Summary
В этой рукописи описывается подробный протокол для получения массивов 3D-микротизов скелетных мышц человека и минимально инвазивных анализов функции in situ, включая анализы сократительной силы и обработки кальция.
Abstract
Трехмерные (3D) in vitro модели скелетных мышц являются ценным прогрессом в биомедицинских исследованиях, поскольку они дают возможность изучать реформацию и функционирование скелетных мышц в масштабируемом формате, который поддается экспериментальным манипуляциям. 3D-системы мышечных культур желательны, поскольку они позволяют ученым изучать скелетные мышцы ex vivo в контексте клеток человека. 3D-модели in vitro близко имитируют аспекты структуры нативной ткани скелетных мышц взрослого человека. Однако их универсальное применение ограничено наличием платформ, которые просты в изготовлении, дороги и удобны для пользователя, а также дают относительно большое количество скелетных мышечных тканей человека. Кроме того, поскольку скелетные мышцы играют важную функциональную роль, которая нарушается с течением времени во многих болезненных состояниях, экспериментальная платформа для исследований микротизвестности наиболее практична, когда минимально инвазивные измерения преходящих и сократительных сил кальция могут проводиться непосредственно внутри самой платформы. В этом протоколе описывается изготовление 96-хорошей платформы, известной как «MyoTACTIC», и массовое производство 3D-микротизов скелетных мышц человека (hMMT). Кроме того, представлены методы минимально инвазивного применения электрической стимуляции, которая позволяет повторно измерять силу скелетных мышц и обработку кальция каждого микротизнеса с течением времени.
Introduction
Скелетные мышцы являются одной из самых распространенных тканей в организме человека и поддерживают ключевые функции организма, такие как передвижение, тепловой гомеостаз и метаболизм1. Исторически сложилось так, что животные модели и двумерные (2D) системы клеточных культур использовались для изучения биологических процессов и патогенеза заболеваний, а также для тестирования фармакологических соединений при лечении заболеваний скелетных мышц2,3. В то время как животные модели значительно улучшили наши знания о скелетных мышцах в области здоровья и болезней, их трансляционное воздействие было затруднено высокими затратами, этическими соображениями и межвидовыми различиями2,4. Обращаясь к клеточным системам человека для изучения скелетных мышц, 2D-системы клеточных культур благоприятны из-за их простоты. Однако есть ограничение. Этот формат часто не может повторить взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс, которые происходят естественным образом в организме5,6. За последние несколько лет трехмерные (3D) модели скелетных мышц стали мощной альтернативой целым животным моделям и обычным системам 2D-культур, позволяя моделировать физиологически и патологически значимые процессы ex vivo7,8. Действительно, множество исследований сообщили о стратегиях моделирования скелетных мышц человека в биоискусственном формате 3D-культуры1. Одним из ограничений для многих из этих исследований является то, что активная сила количественно определяется после удаления мышечных тканей из платформ культуры и прикрепления к преобразователю силы, который является разрушительным и, следовательно, ограничен в качестве анализа конечнойточки 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. ,19,20,21. Другие разработали системы культивирования, которые позволяют использовать неинвазивные методы измерения активной силы, но не все поддаются тестированию молекул с высоким содержанием приложений7,8,9,10, 14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Этот протокол описывает подробный метод изготовления микротюсов мышц человека (hMMT) в платформе скелетных мышц (Myo) microTissue Array deviCe To Explore forCe (MyoTACTIC); пластинчатое устройство на 96 скважин, которое поддерживает массовое производство 3D микротиз30скелетных мышц. Метод изготовления пластин MyoTACTIC позволяет генерировать 96-луночную полидиметилсилоксановую (PDMS) культуральную пластину и все соответствующие характеристики скважины на одной стадии литья, в соответствии с которой для каждой скважины требуется относительно небольшое количество клеток для формирования микротизвестков. Микроткани, образующиеся в пределах MyoTACTIC, содержат выровненные, поперечно-полосатые и многоядерные миотрубки, которые воспроизводятся от колодца к колодцу устройства и при созревании могут реагировать на химические и электрические раздражители in situ30. В настоящем описаны и обсуждены методика изготовления пластинчатого устройства PDMS MyoTACTIC из полиуретановой (PU) реплики, оптимизированный метод реализации увековеченных миогенных клеток-предшественников человека для изготовления hMMT, а также функциональная оценка инженерной генерации силы hMMT и свойств обработки кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление плит PDMS MyoTACTIC
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления пластин PDMS MyoTACTIC требуется pu отрицательная форма, которая может быть изготовлена, какописано ранее 30. Файл SolidWorks автоматизированного проектирования (CAD) для проектирования пластин MyoTACTIC доступен на GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Приготовьте ~ 110 г раствора полимера PDMS в одноразовом пластиковом стаканчике в соотношении 1:15 мономера к отверждающему агенту, используя компоненты в комплекте силиконовых эластомеров. Перемешайте раствор полимера в течение 2-3 мин, используя одноразовую серологическую пипетку объемом 5 мл до полного перемешивания и однородности.
ВНИМАНИЕ: Избегайте контакта раствора полимера PDMS с кожей и глазами; и избегайте вдыхания. Всегда надевайте лабораторное пальто и одноразовые перчатки при обращении с жидкой смесью PDMS и ссылайтесь на паспорт безопасности (SDS) для получения конкретных протоколов безопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите поверхности оборудования (например, весы, столешницы и т.д.) одноразовым покрытием в случае разлива раствора полимера PDMS. - Дегазируйте смесь при комнатной температуре, помещая чашку в настольную вакуумную камеру, подключенную к стандартному сухому вакуумному насосу, в течение ~ 30 минут или до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены. Разбивайте вакуум каждые 5-10 минут, чтобы помочь в дегазации. Используйте пустой шприц-бочку объемом 50 мл, чтобы погрузить воздух и выдуть оставшиеся пузырьки на поверхности полимерной смеси по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кусок трубки ДИАМЕТРОМ 6,35 мм может быть использован для подключения наконечника пипетки P1250 к стволу для повышения скорости и точности воздушного потока. - Пока раствор полимера PDMS дегазируется, удалите все оставшиеся кусочки PDMS, прилипшие к отрицательной форме PU, аккуратно протерев края и поверхность сухим бумажным полотенцем. Используйте сжатый воздух установки, установленный на 70-100 кПаг для удаления оставшихся мелких частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите отрицательную форму PU от повреждений и накопления твердых частиц, поместив ее в герметичный пластиковый пакет и храня его в ящике, защищенном от лабораторного движения. - Поместите полиуретановую форму в химический вытяжку, которая была защищена одноразовым покрытием. Поместите форму горизонтально под ~75° и распылите на активную поверхность ровный слой высвобождающего агента. Распылите форму сверху вниз, затем слева направо, удерживая банку на расстоянии 15-20 см от формы и используя жидкость вперед и назад размашистым движением. Поверните форму на 180° и повторите распыления, затем дайте полиуретной форме постоять в химической вытяжке в течение 10-15 минут для высыхания.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что высвобождающий агент используется в химическом вытяжном шкафу, избегайте контакта с кожей и глазами и обратитесь к Паспорту безопасности (SDS) для получения конкретных протоколов безопасности
ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкая пленка должна полностью покрывать активную поверхность, но избыточное покрытие может быть перенесено в PDMS на следующем этапе, что, в свою очередь, может негативно повлиять на посев hMMT. Поверхность должна быть гладкой на ощупь, но не влажной. - Равномерно налейте 100 г PDMS в полиуретановую форму и поместите в вакуумную камеру, подключенную к пластинчато-роторному вакуумному насосу. Дегазируйте заполненную PDMS форму в течение ~45 мин, нарушая вакуумное уплотнение каждые 5-10 мин в течение первых 20 мин, чтобы ускорить процесс. Оставьте в вакуумной камере до тех пор, пока смесь PDMS полностью не исчезнет из всех пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластинчато-роторный вакуумный насос используется для достижения более низкого вакуума и сокращения времени, необходимого для этой стадии. Дегазация заполненной PDMS формы может быть выполнена с помощью настольной вакуумной камеры и стандартного дежурного сухого вакуумного насоса, однако время опорожнения смеси всех пузырьков будет дольше. Что важно, так это удаление всех пузырьков из раствора полимера PDMS, особенно в тех областях, которые предназначены для того, чтобы стать анкерными стойками hMMT. Пузыри в этом регионе приведут к поломке якорного столба, потере культурных скважин и, в свою очередь, приведут к тому, что небольшой кусочек PDMS останется вклинившимся в форму. - Переложите дегазированную полиуретановую форму, заполненную PDMS, в духовку с температурой 65 °C, инкубируя в течение ночи, чтобы вылечить жидкую резину.
