Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å produsere matriser av 3D humane skjelettmuskulaturmikrofunksjoner og minimalt invasive nedstrøms in situ-analyser av funksjon, inkludert kontraktil kraft og kalsiumhåndteringsanalyser.
Abstract
Tredimensjonale (3D) in vitro modeller av skjelettmuskulatur er et verdifullt fremskritt i biomedisinsk forskning, da de gir muligheten til å studere skjelettmuskulaturreformering og fungere i et skalerbart format som er mottagelig for eksperimentelle manipulasjoner. 3D muskelkultursystemer er ønskelige da de gjør det mulig for forskere å studere skjelettmuskulatur ex vivo i sammenheng med menneskelige celler. 3D in vitro modeller etterligner nøye aspekter av den innfødte vevsstrukturen til voksen skjelettmuskulatur. Imidlertid er deres universelle anvendelse begrenset av tilgjengeligheten av plattformer som er enkle å fremstille, koste og brukervennlige, og gir relativt høye mengder menneskelig skjelettmuskulaturvev. I tillegg, siden skjelettmuskulatur spiller en viktig funksjonell rolle som er svekket over tid i mange sykdomstilstander, er en eksperimentell plattform for mikrotissuestudier mest praktisk når minimalt invasive kalsium forbigående og kontraktile kraftmålinger kan utføres direkte i selve plattformen. I denne protokollen beskrives fabrikasjonen av en 96-brønns plattform kjent som 'MyoTACTIC', og masseproduksjon av 3D humane skjelettmuskulaturmikrotissuer (hMMTs). I tillegg rapporteres metodene for en minimal invasiv anvendelse av elektrisk stimulering som muliggjør gjentatte målinger av skjelettmuskulaturkraft og kalsiumhåndtering av hver mikrotissue over tid.
Introduction
Skjelettmuskulatur er et av de mest tallrike vevene i menneskekroppen og støtter viktige kroppsfunksjoner som bevegelse, varme homeostase og metabolisme1. Historisk har dyremodeller og todimensjonale (2D) cellekultursystemer blitt brukt til å studere biologiske prosesser og sykdomspatogenese, samt for å teste farmakologiske forbindelser i behandlingen av skjelettmuskulatursykdommer2,3. Mens dyremodeller har forbedret vår kunnskap om skjelettmuskulatur i helse og sykdom, har deres translasjonspåvirkning blitt hemmet av høye kostnader, etiske hensyn og interspecies forskjeller2,4. Ved å vende seg til menneskelige cellebaserte systemer for å studere skjelettmuskulatur, er 2D-cellekultursystemer gunstige på grunn av deres enkelhet. Det er imidlertid en begrensning. Dette formatet klarer ofte ikke å rekapitulere celle- og celle-ekstracellulære matriseinteraksjoner som forekommer naturlig i kroppen5,6. I løpet av de siste årene har tredimensjonale (3D) skjelettmuskulaturmodeller dukket opp som et kraftig alternativ til hele dyremodeller og konvensjonelle 2D-kultursystemer ved å tillate modellering av fysiologisk og patologisk relevante prosesser ex vivo7,8. Faktisk har en mengde studier rapportert strategier for å modellere menneskelig skjelettmuskulatur i et bioartificial 3D-kulturformat1. En begrensning for mange av disse studiene er at aktiv kraft kvantifiseres etter fjerning av muskelvev fra kulturplattformene og vedlegg til en krafttransduser, som er destruktiv og dermed begrenset til å tjene som endepunktanalyse9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andre har designet kultursystemer som tillater ikke-invasive metoder for måling av aktiv kraft, men ikke alle er mottagelige for høykvalitets molekyltestingsapplikasjoner7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Denne protokollen beskriver en detaljert metode for å fremstille humane muskel mikrotissues (hMMTs) i skjelettmuskelen (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) plattform; en 96 brønnplateenhet som støtter bulkproduksjonen av 3D skjelettmuskulaturmikrotissuer30. MyoTACTIC plate fabrikasjonsmetoden muliggjør generering av en 96 brønn polydimetylsiloksan (PDMS) kulturplate og alle tilsvarende brønnfunksjoner i et enkelt støpetrinn, hvorved hver brønn krever et relativt lite antall celler for mikrotissuedannelse. Mikrotissues dannet i MyoTACTIC inneholder justerte, strikkede og multinukleerte myotuber som er reproduserbare fra brønn til brønn på enheten, og ved modning kan reagere på kjemiske og elektriske stimuli in situ30. Heri, teknikken for å produsere en PDMS MyoTACTIC kultur plate enhet fra en polyuretan (PU) kopi, en optimalisert metode for å implementere udødelige menneskelige myogene stamceller for å fremstille hMMTs, og den funksjonelle vurderingen av konstruert hMMT kraft generasjon og kalsium håndtering egenskaper er skissert og diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS MyoTACTIC plate fabrikasjon
MERK: PDMS MyoTACTIC plate fabrikasjon krever en PU negativ mugg, som kan produseres som tidligere beskrevet30. Den dataassisterte designen (CAD) SolidWorks-filen for MyoTACTIC-platedesignet er gjort tilgjengelig på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Forbered ~ 110 g PDMS polymeroppløsning i en engangs plastkopp med et 1:15-forhold mellom monomer og herdemiddel ved hjelp av komponentene i silikonelastomersettet. Rør polymeroppløsningen i 2-3 min ved hjelp av en 5 ml engangs serologisk pipette til den er helt blandet og homogen.
FORSIKTIG: Unngå kontakt med hud og øyne i PDMS polymeroppløsning; og unngå innånding. Bruk alltid labfrakk og engangshansker når du håndterer den flytende PDMS-blandingen, og se Sikkerhetsdatablad (SDS) for spesifikke sikkerhetsprotokoller.
MERK: Beskytt utstyrsoverflater (f.eks. vekt, benkeplate osv.) med engangsbelegg i tilfelle søl av PDMS-polymerløsninger. - Degas blandingen ved romtemperatur ved å plassere koppen i et benktopvakuumkammer koblet til en standard tørrvakuumpumpe i ~ 30 min, eller til alle bobler er fjernet. Bryt vakuumet hver 5-10 min for å hjelpe til med avgassing. Bruk en tom 50 ml sprøytefat for å stupe luft og blåse ut eventuelle gjenværende bobler på overflaten av polymerblandingen etter behov.
MERK: Et stykke 6,35 mm ID-slange kan brukes til å koble en P1250 pipettespiss til fatet for å forbedre hastigheten og nøyaktigheten til luftstrømmen. - Mens PDMS-polymerløsningen avgasser, fjerner du eventuelle rester av PDMS som er festet til PU-negativ mugg ved å tørke forsiktig av kantene og overflaten med et tørt papirhåndkle. Bruk trykkluft fra anlegget, satt til 70-100 kPag for å fjerne gjenværende fine partikler.
MERK: Beskytt PU-negativ form mot skade og mot partikkelakkumulering ved å plassere den i en forseglet plastpose og lagre den i en skuff som er beskyttet mot laboratorietrafikk. - Plasser PU-formen i en kjemisk hette som er beskyttet med et engangsbelegg. Sett formen horisontalt på ~75° og spray den aktive overflaten med et jevnt lag med utløsermiddel. Spray formen fra topp til bunn, deretter venstre til høyre, mens du holder boksen 15-20 cm fra formen og bruker en væske frem og tilbake feiende bevegelse. Roter formen 180° og gjenta sprayene, og la deretter PU-formen sitte i den kjemiske hetten i 10-15 min for å tørke.
