Summary
이 프로토콜은 하나의 실험에서 4개의 약 사이에서 얻을 수 있는 모든 가능한 조합을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 결과를 평가하기 위해 표준 96-웰 플레이트 마이크로 희석 분석 및 분수 억제 농도(FIC)의 계산을 기반으로 한다.
Abstract
약물 조합 요법의 개념은 주로 약물에 대한 저항의 급격한 증가와 함께 매우 중요해지고 있습니다. Q-checkerboard라고도 하는 Quadruple 체커보드는 다른 프로토콜과 동일한 결과를 달성하는 데 필요한 시간과 작업을 최소화하기 위해 한 실험에서 4개의 약물 간에 얻을 수 있는 가능한 조합수를 극대화하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 약물이 희석되고 여러 96 웰 플레이트에서 함께 결합되는 간단한 마이크로 희석 기술을 기반으로합니다.
96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 뮬러-힌튼 국물은 첫 번째 필수 약물(예: Cefotaxime)이 잇따라 첨가되어 이를 연속적으로 희석시합니다. 첫 번째 단계가 완료된 후, 또 다른 96웰 플레이트 세트는 제2약물(예를 들어, 아미카시)을 희석하여 약물 2의 특정 부피를 제거하고 약물을 포함하는 96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 해당 우물에 넣는데 사용된다. 제3단계는 제3약물(예를 들어, 레보플로색사신)의 필요한 농도를 약물 1과 2의 조합을 포함하는 초기 세트의 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행된다. 네 번째 단계는 제 4 약물의 필요한 농도(예를 들어, 트리메토림-설페마페스옥사졸)를 첫 번째 세트에서 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행됩니다. 이어서, 대장균 ESBL 세균성 접종이 준비되고 추가될 것이다.
이 방법은 가능한 모든 조합을 평가하는 것이 중요하며 생체 내 테스트를 위해 더 넓은 범위의 테스트를 테스트할 수 있습니다. 많은 초점을 필요로하는 피곤한 기술임에도 불구하고, 결과는 하나의 실험에서 많은 조합을 테스트 할 수있는 놀라운 시간 절약이다.
Introduction
항생제1,2의남용 과용 및 오용으로 인한 저항의 증가와 함께 세균 감염을 치료하기 위한 신약 및 제제를 개발할 필요성이 결정적입니다. 신약 개발과 같은 새로운 접근법은 저항 위기를 극복하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 제약 산업은 새로운 항균제 개발에 관심이 없습니다. 더욱이, 신약이 개발되면 박테리아는 이러한신약3,4에대한 저항을 계속 진화하고 개발할 것이다. 따라서, 저항의 문제는 해결되지 않을 것입니다, 다른 접근에 대한 필요성을 고려하고 세균성 저항을 극복하기 위해 연구해야한다.
약물 조합은 주로 다약물 내성 병원균5,6에의해 유발되는 세균 성 감염을 치료하기위한 매우 중요한 개념이다. 그것은 치료의 과정을 감소, 주어진 복용량을 감소; 따라서, 주어진 약물의 독성을 감소시키고, 저항성의 발병속도를 낮추는 데 도움이 되며, 어떤 면에서, 담보 민감도5,7,8,9의개념에 기술된 바와 같이 주어진 약물에 박테리아를 민감하게 한다.
하나의 약물에 대한 저항 발달은 단일 돌연변이를 필요로한다; 그러나, 여러 경로를 대상으로 하는 약물의 조합에 저항 개발이 조합에 의해 둔화 되는 몇 가지 독립적인 돌연변이 필요. 병용 요법을 사용 하 여 저항감소하는 예는 골균결핵(10)에서리팜핀에 대한 저항률이 감소한다. 또 다른 예는 Gribble 외에 의해 수행 된 연구입니다. 연구 결과에 따르면 진화하는 박테리아에서 아미노글리코사이드에 대한 저항 발달은 이러한 균주를 다양한 다른 약물에 민감하게 만들었습니다5. 베타락탐급 약물 아목시실린과 락타마제 억제제 클라불란산의 조합은 내성세균균제8치료에 성공한 것으로 나타났다.
