Summary
Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol til fremstilling af arrays af 3D menneskelige skeletmuskulaturmikrotiss og minimalt invasive downstream in situ-analyser af funktion, herunder kontraktilkraft og calciumhåndteringsanalyser.
Abstract
Tre-dimensionelle (3D) in vitro modeller af skeletmuskulatur er et værdifuldt fremskridt i biomedicinsk forskning, da de giver mulighed for at studere skeletmuskulatur reformation og funktion i et skalerbart format, der er modtagelige for eksperimentelle manipulationer. 3D-muskelkultursystemer er ønskelige, da de gør det muligt for forskere at studere skeletmuskulatur ex vivo i forbindelse med menneskelige celler. 3D in vitro modeller nøje efterligne aspekter af den indfødte vævsstruktur af voksne skeletmuskulatur. Men deres universelle anvendelse er begrænset af tilgængeligheden af platforme, der er enkle at fremstille, omkostninger og brugervenlige, og giver relativt store mængder af human skelet muskelvæv. Da skeletmuskulaturen spiller en vigtig funktionel rolle, der er svækket over tid i mange sygdomstilstande, er en eksperimentel platform for mikrotissuestudier mest praktisk, når minimalt invasive calciumtransient- og kontraktile kraftmålinger kan udføres direkte inden for selve platformen. I denne protokol beskrives fremstillingen af en 96-velkendt platform kendt som 'MyoTACTIC' og en masseproduktion af 3D-humane skeletmuskulaturmikrotiss (hMMT'er). Derudover rapporteres metoderne til en minimalt invasiv anvendelse af elektrisk stimulation, der muliggør gentagne målinger af skeletmuskulaturkraft og calciumhåndtering af hver mikrotissue over tid.
Introduction
Skeletmuskulatur er en af de mest rigelige væv i den menneskelige krop og understøtter centrale kropsfunktioner såsom bevægelse, varme homøostase og stofskifte1. Historisk set er dyremodeller og todimensionelle (2D) cellekultursystemer blevet brugt til at studere biologiske processer og sygdomspatogenese samt til test af farmakologiske forbindelser til behandling af skeletmuskulatursygdomme2,3. Mens dyremodeller i høj grad har forbedret vores viden om skeletmuskulatur i sundhed og sygdom, er deres translationelle virkning blevet hæmmet af høje omkostninger, etiske overvejelser og interspecies forskelle2,4. Ved at henvende sig til menneskelige cellebaserede systemer til at studere skeletmuskulatur er 2D-cellekultursystemer gunstige på grund af deres enkelhed. Der er dog en begrænsning. Dette format undlader ofte at generobre de cellecelle- og celle-ekstracellulære matrixinteraktioner, der forekommer naturligt i kroppen5,6. I løbet af de sidste mange år har tredimensionelle (3D) skeletmuskulaturmodeller vist sig som et stærkt alternativ til hele dyremodeller og konventionelle 2D-kultursystemer ved at tillade modellering af fysiologisk og patologisk relevante processer ex vivo7,8. Faktisk har en overflod af undersøgelser rapporteret strategier til at modellere menneskelige skeletmuskulatur i et bioartificialt 3D-kulturformat1. En begrænsning for mange af disse undersøgelser er, at aktiv kraft kvantificeres efter fjernelse af muskelvæv fra kulturplatformene og tilknytningen til en krafttransducer, som er destruktiv og dermed begrænset til at fungere som en endpoint assay9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andre har designet kultursystemer, der giver mulighed for ikke-invasive metoder til måling af aktiv kraft, men ikke alle er modtagelige for molekyletestapplikationer med højt indhold7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Denne protokol beskriver en detaljeret metode til fremstilling af humane muskelmikrotiss (hMMTs) i skeletmuskulaturen (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platform; en 96 brønd plade enhed, der understøtter bulk produktion af 3D skeletmuskulatur microtissues30. MyoTACTIC pladefremstillingsmetoden muliggør generering af en 96 brøndpolylsiloxan (PDMS) kulturplade og alle tilsvarende brøndfunktioner i et enkelt støbetrin, hvorved hver brønd kræver et relativt lille antal celler til mikrotissuedannelse. Microtissues dannet i MyoTACTIC indeholder justeret, striated, og multinukleated myotubes, der er reproducerbare fra godt til brønd af enheden, og ved modning, kan reagere på kemiske og elektriske stimuli in situ30. Heri, teknikken til at fremstille en PDMS MyoTACTIC kultur plade enhed fra en polyurethan (PU) replika, en optimeret metode til at gennemføre udødeliggjorte menneskelige myogene stamfader celler til at fremstille hMMTs, og den funktionelle vurdering af manipuleret hMMT kraft generation og calcium håndtering egenskaber er skitseret og diskuteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS MyoTACTIC plade fabrikation
BEMÆRK: PDMS MyoTACTIC plade fabrikation kræver en PU negativ skimmel, som kan fremstilles som tidligere beskrevet30. Den computerstøttede design (CAD) SolidWorks-fil til MyoTACTIC-pladedesignet er blevet gjort tilgængeligt på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Forbered ~ 110 g PDMS polymeropløsning i en engangsplastkop ved et 1:15-forhold mellem monomer og hærdningsmiddel ved hjælp af komponenterne i silikoneelastomersættet. Rør polymeropløsningen i 2-3 min ved hjælp af en 5 mL engangs serologisk pipette, indtil den er helt blandet og homogen.
FORSIGTIG: Undgå PDMS polymer løsning kontakt med hud og øjne; og undgå indånding. Brug altid en kittel og engangshandsker ved håndtering af den flydende PDMS-blanding, og se sikkerhedsdatabladet (SDS) for specifikke sikkerhedsprotokoller.
BEMÆRK: Beskyt udstyrsoverflader (f.eks. skala, bænktop osv.) med engangsbeklædning i tilfælde af spild af PDMS polymeropløsning. - Afgas blandingen ved stuetemperatur ved at placere koppen i en bordplade vakuumkammer tilsluttet en standard pligt tør vakuumpumpe i ~ 30 min, eller indtil alle bobler er fjernet. Bryd vakuum hvert 5-10 minut for at hjælpe med afgasning. Brug en tom 50 mL sprøjte tønde til at kaste luft og blæse eventuelle resterende bobler på overfladen af polymer blandingen efter behov.
BEMÆRK: Et stykke 6,35 mm ID slanger kan bruges til tilslutning af en P1250 pipettespids til tønden for at forbedre luftstrømmens hastighed og nøjagtighed. - Mens PDMS polymer opløsning er afgasning, fjerne eventuelle rester stykker af PDMS klæbet til PU negative skimmel ved forsigtigt at tørre ned kanterne og overfladen med et tørt papir håndklæde. Brug trykluft fra anlægget, der er indstillet til 70-100 kPag for at fjerne de resterende fine partikler.
BEMÆRK: Beskyt PU negativ skimmel mod skader og fra partikel ophobning ved at placere det i en tætningsdygtig plastpose og opbevare den i en skuffe, der er beskyttet mod laboratorietrafik. - Placer PU-formen i en kemisk hætte, der er beskyttet med engangsbeklædning. Stå formen vandret ved ~ 75 ° og spray den aktive overflade med et jævnt lag af frigivelsesmiddel. Spray formen fra top til bund, derefter fra venstre mod højre, mens du holder dåsen 15-20 cm fra formen og ved hjælp af en væske frem og tilbage fejende bevægelse. Roter formen 180° og gentag sprays, og lad derefter PU-formen sidde i den kemiske hætte i 10-15 minutter for at tørre.
