos son bastante uniformes en tamaño a lo largo de su longitud y entre diferentes hMMTs (Figura 2h-i). Los miotubos se caracterizan por la presencia de estrías de sarcómeros que se visualizan mediante inmunotinción para la α sarcomérica - actinina (SAA; Figura 2h).
Las propiedades funcionales también se pueden examinar en hMMTs a partir de alrededor de 7 días de diferenciación. La configuración experimental para completar estos estudios funcionales se ilustra en la Figura 3a. La configuración de microscopía se muestra en la parte superior de una mesa de vibraplano; sin embargo, esto no es necesario para completar las investigaciones funcionales. En los estudios funcionales, los electrodos generados como se describe en la sección de estimulación eléctrica del protocolo se insertan en el PDMS, de modo que los electrodos residen detrás de los postes. Es importante tener una buena visualización de la región del poste antes de insertar el electrodo, ya que la necesidad de reinsertar puede provocar el desplazamiento del tejido del poste. La inserción adecuada de los electrodos también es importante para obtener un enfoque nítido de la publicación para que la post-deflexión pueda rastrearse posteriormente con el script python. La Figura 3b muestra un desplazamiento representativo del poste de la placa del pozo Miotáctico en respuesta a la estimulación eléctrica hMMT de baja (contracción, 0,5 Hz) y alta (tétanos, 20Hz). La cuantificación del desplazamiento posterior se puede utilizar para calcular la fuerza contráctil inducida de hMMTs (Figura 3c). Cuando esta información se combina con el área de sección transversal hMMT, se puede determinar la fuerza específica30. Además, los transitorios de calcio juegan un papel importante en la contracción muscular. La transducción estable de mioblastos del músculo esquelético con un indicador de calcio codificado genéticamente como GCaMP612,30,33,34, permite la vigilancia en vivo de los transitorios de calcio12,30,34. Los transitorios de calcio se analizaron utilizando la configuración de estimulación eléctrica descrita anteriormente hasta estimular los mMMT del día 12 generados con mioblastos inmortalizados que expresan el reportero MHCK7-GCAMP6(Figura 4a),y se cuantificaron como intensidad fluorescente máxima media durante la estimulación eléctrica de frecuencia baja (contracción, 0,5 Hz) y alta (tétanos, 20Hz)(Figura 4b). Se observa que las propiedades de manejo de calcio hMMT medidas a través de diferentes experimentos son relativamente consistentes (Figura 4b). Los métodos de cuantificación para la postdespinción y el manejo del calcio se describen en el Video Suplementario 1 y el Video Suplementario 2.
Figura 1: Preparación de la placa MyoTACTIC PDMS antes de la siembra de hMMT. La plataforma de 96 pocillos conocida como MyoTACTIC se fabrica curando primero el polidimetilsiloxano (PDMS) dentro de un molde de poliuretano negativo (PU). La plataforma de cultivo basada en PDMS se pela cuidadosamente del molde de PU negativo. En un entorno académico, el dispositivo PDMS se corta en unidades más pequeñas que contienen 6 ± 2 pozos funcionales. Estos pozos se colocan en una bolsa de esterilización, se colocan en autoclave y se almacenan hasta su uso. Hasta un día antes de su uso, el número deseado de porciones del dispositivo se coloca dentro de una placa de cultivo de 10 cm y se agrega Pluronic F-127 a cada pozo. Se agrega la tapa del plato de 10 cm, el borde se sella con parafilm antes de incubar el plato a 4 ° durante 2-24 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:MyoTACTIC apoya la autoorganización de hMMT y la formación de miotubos alineados. (a ) (arriba) Línea de tiempo esquemática de la autoorganización de hMMT y posterior maduración de miotubos durante un período de cultura de 14 días. (abajo) Imágenes representativas de contraste de fase 4x para ilustrar la cinética de la autoorganización de mioblastos inmortalizados en los dos postes verticales que dan como resultado la formación de un hMMT 3D. Barra de escala, 500 μm. (b-f) Imágenes representativas de contraste de fase 4x de hMMTs en el día 12 de diferenciación que muestran resultados de hMMT causados por (b) una burbuja dentro de la célula - ECM en el momento de la siembra (los puntos de flecha roja a la burbuja inducen daño hMMT), (c) aspiración incorrecta del recubrimiento de solución Pluronic F-127, y (d-f ) Remodelación excesiva de hMMT que puede indicar una gelificación inadecuada de ECM, falta de actividad de ACA en medios