치료 시간을 줄이는 것은 약물 조합으로 인한 좋은 이점입니다. 예를 들어, 2주 동안 겐타미신을 가진 결합된 페니실린 또는 세프트리악손의 치료는 4주11에주어지면 페니실린 또는 세프트리악손만이 주어지는 것과 동일한 효능을 부여한다. 약물을 결합하면 하위 MiC와 같이 단독으로 투여 될 때 효과적이지 않은 약물의 낮은 복용량을 사용할 수 있습니다. 설포나미드의 예는 삼중 설포나미드의 사용이 최소화되는 경우, 더 낮은 용량으로, 완전투여량12에서불용성 설포나미드를 사용할 때 결정 형성 또는 결정성루리아인 독성을 최소화할 수 있다.
따라서 주어진 복용량과 치료 시간을 줄이면 결국 신체의 약물의 독성이 감소합니다. 결합된 약 사이 상호 작용을 평가하는 방법을 개발하는 아이디어는 아주 중요합니다. 한 연구에서는, 결과는 조합 치료가 아신토박터와 P. aeruginosa8의저항하는 종의 처리를 위해 더 효과적이다는 것을 보여주었습니다.
조합하여 약물을 제공
체크보드 방법, 시간 kill 곡선 방법 및 E-test방법(13)과같은 약물 조합을 연구할 수 있는 다른 방법이 있다. 체크 보드 방법은 하나의 실험 자체에서 문제의 두 약물 사이의 가능한 모든 조합을 연구 할 수 있습니다. 또한, 3개의약물(14)의조합을 연구하기 위해 개발되었다. 지금, 우리는 주로 다제 내성 병원균의 처리를 위한 4개의 약의 조합을 연구하기 위하여 이것을 확장합니다.
시간 살인 곡선 분석법은 일반적으로 특정 약물의 bactericidal 효과에 대한 테스트 수행. 그것은 또한 여러 약물 특정 농도에서 결합 되는 약물 조합의 효과 대 한 테스트 에 사용 되었다. 이 프로토콜은 각 컵에서 국물, 약물의 조합 및 필요한 세균균을 추가하는 여러 멸균 튜브 또는 컵의 준비를 필요로합니다. 여러 시점에서 광학 밀도의 인큐베이션 및 기록 후, 결과는 사용 된 균주의 정상 성장 속도와 비교하여 성장 속도가 증가, 감소 또는13을변경하지 않았는지 여부를 확인합니다.
전자시험방법은 일반적으로 문제의 약물의 그라데이션 농도를 포함하는 스트립이 접종된 플레이트에 놓이는 최소한의 억제 농도(MIC)를 시험하기 위해 수행됩니다. 또한 두 개의 스트립이 MIC13에서교차하는 수직 방식으로 플레이트에 첨가되는 두 약물 간의 조합을 테스트하는 데 사용되었다.
문학에 따르면, 정의하고 시너지 를 연구하는 금 본위제는 없습니다; 따라서, 조합을 연구하는 데 사용되는 방법 중 어느 것이 더 좋으며 어느 것이 더 좋고 더 신뢰할 수 있는 결과를 주로13을생성하는지 평가하기가 어렵다. 그러나, 시간-살인 분석법은 노동 집약적, 시간 소모,고가의 15,16,E-시험 방법은 두 약물 간의 조합을 연구하기 위해 개발된다. 체커보드는 테스트된 두 약물 사이의 가능한 모든 조합을 연구할 수 있으며, 이것이 이 기술이 개발되기로 선택된 이유입니다.
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Protocol
1. 준비 단계
- 증류수 1L에 MH 국물 25g을 첨가하여 뮬러-힌튼 국물(MHB)을 준비합니다. 2.5 h에 대한 121 °C에서 오토 클레이브. 그런 다음, 실온이나 냉장고에 오토클레이브 미디어를 저장합니다.
- 문제의 박테리아를 서브배양(대장균 ESBL) 4 사분면 줄무늬 방법을 사용하여 천 매체에 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 멸균 루프를 사용하여, 하나의 식민지를 가지고 가까운 병렬 줄무늬를 수행하여 맥콩키 한천 판의 전반부에 확산.
