Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man studerer alle mulige kombinasjoner som kan oppnås mellom fire legemidler i ett enkelt eksperiment. Denne metoden er basert på standard 96-brønns mikrofortynningsanalyse og beregning av fraksjonelle hemmende konsentrasjoner (FICer) for å evaluere resultatene.
Abstract
Konseptet med legemiddelkombinasjonsterapi blir svært viktig, hovedsakelig med den drastiske økningen i resistens mot narkotika. Quadruple checkerboard, også kalt Q-checkerboard, tar sikte på å maksimere antall mulige kombinasjoner som kan oppnås mellom fire stoffer i ett eksperiment for å minimere tiden og arbeidet som trengs for å oppnå de samme resultatene med andre protokoller. Denne protokollen er basert på den enkle mikrofortynningsteknikken der stoffene fortynnes og kombineres sammen i flere 96-brønnsplater.
I det første settet med 96-brønnsplater tilsettes Muller-Hinton-kjøttkraft etterfulgt av det første nødvendige stoffet (f.eks. Cefotaxime her) for å fortynne det serielt. Etter at det første trinnet er gjort, brukes et annet sett med 96-brønnsplater til å fortynne det andre stoffet (f.eks. Amikaci), som vil bli overført ved å fjerne et bestemt volum av legemiddel 2 og sette inn de tilsvarende brønnene i det første settet med 96-brønnsplater som inneholder stoff en. Det tredje trinnet gjøres ved å legge til de nødvendige konsentrasjonene av det tredje stoffet (f.eks. Levofloxacin), til de riktige platene i det første settet som inneholder kombinasjon av legemiddel 1 og 2. Det fjerde trinnet gjøres ved å legge til de nødvendige konsentrasjonene av det fjerde stoffet (f.eks. Trimethoprim-sulfametoksazol) i de riktige platene i det første settet. Deretter vil E. coli ESBL bakteriell inoculum bli forberedt og tilsatt.
Denne metoden er viktig for å evaluere alle mulige kombinasjoner og har et bredere spekter av muligheter som skal testes videre for in vivo-testing. Til tross for at det er en slitsom teknikk som krever mye fokus, er resultatene bemerkelsesverdige og tidsbesparende der mange kombinasjoner kan testes i et enkelt eksperiment.
Introduction
Med økningen i motstand på grunn av overforbruk og misbruk av antibiotika1,2, har behovet for å utvikle nye stoffer og midler for å behandle bakterielle infeksjoner blitt avgjørende. Nye tilnærminger som utvikling av nye legemidler er svært viktig for å overvinne motstandskrisen. Den farmasøytiske industrien er imidlertid ikke interessert i å utvikle nye antimikrobielle midler. Videre, hvis nye stoffer utvikles, vil bakterier fortsette å utvikle seg og utvikle motstand mot disse nye stoffene3,4. Dermed vil problemet med motstand ikke bli løst, noe som gjør behovet for en annen tilnærming til et must som bør vurderes og studeres for å overvinne bakteriell motstand.
Legemiddelkombinasjon er et svært viktig konsept for behandling av bakterielle infeksjoner hovedsakelig de som er forårsaket av multidrug-resistente patogener5,6. Det reduserer behandlingsforløpet, reduserer dosen som er gitt; Dermed reduserer toksisiteten til det gitte stoffet, bidrar til å redusere graden av motstandsutvikling og på en måte sensibiliserer bakteriene til de gitte stoffene som beskrevet i begrepet sikkerhetsfølsomhet5,7,8,9.
Motstandsutvikling til ett stoff krever en enkelt mutasjon; Resistensutviklingen mot en kombinasjon av legemidler rettet mot flere veier krever imidlertid flere uavhengige mutasjoner som bremses av denne kombinasjonen. Et eksempel på redusert motstand mens du bruker kombinasjonsterapi er den reduserte motstandshastigheten mot Rifampin i Mycobacterium Tuberculosis10. Et annet eksempel er en studie gjort av Gribble et al. som viste frekvensen av fremveksten av resistente stammer hos pasienter som tar Piperacillin alene for å være høyere enn hos de som tar en kombinasjon av karboksypenicillin og aminoglykosid10. Studier har vist at resistensutvikling mot aminoglykosider i utviklende bakterier gjorde disse stammene følsomme for ulike andre legemidler5. Kombinasjonen mellom beta-laktam klasse stoffet amoksicillin og laktamasehemmeren clavulanic acid viste suksess i behandling av resistente bakteriestammer8.