- Извлеките из духовки отвержденную PDMS положительную пластину и охладите тарелку при комнатной температуре не менее 30 минут.
- С помощью скальпеля без лезвия аккуратно отсоедините отвержденный PDMS от полиуретановой формы, проведя заднюю часть рукоятки между PDMS и стенками формы. Начните вдоль верхнего края и разделите все 4 стороны, прежде чем надавить вниз на основание формы и отсоединить эту часть. Этот шаг завершается, когда задняя часть ручки плавно проходит между PDMS и всеми 4 стенками полиуретановой формы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте медленно и осторожно с безлопастным скальпелем, чтобы предотвратить растрескивание полиуретановой формы или разрыв PDMS. Этот шаг должен занять 15-20 минут. - Начиная с одного конца, используйте безлопастной скальпель, чтобы поднять край PDMS и работать пальцами между отвержденной культуральной пластиной PDMS и полиуретановой формой. Затем, обеими руками, протолкните пальцы дальше под пластину, медленно отслаиваясь и выходя из полиуновой формы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте медленно и используйте обе руки, чтобы равномерно очистить тарелку. Сведите к минимуму изгиб, чтобы снизить вероятность поломки анкерного столба. Этот шаг должен занять 5-10 мин. - Используйте лезвие бритвы с одним краем, чтобы разрезать пластину на группы по 6 ± 2 колодца MyoTACTIC(рисунок 1)для целей посева тканей. Поместите полные пластины MyoTACTIC или части пластин в мешок для стерилизации инструмента и автоклав на 25-минутный сухой цикл (20 минут времени стерилизации и 5 минут сухого времени) при 120 °C и 100-140 кПаг.
2. Культура увековеченных клеток-предшественников миобласта человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Увековеченные миобласты, используемые в этом протоколе, были получены из Института миологии (Париж, Франция)31.
- Получить один флакон замороженных клеток из жидкого азота дьюара и быстро разморозить флакон на водяной бане с температурой 37 °C (менее чем за 1 мин). Клетки замораживают при плотности 7,5 х 105 клеток на 1 мл морозильной среды, состоящей на 90% из фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (DMSO).
- Осторожно перенесите содержимое флакона в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл предварительно нагретой промывочной среды, состоящей из 89% DMEM 1x, 10% FBS и 1% Pen/Strep, чтобы разбавить DMSO. Раскрутите коническую трубку объемом 15 мл при 400 х г в течение 10 минут, а затем аспирируйте среду, стараясь избежать гранулы клетки.
- Повторно суспендировать гранулу в 1 мл питательной среды, состоящей из 84% базальной среды клеток скелетных мышечных мышц со смесью добавок для скелетных мышечных клеток, 15% FBS и 1% Pen/Strep, а затем перевести в коническую трубку объемом 50 мл с 29 мл питательной среды.
- Переложите 10 мл среды, содержащей приблизительно 2,5 x 105 клеток, в чашку для культивирования клеток размером 100 мм x 20 мм. Повторите этот шаг с оставшимися 20 мл клеточного раствора. Затем перенесите чашки для клеточных культур в увлажненный инкубатор клеточных культур, установленный на 37 °C и 5% CO2.
- Обновляйте питательные среды через день. Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут ~ 70%-80% конфлюзии (обычно 4-5 дней), после чего клетки готовятся к посеву. Для генерации каждого hMMT требуется1,5 x 10 5 ячеек. Поэтому прохождение клеток необходимо для достижения необходимого количества клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увековеченные клеточные линии-предшественники миобластов никогда не должны превышать 80% слияния перед посевом клеток в колодцы MyoTACTIC, прохождением клеток или подготовкой морозильных запасов. hMMT, изготовленные из клеток, которые превысили 80% конфлюентности, часто не достигают сократительной зрелости. Процедуры пропуска идентичны методам, описанным ниже на шаге 3.
3. Посев инженерных hMMT с MyoTACTIC
- Подготовка культуральных колодцев и реагентов MyoTACTIC для посева hMMT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предоставляет конкретные детали для производства 6 хММТ.- За 2-3 ч до посева клеток поместите 6-луночную порцию пластины MyoTACTIC в чашку для культивирования клеток 10 см. Хорошо подготовьте каждую отдельную культуру MyoTACTIC, добавив в каждую лунку 100 мкл 5% раствора Pluronic F-127. Положите крышку на 10-сантиметровую чашку для культивирования, нанесите парафин, чтобы запечатать пространство между 10-сантиметровой тарелкой и крышкой, а затем поместите 10-сантиметровую тарелку, содержащую порцию MyoTACTIC, в центрифугу, оснащенную адаптером для спиннера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если адаптер спиннера для пластин центрифуги недоступен, наконечник пипетки p20 может быть использован для осторожного удаления пузырьков из-за стоек, тем самым гарантируя, что вся поверхность культуры равномерно покрыта. - Центрифуга при 1 550 х г в течение 1 мин для удаления всех пузырьков в культуральных колодцах, особенно за стойками. Храните 10 см чашку для культивирования клеток, содержащую часть пластины MyoTACTIC, содержащую раствор Pluronic F-127, при 4 °C до тех пор, пока клетки не будут подготовлены к посеву.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плуроническое покрытие F-127 можно наносить всего за 2 ч до 24 ч. Например, колодцы могут быть заполнены раствором Pluronic F-127 в конце дня для использования на следующий день. Не превышайте 24 ч, так как это негативно повлияет на ремоделирование hMMT и не сможет сформировать здоровые ткани, которые достигают сократительной зрелости. - Медленно разморозьте одну аликвоту экстракта базальной мембраны объемом 50 мкл и одну аликвоту тромбина 10 мкл (стоковый раствор 100 Ед/мл) на льду в пределах культуральной вытяжки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует повторно замораживать аликвоты экстракта базальной мембраны. Они одноразовые. Тромбиновые аликвоты многоразовые, поэтому повторно замораживают до 5 раз после использования. - Взвесьте ~ 7 мг порошкообразного фибриногена в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл, а затем перенесите в вытяжку клеточной культуры. Добавьте 700 мкл 0,9% (масс./об.) раствора NaCl в воду (или физиологический раствор) для получения раствора конечной концентрации 10 мг/мл. Не вращайте фибриноген для растворения, вместо этого поместите трубку в инкубатор клеточной культуры 37 °C на 3-5 мин.