- 루프를 사용하여 첫 번째 사분면에서 줄무늬로 두 번째 사분면에 박테리아를 확산시면 됩니다.
- 두 번째 사분면에서 가까운 병렬 줄무늬를 사용하여 세 번째 사분면의 줄무늬를 확장합니다.
- 세 번째 사분면에서 그것을 줄무늬로 네 번째 사분면의 중심에 박테리아를 확산.
2. 패널 준비
- 사각형을 형성하기 위해 서로 옆에 96 웰 플레이트 4개를 놓습니다. 테이프를 사용하여 바닥을 함께 테이프로 테이프로 붙입니다.
- 이 단계를 반복하여 각각 4개의 플레이트를 포함하는 4개의 패널을 구하고 A1, A2, A3 및 A4의 이름을 지정합니다.
- 4개의 패널의 16 96웰 플레이트에 2와 열 11 사이의 우물에 MH 국물의 50 μL을 추가합니다.
- 4개의 패널의 16 96웰 플레이트에서 음의 대조군역할을 하는 잘 H12에 MH 국물의 200 μL을 추가합니다.
- 4개의 패널의 16 96웰 플레이트에서 양성 제어 우물역할을 하는 우물 A1 및 H1에 MH 국물의 150 μL을 추가합니다.
3. 약물 1, 세포택시, 직렬 희석
- 원내 튜브에 멸균 dH2O의 15mL를 추가합니다.
- 포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 15 mL) / C1.
참고 : 우리의 경우, Cefotaxime 재고 솔루션은 105 μg / mL이고 C2는 256 μg / mL입니다; 따라서, V1 = 38.4 μL.
- 포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 15 mL) / C1.
- 멸균 dH2O의 15 mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.
- 제조된 약물 용액의 파이펫 50 μL은 H12를 제외한 열(11) 및 열(12)에서 각각 의음으로 들어올 것이다.
- 열 11에서 50 μL을 제거하고 열 10의 해당 우물에 넣은 다음 10에서 열 2에서 가져온 50 μL이 폐기되는 열 2에 도달하여 직렬 희석을 시작합니다.
- 4개의 패널의 16개의 96웰 플레이트에 대해 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다.
4. 약물 2, 암카신, 직렬 희석
- 원내 튜브에 멸균 dH2O의 10mL를 추가합니다.
- 포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 10 mL) / C1.
참고: 우리의 경우, Amikacin 재고 용액은 103 μg/mL이고 C2는 64 μg/mL; 따라서, V1 = 64 μL. - 멸균 dH2O의 10mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.
- 8 개의 별도 96 웰 플레이트를 가져 가라.
- 각 플레이트에 G와 B행 사이의 우물에 100 μL의 MHB를 추가합니다.
- 이전에 준비된 약물 2 용액의 100 μL을 행 G의 우물에 추가합니다.
- 각 우물에서 100 μL을 복용하여 행 G에서 행 B로 연속적으로 희석하고 마지막으로 행 B의 우물에서 100 μL을 폐기하십시오.
- 4.5, 4.6 및 4.7 단계를 반복하여 8개의 플레이트를 준비합니다.
5. 4 개의 패널에 약물 2의 전송
- 4개의 패널에 있는 각 플레이트의 해당 우물로 행 G와 B 사이의 우물에서 약물 2의 파이펫 50 μL. 준비된 96웰 플레이트 1개는 1개의 패널에 2개의 플레이트에 충분한 100 μL의 약물 2를 포함합니다.
6. 약물 3, 레보플로록사신, 추가
- 4개의 상질형 튜브에 멸균 dH2O의 14mL를 추가합니다.
- 포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서, V1 = (C2 x 14 mL) / C1.
참고 : 우리의 경우, 레보플로록사신은 5 x 103 μg / mL의 재고 용액에서 네 가지 농도로 준비됩니다.
C1 = 2 μg/mL, V1 = 5.6 μL
C2 = 4 μg/mL, V1 = 11.2 μL
C3 = 8 μg/mL, V1 = 22.4 μL
C4 = 16 μg/mL, V1 = 44.8 μL - 각 튜브에서 멸균 dH2O의14mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.