FORSIGTIG: Sørg for, at frigivelsesmidlet anvendes i en kemisk røghætte, undgå kontakt med hud og øjne, og se sikkerhedsdatabladet (SDS) for specifikke sikkerhedsprotokoller
BEMÆRK: En tynd film skal dække den aktive overflade fuldt ud, men overdreven belægning kan overføres til PDMS i næste trin, hvilket igen kan påvirke hMMT-såningen negativt. Overfladen skal føles glat at røre ved, men ikke våd. - Hæld 100 g PDMS jævnt i PU-formen, og placer den i et vakuumkammer, der er tilsluttet en roterende vingevakuumpumpe. Degas pdms-fyldt skimmel for ~ 45 min, bryde vakuumforsegling hver 5-10 minutter for de første 20 minutter til at fremskynde processen. Lad i vakuumkammeret, indtil PDMS-blandingen er helt tom for alle bobler.
BEMÆRK: En roterende vinge vakuumpumpe bruges til at opnå et lavere vakuum og reducere den tid, der kræves for dette trin. Afgasning af PDMS-fyldt skimmel kan udføres ved hjælp af bordpladen vakuumkammer og standard pligt tør vakuumpumpe, men tid til at annullere blandingen af alle bobler vil være længere. Det afgørende er fjernelsen af alle bobler fra PDMS polymeropløsningen, især i de regioner, der er bestemt til at blive hMMT-forankringsposter. Bobler i denne region vil resultere i anker post brud, tab af kultur brønde, og til gengæld resultere i et lille stykke PDMS resterende kilet ind i formen. - Overfør den afgassede PDMS-fyldte PU-form til en 65 °C ovn, der inkuberes natten over for at helbrede det flydende gummi.
- Fjern den hærdede PDMS-positive plade fra ovnen, og pladen afkøles ved stuetemperatur i mindst 30 min.
- Med en knivløs skalpel, forsigtigt løsne hærdet PDMS fra PU skimmel ved at køre bagsiden af håndtaget mellem PDMS og vægge af formen. Start langs den øverste kant og adskille alle 4 sider, før du skubber ned til bunden af formen og løsriving denne del. Dette trin er komplet, når bagsiden af håndtaget kører problemfrit mellem PDMS og alle 4 vægge i PU skimmel.
BEMÆRK: Arbejd langsomt og forsigtigt med den knivløse skalpel for at forhindre revner i PU-formen eller rive PDMS i stykker. Dette trin skal tage 15-20 min. - Fra den ene ende skal du bruge den knivløse skalpel til at løfte kanten af PDMS og arbejde fingre mellem den hærdede PDMS kulturplade og PU skimmel. Derefter, ved hjælp af begge hænder, skubbe fingrene længere under pladen, langsomt peeling op og ud af PU skimmel.
BEMÆRK: Arbejd langsomt og brug begge hænder til jævnt at skrælle pladen. Minimer bøjning for at reducere sandsynligheden for anker efter brud. Dette trin skal tage 5-10 min. - Brug et enkelt kant barberblad til at skære pladen i grupper af 6 ± 2 MyoTACTIC brønde (Figur 1) til vævssåning formål. Læg fyldige MyoTACTIC plader eller pladedele i en instrumentsteriliseringspose og autoklave i en 25 min tørcyklus (20 min steriliseringstid og 5 min tørtid) ved 120 °C og 100-140 kPag.
2. Kultur af udødeliggjorte menneskelige myoblast stamfader celler
BEMÆRK: De udødeliggjorte myoblaster, der anvendes i denne protokol blev opnået fra Institut de Myologie (Paris, Frankrig)31.
- Få et hætteglas af frosne celler fra den flydende kvælstof dewar og hurtig optø hætteglasset i en 37 °C vandbad (på mindre end 1 min). Cellerne fryses med en densitet på 7,5 x 105 celler pr. 1 mL frysende medier bestående af 90% fosterkvægsserum (FBS) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Overfør forsigtigt hætteglassets indhold til et 15 mL konisk rør, der indeholder 9 mL forvarmet vaskemedium bestående af 89% DMEM 1x, 10% FBS og 1% Pen /Strep for at fortynde DMSO' en. Drej det 15 mL koniske rør ved 400 x g i 10 min og derefter aspirere væk medierne tager sig af at undgå cellen pellet.
- Resuspend pellet i 1 mL vækstmedier bestående af 84% Skelet muscle cell basal medium med skeletmuskulaturcellevækst Medium Supplement Mix, 15% FBS og 1% Pen / Strep og derefter overføre til en 50 mL konisk rør med 29 mL vækstmedier.
- Overfør 10 mL medier, der indeholder ca. 2,5 x 105 celler, til en 100 mm x 20 mm cellekulturret. Gentag dette trin med de resterende 20 mL af celleopløsningen. Overfør derefter cellekulturretter til en befugtet cellekulturinkubator indstillet til 37 °C og 5% CO2.
- Genopfrisk kulturmedierne hver anden dag. Kultur cellerne, indtil de opnår ~ 70%-80% sammenløb (typisk 4-5 dage), hvorefter cellerne er forberedt til såning. Der kræves 1,5 x 105 celler for at generere hver hMMT. Derfor passage cellerne efter behov for at opnå det nødvendige antal celler.
BEMÆRK: Den udødeliggjorte myoblast stamfader celle linjer bør aldrig overstige 80% sammenløb før såning celler i MyoTACTIC brønde, passerer cellerne, eller forberede fryser lagre. hMMTs fremstillet af celler, der har overskredet 80% sammenløb ofte ikke at nå kontraktile modenhed. Besenteringsprocedurer er identiske med metoder, der er beskrevet nedenfor i trin 3.
3. Såning manipuleret hMMTs med MyoTACTIC
- Forberedelse af MyoTACTIC kultur brønde og reagenser til hMMT såning.
BEMÆRK: Denne protokol indeholder specifikke oplysninger til fremstilling af 6 hMMT'er.- 2-3 timer før celle såning, placere en 6 godt MyoTACTIC plade del i en 10 cm celle kultur skål. Forbered hver enkelt MyoTACTIC kultur godt ved at tilføje 100 μL af en 5% Pluronic F-127 løsning i hver brønd. Sæt låget på 10 cm kultur skål, anvende paraffin at forsegle rummet mellem 10 cm fad og låg, og derefter placere 10 cm plade indeholder MyoTACTIC del i en centrifuge udstyret med en plade spinner adapter.
BEMÆRK: Hvis der ikke findes en centrifugpladespinneradapter, kan en p20 pipettespids bruges til forsigtigt at fjerne bobler bag stolperne og dermed sikre, at hele kulturoverfladen er jævnt belagt. - Centrifuge ved 1.550 x g i 1 minut for at fjerne alle bobler i kulturbondene, især bag stolperne. Opbevar den 10 cm store cellekulturskål, der indeholder myoTACTIC-pladedelen, der indeholder pluronisk F-127-opløsning, ved 4 °C, indtil cellerne er forberedt til såning.