- Аккуратно снимите и проведите трубкой, затем импульсно раскрутите растворенный раствор в настольной мини-центрифуге (микрофуге) и вернитесь в культуральную вытяжку. Фильтруйте раствор фибриногена с помощью шприца объемом 1 мл, оснащенного шприцевым фильтром 0,22 мкм. Перенесите растворенный раствор фибриногена на лед вместе с экстрактом базальной мембраны и аликвотами тромбина.
- Наконец, подготовьте посадочную среду hMMT, которая будет введена в культуральные колодцы после посева тканей. Эта среда содержит базальную среду клеток скелетных мышц, дополненную 20% FBS, 1% P/S и 3% 6-аминокапроновой кислотой (ACA; конечная концентрация 1,5 мг/мл достигается путем разбавления из 50 мг/мл раствора; % выражается в v/v). Перед использованием предварительно прогрейте среду при температуре 37 °C.
- За 2-3 ч до посева клеток поместите 6-луночную порцию пластины MyoTACTIC в чашку для культивирования клеток 10 см. Хорошо подготовьте каждую отдельную культуру MyoTACTIC, добавив в каждую лунку 100 мкл 5% раствора Pluronic F-127. Положите крышку на 10-сантиметровую чашку для культивирования, нанесите парафин, чтобы запечатать пространство между 10-сантиметровой тарелкой и крышкой, а затем поместите 10-сантиметровую тарелку, содержащую порцию MyoTACTIC, в центрифугу, оснащенную адаптером для спиннера.
- Подготовка клеток к посеву hMMT.
- Соберите пластины для культивирования клеток из инкубатора культуры. Аспирируйте среду с каждой пластины, затем промывайте клетки один раз D-PBS, добавляя 5 мл D-PBS в каждую культуральную пластину. Затем аспирируют D-PBS и отделяют клетки, добавляя 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую чашку для культивирования. Поместите в инкубатор клеточной культуры на 3 мин.
- Остановите прием трипсина, добавив 3 мл моющего средства (89% от 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep) в чашку для культивирования. Переложите клеточный раствор в коническую трубку соответствующего размера, а затем гранулируйте ячейки центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин. Аспирируйте среду, заботясь о том, чтобы избежать гранул клетки. Затем повторно суспендируют ячейку гранулы в 1 мл промывочной среды.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и трипан-синего красителя под микроскопией яркого поля.
Если использовать несколько пластинок клеток, то эта клеточная суспензия будет очень концентрированной. Разбавляйте клеточные суспензии перед подсчетом по мере необходимости. - Поскольку каждая ткань требует 150 000 клеток, повторно суспендированных в 15 мкл смеси внеклеточного матрикса (ECM), для 6 тканей требуется 900 000 клеток в 90 мкл смеси ECM. Чтобы учесть потерю раствора cell-ECM, которая происходит в процессе приготовления из-за образования пузырьков или потери пипетки, приготовьте дополнительную смесь cell-ECM (т. Е. 8 тканей или 1 200 000 клеток в 120 мкл ECM). Перенесите объем клеточной суспензии, содержащей 1 200 000 клеток, в новую коническую трубку. Увеличьте объем до 10 мл со средой для промывки и открутите при 400 х г в течение 10 мин.
- Пока клетки вращаются вниз, приготовьте смесь ECM объемом 150 мкл в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл, используя следующий рецепт. Сначала добавляют 60 мкл DMEM (объем 40%), затем добавляют 60 мкл фибриногена 10 мг/мл раствора (объем 40%) и, наконец, добавляют 30 мкл экстракта базальной мембраны (объем 20%). Храните смесь ECM на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте наконечники, предварительно охлажденные при -20 °C при работе с растворами, содержащими экстракт базальной мембраны. Смесь ECM содержит 4 мг/мл фибриногена.
- Посев хММТ
- Соберите коническую трубку, содержащую раскрученные вниз клетки, и аспирируйте среду, заботясь о том, чтобы избежать гранул клетки. Энергично проведите пальцем в перчатке концом трубки, чтобы выбить гранулу и продолжайте щелкать, пока гранула не появится в виде клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно аспирировать как можно больше промывочной среды, чтобы убедиться, что клеточная суспензия ECM находится в желаемом разведении. При необходимости используйте пипетку для удаления оставшихся моющих средств. - Перенесите 120 мкл раствора ECM в трубку, содержащую ячейку гранулы. Пипетка вверх и вниз, чтобы полностью повторно суспендировать клетки внутри ECM для создания одноклеточной суспензии. Пипетка медленно и осторожно, чтобы избежать введения пузырьков, которые бы уменьшили рабочий объем. Затем поместите раствор cell-ECM на лед до использования.
- Извлеките из холодильника с температурой 4 °C порции пластины MyoTACTIC, содержащие колодцы MyoTACTIC, покрытые Pluronic F-127, и поместите 10-сантиметровую чашку, содержащую колодцы MyoTACTIC, поверх пакета со льдом внутри вытяжки для культивирования клеток.
- Аспирировать раствор Pluronic F-127 из каждой скважины. PDMS пористый и впитывает раствор Pluronic F-127, особенно если пластины были раскручены центрифугой. Дайте остаточному раствору Pluronic F-127 освободиться и осесть на дно скважины, давая скважинам постоять в течение 5 минут, а затем снова аспирировать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку Pasteur с наконечником p1250, прикрепленным на конце, и опрокидыванием p200 над наконечником p1250 при аспирации раствора Pluronic F-127. Это позволит повысить точность для предотвращения случайного аспирации столбовых конструкций. Избегайте соскабливания овальной зоны посева клеток бассейна на дне скважины пипеткой, так как это нарушает покрытие Pluronic F-127 и мешает процессу самоорганизации hMMT. Правильная техника заключается в том, чтобы навести наконечник пипетки прямо над овальным бассейном во время аспирации раствора Pluronic F-127. - Аккуратно пипетка клеточной суспензии ECM для повторного суспендирования любых клеток, которые могли опуститься на дно трубки. Затем переложите 105 мкл клеточной суспензии ECM в свежую, предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл. Позаботьтесь о том, чтобы захватить трубку близко к верху, чтобы предотвратить прогревание раствора.