- 제3 약물의 필요한 농도를 준비한 후, 50 μL을 취하고 C1이 4개의 패널에서 4개의 P1 플레이트에 대응하는 각 패널의 해당 플레이트에 B와 G 및 열 2 및 12 사이의 해당 우물에 추가한 C2는 4개의 패널에서 4개의 P2 플레이트에 해당합니다. , C3는 4개의 패널에서 4개의 P3 플레이트에 대응하고, C4는 4개의 패널에서 4개의 P4 플레이트에 해당한다.
7. 약물 4, 트리메토림-설파메톡사졸, 추가
- 원내 튜브에 멸균 dH2O의 14mL를 추가합니다.
- 포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서, V1 = (C2 x 14 mL) / C1.
참고 : 우리의 경우, trimethoprim-sulfamethoxazole의 재고 용액에서 4 개의 다른 농도로 제조 됩니다 48 x 103 μg/mL.
C1 = 512 μg/mL, V1 = 149.33 μL
C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298.66 μL
C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597.33 μL
C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194.66 μL - 각 튜브의 멸균 dH2O의 14mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.
- 제4 약물의 필요한 농도를 준비한 후, 50 μL을 취하고 C1이 패널 1에 대응하는 해당 패널의 4개 판에서 B와 G 및 컬럼 2 및 열 2 및 12 사이의 해당 우물에 추가, C2는 패널 2에 대응하고, C3는 패널 에 대응하고, C4는 패널 4에 대응한다.
8. 세균성 접종 대장균 ESBL의 준비 및 첨가
- 멸균 루프를 사용하여, 이전에 플레이트상에서 배양된 세균분리 대장균 ESBL의 콜로니 1마리를 멸균 MHB 및 소용돌이2mL로 이송한다.
- 밀도계를 사용하여 0.5 McFarland여야 하는 탁도를 확인합니다.
- 멸균 된 소변 컵에 멸균 MH 국물의 80 mL을 추가합니다.
- C1V1 = C 2 V2,V1 = (106 x 80 mL) / 10 8 =800 μL에 이어 소변 컵에 0.5 McFarland inoculum에서 세균 접종을 추가합니다.
- 피펫 50 μL 의 접종용액(106 CFU/mL)은 H12를 제외한 각 웰에 들어있으며, 이는 멸균 제어가 잘 된다.
- 패널을 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다.
- 인큐베이션 후, 50 μL의 이오도테라졸리움을 추가하여 우물의 성장을 기록합니다.
9. FIC 템플릿프로토콜(보충 파일)
- 패널 A의 노란색 셀에 약물 1 (Cefotaxime)의 가장 높은 농도를 작성합니다.
- 패널 B의 노란색 세포에 약물 2 (Amikacin)의 가장 높은 농도를 작성합니다.
- 패널 C의 노란색 세포에 약물 3 (Levofloxacin)의 가장 높은 농도를 작성합니다.
- 패널 D에 약물 4 (트리메토림 - 설파메스톡사졸)의 가장 높은 농도를 작성합니다.
- 빨간색으로 성장한 우물을 강조하여 레드라인(성장/성장 인터페이스 없음)을 추적합니다.
- 약물 1 (ATB1)의 테이블에 약물 1의 MIC를 작성합니다.
- 약물 2 (ATB2)의 테이블에 약물 2의 MIC를 작성합니다.
- 약물 3 (ATB3)의 테이블에 약물 3의 MIC를 작성합니다.
- 약물 4 (ATB4)의 테이블에 약물 4의 MIC를 작성합니다.
- ATB1에 대한 FIC를 계산하려면
- 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 결정합니다.
- 표 ATB1에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 A 왼쪽의 노란색 셀을 잘 선택한 상태로 드래그합니다.
- 반복 단계 9.10.2 잘 1 FIC1에 해당 하는 모든 선택 된 잘 에 대 한, 잘 2 FIC2에 해당, 등등.
- ATB2에 대한 FIC를 계산하려면
- 표 ATB2에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 B 왼쪽의 노란색 셀을 첫 번째 미리 선택된 우물로 드래그합니다.
- 미리 선택된 모든 우물에 대해 9.11.1 단계를 반복합니다.