FORSIKTIG: Sørg for at utløsermiddelet brukes i en kjemisk avtrekkshette, unngå kontakt med hud og øyne, og se Sikkerhetsdatablad (SDS) for spesifikke sikkerhetsprotokoller
MERK: En tynn film må dekke den aktive overflaten helt, men overdreven belegg kan overføres til PDMS i neste trinn, noe som igjen kan påvirke hMMT-sådd negativt. Overflaten skal føles glatt å ta på, men ikke våt. - Hell 100 g PDMS jevnt inn i PU-formen og plasser den i et vakuumkammer koblet til en lamellvakuumpumpe. Degas den PDMS-fylte formen i ~ 45 min, og bryter vakuumtetningen hver 5-10 min i de første 20 minutter for å akselerere prosessen. La i vakuumkammeret til PDMS-blandingen er helt tom for alle bobler.
MERK: En lamellvakuumpumpe brukes til å oppnå et lavere vakuum og redusere tiden som kreves for dette trinnet. Avgassing av den PDMS-fylte formen kan utføres ved hjelp av benktopvakuumkammeret og standard tørrvakuumpumpe, men tiden for å annullere blandingen av alle bobler vil være lengre. Det som er viktig er fjerning av alle bobler fra PDMS-polymerløsningen, spesielt i de regionene som er bestemt til å bli hMMT-forankringsstolper. Bobler i denne regionen vil resultere i ankerstolpebrudd, tap av kulturbrønner, og i sin tur resultere i et lite stykke PDMS som forblir kilt i formen. - Overfør den avgassede PDMS-fylte PU-formen til en ovn på 65 °C, og inkuber over natten for å kurere den flytende gummien.
- Fjern den herdede PDMS-plussplaten fra ovnen og avkjøl platen ved romtemperatur i minst 30 minutter.
- Med en bladløs skalpell løsner du forsiktig herdet PDMS fra PU-formen ved å kjøre baksiden av håndtaket mellom PDMS og veggene i formen. Start langs øvre kant og skill alle 4 sider, før du skyver ned til bunnen av formen og løsner denne delen. Dette trinnet er fullført når baksiden av håndtaket går jevnt mellom PDMS og alle de 4 veggene i PU-formen.
MERK: Arbeid langsomt og forsiktig med den bladløse skalpellen for å unngå å knekke PU-formen eller rive PDMS. Dette trinnet bør ta 15-20 min. - Fra den ene enden bruker du den bladløse skalpellen til å løfte opp kanten av PDMS og arbeidsfingre mellom den herdede PDMS-kulturplaten og PU-formen. Skyv deretter fingrene lenger under platen med begge hender, skrell sakte opp og ut av PU-formen.
MERK: Arbeid langsomt og bruk begge hender til å skrelle platen jevnt. Minimer bøyningen for å redusere sannsynligheten for brudd på ankerstolpen. Dette trinnet bør ta 5-10 min. - Bruk et barberblad med én kant til å skjære platen i grupper på 6 ± 2 MyoTACTIC-brønner (figur 1) for vevssåing. Plasser fulle MyoTACTIC-plater, eller platedeler, i en instrumentsteriliseringspose og autoklav i en 25 min tørr syklus (20 min steriliseringstid og 5 min tørrtid) ved 120 °C og 100–140 kPag.
2. Kultur av udødeliggjorte menneskelige myoblast forfedre celler
MERK: De udødelige myoblastene som ble brukt i denne protokollen ble hentet fra Institut de Myologie (Paris, Frankrike)31.
- Få ett hetteglass med frosne celler fra flytende nitrogen dewar og tine hetteglasset raskt i et 37 °C vannbad (på mindre enn 1 min). Celler fryses med en tetthet på 7,5 x 105 celler per 1 ml frysemedier som består av 90% foster bovint serum (FBS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO).
- Overfør forsiktig innholdet i hetteglasset til et 15 ml konisk rør som inneholder 9 ml forvarmet vaskemedium som består av 89% DMEM 1x, 10% FBS og 1% penn / strep for å fortynne DMSO. Snurr det koniske røret på 15 ml ved 400 x g i 10 minutter og aspirer deretter bort mediene og pass på at du unngår cellepelleten.
- Resuspend pellet i 1 ml vekstmedier bestående av 84% skjelettmuskulaturcelle basal medium med skjelett muskelcelle vekst medium supplement blanding, 15% FBS og 1% penn / strep og deretter overføre til en 50 ml konisk rør med 29 ml vekstmedier.
- Overfør 10 ml medier som inneholder omtrent 2,5 x 105 celler til en cellekulturrett på 100 mm x 20 mm. Gjenta dette trinnet med de resterende 20 ml av celleløsningen. Overfør deretter cellekulturretter til en fuktet cellekulturinkubator satt til 37 °C og 5 % CO2.
- Oppdater kulturmediene annenhver dag. Kultur cellene til de oppnår ~ 70%-80% samløp (vanligvis 4-5 dager), på hvilket tidspunkt cellene er forberedt på såing. 1,5 x 105 celler kreves for å generere hver hMMT. Pass derfor cellene etter behov for å oppnå det nødvendige antall celler.
MERK: De udødeliggjorte myoblastforfedrenes cellelinjer bør aldri overstige 80% samløp før såddceller i MyoTACTIC-brønner, passerer cellene eller forbereder frysebestander. hMMTs fremstilt fra celler som har overskredet 80% samløp, klarer ofte ikke å nå kontraktil modenhet. Passaging-prosedyrer er identiske med metodene beskrevet nedenfor i trinn 3.
3. Seeding konstruerte hMMTs med MyoTACTIC
- Fremstilling av MyoTACTIC kulturbrønner og reagenser for hMMT-såing.
MERK: Denne protokollen gir spesifikke detaljer for å produsere 6 hMMTer.- 2-3 timer før cellesåing, legg en 6 brønn MyoTACTIC platedel i en 10 cm cellekulturrett. Forbered hver enkelt MyoTACTIC-kultur godt ved å legge til 100 μL av en 5% Pluronic F-127-løsning i hver brønn. Sett lokket på 10 cm kulturfatet, påfør parafin for å forsegle plassen mellom 10 cm tallerken og lokk, og legg deretter 10 cm platen som inneholder MyoTACTIC-delen i en sentrifuge utstyrt med en platespinneradapter.
MERK: Hvis en sentrifugeplate spinneradapter ikke er tilgjengelig, kan en p20 pipettespiss brukes til å forsiktig fjerne bobler bak stolpene, og dermed sikre at hele kulturoverflaten er jevnt belagt. - Sentrifuge på 1550 x g i 1 min for å fjerne alle bobler i kulturbrønner, spesielt bak stolpene. Oppbevar 10 cm cellekulturfatet som inneholder MyoTACTIC-platedelen som inneholder Pluronic F-127-oppløsning ved 4 °C til cellene er klargjort for såing.