BEMÆRK: Pluronic F-127 belægning kan påføres så lidt som 2 timer til så længe 24 timer. For eksempel kan brønde fyldes med Pluronic F-127-opløsning i slutningen af dagen til brug den næste dag. Må ikke overstige 24 timer, da dette vil have en negativ indvirkning hMMT remodeling og undlader at danne sunde væv, der når kontraktile modenhed. - Tø langsomt en 50 μL kældermembranekstrakt aliquot og en 10 μL thrombin aliquot (100 U/mL lageropløsning) op på is i kulturhætten.
BEMÆRK: Nedfryse ikke kældermembranekstrakt aliquots. De er engangsbrug. Thrombin aliquots kan genbruges, derfor fryses op til 5 gange efter brug igen. - Veje ~ 7 mg pulveriseret fibrinogen i en 1,5 mL mikrocentrifuge rør og derefter overføre til cellen kultur hætte. Der tilsættes 700 μL 0,9% (wt/vol) NaCl-opløsning i vand (eller saltvandsopløsning) for at nå frem til en 10 mg/mL endelig koncentrationsopløsning. Hvirvelfibrinogen må ikke hvirvler op, men læg i stedet røret i en 37 °C cellekulturinkubator i 3-5 min.
- Fjern og svirp røret forsigtigt, og pulsen spinde derefter den opløste opløsning i en minicentrifuge (mikrofuge) og vend tilbage til kulturhætten. Fibrinogenopløsningen filtreres med en 1 mL sprøjte udstyret med et 0,22 μm sprøjtefilter. Overfør den opløste fibrinogenopløsning til is ved siden af kældermembranekstraktet og thrombin aliquots.
- Endelig forberede hMMT såning medier, der vil blive introduceret til kulturen brønde efter såning af væv. Dette medie indeholder skeletmuskulaturcelle basal medium suppleret med 20% FBS, 1% P/S og 3% 6-aminocaproic acid (ACA; 1,5 mg/mL endelig koncentration opnås ved fortynding fra en 50 mg/mL lageropløsning; % udtrykkes som v/v). Forvarm mediet ved 37 °C før brug.
- 2-3 timer før celle såning, placere en 6 godt MyoTACTIC plade del i en 10 cm celle kultur skål. Forbered hver enkelt MyoTACTIC kultur godt ved at tilføje 100 μL af en 5% Pluronic F-127 løsning i hver brønd. Sæt låget på 10 cm kultur skål, anvende paraffin at forsegle rummet mellem 10 cm fad og låg, og derefter placere 10 cm plade indeholder MyoTACTIC del i en centrifuge udstyret med en plade spinner adapter.
- Forberedelse af celler til hMMT-såning.
- Saml cellekulturpladerne fra kulturkuvøsen. Aspirer mediet fra hver plade, vask derefter cellerne én gang med D-PBS ved at tilføje 5 mL D-PBS i hver kulturplade. Næste aspirere D-PBS og løsne cellerne ved at tilføje 1 mL af 0,25% Trypsin-EDTA i hver kultur parabol. Placer i cellekultur inkubatoren i 3 min.
- Stop trypsin ved at tilføje 3 mL vaske medium (89% af 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen / Strep) til kultur skålen. Overfør celleopløsningen til et konisk rør i passende størrelse, og pellet cellerne ved centrifugering ved 400 x g i 10 min. Aspirere medierne tager sig af at undgå cellen pellet. Derefter genbruges cellepillen i 1 mL af vaskemediet.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og trypan blå farvestof under brightfield mikroskopi.
Hvis du bruger flere plader af celler, vil denne celle suspension være meget koncentreret. Fortynd celleaffjedring før optælling efter behov. - Da hvert væv kræver 150.000 celler suspenderet igen i 15 μL af den ekstracellulære matrix (ECM) blanding, kræves 900.000 celler i 90 μL ECM blanding for 6 væv. For at tage højde for tab af celle-ECM-opløsning, der opstår under forberedelsesprocessen på grund af bobledannelse eller pipettetab, skal der forberedes ekstra celle-ECM-blanding (dvs. 8 væv eller 1.200.000 celler i 120 μL ECM). Overfør mængden af celleaffjedring, der indeholder 1.200.000 celler, til et nyt konisk rør. Forøg lydstyrken til 10 mL med vaskemedium og drej ved 400 x g i 10 min.
- Mens cellerne spinder ned, forberede 150 μL ECM blanding i en 1,5 mL mikrocentrifuge rør ved hjælp af følgende opskrift. Tilsæt først 60 μL DMEM (40% volumen), tilsæt derefter 60 μL Fibrinogen 10 mg/mL opløsning (40% volumen) og tilsættes til sidst 30 μL kældermembranekstrakt (20% volumen). Opbevar ECM-blandingen på is, indtil den er brugt.
BEMÆRK: Brug altid spidser, der er forkølet ved -20 °C, når du arbejder med opløsninger, der indeholder kældermembranekstrakt. ECM-blandingen indeholder 4 mg/mL fibrinogen.
- Såning hMMTs
- Saml det koniske rør, der indeholder de spundet ned celler og aspirere medierne tager sig af at undgå cellen pellet. Svirp kraftigt enden af røret med en behandsket finger for at løsne pelleten og fortsætte med at svirpe, indtil pellet vises som en celle gylle.
BEMÆRK: Det er vigtigt at aspirere så meget vaskemedier som muligt for at sikre, at celle-ECM-suspensionen er ved den ønskede fortynding. Brug en pipette til at fjerne de resterende vaskemedier, hvis det er nødvendigt. - 120 μL af ECM-opløsningen overføres til røret, der indeholder cellepillen. Pipette op og ned for grundigt at genbruge cellerne i ECM til at generere en enkelt celle suspension. Pipette langsomt og omhyggeligt for at undgå at indføre bobler, hvilket ville reducere arbejdsvolumen. Placer derefter celle-ECM-opløsningen på is, indtil den er i brug.
- Hent MyoTACTIC pladeportioner, der indeholder pluroniske F-127 coatede MyoTACTIC brønde fra 4 °C køleskabet, og læg den 10 cm store skål, der indeholder myoTACTIC-brøndene, oven på en ispose inde i cellekulturhætten.
- Aspirere Pluronic F-127 opløsning fra hver brønd. PDMS er porøs og vil opsuge Pluronic F-127 opløsning, især hvis pladerne blev spundet ned med en centrifuge. Tillad resterende Pluronic F-127 opløsning til at frigive og bosætte sig til bunden af brønden ved at lade brønde sidde i 5 min, derefter aspirere igen.
BEMÆRK: Brug en Pasteur pipette med en p1250 tip fastgjort i slutningen, og en p200 tip over p1250 spidsen, når aspirerende Pluronic F-127 løsning. Dette vil forbedre præcisionen for at forhindre utilsigtet aspiration af poststrukturerne. Undgå at skrabe det ovale poolformede cellesåningsområde i bunden af brønden med pipetten, da dette forstyrrer pluronic F-127-belægningen og forstyrrer hMMT-selvorganiseringsprocessen. Den rigtige teknik er at svæve pipettespidsen lige over den ovale pool, mens du aspireerer pluronic F-127-opløsningen. - Pipette celle-ECM suspension omhyggeligt at genbruge eventuelle celler, der kan have sunket til bunden af røret. Overfør derefter 105 μL celle-ECM-suspension til et friskt, forkølet 1,5 mL rør. Sørg for at gribe fat i røret tæt på toppen for at forhindre opløsningen i at varme.