- Добавьте 0,84 мкл 100 Ед/мл раствора тромбина к 105-мкл клеточной ECM-суспензии, чтобы получить конечную концентрацию 0,2 Ед/мг фибриногена. Пипетку быстро, осторожно и тщательно перемешать, избегая при этом введения пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбин инициирует быстрое превращение фибриногена в сгусток фибрина. Таким образом, существует ограниченное время для посева тканей при добавлении тромбина. Чтобы избежать преждевременного свертывания перед переносом клеточно-ECM-смеси в культуральные колодцы, перед добавлением тромбина установите пипетку p20 на 15 мкл. Используйте предварительно охлажденные наконечники или окуните наконечник пипетки в холодный DMEM на несколько секунд, прежде чем собирать и переносить 15 мкл смеси cell-ECM в каждую лунку. Наилучшей практикой является приготовление аликвот клеточно-ECM-смеси таким образом, чтобы за один раз высевалось не более 6 хММТ. - Чтобы засеять ткани, добавьте 15 мкл клеточно-ECM-смеси (т.е. 150 000 клеток) к каждой отдельной лунке. Осторожно добавьте смесь cell-ECM к центру овального бассейна и избегайте вдавливания наконечника пипетки в дно колодца. Затем двумя легкими движениями распределите клеточную суспензию за каждым столбом в колодце. После того, как поверхность равномерно покрыта суспензией CELL-ECM, переходите к следующей скважине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте эффективно, чтобы избежать преждевременного гелеобразования клеточно-ECM-смеси в пробирке до того, как все ткани будут засеяны. При посеве скважин крайне важно избегать переноса пузырьков, так как пузырь будет мешать ремоделированию hMMT, что делает hMMT непригодным для использования. - Поместите крышку на 10-сантиметровую культуральную пластину, содержащую семенные колодцы, и перенесите в инкубатор тканевых культур при температуре 37 °C примерно на 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите микроцентрифужную трубку с остаточной клеточно-ECM-смесью в инкубатор в качестве подтверждения процесса полимеризации геля. - После того, как клеточно-ECM-смесь полимеризуется, добавьте 200 мкл предварительно расплавленной посевной среды hMMT в каждую скважину MyoTACTIC. Замените крышку на 10-сантиметровой тарелке и верните порции тарелки MyoTACTIC в пределах 10-сантиметровой тарелки в инкубатор. Этот момент времени называется Днем -2. Не беспокойте ткани до следующего шага.
- Соберите коническую трубку, содержащую раскрученные вниз клетки, и аспирируйте среду, заботясь о том, чтобы избежать гранул клетки. Энергично проведите пальцем в перчатке концом трубки, чтобы выбить гранулу и продолжайте щелкать, пока гранула не появится в виде клеточной суспензии.
- Дифференциация hMMT
- После 2 дней инкубации осторожно удаляют посадочную среду hMMT с помощью пипетки и заменяют 200 мкл предварительной дифференцировочной среды, содержащей 2% конской сыворотки, 1% Pen/Strep, 4% ACA (т.е. конечную концентрацию 2 мг/мл от исходной концентрации 50 мг/мл; % выражается как v/v) и 10 мкг/мл человеческого рекомбинантного инсулина в ДМЭМ. Этот момент времени называется днем 0 дифференциации.
- Через день после этого обменивайтесь половиной средств массовой информации со свежими дифференциационными средами до 12-го дня дифференциации, последнего дня культуры(рисунок 2а).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сведения о протоколе для изготовления hMMT с использованием первичных человеческих миобластов были опубликованы в другом месте30. Если есть опасения по поводу жизнеспособности клеток после посева, инкубируйте hMMT с кальциеном и йодидом пропидия для количественной оценки жизнеспособности.
4. Электростимуляция и анализ hMMT-индуцированного прогиба поста
- Установите прозрачное нижнее стекло или пластиковое крепление сцены на перевернутом микроскопе и прикрепите камеру смартфона к окуляру микроскопа с помощью крепления микроскопа-камеры. Будет использована фазоконтрастная микроскопия при 10-кратном увеличении(рисунок 3а).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подойдет любой инвертированный фазовый контрастный микроскоп, оснащенный объективом с 10-кратным увеличением. Конструкция колодца PDMS будет извлечена из 10-сантиметровой тарелки и помещена непосредственно на прозрачное нижнее крепление ступени и, следовательно, открыта для воздуха. Стерилизуйте все поверхности и оборудование 70% этанолом и минимизируйте трафик в этом районе во время экспериментов. - Для приготовления электростимуляционных электродов отрежьте ~30 см медной проволоки с оловянным покрытием. Затем, начиная с ступицы 25-граммовой правильной конической иглы, плотно оберните ~ 10 см проволоки вокруг верхней половины, оставив ~ 20 см лишней проволоки. Повторите для второй иглы, а затем отрежьте ступицу от каждой иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проволока должна быть плотной вокруг иглы, чтобы гарантировать, что она не движется, и проволока, обернутая частью электрода, не должна касаться PDMS, так как это может препятствовать генерации электрического поля. - Подключите BNC к кабелю разъема аллигатора к выходному каналу на генераторе сигналов и установите канал для квадратных импульсов с рабочим циклом 20%, амплитудой 5 В (напряженность электрического поля 10 В/см). Частота будет изменяться между 0,5 Гц и 20 Гц для сокращений подергивания и столбняка соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки генератора сигналов могут потребовать оптимизации для конкретного эксперимента - Поместите часть пластины MyoTACTIC, содержащую hMMT, на ступень микроскопа и осторожно вставьте каждый конический конец электрода в PDMS непосредственно за каждым столбом в овальном бассейне. Аккуратно приклейте 20-сантиметровые участки избыточного провода к ступени микроскопа, чтобы иглы оставались вертикальными и ~ 10 см каждого провода оставались свободными для подключения(рисунок 3a).
ВНИМАНИЕ: Никогда не кладите голый палец на оба конца электрода. Убедитесь, что на указательном пальце надет наперсток для оказания легкого давления на электрод при вставке в PDMS. - Сфокусируйте поле зрения микроскопа на одном из двух столбов, так что фокус будет резким на краю столба, ближайшем к электроду. Затем заблокируйте фокус камеры смартфона на самую четкую область столба. Это важно для последующего анализа, так как изменение фокуса во время записи будет мешать анализу.
- Подключите свободные концы заклеенных проводов к генератору сигналов с помощью зажимов аллигатора(рисунок 3a).
- Запустите запись видео на камеру смартфона, а затем включите выход канала, чтобы начать стимуляцию. Индуцируйте hMMT пройти 3 подергивания и 3 сокращения столбняка, с 2 мин отдыха между сериями стимуляции подергивания и столбняка.