MERK: Pluronic F-127 belegg kan påføres så lite som 2 timer til så lenge som 24 timer. For eksempel kan brønner fylles med Pluronic F-127-løsning på slutten av dagen for bruk neste dag. Ikke overskrid 24 timer, da dette vil påvirke hMMT-ombygging negativt og unnlate å danne sunne vev som når kontraktil modenhet. - Tin sakte en 50 μL kjellermembranekstrakt aliquot og en 10 μL trombin aliquot (100 U / ml lagerløsning) på is i kulturhetten.
MERK: Ikke frys kjellermembranekstrakt aliquots på nytt. De er engangsbruk. Trombin aliquots er gjenbrukbare, derfor fryses opp til 5 ganger etter bruk. - Vei ~ 7 mg pulverisert fibrinogen i et 1,5 ml mikrosenterrør og overfør deretter til cellekulturhetten. Tilsett 700 μL 0,9% (wt/vol) NaCl-oppløsning i vann (eller saltløsning) for å komme frem til en 10 mg/ml endelig konsentrasjonsløsning. Ikke virvelfibrinogen å oppløse, plasser i stedet røret i en 37 °C cellekulturinkubator i 3-5 min.
- Fjern og sveip røret forsiktig, og pulser deretter den oppløste oppløsningen i en stasjonær mini sentrifuge (mikrofuge) og gå tilbake til kulturhetten. Filtrer fibrinogenoppløsningen ved hjelp av en 1 ml sprøyte utstyrt med et 0,22 μm sprøytefilter. Overfør den oppløste fibrinogenløsningen til is sammen med kjellermembranekstraktet og trombin aliquots.
- Til slutt, forbered hMMT-såddmediene som vil bli introdusert til kulturbrønnene etter sådd av vevet. Dette mediet inneholder skjelettmuskulaturcelle basal medium supplert med 20% FBS, 1% P / S og 3% 6-aminokaproinsyre (ACA; 1,5 mg / ml endelig konsentrasjon oppnås ved å fortynne fra en 50 mg / ml lagerløsning; % uttrykkes som v / v). Forvarm mediet ved 37 °C før bruk.
- 2-3 timer før cellesåing, legg en 6 brønn MyoTACTIC platedel i en 10 cm cellekulturrett. Forbered hver enkelt MyoTACTIC-kultur godt ved å legge til 100 μL av en 5% Pluronic F-127-løsning i hver brønn. Sett lokket på 10 cm kulturfatet, påfør parafin for å forsegle plassen mellom 10 cm tallerken og lokk, og legg deretter 10 cm platen som inneholder MyoTACTIC-delen i en sentrifuge utstyrt med en platespinneradapter.
- Forberedelse av celler for hMMT-såing.
- Samle cellekulturplatene fra kulturinkubatoren. Aspirer mediet fra hver plate, vask deretter cellene en gang med D-PBS ved å legge til 5 ml D-PBS i hver kulturplate. Deretter aspirerer du D-PBS og løsner cellene ved å legge til 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA i hver kulturrett. Plasser i cellekulturinkubatoren i 3 min.
- Stopp trypsin ved å legge til 3 ml vaskemedium (89% av 1x DMEM + 10% FBS + 1% Penn / Strep) til kulturretten. Overfør celleløsningen til et konisk rør i riktig størrelse, og pellet deretter cellene ved sentrifugering ved 400 x g i 10 minutter. Aspirer mediene som tar vare på å unngå cellepellet. Deretter resuspenderer du cellepelleten i 1 ml av vaskemediet.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og trypan blå fargestoff under brightfield mikroskopi.
Hvis du bruker flere plater av celler, vil denne celleopphenget være veldig konsentrert. Fortynn cellesuspensjoner før telling etter behov. - Siden hvert vev krever 150 000 celler som er resuspendert i 15 μL av den ekstracellulære matriseblandingen (ECM), er det nødvendig med 900 000 celler i 90 μL ECM-blanding for 6 vev. For å gjøre rede for celle-ECM-løsningstap som oppstår under forberedelsesprosessen på grunn av bobledannelse eller pipettetap, lag ekstra celle-ECM-blanding (dvs. 8 vev eller 1200 000 celler i 120 μL ECM). Overfør volumet av celleoppheng som inneholder 1200 000 celler til et nytt konisk rør. Øk volumet til 10 ml med vaskemedium og spinn på 400 x g i 10 minutter.
- Mens cellene spinner ned, lag 150 μL ECM-blanding i et 1,5 ml mikrosenterrør ved hjelp av følgende oppskrift. Tilsett først 60 μL DMEM (40% volum), tilsett deretter 60 μL Fibrinogen 10 mg/ ml oppløsning (40% volum) og tilsett til slutt 30 μL kjellermembranekstrakt (20% volum). Oppbevar ECM-blandingen på is til bruk.
MERK: Bruk alltid tips som er forhåndskjølt ved -20 °C når du arbeider med løsninger som inneholder membranekstrakt i kjelleren. ECM-blanding inneholder 4 mg/ml fibrinogen.
- Såing hMMTs
- Samle det koniske røret som inneholder spunnet ned celler og aspirer media tar vare på å unngå cellepellet. Sveip enden av røret kraftig med en hansket finger for å løsne pelletsen og fortsett å flikke til pelletsen vises som en celleslam.
MERK: Det er viktig å aspirere så mye vaskemedier som mulig for å sikre at celle-ECM-suspensjonen er ved ønsket fortynning. Bruk en pipette til å fjerne gjenværende vaskemedier om nødvendig. - Overfør 120 μL av ECM-oppløsningen til røret som inneholder cellepelleten. Pipette opp og ned for å resuspendere cellene i ECM for å generere en enkelt celle suspensjon. Pipette sakte og forsiktig for å unngå å introdusere bobler, noe som vil redusere arbeidsvolumet. Plasser deretter celle-ECM-løsningen på is til bruk.
- Hent MyoTACTIC-platedeler som inneholder Pluronic F-127 belagte MyoTACTIC-brønner fra 4 °C kjøleskapet og plasser den 10 cm store retten som inneholder MyoTACTIC-brønnene på toppen av en ispakke inne i cellekulturhetten.
- Aspirer Pluronic F-127-løsningen fra hver brønn. PDMS er porøs og vil suge opp Pluronic F-127-løsningen, spesielt hvis platene ble spunnet ned med en sentrifuge. La gjenværende Pluronic F-127-løsning slippe ut og slå seg ned til bunnen av brønnen ved å la brønnene sitte i 5 min, og deretter aspirere igjen.
MERK: Bruk en Pasteur pipette med en p1250-spiss festet på enden, og en p200-spiss over p1250-spissen når du aspirerer Pluronic F-127-løsningen. Dette vil forbedre presisjonen for å forhindre utilsiktet aspirasjon av poststrukturene. Unngå å skrape det ovale bassengformede cellefrøområdet på bunnen av brønnen med pipetten, da dette forstyrrer Pluronic F-127-belegget og forstyrrer hMMT-selvorganiseringsprosessen. Den riktige teknikken er å sveve pipettespissen rett over det ovale bassenget mens du aspirerer Pluronic F-127-løsningen. - Pipette celle-ECM-suspensjonen forsiktig for å resuspendere celler som kan ha sunket til bunnen av røret. Overfør deretter 105 μL celle-ECM suspensjon til et friskt, forhåndskjølt 1,5 ml rør. Pass på at du tar tak i røret nær toppen for å forhindre at oppløsningen varmes opp.