- ATB3에 대한 FIC를 계산하려면
- 표 ATB3에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 C 왼쪽의 노란색 셀을 첫 번째 미리 선택된 우물로 드래그합니다.
- 미리 선택된 모든 우물에 대해 9.12.1 단계를 반복합니다.
- ATB4에 대한 FIC를 계산하려면
- 표 ATB4에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 D 왼쪽의 노란색 셀을 첫 번째 미리 선택된 우물로 드래그합니다.
- 미리 선택된 모든 우물에 대해 9.13.1 단계를 반복합니다.
- ATB1+2+3+4로 표시된 표에서 각 ATB의 FIC1을 자동으로 합산합니다. 다른 FIC(FIC2, FIC3 등)도 마찬가지입니다.
- FIC를 포함하고 노란색으로 강조 표시된 셀에서 두 번 클릭하고 테이블 ATB1+2+3+4에서 합계된 ΣFIC를 선택합니다.
- 9개의 플레이트를 나타내는 9개의 시트 각각에 대해 이 단계를 반복합니다.
참고: 시트 FIC 에서 테이블에는 획득한 값의 해석과 함께 최종 합계 FIC가 표시됩니다.
10. 4개의 약에 대한 미세 희석 분석기를 이용한 MIC 결정
- 각 테스트 약물의 약어와 네 개의 서로 다른 행을 레이블. 예를 들어, 세포로메메의 CTX, 아미카신을 위한 AMK, 레보플로생신의 LEVO, 트리메토림-설파메르톡사졸용 SXT.
- 멸균 뮬러 힌튼 국물의 파이펫 200 μL은 각 사용된 행에서 잘 번호 1과 잘 번호 12로 국물. 음 넘버 12는 음의 통제역할을 할 것입니다.
- 소독 뮬러 힌튼 국물의 파이펫 100 μL은 각 사용된 행에서 2~11개의 우물에 들어있습니다.
- 수식 C1V1 = C 2V2를사용하여 추가될 각 약물의 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 4 x V2)/ C1. V2는 200 μL, C1이 스톡 용액의 농도인 우물의 최종 부피이며,C2는 우리가 처음 우물에서 가져야 할 초기 농도이다.
참고: 여기에서는 다음을 사용합니다.
Cefotaxime: C1 = 105 μg/mL, 여기서 우리는 104 μg/mL, C2 = 256 μg/mL로 희석; 따라서, V1 = 20.48 μL
아키카신: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; 따라서, V1 = 51.2 μL
Levofloxacin: C1 = 5 x 103 μg/mL, 여기서 우리는 5 x 102 μg/mL, C2 = 16 μg/mL로 희석; 따라서, V1 = 25.6 μL
트리메호프프-설파메톡사졸: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; 따라서, V1 = 68.26 μL - 200 μL 국물로부터 동일한 부피를 제거한 후 해당 행의 제1 웰에서 각 약물에 필요한 부피를 피펫하여 약물을 첨가한 후 총 200 μL의 부피를 얻었다.
- 100 μL을 잘 1에서 잘 2로 제거하여 100 μL을 잘 2로 제거하여 100 μL을 잘 제거할 때까지 100 μL이 폐기됩니다. 잘 11은 긍정적 인 제어 역할을 잘합니다.
- 106의 파이펫 100 μL은 음의 대조군으로 작용하는 우물 번호 12를 제외하고 각 사용된 행에 각각의 우물로 세균 접종을 준비하였다.
- 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
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Representative Results
도 2A는 세포로메와 아키카신을 레보플로삭신과 트리메호프-설파움톡사졸의 특정 농도를 결합하여 얻은 결과를 나타낸다. 우리는 그림의 오른쪽 부분에 있는 약의 농도와 함께 schematically 제시되는 4개의 판의 왼쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 화살표는 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 나타냅니다. 색깔의 우물은 성장을 포함하는 우물입니다. 우리는 네 번째 플레이트가 조합을 포함하는 사분면의 성장을 포함하지 않는 것을 알 수 있습니다. 이 접시에 우리는 성장을 억제 할 레보 플로록사신의 MIC가 있기 때문이다. 이 그림에서, 우리는 Cefotaxime의 MIC가 32 μg /mL와 동일한 우물 A8에서 얻어지는 것을 볼 수 있습니다. Amikacin의 MIC는 16 μg/mL과 동일한 웰 E1에서 수득됩니다. 억제 효과는 트리메호프림-설파움톡사졸의 1/8 MIC 이외에 세포로메와 레보플로록사신의 여러 서브MIC 이외에 아키카신(row D)의 1/2 MIC를 함유하는 행에서 볼 수 있다. subMIC 농도를 포함하는 우물에서 세균 성장의 이 억제는 4개의 약의 이 사격 사이 시너지의 한 형태일 지도 모릅니다.