- Выключите выход канала, отсоедините зажимы аллигатора от медных проводов с оловянным покрытием, снимите ленту с проводов и протрите каждый электрод 70% этанолом перед вставкой в последующие скважины hMMT. Повторите процедуру из шага 4.5 для всех hMMT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте время, которое hMMT проводят вне инкубатора, стимулируя не более 3 тканей одновременно. Если дополнительные hMMT в части пластины MyoTACTIC еще предстоит проанализировать, верните пластину в инкубатор в течение 10 минут, чтобы позволить hMMT вернуться к 37 °C. - Чтобы проанализировать отклонение поста и рассчитать генерацию силы hMMT, используйте пользовательский скрипт, который был доступен на GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Следуйте инструкциям в README.md, чтобы настроить и запустить сценарий, а затем откройте каждое видео отслеживания записей, чтобы провести анализ силы.
- Выберите интересующую область (ROI) вдоль края столба, которая будет отслеживаться на предмет смещения столба. Нажмите Enter, чтобы подтвердить рентабельность инвестиций, и нажмите Enter еще раз, чтобы запустить сценарий (Дополнительное видео 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие отклонения приводят к выходу трекера из строя. Если трекер выходит из строя во время сжатия, размер ROI может быть увеличен, чтобы сделать отслеживание менее чувствительным, но позволить отслеживать большие отклонения. Три размера предусмотрены в коде и могут быть настроены путем настройки комментариев скрипта. - Сценарий заканчивается двумя входными требованиями. Во-первых, введите y, чтобы подтвердить, что видео содержало несколько сокращений. Во-вторых, введите y (да) или n (нет) для экспорта результатов в . CSV файл (Дополнительное видео 1).
- Убедитесь, что результаты после отклонения отражаются как смещение в пикселях для каждого сокращения. Преобразуйте пиксели в значения мкм для настройки 10-кратного увеличения микроскопа. Затем преобразуют числа посттравления в абсолютные сократительные силы (мкН) путем умножения значений (мкм) на коэффициент преобразования силы-смещения 2,36 мкН/мкм, что соответствует соотношению 1:15 отверждающего агента к мономеру PDMS, используемого в изготовлении MyoTACTIC30.
5. Анализ переходных процессов кальция с использованием электростимуляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов по обращению с кальцием увековеченные миобласты стабильно трансдуцировались с помощью репортера MHCK7-GCAMP6, как описаноранее 11,12. Трансдуцированные клетки были отсортированы FACS для GFP для получения положительной популяции, а затем использованы для изготовления hMMT. Альтернативные методы визуализации кальция, такие как использование метрических красителей, таких как Fura-2 AM и Indo-1, или флуоресцентная пожизненная визуализация показателей кальция (например, Fluo-4 или Oregon Green BAPTA1), могут поддаваться нашей системе.
- Настройте ступень микроскопа и оборудование для стимуляции (электроды, генератор сигналов и т.д.), как описано ранее в шаге 4. Для этого эксперимента используйте 4-кратное увеличение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуется темная комната и эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой. - Запустите программное обеспечение для визуализации микроскопа, выберите канал фильтра FITC (синий свет) и выберите функцию записи видео. Устанавливается при экспозиции 500 мс и разрешении 680 x 510 (Binning 2x2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для обработки изображений может отличаться, и экспозиция устанавливается пользователем вручную. Позаботьтесь о том, чтобы избежать чрезмерного воздействия hMMT до стимуляции. В состоянии покоя контур / тень темной ткани со спонтанной флуоресценцией является нормальным, в то время как четкое изображение ткани подвергается чрезмернойэкспозиции (Дополнительное видео 2). Убедитесь, что экспозиция согласована для всех hMMT в рамках эксперимента. - Закройте затвор микроскопа и держите канал FITC выключенным до тех пор, пока он не будет готов к записи обращения с кальцием.
- Когда все оборудование и программное обеспечение настроено, извлеките часть пластины MyoTACTIC, содержащую анализируемые hMMT, и установите ее непосредственно на ступень микроскопа. Затем вставьте и соедините электроды, как описано ранее на шаге 4.
- Используйте яркое поле, чтобы сфокусировать поле зрения на центре выбранного hMMT. Затем выключите лампу.
- Откройте затвор канала FITC микроскопа, убедитесь, что горит синий свет, а затем выберите Запись видео в программном обеспечении.
- Включите выход генератора сигналов, чтобы инициировать электрическую стимуляцию. Побудить hMMT пройти 8 подергиваний и 8 сокращений столбняка. Обеспечьте 2 мин отдыха между сериями стимуляции подергивания и столбняка, в течение которых затвор FITC находится в закрытом положении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Допускается 10 с спонтанной активности до и после электрической стимуляции для регистрации минимальной флуоресценции для целей расчета и анализа данных. - Выключите выход канала, отсоедините зажимы аллигатора от медных проводов с оловянным покрытием, снимите ленту с проводов и протрите каждый электрод 70% этанолом перед вставкой в последующие скважины hMMT. Повторите процедуру стимуляции и записи для всех хММТ.
- Сохраняйте фильмы в формате файла TIFF для анализа в ImageJ или альтернативном программном обеспечении для обработки изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте время, которое hMMT проводят вне инкубатора, стимулируя не более 3 тканей одновременно. Если дополнительный hMMT в части пластины MyoTACTIC еще предстоит проанализировать, верните устройство в инкубатор в течение 10 минут, чтобы позволить hMMT вернуться к 37 °C. - Чтобы проанализировать данные о переходных процессах кальция, сначала откройте ImageJ. Выберите «Анализировать»,затем «Установить измерения»,затем выберите «Среднее значение серого» и снимите флажки со всех остальных параметров. По завершении откройте видео с кальцием (.tiff)(Дополнительное видео 2).
- Очертите границу микротизуса с помощью инструмента выделения полигонов и сохраните эту область как рентабельность инвестиций(Дополнительное видео 2). В разделе Дополнительно в окне Диспетчер окупаемости инвестиций выберите Multi Measure и измерьте интенсивность флуоресценции для всех фрагментов файла по одной строке на фрагмент (Дополнительное видео 2).
- Скопируйте все измерения, включая номер среза (кадр), в электронную таблицу и сравните интенсивность флуоресцентности каждого среза с минимальной спонтанной флуоресцентной интенсивностью из файла, используя ΔF / F0 = (Fimmediate - Fминимум) / Fминимум (Дополнительное видео 2).
- Рассчитайте время для каждого кадра, умножив скорость кадра записи видео на номер среза (кадр), и постройте график ΔF / F 0 противвремени для переходного ответа hMMT кальция на стимуляцию (Дополнительное видео 2).