- Tilsett 0,84 μL av den 100 U/ml trombinbestandsløsningen til 105 μL celle-ECM-suspensjonen for å komme frem til en endelig konsentrasjon på 0,2 U/mg fibrinogen. Pipette raskt, forsiktig og grundig for å blande, samtidig som du unngår innføring av bobler.
MERK: Trombin initierer rask konvertering av fibrinogen til en fibrin blodpropp. Som sådan er det begrenset tid til å frø vevet ved trombintilsetning. For å unngå for tidlig koagulering før celle-ECM-blanding overføres til kulturbrønnene, sett en p20 pipette til 15 μL før du tilsetter trombin. Bruk forhåndskjølte spisser eller dypp pipettespissen i iskald DMEM i noen sekunder før du samler og overfører 15 μL av celle-ECM-blandingen i hver brønn. Det er en beste praksis å forberede celle-ECM blanding aliquots slik at ikke mer enn 6 hMMTs er frøet om gangen. - For å frø vevet, tilsett 15 μL celle-ECM-blanding (dvs. 150 000 celler) til hver enkelt brønn. Tilsett forsiktig celle-ECM-blanding i midten av det ovale bassenget og unngå å trykke pipettespissen inn i bunnen av brønnen. Deretter, med to lysbevegelser, spred cellefjæringen bak hvert innlegg i brønnen. Når overflaten er jevnt belagt i celle-ECM-fjæringen, går du videre til neste brønn.
MERK: Arbeid effektivt for å unngå for tidlig gelering av celle-ECM-blandingen i røret før alle vev blir sådd. Ved såing av brønnene er det ekstremt viktig å unngå å overføre bobler, da boblen vil forstyrre ombyggingen av hMMT, noe som gjør hMMT ubrukelig. - Plasser lokket på 10 cm kulturplaten som inneholder frøbrønnene og overfør til en 37 °C vevskulturinkubator i ca. 5 min.
MERK: Plasser mikrocentrifugerøret med restcelle-ECM-blandingen i inkubatoren som en bekreftelse på gelpolymeriseringsprosessen. - Etter at celle-ECM-blandingen har polymerisert, tilsett 200 μL forhåndsvarslet hMMT-såingsmedium til hver MyoTACTIC-brønn. Sett lokket på 10 cm fatet tilbake og returner MyoTACTIC platedeler innenfor 10 cm tallerkenen til inkubatoren. Dette tidspunktet kalles Dag -2. Ikke forstyrr vev før neste trinn.
- Samle det koniske røret som inneholder spunnet ned celler og aspirer media tar vare på å unngå cellepellet. Sveip enden av røret kraftig med en hansket finger for å løsne pelletsen og fortsett å flikke til pelletsen vises som en celleslam.
- Differensiere hMMTer
- Etter 2 dager med inkubasjon, fjern hMMT-såingsmediet forsiktig ved hjelp av en pipette og erstatt med 200 μL forhåndsvarslet differensieringsmedium som inneholder 2% hesteserum, 1% Pen/Strep, 4% ACA (dvs. 2 mg/ml sluttkonsentrasjon fra en lagerkonsentrasjon på 50 mg/ml; % uttrykkes som v/v) og 10 μg/ml humant rekombinant insulin i DMEM. Dette tidspunktet kalles differensieringsdagen 0.
- Annenhver dag deretter utveksler halvparten av mediene med ferske differensieringsmedier til dag 12 av differensiering, den siste kulturdagen (Figur 2a).
MERK: Protokolldetaljer for å fremstille hMMTer ved hjelp av primære menneskelige myoblaster har blitt publisert andre steder30. Hvis det er bekymringer for celle levedyktighet etter sådd, inkubere hMMTs med calcein og propidium jod for å kvantifisere levedyktighet.
4. Elektrisk stimulering og analyse av hMMT-indusert stolpeavbøyning
- Sett opp et klart scenefeste i bunnglass eller plast på et invertert mikroskop og fest et smarttelefonkamera til mikroskopokularet ved hjelp av et mikroskopkamerafeste. Fasekontrastmikroskopi ved 10x forstørrelse vil bli brukt (Figur 3a).
MERK: Ethvert invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et 10x forstørrelsesmål vil være passende. PDMS brønnkonstruksjoner vil bli fjernet fra 10 cm parabolen og plassert direkte på den klare bunnfestet, og dermed åpen for luften. Steriliser alle overflater og utstyr med 70% etanol og minimer trafikken i området under eksperimentering. - For å forberede de elektriske stimuleringselektrodene, kutt ~ 30 cm tinnbelagt kobbertråd. Deretter, fra navet til en 25 G vanlig skrå nål, pakk ~ 10 cm av ledningen tett rundt den øverste halvdelen, og la ~ 20 cm overflødig ledning. Gjenta for en ny nål og kutt deretter navet av hver nål.
MERK: Ledningen må være stram rundt kanylen for å sikre at den ikke beveger seg, og trådinnpakket del av elektroden må ikke berøre PDMS, da dette kan hindre elektrisk feltgenerering. - Fest BNC til alligatorklemmekontaktkabelen til en utgangskanal på bølgeformgeneratoren og still inn kanalen for firkantede pulser med 20% driftssyklus, 5 V amplitude (elektrisk feltstyrke på 10 V / cm). Frekvensen vil endre seg mellom 0,5 Hz og 20 Hz for henholdsvis rykninger og stivkrampesammentrekninger.
MERK: Innstillinger for Bølgeformgenerator kan kreve eksperimentspesifikk optimalisering - Plasser en MyoTACTIC platedel som inneholder hMMTer på mikroskopstadiet, og sett forsiktig hver elektrode skråkant i PDMS rett bak hver stolpe i det ovale bassenget. Tape forsiktig ned de 20 cm delene av overflødig ledning til mikroskopstadiet slik at nålene forblir vertikale og ~ 10 cm av hver ledning forblir fri for tilkobling (Figur 3a).
FORSIKTIG: Plasser aldri en bar finger over hver ende av elektroden. Sørg for at det brukes en fingerbøl på pekefingeren for å påføre lystrykk på elektroden ved innsetting i PDMS. - Fokuser mikroskopfeltet på en av to stolper, slik at fokuset er skarpt på stiftkanten nærmest elektroden. Lås deretter smarttelefonkamerafokuset til det klareste området av stolpen. Dette er viktig for nedstrømsanalysen som en endring i fokus, mens registrering vil forstyrre analysen.
- Koble de frie endene av de teipede ledningene til bølgeformgeneratoren via alligatorklemmer (Figur 3a).
- Start videoopptak på smarttelefonkameraet, og slå deretter på kanalutgangen for å starte stimulering. Induser hMMT til å gjennomgå 3 rykninger og 3 stivkrampesammentrekninger, med 2 min hvile mellom rykninger og stivkrampestimuleringsserie.
- Slå av kanalutgangen, løsne alligatorklemmer fra de tinnbelagte kobberledningene, fjern tapen fra ledningene og tørk hver elektrode med 70% etanol før du setter inn i påfølgende hMMT-brønner. Gjenta prosedyren fra trinn 4.5 for alle hMMTer.