Å redusere behandlingstidspunktet er en god fordel som følge av legemiddelkombinasjoner. For eksempel vil en terapi av kombinert penicillin eller ceftriaxon med gentamicin i 2 uker gi samme effekt gitt av penicillin eller ceftriaxon alene når det gis i 4 uker11. Kombinere medisiner gjør det mulig å bruke lavere doser av legemidler som ikke er effektive når de gis alene, for eksempel Sub-MICene. Eksempelet på sulfonamider kan gis der bruk av trippel-sulfonamider minimerer, ved lavere doser, toksisiteten som produseres som er krystalldannelse eller krystalliuri ved bruk av uoppløselige sulfonamider ved fulle doser12.
Dermed vil reduksjon av doseringen gitt og behandlingstidspunktet til slutt redusere toksisiteten til legemidlene på kroppen. Ideen om å utvikle metoder for å vurdere samspillet mellom kombinerte legemidler er svært viktig. I en studie viste resultatene at kombinasjonsterapi er mer effektiv for behandling av resistente arter av Acinetobacter og P. aeruginosa8.
Gi narkotika i kombinasjon
Det finnes forskjellige metoder som vi kan studere stoffkombinasjoner, for eksempel checkerboard-metoden, time-kill kurvemetoden og E-testmetoden13. Checkerboard-metoden kan studere alle mulige kombinasjoner mellom de to aktuelle stoffene i selve eksperimentet. I tillegg ble det utviklet for å studere en kombinasjon av tre stoffer14. Nå utvider vi dette for å studere en kombinasjon av fire stoffer hovedsakelig for behandling av multidrug-resistente patogener.
Tidsdrepende kurveanalysen utføres vanligvis for å teste for bakteriedrepende effekten av et bestemt stoff. Det ble også brukt til å teste effekten av legemiddelkombinasjoner der flere stoffer kombineres ved spesifikke konsentrasjoner. Denne protokollen krever tilberedning av flere sterile rør eller kopper der vi i hver kopp legger til buljongen, kombinasjonen av narkotika og den nødvendige bakteriestammen. Etter inkubasjon og registrering av den optiske tettheten på flere tidspunkter, sammenlignes resultatene med den normale vekstraten for den brukte stammen for å se om vekstraten økte, reduserte eller ikke endretseg 13.
E-testmetode gjøres vanligvis for å teste for den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) der en stripe som inneholder en gradientkonsentrasjon av det aktuelle stoffet, settes på en inokulert plate. Det ble også brukt til å teste kombinasjonen mellom to stoffer der to strimler legges til platen på en vinkelrett måte som krysser ved DERES MIC13.
Ifølge litteraturen er det ingen gullstandard for å definere og studere synergi; Dermed er det vanskelig å vurdere hvilken av metodene som brukes til å studere kombinasjon er bedre og hvilken som gir bedre og mer pålitelige resultater hovedsakelig13. Imidlertid er Time-kill analyse arbeidsintensiv, tidkrevende og dyr15,16, mens E-testmetoden er utviklet for å studere en kombinasjon mellom bare to stoffer. Checkerboard kan studere alle mulige kombinasjoner mellom de to legemidlene som er testet, og dette er grunnen til at denne teknikken er valgt til å utvikles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelsestrinn
- Forbered Muller-Hinton kjøttkraft (MHB) ved å tilsette 25 g MH kjøttkraft til 1 L destillert vann og bland. Autoklav ved 121 °C i 2,5 timer. Deretter lagrer du det autoklavede mediet ved romtemperatur eller i kjøleskapet.
- Subkultur de aktuelle bakteriene (E. coli ESBL) på agarmediene ved hjelp av den fire-kvadrant stripemetoden og inkubere over natten ved 37 °C.
- Bruk en steril sløyfe, ta en koloni og spre den i første halvdel av MacConkey agarplaten ved å gjøre nære parallelle striper.