- Выберите пиковый переходный сигнал кальция для каждого из 6 последовательных сокращений и средние значения, чтобы рассчитать относительное среднее изменение интенсивности флуоресцентной жидкости каждого hMMT(Дополнительное видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда исключайте данные, возникающие в результате первого сокращения подергивания, из общего анализа. Электронная таблица под названием «Шаблон обработки кальция.xlsx» была размещена на GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) для облегчения анализа переходных процессов кальция hMMT. Заполняемые ячейки, в которые необходимо ввести значения и входные данные, выделены серым цветом. Не забудьте настроить пиковые номера выбора, так как это только руководство, помогающее в пиковомвыборе (Дополнительное видео 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем описаны способы отливки 96-луночной платформы культуры MyoTACTIC на основе PDMS из полиуретановой формы, изготовления массивов тканей-реплик hMMT и анализа двух аспектов функции hMMT в рамках генерации силы устройства культивирования и обработки кальция. На рисунке 1 представлен схематический обзор подготовки культуральных скважин MyoTACTIC перед посевом hMMT. PDMS представляет собой широко используемый полимер на основе силикона, который может быть легко отлит для создания сложных устройств32. Протокол на основе PDMS был разработан для отливки неограниченного числа 96-луночных культуральных устройств из изготовленной отрицательной полиуретановой формы30. Окончательная отвержденная положительная пластина PDMS является гибкой и может быть легко разрезана на функциональные блоки меньшего размера с помощью лезвия бритвы с одним краем(рисунок 1). Это позволяет пользователю масштабировать устройство в соответствии с потребностями реплики hMMT, характерными для их экспериментального проектирования. Эти меньшие функциональные блоки также полезны для преодоления ограничения работы со каркасом ECM, который быстро полимеризуется, таким как гидрогели фибрина, путем легкой настройки количества скважин в соответствии со скоростью посева клеток пользователя. Кроме того, PDMS легко автоклавируется и может храниться в течение неопределенного периода. Наконец, с точки зрения логистики, полная пластина MyoTACTIC может быть покрыта любой стандартной крышкой из 96 лунок, а размер и профиль частей пластины MyoTACTIC поддаются инкубации в 10-сантиметровой культуральной пластине, чтобы обеспечить стерильность культуры hMMT. Плуроническое покрытие раствора F-127 перед посевом клеток выполняет двойную роль, обеспечивая дополнительную меру стерилизации культуральных скважин, а в качестве неионного поверхностно-активного вещества, предотвращающего клеточную адгезию в пользу равномерного клеточного - ECM-ремоделирования(фиг.1).
Когда увековеченная популяция миогенных клеток-предшественников готова к экспериментам, клетки затем инкапсулируют в гидрогель, состоящий из фибриногена и экстракта базальной мембраны. Затем смесь клеток-ECM равномерно осаждается в овальном бассейне на дне каждого колодца MyoTACTIC, а затем в течение 14-дневного периода культивирования клетки пространственно самоорганизуются через эти два вертикальных столба, образуя 3D-микротизю, заполненный слоем выровненных, многоядерных, полосатых миотрубок, которые напоминают аспекты организации нативной ткани(рисунок 2a, г,ч). В процессе ремоделирования между двумя точками крепления создается одноосное напряжение, и это направляет процесс самоорганизации ткани, чтобы, в свою очередь, стимулировать образование компактной ткани. В течение периода дифференцировки ширина hMMT, построенных из миобластов, полученных от здоровых пациентов, остается довольно последовательной. Однако в случаях ошибок, которые мешают ремоделированию hMMT, это однородность теряется(рисунок 2a-f),что делает эту простую метрику полезной при оценке контроля качества hMMT. Например, чрезмерно усердное перемешивание клеточной – ECM-суспензии может привести к образованию пузырьков. Пузырьки, перенесенные в скважину MyoTACTIC, препятствуют ремоделированию hMMT. В таких случаях пузырьки вытесняют некоторые или все миобласты из области, занимаемой пузырьком, в конечном итоге образуя расщелину в конечном hMMT(рисунок 2b;см. красную стрелку). Другой пример касается целостности покрытия Pluronic F-127 в скважинах. Pluronic F-127 является неионным поверхностно-активным веществом, которое предотвращает прилипание клеток к колодцу MyoTACTIC. Если покрытие соскоблено во время аспирации, миобласты будут прилипать к поверхности скважин MyoTACTIC, образуя новые точки крепления и в результате чего миотрубы не выровнены поперек двух столбов(рисунок 2c). Дополнительные ошибки также могут привести к аберрантному ремоделированию hMMT, как показано на рисунке 2d-f. Жизнеспособность клеток после посева также может быть оценена с использованием анализов окрашивания на основе кальциина / пропидия на основе йодида. Когда этих технических ошибок удается избежать, hMMT заполняются слоем выровненных и многоядерных миотрубок, которые простираются по всей длине каждого hMMT(рисунок 2g). Миотрубы довольно однородны по размеру по всей их длине и между различными hMMT(рисунок 2h-i). Миотубы характеризуются наличием саркомерных полос, которые визуализируются иммуноокрашиванием саркомерного α - актинина (SAA; Рисунок 2h).
Функциональные свойства также могут быть исследованы в hMMT, начиная примерно с 7 дней дифференцировки. Экспериментальная установка для завершения этих функциональных исследований проиллюстрирована на рисунке 3а. Установка микроскопии изображена поверх стола вибраплана; однако это не требуется для завершения функциональных расследований. В функциональных исследованиях электроды, генерируемые, как описано в разделе электростимуляции протокола, вставляются в PDMS, так что электроды находятся за стойками. Важно иметь хорошую визуализацию области столба перед введением электрода, так как необходимость повторной вставки может привести к смещению ткани из столба. Правильная вставка электродов также важна для получения резкого фокуса столба, чтобы пост-отклонение можно было впоследствии отслеживать с помощью скрипта python. На рисунке 3b показано репрезентативное смещение пластинчатого столба скважины MyoTACTIC в ответ на электрическую стимуляцию hMMT с низкой (подергивание, 0,5 Гц) и высокой (столбняк, 20 Гц) частотой. Количественная оценка смещения поста может быть использована для расчета индуцированной сократительной силы hMMT(рисунок 3c). Когда эта информация объединяется с площадью поперечного сечения hMMT, удельная сила можетбыть определена 30. Кроме того, переходные процессы кальция играют важную роль в сокращении мышц. Стабильная трансдукция миобластов скелетных мышц с генетически закодированным показателем кальция, таким как GCaMP612,30,33, 34,позволяет в режиме реальноговременинаблюдать за переходными процессами кальция12,30,34. Переходные процессы кальция анализировали с использованием вышеописанной установки электрической стимуляции для стимуляции 12 гММТ 12 дней, генерируемых увековеченными миобластами, экспрессирующими репортер MHCK7-GCAMP6(рисунок 4a),и количественно оценивали как среднюю пиковую интенсивность флуоресцентной жидкости при низкой (подергивание, 0,5 Гц) и высокой (столбняк, 20 Гц) частоте электрической стимуляции(рисунок 4b). Замечено, что свойства обработки кальция hMMT, измеренные в различных экспериментах, относительно последовательны(рисунок 4b). Методы количественной оценки для обработки после отклонения и кальция описаны в Дополнительном Видео 1 и Дополнительном Видео 2.