- Der tilsættes 0,84 μL af opløsningen af 100 U/mL-trombinlageret til 105 μL-celle-ECM-suspensionen for at nå frem til en endelig koncentration på 0,2 U/mg fibrinogen. Pipette hurtigt, omhyggeligt og grundigt at blande, samtidig med at man undgår indførelse af bobler.
BEMÆRK: Thrombin indleder den hurtige konvertering af fibrinogen til en fibrinprop. Som sådan er der begrænset tid til at så vævene ved thrombintilsætning. For at undgå for tidlig koagulation, før celle-ECM-blandingen overføres til kulturbondene, skal du indstille en p20 pipette til 15 μL, før thrombinen tilføjes. Brug forkølede spidser, eller dyp pipettespidsen i iskold DMEM i et par sekunder, før du opsamler og overfører 15 μL af celle-ECM-blandingen i hver brønd. Det er en bedste praksis at forberede celle-ECM blanding aliquots således, at ikke mere end 6 hMMTs er seedet ad gangen. - For at så vævene tilsættes 15 μL celle-ECM-blanding (dvs. 150.000 celler) til hver enkelt brønd. Tilsæt forsigtigt celle-ECM-blandingen til midten af den ovale pool og undgå at trykke pipettenspidsen ind i bunden af brønden. Derefter spredes celleaffjedringen bag hver stolpe i brønden med to lette bevægelser. Når overfladen er jævnt belagt med celle-ECM suspension, gå videre til den næste brønd.
BEMÆRK: Arbejd effektivt for at undgå for tidlig gelering af celle-ECM-blandingen i røret, før alt væv sås. Når såning brønde, er det yderst vigtigt at undgå at overføre bobler som boblen vil forstyrre ombygning af hMMT, hvilket gør hMMT ubrugelig. - Læg låget på den 10 cm store kulturplade, der indeholder de seedede brønde, og overfør til en 37 °C vævskulturinkubator i ca. 5 min.
BEMÆRK: Placer mikrocentrifugerøret med resterende celle-ECM-blanding i inkubatoren som en bekræftelse af gelpolymeriseringsprocessen. - Når celle-ECM-blandingen er polymeriseret, tilsættes 200 μL for forvarmede hMMT-såmedier til hver myoTACTIC-brønd. Udskift låget på 10 cm fadet, og returner MyoTACTIC pladeportioner i 10 cm skålen til inkubatoren. Dette tidspunkt kaldes dag -2. Forstyr ikke væv før næste trin.
- Saml det koniske rør, der indeholder de spundet ned celler og aspirere medierne tager sig af at undgå cellen pellet. Svirp kraftigt enden af røret med en behandsket finger for at løsne pelleten og fortsætte med at svirpe, indtil pellet vises som en celle gylle.
- Differentiere hMMTs
- Efter 2 dages inkubation fjernes hMMT-såmedierne omhyggeligt ved hjælp af en pipette, og 2 mg/mL slutkoncentration fra en bestandskoncentration på 50 mg/mL, % udtrykkes som v/v) og 10 μg/mL human rekombinant insulin i DMEM. Dette tidspunkt kaldes dag 0 for differentiering.
- Hver anden dag derefter udveksle halvdelen af medierne med nye differentiering medier indtil dag 12 af differentiering, den sidste dag i kulturen (Figur 2a).
BEMÆRK: Protokoloplysninger til fremstilling af hMMT'er ved hjælp af primære menneskelige myoblaster er blevet offentliggjort andre steder30. Hvis der er bekymringer for celle levedygtighed efter såning, inkubere hMMTs med calcein og propidium jod at kvantificere levedygtigheden.
4. Elektrisk stimulering og analyse af hMMT-induceret postafbøjning
- Sæt en klar bund glas eller plast scene mount på en omvendt mikroskop og vedhæfte en smartphone kamera til mikroskop okular ved hjælp af et mikroskop-kamera mount. Der anvendes fasekontrastmikroskopi ved 10x forstørrelse (figur 3a).
BEMÆRK: Enhver omvendt fase kontrast mikroskop udstyret med en 10x forstørrelse mål vil være passende. PDMS brøndkonstruktioner vil blive fjernet fra 10 cm skålen og placeret direkte på den klare nederste trin mount, og dermed åben for luften. Steriliser alle overflader og udstyr med 70% ethanol og minimer trafikken i området under forsøg. - For at forberede de elektriske stimulationselektroder skæres ~ 30 cm tinbelagt kobbertråd. Derefter starter ved navet af en 25 G regelmæssig facet nål, wrap ~ 10 cm af ledningen tæt omkring den øverste halvdel, forlader ~ 20 cm overskydende ledning. Gentag for en anden nål og skær derefter navet af hver nål.
BEMÆRK: Ledningen skal være tæt omkring nålen for at sikre, at den ikke bevæger sig, og den ledningsindpakkede del af elektroden må ikke røre PDMS, da dette kan hæmme produktionen af elektriske felter. - Fastgør BNC til alligator klip stikkabel til en udgangskanal på bølgeform generator og indstille kanalen for firkantede impulser med 20% arbejdscyklus, 5 V amplitud (elektrisk felt styrke på 10 V /cm). Frekvensen vil ændre sig mellem 0,5 Hz og 20 Hz for henholdsvis trækninger og stivkrampesammentrækninger.
BEMÆRK: Waveform generator indstillinger kan kræve eksperiment-specifik optimering - Placer en MyoTACTIC plade del, der indeholder hMMTs på mikroskop fase og forsigtigt indsætte hver elektrode facet ende i PDMS direkte bag hver post i den ovale pool. Tape forsigtigt ned 20 cm sektioner af overskydende ledning til mikroskop fase, således at nålene forbliver lodret og ~ 10 cm af hver ledning forbliver fri til tilslutning (Figur 3a).
FORSIGTIG: Anbring aldrig en bar finger over den ene ende af elektroden. Sørg for, at der bæres finger finger for at påføre elektroden et lystryk ved indføring i PDMS. - Fokuser mikroskopfeltet på en af to indlæg, så fokus er skarpt på den postkant, der er tættest på elektroden. Lås derefter smartphonekameraets fokus til det klareste område af posten. Dette er vigtigt for downstream-analysen, da en ændring i fokus, mens registreringen vil forstyrre analysen.
- Tilslut de frie ender af de tapede ledninger til bølgeformgeneratoren via alligatorklemmer (Figur 3a).
- Start videooptagelsen på smartphonekameraet, og tænd derefter kanaludgangen for at starte stimulering. Fremvis hMMT til at gennemgå 3 spjæt og 3 stivkrampe sammentrækninger, med 2 minutters hvile mellem spjæt og stivkrampe stimulation serien.