- Bruk løkken, spre bakteriene i den andre kvadranten ved å strekke den fra den første kvadranten.
- Fra den andre kvadranten forlenger du stripene i den tredje kvadranten ved hjelp av nære parallelle striper.
- Spred bakteriene i midten av den fjerde kvadranten ved å strekke den fra den tredje kvadranten.
2. Panel forberedelse
- Plasser fire 96-brønnsplater ved siden av hverandre for å danne en firkant. Bruk et bånd til å teipe bunnen sammen.
- Gjenta dette trinnet for å få fire paneler som hver inneholder 4 plater, og gi dem navnet A1, A2, A3 og A4.
- Tilsett 50 μL MH-kjøttkraft til brønnene mellom kolonne 2 og kolonne 11 i de 16 96 brønnplatene til de fire panelene.
- Tilsett 200 μL MH kjøttkraft til brønnen H12 som fungerer som den negative kontrollbrønnen i de 16 96-brønnsplatene på de fire panelene.
- Tilsett 150 μL MH-kjøttkraft til brønnene A1 og H1 som fungerer som positive kontrollbrønner i de 16 96 brønnplatene til de fire panelene.
3. Legemiddel 1, Cefotaxime, seriell fortynning
- Til et konisk rør, tilsett 15 ml steril dH2O.
- Beregn volumet som skal fjernes fra lagerløsningen av legemidlet etter formelen C1V1 = C2V2. Dermed V1 = (C2 x 15 ml) / C1.
MERK: I vårt tilfelle er Cefotaxime lagerløsningen 105 μg / ml og C2 er 256 μg / ml; Dermed V1 = 38,4 μL.
- Beregn volumet som skal fjernes fra lagerløsningen av legemidlet etter formelen C1V1 = C2V2. Dermed V1 = (C2 x 15 ml) / C1.
- Fjern det beregnede volumet fra 15 ml steril dH2O, og tilsett deretter stoffet.
- Pipette 50 μL av den tilberedte legemiddelløsningen i hver brønn i kolonne 11 og kolonne 12 unntatt H12.
- Start den serielle fortynning ved å fjerne 50 μL fra kolonne 11 og sette den inn i de tilsvarende brønnene i kolonne 10, og deretter fra 10 til du når kolonne 2 der 50 μL tatt fra kolonne 2 skal kastes.
- Gjenta trinn 3.4 og 3.5 for alle de 16 96-brønns platene på de fire panelene.
4. Legemiddel 2, Amkacin, seriell fortynning
- Til et konisk rør, tilsett 10 ml steril dH2O.
- Beregn volumet som skal fjernes fra lagerløsningen av legemidlet etter formelen C1V1 = C2V2. Dermed V1 = (C2 x 10 ml) / C1.
MERK: I vårt tilfelle er Amikacin lagerløsningen 103 μg / ml og C2 er 64 μg / ml; Dermed V1 = 64 μL. - Fjern det beregnede volumet fra 10 ml steril dH2O, og tilsett deretter stoffet.
- Ta åtte separate 96-brønnsplater.
- Tilsett 100 μL MHB til brønnene mellom rad G og B til hver plate.
- Tilsett 100 μL av den tidligere tilberedte legemiddel 2-løsningen til brønnene på rad G.
- Fortynn serielt fra rad G til rad B ved å ta 100 μL fra hver brønn og til slutt kaste 100 μL fra brønnene på rad B.
- Gjenta trinn 4,5, 4,6 og 4,7 for å klargjøre åtte plater.
5. Overføring av legemiddel 2 til de fire panelene
- Pipette 50 μL legemiddel 2 fra brønnene mellom rad G og B inn i de tilsvarende brønnene i hver plate i de fire panelene. En tilberedt 96-brønnsplate inneholder 100 μL legemiddel 2 som er nok for to plater i ett panel.
6. Legemiddel 3, Levofloxacin, tillegg
- Til fire forskjellige koniske rør, tilsett 14 ml steril dH2O.
- Beregn volumet som skal fjernes fra lagerløsningen av legemidlet etter formelen C1V1 = C2V2. Dermed V1 = (C2 x 14 ml) / C1.