도 2B는 세포로메와 아키카신을 레보플로삭신과 트리메토프림-설파움톡사졸의 특정 농도를 결합하여 얻은 결과를 나타낸다. 우리는 그림의 오른쪽 부분에 있는 약의 농도와 함께 schematically 제시되는 4개의 판의 왼쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 화살표는 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 나타냅니다. 색깔의 우물은 성장을 포함하는 우물입니다. 네 번째 플레이트에 대해 동일한 해석을 따르십시오. 이 그림으로 대표되는 패널에서는, 우리는 세균 성장의 억제 패턴이 또한 행 D에서 발생 것을 볼 수 있습니다, 우물은 세포로메와 레보플로록사신의 서브 MIC를 포함, 1/2 아키카신의 MIC와 트리메토프림 - 설파메톡소잘의 1/4 MIC.
도 2C는 세포로메와 아키카신을 레보플로삭신과 트리메호프-설파움톡사졸의 특정 농도를 결합하여 얻은 결과를 나타낸다. 우리는 그림의 오른쪽 부분에 있는 약의 농도와 함께 schematically 제시되는 4개의 판의 왼쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 화살표는 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 나타냅니다. 색깔의 우물은 성장을 포함하는 우물입니다. 네 번째 플레이트에 대해 동일한 해석을 따르십시오. 이 패널의 억제 패턴에 관해서는, 우리는 행 C와 D 성장이 보이지 않는 것을 볼 수 있습니다. 즉, 우물에는 트리메호프프-설파메톡사졸의 1/2 MIC와 1/4 MIC 및 1/2 MIC 인 아키카신이 외에도 세포로메메와 레보플로록사신의 여러 서브MIC가 포함되어 있음을 의미합니다.
도 2D는 세포로메와 아키카신을 레보플로삭신과 트리메호프-설파움톡사졸의 특정 농도를 결합하여 얻은 결과를 나타낸다. 우리는 그림의 오른쪽 부분에 있는 약의 농도와 함께 schematically 제시되는 4개의 판의 왼쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 화살표는 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 나타냅니다. 네 번째 플레이트에 대해 동일한 해석을 따르십시오. 우리는 단지 행 A와 열 1 우리는 성장을 의미 우물을 착색 한 것을 볼 수 있습니다. 이 패널에서 우리는 완전히 성장을 억제 할 trimethoprim-sulfamethoxazole의 MIC를 가지고 있기 때문이다.
그림 1: Q-checkerboard 설정 및 패널 및 약물 이 추가 방법의 지도의 회로도.
그림 2: 시험 1에서 얻은 실험 결과 테스트 특정 조합에 대해.
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Discussion
쿼드러플 체커보드 방법은 체커보드와 프로토콜의 3차원 체커보드와 유사합니다. 그러나 실험 중 오류를 방지하기 위해 특정 중요한 단계를 고려해야 합니다.
테스트된 각 약물의 MIC에 대해 테스트해야 하는 프로토콜을 시작하기 전에 플레이트에서 연속적으로 희석되어야 하는 약물 1 및 약물 2에 대한 희석을 시작하는 데 필요한 농도가 무엇인지 알아야 합니다. 약물 3 및 약물 4에 관해서는, MIC는 또한 시험하는 데 필요한 농도를 계산하는 것으로 알려져야한다 (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, 및 MIC). MIC를 결정하는 많은 방법이 있지만, Q-checkerboard 프로토콜도 직렬 희석을 위한 미세 희석 분석법을 사용하기 때문에 가장 좋은 방법은 마이크로 희석 기술로 이를 결정하는 것입니다.