MERK: Begrens tiden hMMTs bruker utenfor inkubatoren ved å stimulere ikke mer enn 3 vev om gangen. Hvis ytterligere hMMTer i MyoTACTIC-platedelen gjenstår å analysere, returnerer du platen til inkubatoren i 10 minutter slik at hMMTs kan gå tilbake til 37 °C. - For å analysere avbøyning etter avbøyning for å beregne hMMT-kraftgenerering, bruk det tilpassede skriptet, som er gjort tilgjengelig på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Følg instruksjonene i README.md for å konfigurere og starte skriptet, og åpne deretter hver video for sporing av innlegg for å utføre kraftanalysen.
- Velg et interesseområde (ROI) langs stiftkanten som skal spores for forskyvning etter innlegg. Trykk ENTER for å bekrefte avkastningen, og trykk ENTER på nytt for å kjøre skriptet (Tilleggsvideo 1).
MERK: Store avbøyninger fører til at trackeren svikter. Hvis trackeren svikter under sammentrekning, kan avkastningen økes for å gjøre sporingen mindre følsom, men tillate sporing av store avbøyninger. Du finner tre størrelser i koden og kan justeres ved å justere skriptkommentarene. - Skriptet avsluttes med to inndatakrav. Først skriver du inn y for å bekrefte at videoen inneholdt flere sammentrekninger. Deretter skriver du inn y (ja) eller n (nei) for å eksportere resultatene til en . CSV-fil (Ekstra video 1).
- Sørg for at resultatene etter avbøyning rapporteres som forskyvning i piksler for hver sammentrekning. Konverter bildepunkter til μm-verdier for innstillingen for 10x forstørrelse i mikroskopet. Konverter deretter etterforskyvningsnumre til absolutte kontraktile krefter (μN) ved å multiplisere verdier (μm) med kraftforskyvningskonverteringsfaktoren på 2,36 μN / μm, som tilsvarer 1: 15 herdemiddel til monomerforholdet til PDMS som brukes i MyoTACTIC fabrikasjon30.
5. Kalsium forbigående analyse ved hjelp av elektrisk stimulering
MERK: For kalsiumhåndteringsforsøk ble udødelige myoblaster stabilt transdusert med MHCK7-GCAMP6-reporteren som tidligere beskrevet11,12. Transduced celler ble FACS sortert for GFP for å oppnå den positive populasjonen, og deretter brukt til å fremstille hMMTs. Alternative metoder for kalsiumavbildning som bruk av ratio-metriske fargestoffer som Fura-2 AM og Indo-1 eller fluorescens levetidsavbildning av kalsiumindikatorer (f.eks. Fluo-4 eller Oregon Green BAPTA1) kan være mottagelige for systemet vårt.
- Sett opp mikroskopstadiet og stimuleringsutstyret (elektroder, bølgeformgenerator osv.) som tidligere beskrevet i trinn 4. For dette eksperimentet, bruk en 4x forstørrelse.
MERK: Et mørkt rom og et epifluorescensmikroskop utstyrt med et CCD-kamera vil være nødvendig. - Start programvare for mikroskopavbildning, velg FITC-filterkanalen (blått lys), og velg filmopptaksfunksjon. Sett med en eksponering på 500 ms og en oppløsning på 680 x 510 (binning 2x2).
MERK: Bildebehandlingsprogramvaren kan variere, og eksponeringen angis manuelt av brukeren. Pass på at du unngår hMMT over eksponering før stimulering. I ro er en mørk vevskontur/skygge med spontan fluorescens normalt, mens et klart vevsbilde er over eksponering (Supplerende video 2). Sørg for at eksponeringen er konsistent for alle hMMTer i et eksperiment. - Lukk mikroskoplukkeren og hold FITC-kanalen av til den er klar til å ta opp kalsiumhåndtering.
- Når alt utstyr og programvare er satt opp, henter du MyoTACTIC-platedelen som inneholder hMMTene som skal analyseres og setter den direkte på mikroskopstadiet. Sett deretter inn og koble til elektroder som tidligere beskrevet i trinn 4.
- Bruk brightfield til å fokusere synsfeltet på midten av den valgte hMMT. Slå deretter av lampen.
- Åpne mikroskopet FITC-kanallukkeren, bekreft at blått lys er på, og velg deretter Filmopptak i programvaren.
- Slå på utgangen på bølgeformgeneratoren for å starte den elektriske stimuleringen. Induser hMMT til å gjennomgå 8 rykninger og 8 stivkrampesammentrekninger. La det hvile i 2 minutter mellom rykninger og stivkrampestimuleringsserie, i løpet av hvilken tid FITC-lukkeren er i lukket stilling.
MERK: La 10 s spontan aktivitet før og etter elektrisk stimulering registrere minimum fluorescens for beregnings- og dataanalyseformål. - Slå av kanalutgangen, løsne alligatorklemmer fra de tinnbelagte kobberledningene, fjern tapen fra ledningene og tørk hver elektrode med 70% etanol før du setter inn i påfølgende hMMT-brønner. Gjenta stimulerings- og opptaksprosedyren for alle hMMTer.
- Lagre filmer i TIFF-filformat for analyse i ImageJ, eller alternativ bildebehandlingsprogramvare.
MERK: Begrens tiden hMMTs bruker utenfor inkubatoren ved å stimulere ikke mer enn 3 vev om gangen. Hvis ytterligere hMMT i MyoTACTIC-platedelen gjenstår å analysere, må du returnere enheten til inkubatoren i 10 minutter slik at hMMTs kan gå tilbake til 37 °C. - For å analysere kalsium forbigående data, åpne først ImageJ. Velg Analyser, angi mål, velg deretter Gjennomsnittlig grå verdi , og fjern merkingen av alle andre alternativer. Når du er ferdig, åpner du en kalsiumvideo (.tiff) (Ekstra video 2).
- Omrisset kantlinjen på mikrobrikken ved hjelp av et markeringsverktøy for polygon og lagre dette området som avkastning (Ekstra video 2). Under Mer i ROI Manager-vinduet velger du Multimål og måler fluorescerende intensitet for alle filstykker med én rad per sektor (Ekstra video 2).
- Kopier alle mål, inkludert stykkenummer (ramme), til et regneark, og sammenlign fluorescerende intensitet for hvert stykke med minimum spontan fluorescerende intensitet fra filen ved hjelp av ΔF/F0 = (Fimmediate - Fminimum)/Fminimum ( Ekstravideo 2).
- Beregn tiden for hvert delbilde ved å multiplisere filmopptaksbildehastigheten med stykkenummer (ramme) og plott ΔF/F0 mot tiden for hMMT kalsium forbigående respons på stimulering (Ekstra video 2).
- Velg topp kalsium forbigående signal for hver av 6 påfølgende sammentrekninger og gjennomsnittsverdier for å beregne den relative gjennomsnittlige gjennomsnittlige topp fluorescerende intensitetsendringen for hver hMMT (Supplemental Video 2).