MERK: I vårt tilfelle fremstilles Levofloxacin i fire forskjellige konsentrasjoner fra en lagerløsning på 5 x 103 μg/ml.
C1 = 2 μg/ml, V1 = 5,6 μL
C2 = 4 μg/ml, V1 = 11,2 μL
C3 = 8 μg/ml, V1 = 22,4 μL
C4 = 16 μg/ml, V1 = 44,8 μL - Fjern det beregnede volumet fra 14 ml steril dH2O fra hvert rør, og tilsett deretter stoffet.
- Etter å ha forberedt de nødvendige konsentrasjonene av det tredje stoffet, ta 50 μL og legg det til de tilsvarende brønnene mellom rad B og G og kolonne 2 og 12 i tilsvarende plate i hvert panel der C1 tilsvarer de fire P1-platene i de fire panelene, tilsvarer C2 de fire P2-platene i de fire panelene. , C3 tilsvarer de fire P3-platene i de fire panelene, og C4 tilsvarer de fire P4-platene i de fire panelene.
7. Legemiddel 4, Trimetoprim-sulfametoksazol, tilsetning
- Til et konisk rør, tilsett 14 ml steril dH2O.
- Beregn volumet som skal fjernes fra lagerløsningen av legemidlet etter formelen C1V1 = C2V2. Dermed V1 = (C2 x 14 ml) / C1.
MERK: I vårt tilfelle fremstilles trimetoprim-sulfametoksazol i fire forskjellige konsentrasjoner fra en lagerløsning på 48 x 103 μg/ml.
C1 = 512 μg/ml, V1 = 149,33 μL
C2 = 1024 μg/ml, V1 = 298,66 μL
C3 = 2048 μg/ml, V1 = 597,33 μL
C4 = 4096 μg/ml, V1 = 1 194,66 μL - Fjern det beregnede volumet fra 14 ml steril dH2O i hvert rør, og tilsett deretter stoffet.
- Etter å ha forberedt de nødvendige konsentrasjonene av det fjerde stoffet, ta 50 μL og legg det til de tilsvarende brønnene mellom rad B og G og kolonne 2 og 12 i de fire platene i det tilsvarende panelet der C1 tilsvarer panel 1, C2 tilsvarer panel 2, C3 tilsvarer panel 3, og C4 tilsvarer panel 4.
8. Tilberedning og tilsetning av bakteriell inoculum E. coli ESBL
- Bruk en steril sløyfe, overfør en koloni av bakteriell isoler E. coli ESBL tidligere dyrket på en tallerken i 2 ml steril MHB og virvel.
- Se etter turbiditeten der den skal være 0,5 McFarland ved hjelp av et densitometer.
- Tilsett 80 ml steril MH-kjøttkraft til en steril urinkopp.
- Tilsett bakteriell inokulum fra 0,5 McFarland-inokulumet i urinkoppen etter C1V1 = C2V2, der V1 = (106 x 80 ml) / 108 = 800 μL.
- Pipette 50 μL av inokulumoppløsningen 106 CFU/ml i hver brønn unntatt H12, som er sterilitetskontrollen godt.
- Inkuber panelene ved 37 °C over natten.
- Etter inkubasjon, tilsett 50 μL Iodotetrazolium for å registrere veksten i brønnene.
9. Protokoll for FIC-malen (Tilleggsfil)
- Skriv den høyeste konsentrasjonen av legemiddel 1 (Cefotaxime) i den gule cellen i panel A.
- Skriv den høyeste konsentrasjonen av legemiddel 2 (Amikacin) i den gule cellen i panel B.
- Skriv den høyeste konsentrasjonen av legemiddel 3 (Levofloxacin) i den gule cellen i panel C.
- Skriv den høyeste konsentrasjonen av legemiddel 4 (Trimethoprim-sulfametoksazol) i panel D.
- Spor Redline (Growth/no Growth interface) ved å fremheve brønnene som har vekst i rødt.
- Skriv MIC av legemiddel 1 i tabellen over legemiddel 1 (ATB1).
- Skriv MIC av legemiddel 2 i tabellen over legemiddel 2 (ATB2).
- Skriv MIC av legemiddel 3 i tabellen over legemiddel 3 (ATB3).