de cultivo, cuidado inadecuado de la línea parental de mioblastos, etc. Barra de escala, 500 μm. (g) Imagen confocal representativa en mosaico y aplanada de un día 12 hMMT tomada a un aumento de 10x. Los hMMT se fijan directamente en el molde PDMS, luego se retiran cuidadosamente y se colocan en una placa de cultivo de 96 pocillos para teñirlos. Sarcomérica α-actinina (SAA) mostrada en magenta, y contratinta nuclear Hoechst 33342 mostrada encian. Barra de escala, 500 μm. (h) Imagen confocal representativa de un día 12 hMMT a un aumento de 40x. Los miotubos y núcleos de hMMT se visualizan mediante inmunotinción para SAA (magenta) y contratinción con Hoechst 33342 (cian). Barra de escala, 50 μm. (i) Gráfico de diagrama de puntos del diámetro medio del miotubo hMMT en el día 12 de diferenciación. Los valores se reportan como media ± SEM. n = 8 hMMTs de 3 réplicas biológicas, distinguidas por formas de símbolos, por lo que se analizan un mínimo de 30 miotubos por hMMT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición in situ de la fuerza contráctil dentro de la plataforma Miotáctica. (a ) Representación de la disposición de estimulación eléctrica (izquierda). Aunque se muestra en esta configuración, no se requiere una tabla de vibraplane. Una cámara y una montura de teléfono inteligente se equiparon al ocular de un microscopio invertido equipado con una lámpara de fluorescencia para las grabaciones de video de los desplazamientos de postes de estimulación eléctrica hMMT (izquierda). Las agujas de 25 G se envolvieron con alambres de cobre recubiertos de estaño (abajo a la derecha), se conectaron a un cable conector de clip BNC a caimán (arriba a la derecha) y se fijaron a un generador de forma de onda arbitraria. La colocación de electrodos durante la estimulación eléctrica se muestra en la parte inferior derecha. b)Instantáneas representativas tomadas de vídeos posteriores a la desviación adquiridos de hMMTs en el día 12 de diferenciación. Los videos fueron capturados a un aumento de 10x. Las líneas verticales blancas sólidas muestran la colocación del poste cuando las hMMT están relajadas, mientras que las líneas verticales blancas punteadas muestran el desplazamiento posterior a la estimulación de frecuencia alta (tétanos 20 Hz) o baja (0,5 Hz). Barra de escala, 100 μm. (c) Gráfico de diagrama de puntos de la contracción media de hMMT (0,5 Hz) y la fuerza contráctil inducida por el tétanos (20 Hz) en el día 12 de la diferenciación. Los valores se reportan como media ± SEM. n = 9 hMMTs de 3 réplicas biológicas, distinguidas por formas de símbolos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición in situ del manejo del calcio dentro de la plataforma MyoTACTIC. (a ) Imágenes representativas de una grabación de video de aumento 4x de GCaMP6+ transitorios de calcio espontáneos y transitorios de calcio en respuesta a la estimulación eléctrica de baja (contracción por contracción, 0.5 Hz) y alta (contracción del tétanos, 20 Hz). Los hMMT están delineados por una línea amarilla punteada. Barra de escala, 200 μm. (b) Gráfico de diagrama de puntos que muestra la cuantificación de la intensidad fluorescente máxima media por hMMT después de la estimulación eléctrica de frecuencia baja (contracción de contracción, 0,5 Hz) y alta (contracción del tétanos, 20 Hz). Los valores se reportan como media ± SEM. n = 9 hMMTs de 3 réplicas biológicas, distinguidas por formas de símbolos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video suplementario 1: Demostración de métodos para analizar datos posteriores a la desviación. Un video representativo del análisis posterior a la desviación en el día 12 de la diferenciación siendo rastreada por el guión personalizado durante la estimulación del tétanos. Primero, el tamaño del ROI se selecciona directamente dentro del script de seguimiento de publicaciones. A continuación, el video se abre seleccionando el botón de reproducción para ejecutar el script. Se selecciona una región enfocada nítida de la publicación como el ROI y se coloca el cuadro de seguimiento de publicaciones azul. Se presiona Intro para bloquear el ROI y se presiona de nuevo para ejecutar el script. "y" se introduce como respuesta al mensaje "¿Vídeo de contracción múltiple? [Y/N]", luego se ingresa 'n' como respuesta al mensaje "¿Exportar ubicaciones de publicaciones como archivo de .csv? [Y/N]". La deflexión posterior como desplazamiento relativo en píxeles es la salida final. Haga clic aquí para descargar este video.