- Sluk for kanaludgangen, løsriv alligatorclips fra de tinbelagte kobbertråde, fjern båndet fra ledningerne, og tør hver elektrode af med 70% ethanol, før du sætter den i efterfølgende hMMT-brønde. Gentag proceduren fra trin 4.5 for alle hMMT'er.
BEMÆRK: Begræns den tid, hMMT'er tilbringer uden for inkubatoren, ved ikke at stimulere mere end 3 væv ad gangen. Hvis der stadig er yderligere hMMT'er i myoTACTIC-pladedelen, skal pladen returneres til inkubatoren i 10 minutter, så hMMT'erne kan vende tilbage til 37 °C. - Hvis du vil analysere postafbøjning for at beregne hMMT-kraftgenerering, skal du bruge det brugerdefinerede script, som er blevet gjort tilgængeligt på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Følg instruktionerne i README.md for at konfigurere og starte scriptet, og åbn derefter hver postsporingsvideo for at udføre kraftanalysen.
- Vælg et interesseområde langs opslagskanten, der skal spores for efterskydning. Tryk på Enter for at bekræfte investeringsafkast, og tryk på Enter igen for at køre scriptet ( Supplerendevideo 1).
BEMÆRK: Store afbøjninger får trackeren til at mislykkes. Hvis trackeren mislykkes under sammentrækning, kan ROI-størrelsen øges for at gøre sporingen mindre følsom, men tillader sporing af store afbøjninger. Tre størrelser er angivet i koden og kan indstilles ved at justere script kommentarer. - Scriptet slutter med to inputkrav. Først skal du indtaste y for at bekræfte videoen indeholdt flere sammentrækninger. For det andet skal du skrive y (ja) eller n (nej) for at eksportere resultater til en . CSV-fil (supplerende video 1).
- Sørg for, at resultaterne efter afbøjning rapporteres som forskydning i pixel for hver sammentrækning. Konverter pixel til μm-værdier for mikroskopets 10x forstørrelsesindstilling. Konverter derefter postforskydningsnumre til absolutte kontraktile kræfter (μN) ved at multiplicere værdier (μm) med kraftforskydningskonverteringsfaktoren på 2,36 μN / μm, hvilket svarer til 1:15-hærdemidlet til monomerforholdet mellem pdms, der anvendes i myoTATISK fabrikation30.
5. Calcium forbigående analyse ved hjælp af elektrisk stimulation
BEMÆRK: For calcium håndtering eksperimenter, udødeliggjort myoblasts blev stably transduced med MHCK7-GCAMP6 reporter som tidligere beskrevet11,12. Transduced celler blev FACS sorteret for GFP at opnå den positive befolkning, og derefter bruges til at fremstille hMMTs. Alternative metoder til calcium imaging såsom brug af forholdet-metriske farvestoffer som Fura-2 AM og Indo-1 eller fluorescens levetid billeddannelse af calcium indikatorer (f.eks Fluo-4 eller Oregon Green BAPTA1) kan være modtagelige for vores system.
- Opsætning af mikroskopstadiet og stimuleringsudstyret (elektroder, bølgeformgenerator osv.) som tidligere beskrevet i trin 4. Til dette eksperiment skal du bruge en 4x forstørrelse.
BEMÆRK: Der er brug for et mørkt rum og et epifluorescencemikroskop udstyret med et CCD-kamera. - Start mikroskopbilledsoftware, vælg FITC-filterkanalen (blåt lys), og vælg filmoptagelsesfunktion. Indstillet til en eksponering på 500 ms og en opløsning på 680 x 510 (Binning 2x2).
BEMÆRK: Billedbehandlingssoftware kan variere, og eksponeringen indstilles manuelt af brugeren. Pas på at undgå hMMT over eksponering før stimulering. I hvile, en mørk væv skitse / skygge med spontan fluorescens er normal, mens et klart væv billede er over eksponering (Supplerende Video 2). Sørg for, at eksponeringen er konsistent for alle hMMT'er i et eksperiment. - Luk mikroskopskodderen, og hold FITC-kanalen slukket, indtil den er klar til at optage calciumhåndtering.
- Når alt udstyr og software er sat op, skal du hente myoTACTIC-pladedelen, der indeholder de hMMT'er, der skal analyseres, og indstille den direkte på mikroskopstadiet. Indsæt og tilslut derefter elektroder som tidligere beskrevet i trin 4.
- Brug brightfield til at fokusere synsfeltet i midten af den valgte hMMT. Sluk derefter for lampen.
- Åbn mikroskop fitc kanal lukkeren, bekræft blåt lys er tændt, og derefter vælge Movie Record i softwaren.
- Tænd for udgangen på bølgeformgeneratoren for at starte den elektriske stimulering. Få hMMT til at gennemgå 8 spjæt og 8 stivkrampesammentrækninger. Lad 2 minutters hvile mellem twitch og stivkrampe stimulation serien, i hvilket tidsrum FITC lukkeren er i lukket position.
BEMÆRK: Der skal tillades 10 s spontan aktivitet før og efter elektrisk stimulering for at registrere minimal fluorescens til beregnings- og dataanalyseformål. - Sluk for kanaludgangen, løsriv alligatorclips fra de tinbelagte kobbertråde, fjern båndet fra ledningerne, og tør hver elektrode af med 70% ethanol, før du sætter den i efterfølgende hMMT-brønde. Gentag stimulerings- og optagelsesproceduren for alle hMMT'er.
- Gem film i TIFF-filformat til analyse i ImageJ eller alternativ billedbehandlingssoftware.
BEMÆRK: Begræns den tid, hMMT'er tilbringer uden for inkubatoren, ved ikke at stimulere mere end 3 væv ad gangen. Hvis der stadig er yderligere hMMT i MyoTACTIC-pladedelen, skal enheden returneres til inkubatoren i 10 minutter, så hMMT'erne kan vende tilbage til 37 °C. - Hvis du vil analysere transientdata for calcium, skal du først åbne ImageJ. Vælg Analyser, angivderefter mål , vælg derefter den gennemsnitlige grå værdi, og fjern markeringen af alle andre indstillinger. Når du er færdig, skal du åbne en calciumvideo (.tiff) (Supplerende video 2).
- Omrids mikrotissens kant ved hjælp af et polygonvalgværktøj, og gem dette område som investeringsafkast (supplerende video 2). Under Mere i vinduet ROI Manager skal du vælge Multi Measure og måle fluorescerende intensitet for alle filudsnit i én række pr. udsnit ( Supplerende video2).
- Kopier alle målinger, herunder udsnitsnummer (ramme), med et regneark, og sammenlign fluorescerende intensiteten af hvert udsnit med den minimale spontane fluorescerende intensitet fra filen ved hjælp af ΔF/F0 = (Fimmediate - Fminimum)/Fminimum ( Supplerendevideo 2).
- Beregn tiden for hver ramme ved at gange filmens optagelsesrammehastighed med udsnitsnummer (ramme) og plot ΔF/F0 mod tiden for hMMT calcium forbigående respons på stimulering (Supplerende video 2).
- Vælg peak calcium forbigående signal for hver af 6 på hinanden følgende sammentrækninger og gennemsnitsværdier til at beregne den relative gennemsnitlige gennemsnitlige peak fluorescerende intensitet ændring af hver hMMT (supplerende video 2).