- Skriv MIC av legemiddel 4 i tabellen over legemiddel 4 (ATB4).
- Slik beregner du FIC for ATB1
- Bestem brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet.
- I tabell ATB1 dobbeltklikker du cellen ved siden av FIC1 og drar den gule cellen til venstre for panel A til den første markerte brønnen.
- Gjenta trinn 9.10.2 for hver valgte brønn der brønn 1 tilsvarer FIC1, brønn 2 tilsvarer FIC2, og så videre.
- Slik beregner du FIC for ATB2
- I tabell ATB2 dobbeltklikker du cellen ved siden av FIC1 og drar den gule cellen til venstre for panel B til den første forhåndsvalgte brønnen.
- Gjenta trinn 9.11.1 for hver forhåndsvalgte brønn.
- Slik beregner du FIC for ATB3
- I tabell ATB3 dobbeltklikker du cellen ved siden av FIC1 og drar den gule cellen til venstre for panel C til den første forhåndsvalgte brønnen.
- Gjenta trinn 9.12.1 for hver forhåndsvalgte brønn.
- Slik beregner du FIC for ATB4
- I tabell ATB4 dobbeltklikker du cellen ved siden av FIC1 og drar den gule cellen til venstre for panel D til den første forhåndsvalgte brønnen.
- Gjenta trinn 9.13.1 for hver forhåndsvalgte brønn.
- I tabellen merket ATB1+2+3+4 summerer du FIC1 for hver ATB automatisk. Det samme vil skje for de andre FICene (FIC2, FIC3 og så videre).
- I cellen som inneholder FIC og uthevet i gult, dobbeltklikker du på den og velger de summerte ΣFICene fra tabellen ATB1+2+3+4.
- Gjenta disse trinnene for hvert av de ni arkene som representerer de ni platene.
MERK: I arket FIC alle, vil tabellen vise den endelige oppsummert FIC med tolkningen av den oppnådde verdien.
10. MIC-bestemmelse ved bruk av mikrodilusjonsanalysen for de fire legemidlene
- Merk fire forskjellige rader med forkortelsen for hvert testede stoff. For eksempel CTX for Cefotaxime, AMK for Amikacin, LEVO for Levofloxacin og SXT for Trimethoprim-sulfametoksazol.
- Pipette 200 μL steril Muller Hinton buljong i brønn nummer 1 og brønn nummer 12 i hver brukte rad. Brønn nummer 12 vil fungere som den negative kontrollbrønnen.
- Pipette 100 μL steril Muller Hinton buljong til brønnene 2 til 11 i hver brukte rad.
- Beregn volumet av hvert legemiddel som skal tilsetts ved hjelp av formelen C1V1 = C2V2. Dermed V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 er det endelige volumet i brønnene som er 200 μL, C1 er konsentrasjonen av lagerløsningen, og C2 er den første konsentrasjonen vi trenger å ha i den første brønnen.
MERK: Her bruker vi følgende:
Cefotaxime: C1 = 105 μg/ml, hvor vi fortynner den til 104 μg/ml, C2 = 256 μg/ml; Dermed er V1 = 20,48 μL
Amikacin: C1 = 103 μg/ml, C2 = 64 μg/ml; Dermed er V1 = 51,2 μL
Levofloxacin: C1 = 5 x 103 μg/ml, hvor vi fortynner den til 5 x 102 μg/ml, C2 = 16 μg/ml; dermed er V1 = 25,6 μL
Trimetoprim-Sulfamethoxazol: C1 = 48 x 103 μg/ml, C2 = 4096 μg/ml; dermed er V1 = 68,26 μL - Pipette det nødvendige volumet for hvert stoff i den første brønnen i tilsvarende rad etter å ha fjernet det samme volumet fra 200 μL kjøttkraft for å oppnå et totalt volum på 200 μL etter tilsetning av stoffet.
- Fortynn serielt ved å fjerne 100 μL fra brønn 1 til brønn 2 og så videre til den når brønn 10 der 100 μL fjernet fra brønn 10 skal kastes. Merk at brønn 11 fungerer som den positive kontrollbrønnen.