MERK: Utelat alltid data som oppstår fra den første rykningskontraksjonen fra den samlede analysen. Et regneark med tittelen "Kalsiumhåndteringsmal.xlsx" er gitt på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) for å lette hMMT kalsium forbigående analyse. Utfyllbare celler der verdier og inndata skal skrives inn, utheves i grått. Sørg for å justere toppvalgnumre, da dette bare er en veiledning for å hjelpe til med toppvalg (Ekstra video 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrevet heri er metoder for å kaste en 96-brønns PDMS-basert MyoTACTIC kulturplattform fra en PU-form, for å fremstille matriser av hMMT-kopivev, og for å analysere to aspekter av hMMT-funksjon innen kulturen enhetskraftgenerering og kalsiumhåndtering. Figur 1 gir en skjematisk oversikt over utarbeidelsen av MyoTACTIC kulturbrønner før hMMT-sådd. PDMS er en mye brukt silikonbasert polymer, som lett kan formes for å skape komplekse enheter32. En PDMS-basert protokoll ble designet for å kaste et ubegrenset antall 96-brønns kulturenheter fra en produsert negativ PU-mugg30. Den endelige herdede PDMS-positive platen er fleksibel og kan enkelt kuttes i mindre funksjonelle enheter ved hjelp av et enkelt kant barberblad (figur 1). Dette gjør at brukeren kan skalere enheten for å møte hMMT-replikaen som er spesifikke for deres eksperimentelle design. Disse mindre funksjonelle enhetene er også gunstige for å overvinne en begrensning i arbeidet med et ECM-stillas som polymeriserer raskt, for eksempel fibrinhydrgeler, ved enkelt å justere antall brønner for å matche brukerens cellesåhastighet. Videre er PDMS lett autoklaverbar, og den kan lagres på ubestemt tid. Til slutt, fra et logistikksynspunkt, kan en full MyoTACTIC-plate dekkes av et hvilket som helst standard 96-brønns platelokk, og dimensjonen og profilen til MyoTACTIC-platedeler er egnet til inkubasjon innenfor en 10 cm kulturplate, for å sikre hMMT-kultursterilitet. Pluronic F-127 løsningsbelegg foran cellesåing tjener en dobbel rolle i å gi et ekstra mål på kulturens brønnsterilisering, og som et ikke-ionisk overflateaktivt middel, og forhindrer celleadhesjon til fordel for ensartet celle - ECM-ombygging (figur 1).
Når den udødeliggjorte myogene stamcellepopulasjonen er klar for eksperimentering, blir cellene deretter innkapslet i en hydrogel bestående av fibrinogen og kjellermembranekstrakt. Celle-ECM-blandingen blir deretter jevnt avsatt i det ovale bassenget på bunnen av hver MyoTACTIC-brønn, og deretter over en 14-dagers kulturperiode, cellene romlig selvorganiseres over disse to vertikale innleggene for å danne en 3D-mikrotissue befolket med en seng av justert, multinukleert, strikket myotuber som ligner aspekter av innfødt vevsorganisasjon (Figur 2a, g,h). Over ombyggingsprosessen genereres uniaxial spenning mellom de to forankringspunktene, og dette guider vevets selvorganiseringsprosess til igjen å drive dannelsen av et kompakt vev. I differensieringsperioden forblir bredden på hMMTene konstruert av myoblaster avledet fra friske pasienter ganske konsistent. I tilfeller av feil som forstyrrer hMMT-ombygging, går imidlertid denne ensartetheten tapt (Figur 2a-f), noe som gjør denne enkle beregningen nyttig i hMMT kvalitetskontrollvurdering. For eksempel kan overivrig blanding av cellen - ECM suspensjon føre til dannelse av bobler. Bobler overført til MyoTACTIC godt hindre hMMT ombygging. I slike tilfeller fortrenger bobler noen eller alle myoblastene fra området okkupert av boblen, og danner til slutt en sprekk i den endelige hMMT (Figur 2b; se rød pil). Et annet eksempel er integriteten til Pluronic F-127-belegget i brønnene. Pluronic F-127 er et ikke-ionisk overflateaktivt middel som forhindrer celler i å følge MyoTACTIC-brønnen. Hvis belegget skrapes av under aspirasjon, vil myoblastene feste seg til overflaten av MyoTACTIC-brønnene, og danne nye forankringspunkter og resultere i myorør som ikke er justert over de to stolpene (Figur 2c). Ytterligere feil kan også føre til avvikende hMMT-ombygging, som vist i figur 2d-f. Celle vitalitet post sådd kan også evalueres ved hjelp av calcein / propidium jod-baserte farging analyser. Når disse tekniske feilene unngås, fylles hMMTs av en seng med justerte og multinukleerte myotuber som strekker seg over lengden på hver hMMT (Figur 2g). Myotubene er ganske ensartede i størrelse over hele lengden og mellom forskjellige hMMTs (Figur 2h-i). Myotubes er preget av tilstedeværelsen av sarcomere striations som visualiseres ved immunostaining for sarkomerisk α - aktinin (SAA; Figur 2t).
Funksjonelle egenskaper kan også undersøkes i hMMTs som begynner rundt 7 dager med differensiering. Det eksperimentelle oppsettet for å fullføre disse funksjonelle studiene er illustrert i figur 3a. Mikroskopioppsettet er avbildet på toppen av et vibraplanbord; Dette er imidlertid ikke nødvendig for å fullføre funksjonelle undersøkelser. I funksjonelle studier settes elektroder generert som beskrevet i den elektriske stimuleringsdelen av protokollen inn i PDMS, slik at elektroder ligger bak stolpene. Det er viktig å ha god visualisering av stiftregionen før du setter inn elektroden, da behovet for å sette inn igjen kan føre til forskyvning av vevet fra stiften. Riktig innsetting av elektrodene er også viktig for å oppnå skarpt fokus på stolpen slik at etteravbøyning senere kan spores med pythonskriptet. Figur 3b viser en representativ forskyvning av MyoTACTIC brønnplatestolpe som svar på lav (rykninger, 0,5 Hz) og høy (stivkrampe, 20 Hz) frekvens hMMT elektrisk stimulering. Kvantifisering av postforskyvning kan brukes til å beregne den induserte kontraktilkraften til hMMTs (Figur 3c). Når denne informasjonen kombineres med hMMT tverrsnittsområde, kan spesifikk kraft bestemmes30. Videre spiller kalsiumtransienter en viktig rolle i muskelkontraksjon. Stabil transduksjon av skjelettmuskulatur myoblaster med en genetisk kodet kalsiumindikator som GCaMP612,30,33,34, muliggjør live overvåking av kalsiumtransienter12,30,34. Kalsiumtransienter ble analysert ved hjelp av det nevnte elektriske stimuleringsoppsettet opp til å stimulere dag 12 hMMT generert med udødeliggjorte myoblaster som uttrykker MHCK7-GCAMP6-reporteren (Figur 4a), og kvantifisert som gjennomsnittlig topp fluorescerende intensitet under lav (rykning, 0,5 Hz) og høy (stivkrampe, 20Hz) frekvens elektrisk stimulering (Figur 4b). Det observeres at hMMT kalsiumhåndteringsegenskaper målt på tvers av forskjellige eksperimenter er relativt konsistente (Figur 4b). Kvantifiseringsmetoder for etteravbøyning og kalsiumhåndtering er skissert i Supplerende video 1 og supplerende video 2.