BEMÆRK: Ekskluder altid data, der stammer fra den første twitch-sammentrækning, fra den samlede analyse. Et regneark med titlen "Calcium Handling Template.xlsx" er blevet leveret på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) for at lette hMMT calcium forbigående analyse. Celler, der kan udfyldes, hvor værdier og input skal indtastes, fremhæves med gråt. Sørg for at justere antallet af spidsvalg, da dette kun er en vejledning i spidsvalg (Supplerende video 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrevet heri er metoder til at kaste en 96-godt PDMS-baserede MyoTACTIC kultur platform fra en PU skimmel, at fremstille arrays af hMMT replika væv, og til at analysere to aspekter af hMMT funktion inden for kultur enhed-kraft generation og calcium håndtering. Figur 1 giver et skematisk overblik over forberedelsen af myoTACTIC kultur brønde før hMMT såning. PDMS er en meget anvendt silikonebaseret polymer, der let kan formes til at skabe komplekse enheder32. En PDMS-baseret protokol var designet til at kaste et ubegrænset antal 96-brønd kultur enheder fra en fremstillet negativ PU skimmel30. Den endelige hærdede PDMS-positive plade er fleksibel og kan nemt skæres i mindre funktionelle enheder ved hjælp af et enkelt kant barberblad (Figur 1). Dette gør det muligt for brugeren at skalere enheden for at opfylde hMMT replika behov specifikke for deres eksperimentelle design. Disse mindre funktionelle enheder er også gavnlige for at overvinde en begrænsning af at arbejde med en ECM stillads, polymeriserer hurtigt, såsom fibrin hydrogels, ved nemt at justere antallet af brønde til at matche cellen såning hastighed af brugeren. Desuden er PDMS let autoklavelig, og det kan opbevares på ubestemt tid. Endelig kan en fuld MyoTACTIC plade fra et logistikmæssigt synspunkt dækkes af ethvert standard 96-brønds pladelåg, og dimensionen og profilen af MyoTACTIC pladedele kan inkuberes inden for en 10 cm kulturplade for at sikre hMMT-kultursterilitet. Pluronic F-127 løsning belægning foran celle såning tjener en dobbelt rolle at give et ekstra mål for kultur godt sterilisering, og som en ikke-ionisk overfladeaktivt middel, forhindrer celle vedhæftning til fordel for ensartet celle - ECM remodeling (Figur 1).
Når den udødeliggjorte myogene stamcellepopulation er klar til eksperimenter, indkapsles cellerne derefter i en hydrogel bestående af fibrinogen og kældermembranekstrakt. Den celle-ECM blanding er derefter jævnt deponeret i den ovale pool i bunden af hver MyoTACTIC godt, og derefter over en 14-dages kultur periode, cellerne rumligt selvorganisere på tværs af disse to lodrette stillinger til at danne en 3D mikrotissue befolket med en seng af justeret, multinukleated, striated myotubes, der ligner aspekter af indfødte væv organisation (Figur 2a, g,h). I løbet af ombygningsprocessen genereres uniaxial spænding mellem de to forankringspunkter, og dette styrer vævs selvorganiseringsprocessen for igen at drive dannelsen af et kompakt væv. I differentieringsperioden forbliver bredden af hMMT'erne, der er konstrueret af myoblasts fra raske patienter, ret konsistent. Men i tilfælde af fejl, der forstyrrer hMMT-ombygning, går denne ensartethed tabt (Figur 2a-f), hvilket gør denne enkle metrik nyttig i hMMT-kvalitetskontrolvurdering. For eksempel kan overivrig blanding af cellen - ECM suspension resultere i dannelsen af bobler. Bobler overføres til MyoTACTIC godt hindre hMMT remodeling. I sådanne tilfælde fortrænger bobler nogle eller alle myoblasterne fra det område, der er besat af boblen, og danner til sidst en sprække i den endelige hMMT(Figur 2b; se rød pil). Et andet eksempel vedrører integriteten af pluronic F-127 belægning i brøndene. Pluronic F-127 er et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, der forhindrer celler i at overholde myoTACTIC godt. Hvis belægningen skrabes af under aspiration, vil myoblasts klæbe til overfladen af MyoTACTIC brønde, danner nye forankring punkter og resulterer i myotubes, der ikke er justeret på tværs af de to stillinger (Figur 2c). Yderligere fejl kan også resultere i afvigende hMMT remodeling, som det ses i figur 2d-f. Celle vitalitet post såning kan også evalueres ved hjælp af calcein / propidium jod-baserede farvning assays. Når disse tekniske fejl undgås, udfyldes hMMT'er af en seng af justerede og flerkerne myotubes, der strækker sig over længden af hver hMMT (Figur 2g). Myotubes er temmelig ensartet i størrelse på tværs af deres længde og mellem forskellige hMMTs(Figur 2h-i). Myotubes er karakteriseret ved tilstedeværelsen af sarkom striationer, som visualiseres ved immunstaining for sarkomiske α - actinin (SAA; Figur 2h).
Funktionelle egenskaber kan også undersøges i hMMTs begynder omkring 7 dages differentiering. Det eksperimentelle forsøg, der er nedsat for at færdiggøre disse funktionelle undersøgelser, er illustreret i figur 3a. Mikroskopiopsætningen er afbilledet oven på et vibraplanbord. Dette er dog ikke nødvendigt for at gennemføre funktionelle undersøgelser. I funktionelle undersøgelser indsættes elektroder genereret som beskrevet i den elektriske stimuleringssektion i protokollen i PDMS, således at elektroder ligger bag stolperne. Det er vigtigt at have en god visualisering af postområdet, før du indsætter elektroden, da behovet for at genindsætte kan resultere i forskydning af vævet fra posten. Korrekt indsættelse af elektroderne er også vigtigt at opnå skarpt fokus på stillingen, så post-afbøjning efterfølgende kan spores med python script. Figur 3b viser en repræsentativ forskydning af myoTACTIC-brøndpladestolpen som reaktion på lav (spjæt, 0,5 Hz) og høj (stivkrampe, 20Hz) frekvens hMMT elektrisk stimulation. Kvantificering af postforskydning kan anvendes til at beregne den inducerede kontraktile kraft af hMMT'er (Figur 3c). Når disse oplysninger kombineres med hMMT tværsnitsområde, kan specifik kraft bestemmes30. Desuden spiller calciumtransienter en vigtig rolle i muskelsammentrækning. Stabil transduktion af skeletmuskulatur myoblaster med en genetisk kodet calciumindikator som GCaMP612,30,33,34, muliggør direkte overvågning af calciumtransienter12,30,34. Calciumtransienter blev analyseret ved hjælp af ovennævnte elektriske stimulation setup op til at stimulere dag 12 hMMTs genereret med udødeliggjort myoblasts udtrykke MHCK7-GCAMP6 reporter (Figur 4a), og kvantificeret som gennemsnitlige peak fluorescerende intensitet under lav (spjæt, 0,5 Hz) og høj (stivkrampe, 20Hz) frekvens elektrisk stimulation (Figur 4b). Det bemærkes, at hMMT calciumhåndteringsegenskaber målt på tværs af forskellige forsøg er relativt konsistente (Figur 4b). Kvantificeringsmetoder til håndtering efter afbøjning og calciumhåndtering er beskrevet i supplerende video 1 og supplerende video 2.