- Pipette 100 μL av 106 tilberedt bakteriell inokulum i hver brønn i hver brukt rad bortsett fra brønn nummer 12 som fungerer som negativ kontroll.
- Inkuber ved 37 °C over natten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A representerer resultatene oppnådd ved å kombinere Cefotaxime og Amikacin med spesifikke konsentrasjoner av Levofloxacin og Trimethoprim-sulfametoksazol. Vi kan se i venstre del av figuren de fire platene som skjematisk presenteres med konsentrasjonene av stoffene i høyre del av figuren. Pilene representerer brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet. De fargede brønnene er brønnene som inneholder vekst. Vi merker at den fjerde platen ikke inneholder vekst i kvadranten som inneholder kombinasjonen. Dette er fordi i denne platen har vi MIC av Levofloxacin som vil hemme veksten. I denne figuren kan vi se at CEfotaximes mikrofon er oppnådd i brønnen A8, som tilsvarer 32 μg/ml. MIC av Amikacin er oppnådd i brønnen E1, som tilsvarer 16 μg/ml. En hemmingseffekt ses i raden som inneholder 1/2 MIC amikacin (rad D) i tillegg til flere subMICer cefotaxim og levofloxacin i tillegg til 1/8 MIC trimetoprim-sulfametoksazol. Denne hemmingen av bakterievekst i brønner som inneholder subMIC-konsentrasjoner kan være en form for synergisme mellom disse konsentrasjonene av de fire legemidlene.
Figur 2B representerer resultatene oppnådd ved å kombinere Cefotaxime og Amikacin med spesifikke konsentrasjoner av Levofloxacin og Trimethoprim-sulfametoksazol. Vi kan se i venstre del av figuren de fire platene som skjematisk presenteres med konsentrasjonene av stoffene i høyre del av figuren. Pilene representerer brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet. De fargede brønnene er brønnene som inneholder vekst. Følg samme tolkning for den fjerde platen. I panelet representert ved denne figuren kan vi se at hemmingsmønsteret for bakterievekst også skjedde i rad D, hvor brønnene inneholder subMICer av Cefotaxime og levofloxacin, 1/2 MIC av Amikacin og 1/4 MIC av Trimethoprim-sulfametoksazol.
Figur 2C representerer resultatene oppnådd ved å kombinere Cefotaxime og Amikacin med spesifikke konsentrasjoner av Levofloxacin og Trimethoprim-sulfametoksazol. Vi kan se i venstre del av figuren de fire platene som skjematisk presenteres med konsentrasjonene av stoffene i høyre del av figuren. Pilene representerer brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet. De fargede brønnene er brønnene som inneholder vekst. Følg samme tolkning for den fjerde platen. Når det gjelder hemmingsmønsteret i dette panelet, kan vi se at i rad C og D-veksten ikke er sett. Dette betyr at i brønnene inneholder flere underMICer av Cefotaxime og Levofloxacin i tillegg til 1/2 MIC av Trimethoprim-sulfametoksazol og 1/4 MIC og 1/2 MIC av Amikacin.
Figur 2D representerer resultatene oppnådd ved å kombinere Cefotaxime og Amikacin med spesifikke konsentrasjoner av Levofloxacin og Trimethoprim-sulfametoksazol. Vi kan se i venstre del av figuren de fire platene som skjematisk presenteres med konsentrasjonene av stoffene i høyre del av figuren. Pilene representerer brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet. Følg samme tolkning for den fjerde platen. Vi kan se at bare i rad A og kolonne 1 har vi fargede brønner som betyr vekst. Dette er fordi i dette panelet har vi MIC av trimetoprim-sulfametoksazol som helt vil hemme veksten.
Figur 1: Skjematisk for Q-sjakkbrettets oppsett og paneler og et kart over hvordan stoffene legges til. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: De eksperimentelle resultatene oppnådd i studie 1 for visse kombinasjoner testet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Quadruple Checkerboard-metoden ligner sjakkbrettet og det tredimensjonale sjakkbrettet i protokollen. Imidlertid bør det tas hensyn til visse viktige skritt for å unngå feil under eksperimentet.