첫 번째 단계에서는 플레이트를 녹화하는 동안 벤치가 깨끗하고 오염을 방지하기 위해 멸균 커버로 플레이트를 덮습니다. 이 프로토콜은 각 플레이트가 네 개의 작은 사분면으로 나뉘어있는 네 개의 패널을 나타내는 4 개의 96 웰 플레이트를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그러나, 희석의 수는 제 1 및 제 2 약물에 대해 최소화될 것이다. 또한 4개의 플레이트를 함께 테이핑하는 대신 깊은 384웰 플레이트를 사용할 수도 있습니다. 그러나 실험을 했을 때 사용할 수 없었습니다. 사용할 플레이트를 선택할 때 우물의 최종 부피가 250 μL이므로 각 우물의 용량을 확인하십시오.
더욱이, 각 패널의 플레이트 수와 패널의 수는 제 3 및 제 4 약물에 필요한 희석의 수에 따라 달라집니다. 예를 들어, 본 실험에서 제3 약물의 4가지 희석제와 제4약물의 4가지 희석이 필요하였다(1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC 및 MIC); 따라서 각 패널에는 4개의 플레이트와 4개의 패널이 있었습니다.
첫 번째 약물의 희석은 열에 따라 패널의 플레이트에서 발생합니다. 그러나, 제2 약물의 희석은 행에 따라 별도의 플레이트에서 발생한다. 세 번째와 네 번째 약물은 연속적으로 희석되지 않습니다. 그러나, 사용되는 각 농도는 별도의 튜브로 제조되고 특정 부피로 각각양에 첨가된다. 4개의 약이 포함된 우물은 행 G와 B 및 열 2 및 12 사이 사분면에 존재한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 체커보드와 3차원 체크보드 프로토콜은 알려진 프로토콜이기 때문에 이 원고에서 촬영되거나 작성되지 않았으며 이 원고의 목적은 Q-checkerboard 프로토콜에 대해 이야기하는 것입니다. 바둑판 기술에서, 행 A는 약물 1만 포함되어 있습니다; 따라서, 약물 1의 MIC를 보여주는. 열 1에는 약물 2만 포함됩니다. 따라서, 약물 2의 MIC를 보여주는.
이 개념은 약물 1의 MIC가 여전히 항행A및 MIC 약물 2로 표시되는 Q-Checkerboard 프로토콜에 보관되어 있으며 여전히 열 1에 나와 있다. 이 외에도, 두 추가 약물실험에서 그들의 MIC를 제시. 약물 3는 약물 3의 MIC가 모든 우물에 첨가되어이 판의 성장을 관찰해서는 안되는 각 패널에 P4 플레이트가 있습니다. 유사하 게, 약물 4 는 A4 패널 어디 약물의 MIC 4 패널에 모든 접시에 모든 우물에 추가 4 그래서 성장이이 패널에서 관찰 되어야 한다.
플레이트의 성장은 혼탁 우물이 성장한 것으로 간주되는 우물의 탁도에 따라 기록됩니다. 탁도 외에도 이오도테트라졸리움 50μL이 첨가되어 몇 분 간 방치됩니다. 분홍색으로 색이 바뀌면 성장이 있다는 것을 의미합니다.
이 메서드에는 특정 제한 사항이 있습니다. 그것은 노력과 초점이 필요합니다. 이 기술은 주로 파이펫팅을 기반으로 하기 때문에 파이프팅 오류가 발생할 수 있습니다. FIC 계산은 두 개 또는 세 개가 아닌 네 개의 값을 처리하기 때문에 이 경우 제한사항으로 간주됩니다. 값을 추가하면 FIC의 값이 증가합니다. 따라서 시너지 효과, 무관심 및 적대감을 결정하는 FIC의 값을 재고해야합니다.