Figur 1: Forberedelse af MyoTACTIC PDMS plade før hMMT såning. Den 96-brønd platform benævnt MyoTACTIC er fremstillet ved først hærdning polydimethylsiloxane (PDMS) inden for en negativ polyurethan (PU) skimmel. Den PDMS-baserede kulturplatform skrælles derefter omhyggeligt fra den negative PU-form. I en akademisk indstilling skæres PDMS-enheden derefter i mindre enheder, der indeholder 6 ± 2 funktionelle brønde. Disse brønde placeres derefter i en steriliseringspose, autoklaves og opbevares indtil brug. Op til en dag før brug placeres det ønskede antal enhedsportioner inden for en 10 cm kulturplade, og Pluronic F-127 tilsættes til hver brønd. Det 10 cm skållåg tilsættes, kanten er forseglet med parafilm, før du inkuberer pladen ved 4° i 2-24 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MyoTACTIC understøtter hMMT selvorganisering og dannelse af tilpassede myotubes. (a) (top) Skematisk tidslinje for hMMT selvorganisering og efterfølgende myotubemodning over en 14-dages kulturperiode. (nederst) Repræsentative 4x fase-kontrast billeder til at illustrere kinetik udødeliggjort myoblasts selvorganisering på tværs af de to lodrette stillinger, der resulterer i dannelsen af en 3D hMMT. Skalastang, 500 μm. (b-f) Repræsentative 4x fasekontrastbilleder af hMMT'er på dag 12 af differentiering, der viser hMMT-resultater forårsaget af (b) en boble i cellen - ECM på såningstidspunktet (røde pilepunkter for boble fremkalder hMMT-skade), (c) forkert aspiration af pluronic F-127-opløsningsbelægningen, og (d-f ) hMMT over-remodeling, der kan signalere forkert ECM gelation, manglende ACA aktivitet i kulturmedier, forkert pleje af myoblast forældre linje, osv. Skalastang, 500 μm. (g) Repræsentativt flisebelagt og fladt konfokalt billede af en dag 12 hMMT taget ved 10x forstørrelse. hMMTs er fastgjort direkte i PDMS skimmel, derefter forsigtigt fjernet og placeret i en 96 godt kultur plade til farvning. Sarkomisk α-actinin (SAA) vist i magenta, og Hoechst 33342 nukleare counterstain vist i cyan. Skalastang, 500 μm. (h) Repræsentativt konfokalt billede af en dag 12 hMMT ved 40x forstørrelse. hMMT myotubes og kerner visualiseres ved immunstaining for SAA (magenta) og modstaining med Hoechst 33342 (cyan). Skalastang, 50 μm. (i) Prikplotgraf med middel hMMT myotubediameter på dag 12 af differentiering. Værdier rapporteres som gennemsnitlige ± SEM. n = 8 hMMTs fra 3 biologiske replikater, kendetegnet ved symbolformer, hvorved der analyseres mindst 30 myotubes pr. hMMT. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: In situ-måling af kontraktilkraft inden for MyoTACTIC-platformen. Selvom det er afbildet i denne opsætning, er der ikke behov for en vibrerende tabel. En smartphone kamera og mount blev udstyret til okularet af en omvendt mikroskop udstyret med en fluorescens lampe til videooptagelser af hMMTs elektrisk stimulation post forskydninger (venstre). 25 G nåle blev pakket ind med tin-coatede kobbertråde (nederst til højre), forbundet til en BNC til alligator klip stikkabel (øverst til højre) og blev fastgjort op til en vilkårlig bølgeform generator. Placering af elektroder under elektrisk stimulation er vist nederst til højre. (b) Repræsentative snapshots taget fra post afbøjning videoer erhvervet fra hMMTs på dag 12 af differentiering. Videoer blev fanget på 10x forstørrelse. Solide hvide lodrette linjer viser placering efter placering, når hMMT'er er afslappede, mens stiplede hvide lodrette linjer viser postforskydning efter høj (stivkrampe 20 Hz) eller lav (0,5 Hz) frekvensstimulering. Skalastang, 100 μm. (c) Prikplotgraf med middel hMMT-spjæt (0,5 Hz) - og stivkrampe (20 Hz)induceret kontraktile kraft på andendagen af differentiering. Værdier rapporteres som gennemsnitlige ± SEM. n = 9 hMMT'er fra 3 biologiske replikater, kendetegnet ved symbolfigurer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: In situ-måling af calciumhåndtering inden for MyoTACTIC-platformen. (a) Repræsentative billeder fra en 4x forstørrelsesvideooptagelse af spontane GCaMP6+ calciumtransienter og calciumtransienter som reaktion på lav (trækninger sammentrækning, 0,5 Hz) og høj (stivkrampesammentrækning, 20 Hz) frekvens elektrisk stimulation. hMMT'er er skitseret af en punkteret gul linje. Skalastang, 200 μm. (b) Prikplotgraf, der viser kvantificering af den gennemsnitlige top fluorescerende intensitet pr. hMMT efter lav (trækninger sammentrækning, 0,5 Hz) og høj (stivkrampesammentrækning, 20 Hz) frekvens elektrisk stimulation. Værdier rapporteres som gennemsnitlige ± SEM. n = 9 hMMT'er fra 3 biologiske replikater, kendetegnet ved symbolfigurer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: Demonstration af metoder til analyse af data efter afbøjning. En repræsentativ video af post afbøjning analyse på dag 12 af differentiering spores af den brugerdefinerede script under stivkrampe stimulation. Først vælges investeringsafkaststørrelsen direkte i postsporingsscriptet. Derefter åbnes videoen ved at vælge knappen Afspil for at køre scriptet. Et skarpt fokuseret område af indlægget vælges som investeringsafkast, og den blå postsporingsboks er placeret. Enter trykkes for at låse investeringsafkast og trykkes igen for at køre scriptet. "y" er indtastet som svar på prompten "Multiple sammentrækning video? [Y/N]", indtastes 'n' som svar på prompten "Eksporter indlægsplaceringer som .csv fil? [Y/N]". Post afbøjning som relativ forskydning i pixels er det endelige output. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende Video 2: Demonstration af metoder til at analysere GCaMP6 calcium forbigående data. En repræsentativ video af epifluorescence calcium håndtering analyse på dag 12 af differentiering under stivkrampe stimulation. For det første er en video af calciumtransienter (gemt som en række tiff-billeder) blevet åbnet i ImageJ, og brugeren har navigeret gennem rammer, indtil hMMT er synlig. Derefter bekræftes den krævede analysemåling "middelgrå værdi", og hMMT er skitseret ved hjælp af det polygonale tegneværktøj. Denne disposition gemmes som det område af interesse, og fluorescerende intensiteten af hvert videoudsnit analyseres ved hjælp af multimål. Disse målinger kopieres til regnearket "CalciumHåndtering Template" med rammedata og calciumtransient peak værdier udfyldt og bekræftet. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver metoder til at fremstille og analysere en 3D hMMT kulturmodel, der kan anvendes til undersøgelser af grundlæggende muskelbiologi, sygdom modellering, eller for kandidat molekyle test. MyoTACTIC-platformen er omkostningsvenlig, nem at fremstille og kræver et relativt lille antal celler til at producere skeletmuskulaturmikrotiss. hMMTs dannet inden for MyoTACTIC kulturplatformen består af justerede, flerkernede og striated myotubes og reagerer på elektriske stimuli ved at indlede calciumtransienter, der udløser sammentrækning (Figur 2, Figur 3, Figur 4). Tidligere undersøgelser viste , at hMMTs tilbyder et lignende svar på biokemiske stimuli og kan nå modningsniveauer, der matcher dem, der er rapporteret i større format 3D skeletmuskulaturmodeller12,30.