Figur 1: Tilberedning av MyoTACTIC PDMS-plate før hMMT-sådd. 96-brønnsplattformen referert til som MyoTACTIC fremstilles ved første herding av polydimetylsiloksan (PDMS) i en negativ polyuretanform (PU). Den PDMS-baserte kulturplattformen skrelles deretter forsiktig fra den negative PU-formen. I en akademisk setting blir PDMS-enheten deretter kuttet i mindre enheter som inneholder 6 ± 2 funksjonelle brønner. Disse brønnene plasseres deretter i en steriliseringspose, autoklaveres og lagres til bruk. Opptil en dag før bruk plasseres ønsket antall enhetsdeler innenfor en 10 cm kulturplate og Pluronic F-127 legges til hver brønn. Det 10 cm tallerkenlokket er tilsatt, kanten er forseglet med parafilm før du inkuberer platen i 4° i 2-24 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MyoTACTIC støtter hMMT selvorganisering og dannelse av justerte myotuber. (a) (øverst) Skjematisk tidslinje for hMMT selvorganisering og påfølgende myotube modning over en 14-dagers kulturperiode. (nederst) Representative 4x fasekontrastbilder for å illustrere kinetikken til udødeliggjort myoblasts selvorganisering på tvers av de to vertikale innleggene som resulterer i dannelsen av en 3D hMMT. Skala bar, 500 μm. (b-f) Representative 4x fase-kontrast bilder av hMMTs på dag 12 av differensiering som viser hMMT utfall forårsaket av (b) en boble i cellen - ECM på tidspunktet for såing (rød pil peker for boble indusere hMMT skade), (c) feil aspirasjon av Pluronic F-127 løsning belegg, og (d-f ) hMMT over-ombygging som kan signalisere feil ECM gelering, mangel på ACA aktivitet i kulturmedier, feil omsorg for myoblast foreldrelinje, etc. Skalastang, 500 μm. (g) Representativ flislagt og flatt konfokalt bilde av en dag 12 hMMT tatt ved 10x forstørrelse. hMMTs festes direkte i PDMS-formen, deretter forsiktig fjernes og plasseres i en 96 brønnkulturplate for farging. Sarcomeric α-actinin (SAA) vist i magenta, og Hoechst 33342 kjernefysiske tellere vist i cyan. Skalalinje, 500 μm. (h) Representativt konfokalt bilde av en dag 12 hMMT ved 40x forstørrelse. hMMT myotubes og nuklei visualiseres ved immunostaining for SAA (magenta) og mottiltak med Hoechst 33342 (cyan). Skala bar, 50 μm. (i) Prikk plott graf av gjennomsnittlig hMMT myotube diameter på dag 12 av differensiering. Verdier rapporteres som gjennomsnittlige ± SEM. n = 8 hMMTs fra 3 biologiske replikeringer, preget av symbolformer, hvorved minst 30 myotuber per hMMT analyseres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: In situ måling av kontraktil kraft i MyoTACTIC-plattformen. (a) Representasjon av det elektriske stimuleringsarrangementet (venstre). Selv om det er avbildet i dette oppsettet, er det ikke nødvendig med et vibraplanbord. Et smarttelefonkamera og en brakett var utstyrt med okularet til et invertert mikroskop utstyrt med en fluorescenslampe for videoopptak av hMMTs elektriske stimuleringsstolpeforskyvninger (venstre). 25 G nåler ble pakket inn med tinnbelagte kobberledninger (nederst til høyre), koblet til en BNC til alligatorklemmekontaktkabel (øverst til høyre) og ble festet til en vilkårlig bølgeformgenerator. Plassering av elektroder under elektrisk stimulering er vist nederst til høyre. (b) Representative øyeblikksbilder hentet fra innleggsavbøyningsvideoer hentet fra hMMTs på dag 12 av differensiering. Videoer ble tatt opp med 10x forstørrelse. Heldekkende hvite vertikale linjer viser innleggsplassering når hMMTs er avslappet, mens prikkede hvite vertikale linjer viser innleggsforskyvning etter høy (stivkrampe 20 Hz) eller lav (0,5 Hz) frekvensstimulering. Skalastang, 100 μm. (c) Prikkplottgraf av gjennomsnittlig hMMT-rykninger (0,5 Hz) - og stivkrampe (20 Hz)-indusert kontraktilkraft på dag 12 av differensiering. Verdier rapporteres som gjennomsnittlige ± SEM. n = 9 hMMTer fra 3 biologiske replikeringer, preget av symbolformer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In situ måling av kalsiumhåndtering i MyoTACTIC-plattformen. (a) Representative bilder fra et 4x forstørrelsesvideoopptak av spontane GCaMP6+ kalsiumtransienter og kalsiumtransienter som respons på lav (rykningskontraksjon, 0,5 Hz) og høy (stivkrampekontraksjon, 20 Hz) elektrisk frekvensstimulering. hMMTer er omrisset av en prikket gul linje. Skalastang, 200 μm. (b) Prikkplottgraf som viser kvantifisering av gjennomsnittlig topp fluorescerende intensitet per hMMT etter lav (rykningskontraksjon, 0,5 Hz) og høy (stivkrampekontraksjon, 20 Hz) frekvens elektrisk stimulering. Verdier rapporteres som gjennomsnittlige ± SEM. n = 9 hMMTer fra 3 biologiske replikeringer, preget av symbolformer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ekstra video 1: Demonstrasjon av metoder for å analysere data etter avbøyning. En representativ video av post avbøyningsanalyse på dag 12 av differensiering spores av det tilpassede skriptet under stivkrampestimulering. Først velges avkastningen direkte i skriptet for sporing etter sporing. Deretter åpnes videoen ved å velge avspillingsknappen for å kjøre skriptet. Et skarpt fokusert område av innlegget er valgt som avkastning og den blå innleggssporingsboksen er plassert. Enter trykkes for å låse avkastningen og trykkes på nytt for å kjøre skriptet. "y" angis som svar på ledeteksten "Flere sammentrekningsvideoer? [Y/N], angis n som svar på ledeteksten Eksporter innleggsplasseringer som .csv fil? [Y/N]". Stolpeavbøyning som relativ forskyvning i piksler er den endelige utdataene. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Ekstra video 2: Demonstrasjon av metoder for å analysere GCaMP6 kalsium forbigående data. En representativ video av epifluorescens kalsiumhåndteringsanalyse på dag 12 av differensiering under stivkrampestimulering. For det første har en video av kalsiumtransienter (lagret som en serie tiff-bilder) blitt åpnet i ImageJ, og brukeren har navigert gjennom rammer til hMMT er synlig. Deretter bekreftes den nødvendige analysemålingen "gjennomsnittlig grå verdi" og hMMT skisseres ved hjelp av det polygonale tegneverktøyet. Denne disposisjonen lagres som interesseområdet, og den fluorescerende intensiteten til hvert videostykke analyseres ved hjelp av multimål. Disse målingene kopieres til regnearket "Kalsiumhåndteringsmal" med rammedata og kalsium forbigående toppverdier fylt ut og bekreftet. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver metoder for å fremstille og analysere en 3D hMMT kulturmodell som kan brukes på studier av grunnleggende muskelbiologi, sykdomsmodellering eller for kandidatmolekyltesting. MyoTACTIC-plattformen er kostnadsvennlig, enkel å produsere og krever et relativt lite antall celler for å produsere skjelettmuskulaturmikrofunksjoner. hMMTer dannet i MyoTACTIC kulturplattform består av justerte, multinukleerte og strikkede myotuber, og reagerer på elektriske stimuli ved å initiere kalsiumtransienter som utløser sammentrekning (Figur 2, Figur 3, Figur 4). Tidligere studier viste at hMMTs tilbyr en lignende respons på biokjemiske stimuli og kan nå modningsnivåer som samsvarer med de som er rapportert i større format 3D skjelettmuskulatur modeller12,30.