Рисунок 1:Подготовка пластины MyoTACTIC PDMS перед посевом hMMT. 96-луночная платформа, называемая MyoTACTIC, изготовлена путем первого отверждения полидиметилсилоксана (PDMS) в отрицательной полиуретановой (PU) форме. Затем культурная платформа на основе PDMS тщательно очищается от отрицательной полиуретановой формы. В академических условиях устройство PDMS затем разрезается на более мелкие блоки, содержащие 6 ± 2 функциональных скважины. Затем эти колодцы помещают в стерилизационный мешочек, автоклавируют и хранят до использования. За один день до использования нужное количество порций прибора помещают в 10-сантиметровую культуральную пластину и добавляют В каждую лунку Pluronic F-127. Добавляется крышка тарелки 10 см, край запечатывается парапленкой перед инкубацией при 4° в течение 2-24 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:MyoTACTIC поддерживает самоорганизацию hMMT и формирование выровненных миотруб. (a) (вверху) Схематическая временная шкала самоорганизации hMMT и последующего созревания миотубов в течение 14-дневного периода культивирования. (внизу) Репрезентативные 4-кратные фазоконтрастные изображения для иллюстрации кинетики самоорганизации увековеченных миобластов на двух вертикальных столбах, что приводит к образованию 3D hMMT. Шкала, 500 мкм. (b-f) Репрезентативные 4-кратные фазоконтрастные изображения hMMT на 12-й день дифференциации, показывающие результаты hMMT, вызванные(b)пузырьком внутри ячейки - ECM во время посева (красные точки стрелок указывают на повреждение пузырька hMMT),(c)неправильная аспирация покрытия раствора Pluronic F-127 и (d-f ) чрезмерное ремоделирование hMMT, которое может сигнализировать о неправильном гелевании ECM, отсутствии активности ACA в питательных средах, неправильном уходе за родительской линией миобласта и т. Д. Шкала, 500 мкм. (g) Репрезентативное мозаичное и сплющенное конфокальное изображение дня 12 hMMT, сделанное при 10-кратном увеличении. hMMT фиксируют непосредственно в форме PDMS, затем тщательно удаляют и помещают в 96-луночную культуральную пластину для окрашивания. Саркомерический α-актинин (SAA), показанный в пурпурном цвете, и Hoechst 33342 ядерный контркруп, показанный в голубом. Шкала бара, 500 мкм. (ч) Репрезентативное конфокальное изображение дня 12 hMMT при 40-кратном увеличении. Миотубы и ядра hMMT визуализируются иммуноокрашиванием для SAA (пурпурный) и контрокрашиванием Hoechst 33342 (голубой). Шкала, 50 мкм.(i)Точечный график среднего диаметра миотруб hMMT на 12 день дифференциации. Значения сообщаются как средние ± SEM. n = 8 hMMT из 3 биологических реплик, различаемых формами символов, в результате чего анализируется не менее 30 миотруб на hMMT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Измерение сократительной силы in situ в платформе MyoTACTIC. (a)Представление расположения электрической стимуляции (слева). Несмотря на то, что это изображение в этой установке, стол вибраплана не требуется. Камера и крепление смартфона были установлены на окуляре перевернутого микроскопа, оснащенного люминесцентной лампой для видеозаписей смещений постов электростимуляции hMMT (слева). Иглы 25 G были обернуты медными проводами с оловянным покрытием (внизу справа), подключены к кабелю BNC к зажиму аллигатора (вверху справа) и прикреплены к генератору сигналов произвольной формы. Размещение электродов во время электростимуляции показано в правом нижнем углу. (b)Репрезентативные снимки, взятые из видеороликов после отклонения, полученных от hMMT на 12-й день дифференциации. Видео было снято с 10-кратным увеличением. Сплошные белые вертикальные линии показывают размещение постов, когда hMMT расслаблены, в то время как пунктирные белые вертикальные линии показывают смещение столба после высокой (столбняк 20 Гц) или низкой (0,5 Гц) частотной стимуляции. Шкала, 100 мкм. (c) Точечный график среднего подергивания hMMT (0,5 Гц) и столбняка (20 Гц), вызванной сократительной силой на 12-й день дифференциации. Значения сообщаются как средние ± SEM. n = 9 hMMT из 3 биологических реплик, различаемых формами символов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Измерение in situ обработки кальция в рамках платформы MyoTACTIC. (a)Репрезентативные изображения из 4-кратной видеозаписи увеличения спонтанных переходных процессов GCaMP6+ кальция и переходных процессов кальция в ответ на электрическую стимуляцию низкой (сокращение подергивания, 0,5 Гц) и высокой (сокращение столбняка, 20 Гц) частоты. hMMT очерчены пунктирной желтой линией. Шкала, 200 мкм.(b)График точечной диаграммы, показывающий количественную оценку средней пиковой интенсивности флуоресцентной жидкости на hMMT после низкой (сокращение подергивания, 0,5 Гц) и высокой (сокращение столбняка, 20 Гц) частоты электрической стимуляции. Значения сообщаются как средние ± SEM. n = 9 hMMT из 3 биологических реплик, различаемых формами символов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео 1: Демонстрация методов анализа данных после отклонения. Репрезентативное видео анализа после отклонения на 12-й день дифференциации отслеживается пользовательским сценарием во время стимуляции столбняком. Сначала размер ROI выбирается непосредственно в скрипте post tracking. Затем видео открывается нажатием кнопки воспроизведения для запуска скрипта. В качестве ROI выбирается четко сфокусированная область сообщения и помещается синее поле отслеживания сообщений. Клавиша ENTER нажимается для блокировки окупаемости инвестиций и снова нажимается для запуска сценария. «y» вводится в ответ на подсказку «Видео с множественным сокращением? [Y/N]», затем 'n' вводится в качестве ответа на запрос «Экспортировать местоположения записей как .csv файл? [Y/N]". Отклонение после относительного смещения в пикселях является конечным выходом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео 2: Демонстрация методов анализа данных о переходных процессах кальция GCaMP6. Репрезентативное видео анализа обработки эпифлуоресценции кальция на 12-й день дифференцировки во время стимуляции столбняком. Во-первых, видео переходных процессов кальция (сохраненное в виде серии изображений tiff) было открыто в ImageJ, и пользователь перемещался по кадрам, пока hMMT не будет виден. Затем подтверждается требуемое измерение анализа «среднее значение серого цвета» и hMMT очерчивается с помощью инструмента полигонального рисования. Этот контур сохраняется как область интереса, а интенсивность флуоресценции каждого фрагмента видео анализируется с помощью нескольких измерений. Эти измерения копируются в электронную таблицу «Шаблон обработки кальция» с данными кадра и заполненными и подтвержденными пиковыми значениями переходных значений кальция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи описываются методы изготовления и анализа модели культуры 3D hMMT, которая может быть применена к исследованиям базовой мышечной биологии, моделированию заболеваний или для тестирования молекул-кандидатов. Платформа MyoTACTIC является экономичной, простой в изготовлении и требует относительно небольшого количества клеток для производства микротизов скелетных мышц. hMMT, сформированные в рамках платформы культур MyoTACTIC, состоят из выровненных, многоядерных и полосатых миотуб и реагируют на электрические стимулы, инициируя переходные процессы кальция, которые вызывают сокращение(рисунок 2, рисунок 3, рисунок 4). Предыдущие исследования показали, что hMMT предлагают аналогичную реакцию на биохимические стимулы и могут достигать уровней созревания, соответствующих тем, о которых сообщалось в более крупных форматах 3D-моделей скелетных мышц12,30.