Video suplementario 2: Demostración de métodos para analizar datos transitorios de calcio GCaMP6. Un video representativo del análisis de manejo de calcio de epifluorescencia en el día 12 de diferenciación durante la estimulación del tétanos. En primer lugar, se ha abierto un vídeo de transitorios de calcio (guardado como una serie de imágenes tiff) en ImageJ y el usuario ha navegado a través de fotogramas hasta que el hMMT es visible. Luego, se confirma la medición de análisis requerida "valor gris medio" y se delinea el hMMT utilizando la herramienta de dibujo poligonal. Este esquema se guarda a medida que la región de interés y la intensidad fluorescente de cada segmento de video se analizan utilizando múltiples medidas. Estas mediciones se copian en la hoja de cálculo "Plantilla de manejo de calcio" con datos de marco y valores máximos transitorios de calcio completados y confirmados. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Este manuscrito describe métodos para fabricar y analizar un modelo de cultivo 3D hMMT que se puede aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La plataforma MyoTACTIC es rentable, fácil de fabricar y requiere un número relativamente pequeño de células para producir microtejidos musculares esqueléticos. Los hMMT formados dentro de la plataforma de cultivo MyoTACTIC están compuestos por miotubos alineados, multinucleados y estriados, y responden a los estímulos eléctricos iniciando transitorios de calcio que desencadenan la contracción(Figura 2, Figura 3, Figura 4). Estudios previos demostraron que los hMMT ofrecen una respuesta similar a los estímulos bioquímicos y pueden alcanzar niveles de maduración que coinciden con los reportados en modelos de músculo esquelético 3D de mayor formato12,30.
Un tema crítico a lo largo de la fabricación de placas MyoTACTIC y la generación de hMMT es garantizar que se eviten las burbujas y, si se forman, se hayan eliminado. Para facilitar la fundición de un solo paso de un molde PDMS operable, se había generado un molde de PU aguas abajo del molde de plástico inicial impreso en 3D previamente descrito por Afshar et al.30. El molde de PU que se ha generado permite a los usuarios producir una huella de 96 pozos de molde PDMS por lo que un máximo de 96 pozos son funcionales (contienen dos postes), según lo dictado por el paso de fabricación del molde de PU. Durante la fabricación de la placa PDMS MyoTACTIC, los nuevos usuarios a menudo pasan por alto burbujas más pequeñas que permanecen en el PDMS líquido, incluso después de la desgasificación. Las burbujas que se localizan en regiones del molde de PU correspondientes a las estructuras de poste flexibles de anclaje darán como resultado la rotura posterior de la separación del molde de PU de la placa de cultivo de PDMS y, en el proceso, dejarán una pequeña pieza de PDMS curado en el molde de PU. El aire comprimido se puede utilizar para eliminar estos restos de PDMS curados, y si no lo hace, reducirá efectivamente el número de pozos funcionales disponibles para futuras fundiciones de placas. Por lo tanto, es fundamental asegurarse de que todas las burbujas se hayan eliminado antes de que se cure la placa PDMS, ya que una ventaja de esta plataforma es que es un dispositivo independiente, por el cual todas las características de la placa se funden en un solo paso en lugar de requerir que cada punto de anclaje de microtejido individual se introduzca en los pozos de cultivo manualmente35, 36,37. La mayoría de los estudios académicos de laboratorio no requieren una placa de cultivo Miotáctica completa. Para maximizar el uso de cada placa PMDS, se corta manualmente en grupos de 6 ± 2 pocillos MyoTACTIC. Para mejorar este proceso, un molde de PU que permite a los usuarios pelar unidades funcionales de 6 ± 2 pozos MyoTACTIC puede eliminar por completo este paso de corte de placa. Además, las burbujas grandes introducidas en la solución de ECM celular durante la mezcla o durante el procedimiento de siembra de tejido afectarán la formación adecuada de tejido. Estas grandes burbujas desplazan a las células de la región que ocupa la burbuja, lo que a menudo resulta en hMMT con regiones con pocos miotubos que sucumbirán al estrés contráctil y se romperán durante la estimulación eléctrica.