Et kritisk tema gjennom hele MyoTACTIC-plateproduksjonen og hMMT-generasjonen sikrer at bobler forhindres, og hvis de dannes, er fjernet. For å lette enkelttrinnsstøping av en operativ PDMS-form, hadde en PU-form blitt generert nedstrøms for den første 3D-trykte plastformen som tidligere ble beskrevet av Afshar et al.30. PU-formen som er generert gjør det mulig for brukere å produsere et 96 brønnfotavtrykk av PDMS-mugg der maksimalt 96 brønner er funksjonelle (inneholder to stolper), som diktert av PU mold fabrikasjonstrinnet. Under fabrikasjon av PDMS MyoTACTIC-platen savner nye brukere ofte mindre bobler som forblir bak i flytende PDMS, selv etter avgassing. Bobler som lokaliserer til områder av PU-formen som tilsvarer forankring av fleksible stiftstrukturer, vil resultere i etterbrudd ved separasjon av PU-formen fra PDMS-kulturplaten, og i prosessen etterlater et lite stykke herdet PDMS i PU-formen. Trykkluft kan brukes til å fjerne disse herdede PDMS-restene, og unnlatelse av å gjøre det vil effektivt redusere antall funksjonelle brønner som er tilgjengelige for fremtidige platestøpninger. Derfor er det viktig å sikre at alle bobler er fjernet før PDMS-platen er herdet som en fordel med denne plattformen er at det er en frittstående enhet, hvorved alle egenskapene til platen er støpt i et enkelt trinn i stedet for å kreve at hvert enkelt mikrotissue forankringspunkt skal innføres til kulturbrønnene manuelt35, 36,37. De fleste akademiske laboratoriestudier krever ikke en hel MyoTACTIC kulturplate. For å maksimere bruken av hver PMDS-plate, kuttes den manuelt i grupper på 6 ± 2 MyoTACTIC-brønner. For å forbedre denne prosessen kan en PU-form som lar brukerne skrelle funksjonelle enheter på 6 ± 2 MyoTACTIC-brønner helt eliminere dette plateskjæringstrinnet. Videre vil store bobler introdusert i celle-ECM-løsningen mens du blander eller under vevssåingsprosedyren, svekke riktig vevsdannelse. Disse store boblene fortrenger celler fra regionen boblen opptar, noe som ofte resulterer i hMMTs med regioner med få myotubes som vil bukke under kontraktil stress og snap under elektrisk stimulering.
En bemerkelsesverdig fordel med MyoTACTIC er evnen til å kvantifisere aktiv kraftgenerering og kalsiumhåndteringsegenskaper in situ. Dette er en utfordring mange andre 3D-kultursystemer står overfor, der undersøkelse av 3D-vevs kontraktilkraft implementeres som en endepunktanalyse etter fjerning av vevet fra kulturenheten12,37. Derfor er MyoTACTIC godt egnet til å støtte langsgående studier, for eksempel å forstå de tidsmessige effektene av narkotikabehandling på skjelettmuskulatur. En begrensning av metoden som er beskrevet her for å kvantifisere aktiv kraftgenerering og kalsiumhåndteringsegenskaper in situ er manuell plassering av elektroder, noe som begrenser bruken av dette systemet for testing av høyinnholdsmolekyler. En mulig løsning ville være å konstruere et klart lokk av elektroder satt opp som en parallell krets som direkte kan settes inn i et standardisert sett med funksjonelle brønner som muliggjør elektrisk stimulering av flere vev samtidig. Alternativt kan bruk av en myogen stamcellelinje som stabilt uttrykker en channelrhodopsinkonstruksjon tillate muskelcellemembrandepolarisering, og dermed vevskontraksjon indusert av blålyseksponering. Videre er aktiv kraft fanget i videoer som etter avbøyning og kvantifisering av aktiv kontraktil kraft kan utføres på en objektiv måte ved å bruke et tilpasset halvautomatisert pythonskript for å spore avbøyning av innlegg i korte videoer. Derfor er objektiv langsgående vurdering av stimulert kontraktilkraft aktivert av MyoTACTIC30. For å forbedre effektiviteten til dataanalyse, er smarttelefonapplikasjoner som er designet for å måle kraft samtidig som de fanger opp videoer av avbøyning etter avbøyning, ideelle for å øke gjennomstrømningen.
Endelig har verdien av denne plattformen også tidligere blitt beskrevet i sin evne til å forutsi nøyaktig legemiddelrespons. I likhet med kliniske resultater har vi tidligere rapportert at behandling av hMMTs (laget med primære myoblaster) med mytoksiske forbindelser (deksametason, cerivastatin) induserte myotube-atrofi og redusert aktiv kontraktil kraft30. Videre ble den prediktive verdien av MyoTACTIC generert hMMTs validert ved å vise at en klinisk relevant dose av en kjemoterapeutisk som brukes til å behandle kreft i bukspyttkjertelen, en sykdom som ofte er forbundet med cachexia2, betydelig redusert hMMT-kvalitet og kontraktil kraft30. Derfor viser den enkle fabrikasjonen av MyoTACTIC og dens brukervennlighet i genereringen av 3D hMMTs mange fordeler for datafangst med høyt innhold som demonstrert av påliteligheten med hensyn til strukturelle og funksjonelle utganger. En generell begrensning av PDMS-baserte cellekulturenheter er at PDMS adsorberer proteiner. Metoden som er beskrevet her, bruker serumholdige kulturmedier, som overvinner denne begrensningen ved å tjene til å "blokkere" enheten og la effekten av molekyl- og legemiddelbehandlinger observeres. På grunn av denne begrensningen skal imidlertid definitive konklusjoner om molekyldoser unngås, og doseresponskurver oppfordres. Motsatt er denne plattformen ikke egnet for serumfri mikrotissuekultur, da tilsetningsstoffene vil adsorbere til PDMS, og dermed hindre vevshelse og utvikling. I fremtiden vil integreringsteknikker som 3D-bioprinting og/eller automatisert væskehåndtering forbedre gjennomstrømningen i produksjonen av hMMT-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi vil takke Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli og Sadegh Davoudi for å ha bidratt til oppfinnelsen av kulturplattformen MyoTACTIC og etablering av fabrikasjons- og analysemetodene som er beskrevet her. HL mottok støtte fra et NSERC-opplæringsprogram (Natural Sciences and Engineering Research Council) i Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship og et stipend fra University of Toronto Wildcat. PMG er Canada Research Chair i EndogenOus Repair og fikk støtte for denne studien fra Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network, og fra Medicine by Design, et Canada First Research Excellence Program. Skjematiske diagrammer ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