Важнейшей темой на протяжении всего производства пластин MyoTACTIC и генерации hMMT является обеспечение того, чтобы пузырьки предотвращались, а если они образовались, были удалены. Чтобы облегчить одноступенчатое литье работоспособной формы PDMS, полиуретановая форма была сгенерирована после первоначальной 3D-печатной пластиковой формы, ранее описанной Afshar et al.30. Созданная полиуретановая форма позволяет пользователям производить 96 скважин формы PDMS, в результате чего максимум 96 скважин являются функциональными (содержат два столба), что диктуется этапом изготовления полиуретановой формы. Во время изготовления пластины PDMS MyoTACTIC новые пользователи часто пропускают более мелкие пузырьки, которые остаются в жидкой PDMS, даже после дегазации. Пузырьки, которые локализуются в областях полиуретановой формы, соответствующих анкерным гибким стержневым структурам, приведут к поломке после разрыва полиуретана от культуральной пластины PDMS и в процессе оставят после себя небольшой кусочек отвержденной PDMS в полиузеляжной форме. Сжатый воздух может быть использован для удаления этих отвержденных остатков PDMS, и неспособность сделать это эффективно уменьшит количество функциональных скважин, доступных для будущих листовых отливок. Поэтому крайне важно убедиться, что все пузырьки были удалены до того, как пластина PDMS будет отверждена, поскольку преимущество этой платформы заключается в том, что она является автономным устройством, в соответствии с которым все функции пластины отливаются за один шаг, а не требуют, чтобы каждая отдельная точка крепления микротизнеса была введена в культуральные скважины вручную35, 36,37. Большинство академических лабораторных исследований не требуют целой культуральной пластины MyoTACTIC. Чтобы максимально использовать каждую пластину PMDS, ее вручную разрезают на группы из 6 ± 2 скважин MyoTACTIC. Чтобы улучшить этот процесс, полиуретановая форма, которая позволяет пользователям очищать функциональные блоки из 6 ± 2 скважин MyoTACTIC, может полностью исключить этот этап резки пластины. Кроме того, большие пузырьки, введенные в раствор cell-ECM во время смешивания или во время процедуры посева тканей, ухудшат правильное формирование тканей. Эти большие пузырьки вытесняют клетки из области, которую занимает пузырь, что часто приводит к hMMT с областями с небольшим количеством миотруб, которые поддаются сократительному стрессу и лопаются во время электрической стимуляции.
Заметным преимуществом MyoTACTIC является возможность количественной оценки генерации активной силы и свойств обработки кальция in situ. Это проблема, с которой сталкиваются многие другие системы 3D-культивирования, где исследование 3D-сократительной силы ткани реализуется в виде анализа конечной точки после удаления ткани из культурального устройства12,37. Поэтому MyoTACTIC хорошо подходит для поддержки продольных исследований, например, понимания временных эффектов медикаментозного лечения на скелетные мышцы. Одним из ограничений способа, описанного в настоящем описании для количественной оценки генерации активной силы и свойств обработки кальция in situ, является ручное размещение электродов, что ограничивает использование этой системы для тестирования молекул с высоким содержанием. Возможным решением может быть создание прозрачной крышки электродов, установленной в виде параллельной цепи, которая может быть непосредственно вставлена в стандартизированный набор функциональных скважин, позволяющих электрическую стимуляцию нескольких тканей одновременно. Альтернативно, использование миогенной клеточной линии-предшественника, стабильно экспрессирующей конструкцию каналродопсина, позволит деполяризовать мембрану мышечных клеток и, следовательно, сокращение тканей, вызванное воздействием синего света. Кроме того, активная сила фиксируется на видео, поскольку отклонение после и количественная оценка активной сократительной силы могут проводиться непредвзятым образом с использованием пользовательского полуавтоматического скрипта Python для отслеживания отклонения поста в коротких видеороликах. Таким образом, объективная продольная оценка стимулированной сократительной силы обеспечивается MyoTACTIC30. Чтобы повысить эффективность анализа данных, приложения для смартфонов, которые предназначены для измерения силы при одновременном захвате видео отклонения поста, идеально подходят для увеличения пропускной способности.
Наконец, ценность этой платформы также была ранее описана в ее способности точно прогнозировать реакцию на наркотики. Подобно клиническим исходам, мы ранее сообщали, что лечение hMMT (сделанных с первичными миобластами) миотоксическими соединениями (дексаметазон, церивастатин) индуцировало атрофию миотуба и уменьшало активную сократительную силу30. Кроме того, прогностическая ценность MyoTACTIC, генерируемого hMMT, была подтверждена, показав, что клинически значимая дозировка химиотерапевтического средства, используемого для лечения рака поджелудочной железы, заболевания, которое часто связано с кахексией2,значительно снижала качество hMMT и сократительную силу30. Таким образом, простое изготовление MyoTACTIC и простота его использования при генерации 3D hMMT показывают много преимуществ для сбора данных с высоким содержанием, о чем свидетельствует его надежность в отношении структурных и функциональных выходов. Общим ограничением устройств клеточной культуры на основе PDMS является то, что PDMS адсорбирует белки. Способ, описанный в настоящем описании, использует сывороточные питательные среды, которые преодолевают это ограничение, служа для «блокирования» устройства и позволяют наблюдать эффекты молекулярной и лекарственной обработки. Однако из-за этого ограничения следует избегать окончательных выводов о дозах молекул и поощрять кривые реакции дозы. И наоборот, эта платформа не подходит для безсыворочной микроткани культуры, поскольку добавки адсорбируют PDMS, тем самым препятствуя здоровью и развитию тканей. В будущем интеграция таких методов, как 3D-биопечать и / или автоматизированная обработка жидкостей, улучшит пропускную способность при производстве культур hMMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Мохаммада Афшара, Хабена Абраху, Мохсена Афшар-Бакушли и Садега Давуди за вклад в изобретение платформы культуры MyoTACTIC и создание методов изготовления и анализа, описанных в настоящем документе. HL получила финансирование от Учебной программы Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в области инженерии и предпринимательства Organ-on-a-Chip и стипендий для выпускников Университета Торонто Wildcat. PMG является Канадской исследовательской кафедрой эндогенного восстановления и получила поддержку для этого исследования от Института регенеративной медицины Онтарио, Сети стволовых клеток и от Medicine by Design, Канадской программы первого научного совершенства. Принципиальные схемы создавались с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