Sørg for å teste for MIC for hvert legemiddel mot den testede isolasjonen før du starter protokollen for å vite hva som er konsentrasjonene som trengs for å starte fortynning med for legemiddel 1 og legemiddel 2 som må fortynnes serielt i platene. Når det gjelder legemiddel 3 og legemiddel 4, bør MIC også være kjent for å beregne konsentrasjonene som trengs for å bli testet (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC og MIC). Det er mange metoder for å bestemme MIC, men det beste er å bestemme det med mikrodilusjonsteknikken siden Q-checkerboard-protokollen også bruker mikrodilusjonsanalysen for seriell fortynning.
I det første trinnet, mens du tapper platene, må du sørge for at benken er ren og dekke platene med sterile deksler for å unngå forurensning. Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan gjøres ved hjelp av fire 96-brønnsplater som representerer de fire panelene, hvor hver plate er delt inn i fire mindre kvadranter. Imidlertid vil antall fortynninger bli minimert for det første og andre stoffet. I tillegg kan man også bruke dype brønnplater på 384 brønner i stedet for å teipe fire plater sammen. Det var imidlertid ikke tilgjengelig da vi gjorde eksperimentene. Vær oppmerksom på at når du velger platen som skal brukes, må du kontrollere kapasiteten til hver brønn siden det endelige volumet i brønnen vil være 250 μL.
Videre avhenger antall plater i hvert panel og antall paneler av antall fortynninger som kreves for det tredje og fjerde stoffet. For eksempel, i dette eksperimentet, var fire fortynninger av det tredje stoffet og fire fortynning av det fjerde stoffet nødvendig (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC og MIC); Dermed hadde vi fire plater i hvert panel og fire paneler.
Fortynning av det første stoffet skjer i panelplatene i henhold til kolonnene. Imidlertid skjer fortynning av det andre stoffet i separate plater i henhold til radene. Det tredje og fjerde stoffet fortynnes ikke serielt. Imidlertid fremstilles hver konsentrasjon i et eget rør og legges til hver brønn i et bestemt volum. Det er viktig å merke seg at brønnene som inneholder de fire legemidlene er til stede i kvadranten mellom rad G og B og bare kolonne 2 og 12. Sjakkbrettet og de tredimensjonale sjakkbrettprotokollene ble ikke filmet eller skrevet i dette manuskriptet fordi de er kjente protokoller, og formålet med dette manuskriptet er å snakke om Q-checkerboard-protokollen. I sjakkbrettteknikken inneholder rad A bare stoff 1; dermed viser MIC av legemiddel 1. Kolonne 1 inneholder bare stoff 2; dermed viser MIC av legemiddel 2.
Dette konseptet holdes i Q-Checkerboard-protokollen der MIC for legemiddel 1 fortsatt er vist i rad A og MIC for legemiddel 2 fortsatt er vist i kolonne 1. I tillegg til dette presenterer de to tilsatte legemidlene sin MIC i eksperimentet. Drug 3 har P4-platen i hvert panel der MIC av legemiddel 3 legges til alle brønnene, slik at vi ikke bør observere veksten i denne platen. På samme måte har legemiddel 4 A4-panel der MIC for legemiddel 4 legges til alle brønnene i alle platene i panel 4, slik at det ikke bør observeres vekst i dette panelet.
Veksten i platene er registrert basert på turbiditeten i brønnene, der de uklare brønnene anses å ha vekst. I tillegg til turbiditeten tilsettes 50 μL Iodotetrazolium og etterlates i få minutter. En endring i farge til rosa betyr at det er vekst.
Denne metoden har visse begrensninger. Det krever hardt arbeid og fokus. Pipetteringsfeil kan oppstå siden denne teknikken hovedsakelig er basert på pipettering. FIC-beregningene regnes som en begrensning i dette tilfellet siden vi har å gjøre med fire verdier ikke to eller tre. Hvis du legger til en verdi, økes verdien av FIC i brønnen. Dermed må verdiene til FIC som bestemmer synergisme, likegyldighet og antagonisme revurderes.