Una ventaja notable de MyoTACTIC es la capacidad de cuantificar la generación de fuerza activa y las propiedades de manejo de calcio in situ. Este es un desafío al que se enfrentan muchos otros sistemas de cultivo 3D, donde la investigación de la fuerza contráctil del tejido 3D se implementa como un ensayo de punto final después de la eliminación del tejido del dispositivo de cultivo12,37. Por lo tanto, MyoTACTIC es muy adecuado para apoyar estudios longitudinales, por ejemplo, comprender los efectos temporales del tratamiento farmacológico en el músculo esquelético. Una limitación del método descrito en este documento para cuantificar la generación de fuerza activa y las propiedades de manejo de calcio in situ es la colocación manual de electrodos, lo que limita el uso de este sistema para aplicaciones de prueba de moléculas de alto contenido. Una posible solución sería diseñar una tapa transparente de electrodos configurada como un circuito paralelo que se pueda insertar directamente en un conjunto estandarizado de pozos funcionales que permita la estimulación eléctrica de múltiples tejidos a la vez. Alternativamente, el uso de una línea celular progenitora miogénica que exprese de manera estable una construcción de canalrodopsina permitiría la despolarización de la membrana de la célula muscular y, por lo tanto, la contracción del tejido inducida por la exposición a la luz azul. Además, la fuerza activa se captura en videos, ya que la deflexión posterior y la cuantificación de la fuerza contráctil activa se pueden realizar de manera imparcial mediante el uso de un script python semiautomatizado personalizado para rastrear la deflexión posterior en videos cortos. Por lo tanto, la evaluación longitudinal imparcial de la fuerza contráctil estimulada es posible gracias a MyoTACTIC30. Para mejorar la eficiencia del análisis de datos, las aplicaciones de teléfonos inteligentes que están diseñadas para medir la fuerza mientras capturan simultáneamente videos de deflexión posterior, son ideales para aumentar el rendimiento.
Finalmente, el valor de esta plataforma también se ha descrito previamente en su capacidad para predecir con precisión la respuesta a los medicamentos. De manera similar a los resultados clínicos, hemos informado previamente que el tratamiento de hMMTs (realizados con mioblastos primarios) con compuestos miotóxicos (dexametasona, cerivastatina) indujo atrofia de miotubos y disminuyó la fuerza contráctil activa30. Por otra parte, el valor predictivo de los hMMT generados por MyoTACTIC se validó demostrando que una dosis clínicamente relevante de un quimioterapéutico utilizado para tratar el cáncer de páncreas, una enfermedad que a menudo se asocia con caquexia2,redujo significativamente la calidad de hMMT y la fuerza contráctil30. Por lo tanto, la simple fabricación de MyoTACTIC y su facilidad de uso en la generación de hMMT 3D muestra muchas ventajas para la captura de datos de alto contenido, como lo demuestra su confiabilidad con respecto a las salidas estructurales y funcionales. Una limitación general de los dispositivos de cultivo celular basados en PDMS es que PDMS adsorbe proteínas. El método aquí descrito hace uso de medios de cultivo que contienen suero, lo que supera esta limitación al servir para "bloquear" el dispositivo y permitir que se observen los efectos de los tratamientos con moléculas y medicamentos. Sin embargo, debido a esta limitación, se deben evitar conclusiones definitivas sobre las dosis de moléculas y se deben alentar las curvas de dosis-respuesta. Por el contrario, esta plataforma no es adecuada para el cultivo de microtejidos sin suero, ya que los aditivos se adsorberán al PDMS, lo que dificultará la salud y el desarrollo de los tejidos. En el futuro, la integración de técnicas como la bioimpresión 3D y / o el manejo automatizado de líquidos mejorará el rendimiento en la fabricación de cultivos hMMT.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli y Sadegh Davoudi por contribuir a la invención de la plataforma de cultivo MyoTACTIC y establecer los métodos de fabricación y análisis descritos en este documento. HL recibió fondos de un Programa de Capacitación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) en Una Beca de Ingeniería y Emprendimiento Organ-on-a-Chip y una beca de posgrado Wildcat de la Universidad de Toronto. PMG es la Cátedra de Investigación de Canadá en Reparación Endógena y recibió apoyo para este estudio del Instituto de Medicina Regenerativa de Ontario, la Red de Células Madre y de Medicine by Design, un Programa de Excelencia en Investigación de Canadá First. Los diagramas esquemáticos se crearon con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
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