Et kritisk tema i hele MyoTACTIC plade fabrikation og hMMT generation er at sikre, at bobler forhindres, og hvis dannet er blevet fjernet. For at lette enkelt trin støbning af en brugbar PDMS skimmel, en PU skimmel var blevet genereret nedstrøms den oprindelige 3D-trykte plast skimmel tidligere beskrevet af Afshar et al.30. Pu skimmel, der er blevet genereret giver brugerne mulighed for at producere en 96 godt fodaftryk af PDMS skimmel, hvorved et maksimum på 96 brønde er funktionelle (indeholder to stillinger), som dikteret af PU skimmel fabrikation trin. Under fremstillingen af PDMS MyoTACTIC-pladen går nye brugere ofte glip af mindre bobler, der forbliver bagud i den flydende PDMS, selv efter afgasning. Bobler, der lokaliserer til regioner i PU skimmel svarende til forankring fleksible post strukturer vil resultere i post brud ved adskillelse af PU skimmel fra PDMS kultur plade, og i den proces, efterlader et lille stykke hærdet PDMS i PU skimmel. Trykluft kan bruges til at fjerne disse hærdede PDMS rester, og en undladelse af at gøre det vil effektivt reducere antallet af funktionelle brønde til rådighed for fremtidige plade støbegods. Derfor er det afgørende at sikre, at alle bobler er blevet fjernet, før PDMS-pladen er helbredt som en fordel ved denne platform, er det en stand-alone enhed, hvor alle pladens funktioner er støbt i et enkelt trin i stedet for at kræve, at hvert enkelt mikrotissueforankringspunkt introduceres til kulturbrne manuelt35, 36,37. De fleste akademiske laboratorieundersøgelser kræver ikke en hel MyoTACTIC kulturplade. For at maksimere brugen af hver PMDS plade skæres den manuelt i grupper på 6 ± 2 MyoTACTIC brønde. For at forbedre denne proces en PU skimmel, der lader brugerne skræl funktionelle enheder på 6 ± 2 MyoTACTIC brønde kan helt fjerne denne plade skæretrin. Desuden vil store bobler indført i celle-ECM-opløsningen under blanding eller under vævssåningsproceduren forringe korrekt vævsdannelse. Disse store bobler fortrænger celler fra regionen boblen indtager, ofte resulterer i hMMTs med regioner med få myotubes, der vil bukke under for kontraktile stress og snap under elektrisk stimulation.
En bemærkelsesværdig fordel ved MyoTACTIC er evnen til at kvantificere aktiv kraftgenererings- og calciumhåndteringsegenskaber in situ. Dette er en udfordring, som mange andre 3D-kultursystemer står over for, hvor undersøgelse af 3D-vævskontraktile kraft implementeres som en endpoint assay efter fjernelse af vævet fra kulturenheden12,37. Derfor er MyoTACTIC velegnet til at støtte langsgående undersøgelser, for eksempel at forstå de tidsmæssige virkninger af lægemiddelbehandling på skeletmuskulaturen. En begrænsning af den metode, der er beskrevet heri for at kvantificere aktive kraftgenererings- og calciumhåndteringsegenskaber in situ, er den manuelle placering af elektroder, som begrænser brugen af dette system til testapplikationer med højt indhold af molekyler. En mulig løsning ville være at konstruere et klart låg af elektroder oprettet som et parallelt kredsløb, der kan indsættes direkte i et standardiseret sæt funktionelle brønde, der muliggør elektrisk stimulering af flere væv på én gang. Alternativt, brug af en myogen stamfader celle linje stably udtrykke en channelrhodopsin konstruere ville tillade muskel celle membran depolarization, og dermed væv sammentrækning induceret af blåt lys eksponering. Desuden er aktiv kraft fanget i videoer som post afbøjning og kvantificering af aktiv kontraktil kraft kan udføres på en upartisk måde ved hjælp af en brugerdefineret semi-automatiseret python script til at spore post afbøjning i korte videoer. Derfor er uvildig langsgående vurdering af stimuleret kontraktile kraft aktiveret af MyoTACTIC30. For at forbedre effektiviteten af dataanalyse er smartphone-applikationer, der er designet til at måle kraft, mens de samtidig fanger videoer af postafbøjning, ideelle til at øge gennemløbet.
Endelig er værdien af denne platform også tidligere blevet beskrevet i sin evne til præcist at forudsige lægemiddelrespons. Svarende til kliniske resultater, har vi tidligere rapporteret, at behandling af hMMTs (lavet med primære myoblasts) med myotoksiske forbindelser (dexamethason, cerivastatin) induceret myotube atrofi og nedsat aktiv kontraktile kraft30. Desuden blev den prædiktive værdi af MyoTACTIC genereret hMMTs valideret ved at vise, at en klinisk relevant dosering af en kemoterapi, der anvendes til behandling af kræft i bugspytkirtlen, en sygdom, der ofte er forbundet med kakeksi2, signifikant reduceret hMMT kvalitet og sammenkædret kraft30. Derfor viser den enkle fabrikation af MyoTACTIC og dens brugervenlighed i generering af 3D hMMTs mange fordele ved datafangst med højt indhold, som det fremgår af dets pålidelighed med hensyn til strukturelle og funktionelle output. En generel begrænsning af PDMS-baserede cellekulturenheder er, at PDMS adsorber proteiner. Den metode, der er beskrevet heri, gør brug af serumholdige kulturmedier, som overvinder denne begrænsning ved at tjene til at "blokere" enheden og tillade, at virkningerne af molekyle- og lægemiddelbehandlinger observeres. På grund af denne begrænsning skal endelige konklusioner om molekyledoser dog undgås, og der tilskyndes til dosisresponskurver. Omvendt er denne platform ikke egnet til serumfri mikrotissuekultur, da tilsætningsstofferne vil adsorbere pdms og dermed hindre vævssundhed og udvikling. I fremtiden vil integration af teknikker som 3D-bioprinting og/eller automatiseret væskehåndtering forbedre gennemløbet i fremstilling af hMMT-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli og Sadegh Davoudi for at have bidraget til opfindelsen af myoTACTIC-kulturplatformen og for at etablere de fremstillings- og analysemetoder, der er beskrevet heri. HL modtaget støtte fra en Naturvidenskab og Engineering Research Council (NSERC) Training Program i Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship og en University of Toronto Wildcat graduate stipendier. PMG er Canada Research Chair i Endogenous Repair og modtog støtte til denne undersøgelse fra Ontario Institute for Regenerativ Medicin, Stem Cell Network, og fra Medicine by Design, en Canada First Research Excellence Program. Skemadiagrammer blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