FIC-verdier kan endres mellom flere referanser om standardene som synergisme, antagonisme og likegyldighet er definert etter. Enkelte referanser sier at en FIC på 0,5 og mindre regnes som synergisme13, mens andre oppgir at en FIC mindre enn 0,8 regnes som synergisme16. En annen referanse sier at en FIC mindre enn 1 regnes som synergisme17. På grunn av ustabiliteten og konflikten i å definere en enhetlig standard FIC for synergisme, anså vi 1 som vår referanse.
Den endelige FIC beregnes ved å legge til FIC-verdiene for hver plate (9 FICer) og dele den på antall plater som er 9. Det er viktig å merke seg at panel 4 ikke vurderes i resultatene siden det inneholder MIC for det fjerde stoffet, slik at hemmingen vil være arbeidet til et enkelt stoff. I tillegg er plate 4 i hvert panel heller ikke vurdert siden den inneholder MIC av legemiddel 3 der hemmingen i denne platen vil være handlingen av stoff 3 alene. Dermed ender vi opp med 9 plater (16 - (4 + 3)).
For hver plate beregnes FIC-ene for brønnene på vekst / ingen vekstgrensesnitt i henhold til følgende formel: (MIC av legemiddel 1 i kombinasjon / MIC av legemiddel 1 alene) + (MIC av legemiddel 2 i kombinasjon / MIC av legemiddel 2 alene) + (MIC av legemiddel 3 i kombinasjon / MIC av legemiddel 3 alene) + (MIC av legemiddel 4 i kombinasjon / MIC av legemiddel 4 alene). Deretter er tallet som er oppnådd delt på 4. Denne formelen gjøres for hver brønn på Growth / no Growth-grensesnittet i samme plate. Deretter summeres alle FIC-ene med samme plate sammen for å oppnå FIC på denne platen. Til slutt, som nevnt tidligere, blir de 9 endelige FICene til hver plate lagt til og delt på 9 for å oppnå den endelige FIC som vil bli tolket.
En FIC mindre enn 1 regnes som synergistisk der den har en viss grad av synergisme: den er enten litt synergistisk (nær en) eller mer synergistisk (når den beveger seg mot 0,5 og mindre). Denne beregningen og tolkningen gjøres ganske enkelt ved hjelp av en FIC-mal som vi utviklet. Vi går bare inn i konsentrasjonene, velger brønnene på Growth/no Growth-grensesnittet for å beregne FIC-ene, og vi vil få den endelige FIC som tolkes i henhold til kriteriene som er nevnt.
Denne metoden tillater testing av alle mulige kombinasjoner som kan gjøres ved hjelp av fire stoffer i ett eksperiment som kan gjøres på en dag. Resultatene oppnås neste dag. Mens, når kill curve analyse, mer tid, arbeidsmaterialer og laboratoriearbeidere er nødvendig for å teste samme antall kombinasjoner, siden hvert sett med kombinasjoner testes alene i et enkelt rør eller kopp, noe som gjør det tidkrevende. Denne metoden kan brukes ikke bare til å teste antibakterielle legemiddelkombinasjoner, men for å teste alle typer legemidler som brukes til å behandle sykdommer og må testes i kombinasjon. Den kan også brukes til å teste en kombinasjon av legemidler og planteekstrakter eller til og med en kombinasjon av bare planteekstrakter. Poenget er at denne metoden kan brukes til å teste ikke bare spesifikke stoffer, men alt som kan kombineres.
Flere begrensninger følger med denne metoden. Pipetteringsferdigheter er svært viktige mens du utfører denne analysen, og enhver feil som kan oppstå mens pipettering og seriell fortynning kan påvirke resultatene negativt og kan føre til falske negative eller falske positive resultater. Dermed vil eventuelle teknologiske fremskritt angående pipetteringsmaskiner og roboter være til stor hjelp for å utføre denne analysen. Denne metoden krever mange beregninger og fortynninger, slik at en enkelt feil kan endre resultatet av resultatene. Denne teknikken gir innsikt i hemmingseffekten bare og ikke drapseffekten. Denne teknikken studerer hemmingen på et enkelt tidspunkt og ikke over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen.
Acknowledgments
ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
| 5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
| 90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
| 96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
| Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
| Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
| Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
| Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
| Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
| Paper Tape | |||
| Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |
References
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
- Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
- Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
- Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
- Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
- Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
- Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
- Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
- Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
- Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
- Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
- Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
- Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
- Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).