FIC 값은 시너지 효과, 적대감 및 무관심이 정의되는 표준에 관한 몇 가지 참조 간에 변경될 수 있습니다. 특정 참고문헌은 FIC가 0.5 이하인 FIC가 시너지효과(13)로간주된다고 명시하고 있으며, 다른 참고로 FIC는 0.8 미만의 FIC가 시너지효과(16)로간주된다고 명시하고 있다. 또 다른 참고 문헌은 FIC가 1 미만이 시너지효과(17)로간주된다고 명시하고 있다. 통합표준 FIC를 정의하는 불안정성과 갈등으로 인해 우리는 1을 우리의 참고 자료로 간주했습니다.
최종 FIC는 각 플레이트(9FIC)의 FIC 값을 추가하고 9인 플레이트 수로 나누어 계산됩니다. 패널 4는 제4 약물의 MIC를 포함하고 있기 때문에 결과에서 고려되지 않으므로 억제가 단일 약물의 작업이 될 것이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 각 패널의 플레이트 4는 약물 3의 MIC를 함유하고 있기 때문에 고려되지 않으며, 여기서 이 판에 억제되는 것은 약물 3 단독으로작용하게 된다. 따라서, 우리는 9 플레이트 (16 - (4 + 3)로 끝납니다.
각 플레이트에 대해, FIC는 다음 공식에 따라 성장/성장 인터페이스에 대한 우물에 대해 계산된다: (약물 1의 조합/MIC 단독으로 약물 1) + (약물 2의 조합/MIC 단독으로 약물 2의 MIC) + (약물 3의 조합/MIC 단독으로) + (약물 3의 조합/MIC 단독으로) + (약물 4의 조합/MIC 단독으로). 이어서, 얻어진 숫자는 4로 나뉜다. 이 수식은 동일한 플레이트의 성장/성장 없음 인터페이스의 각 우물에 대해 수행됩니다. 그런 다음 동일한 플레이트의 모든 IC가 함께 합산되어 이 플레이트의 FIC를 얻습니다. 마지막으로, 앞서 언급했듯이 각 플레이트의 최종 FI 9개를 9개로 나누어 해석될 최종 FIC를 획득합니다.
FIC 미만 1 시너지 효과의 어느 정도가 시너지 효과로 간주됩니다: 그것은 약간 시너지 (하나에 가까운) 또는 더 시너지 (0.5 이하로 이동 하는 경우). 이 계산 및 해석은 단순히 우리가 개발 한 FIC 템플릿을 사용하여 수행됩니다. 우리는 단지 농도를 입력, FIC를 계산하기 위해 성장 / 성장 인터페이스에 우물을 선택, 우리는 언급 된 기준에 따라 해석되는 최종 FIC를 얻을 것이다.
이 방법은 하루에 수행 할 수있는 하나의 실험에서 네 가지 약물을 사용하여 수행 할 수있는 모든 가능한 조합의 테스트를 할 수 있습니다. 결과는 다음 날 얻어진다. 반면, 시간 킬 곡선 분석, 더 많은 시간, 작업 재료 및 실험실 작업자는 조합의 각 세트가 단일 튜브 또는 컵에서 혼자 테스트되기 때문에, 조합의 동일한 수를 테스트하는 데 필요합니다 시간이 많이 소요됩니다. 이 방법은 항균 약물 조합을 테스트할 뿐만 아니라 질병을 치료하는 데 사용되는 모든 유형의 약물을 테스트하기 위해 사용될 수 있으며 병용으로 테스트해야합니다. 그것은 또한 약물과 식물 추출 물의 조합 또는 식물 추출 물의 조합을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 요점은이 방법은 특정 약물뿐만 아니라 결합 할 수있는 모든 것을 테스트하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.
몇 가지 제한 사항은 이 메서드와 함께 합니다. 파이펫팅 기술은 이 분석법을 수행하는 동안 매우 중요하며, 파이펫팅 및 직렬 희석이 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 거짓 음수 또는 거짓 긍정 결과로 이어질 수 있습니다. 따라서 파이펫팅 기계와 로봇에 관한 기술적 진보는 이 분석 작업을 수행하는 데 큰 도움이 될 것입니다. 이 메서드는 단일 오류로 인해 결과의 결과가 변경될 수 있으므로 많은 계산 과 희석이 필요합니다. 이 기술은 억제 효과에 대한 통찰력을 제공하며 살인 효과가 아닙니다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 한 번의 시점에서 억제를 연구합니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
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