Summary
Aqui, descrevemos os procedimentos desenvolvidos em nosso laboratório para a preparação de pós de cristais de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED).
Abstract
Um protocolo detalhado para a preparação de amostras de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED) é descrito. O MicroED foi desenvolvido para resolver estruturas de proteínas e pequenas moléculas usando equipamentos de criomicroscopia eletrônica padrão (cryo-EM). Dessa forma, pequenas moléculas, peptídeos, proteínas solúveis e proteínas de membrana foram recentemente determinadas com altas resoluções. Protocolos são apresentados aqui para a preparação de grades de fármacos de pequenas moléculas usando o fármaco carbamazepina como exemplo. Protocolos para triagem e coleta de dados são apresentados. Etapas adicionais no processo geral, como integração de dados, determinação de estrutura e refinamento são apresentadas em outro lugar. Estima-se que o tempo necessário para preparar as grades de moléculas pequenas seja inferior a 30 min.
Introduction
A difração eletrônica de microcristais (MicroED) é um método de criomicroscopia eletrônica (crio-EM) para determinar estruturas de resolução atômica a partir de cristais de tamanho submicrométrico 1,2. Os cristais são aplicados a grades de microscópio eletrônico de transmissão padrão (TEM) e congelados mergulhando em etano líquido ou nitrogênio líquido. As grades são então carregadas em um MET operando em temperaturas criogênicas. Os cristais são localizados na grade e peneirados para a qualidade inicial da difração. Os dados MicroED de rotação contínua são coletados de um subconjunto dos cristais peneirados, onde os dados são salvos usando uma câmera rápida como um filme3. Esses filmes são convertidos para um formato cristalográfico padrão e processados quase de forma idêntica como um experimento de cristalografia de raios X4.
O MicroED foi originalmente desenvolvido para investigar microcristais de proteína 1,2. Um gargalo na cristalografia de proteínas é o crescimento de cristais grandes e bem ordenados para experimentos tradicionais de difração de raios X síncrotron. Como os elétrons interagem com ordens de magnitude da matéria mais fortes que os raios X, as limitações do tamanho do cristal necessário para produzir difração detectável é consideravelmente menor5. Além disso, a razão entre eventos de espalhamento elástico e inelástico é mais favorável para elétrons, sugerindo que dados mais úteis podem ser coletados com uma menor exposição global5. Desenvolvimentos constantes têm permitido a coleta de dados de MicroED a partir dos microcristais mais desafiadores 6,7,8,9.
Recentemente, o MicroED tem se mostrado uma poderosa ferramenta para determinar as estruturas de fármacos de pequenas moléculas a partir de materiais aparentemente amorfos10,11,12,13. Esses pós podem vir diretamente de um frasco de reagente comprado, de uma coluna de purificação ou até mesmo do esmagamento de uma pílula em um pó fino10. Esses pós parecem amorfos a olho nu, mas podem ser inteiramente compostos de nanocristais ou simplesmente conter traços de depósitos nanocristalinos em uma fração amorfa não cristalina maior. A aplicação do material na grade é fácil, e as etapas subsequentes de identificação de cristais, triagem e coleta de dados podem até ser automatizadas em um futuro próximo14. Enquanto outros podem utilizar diferentes métodos para preparação de amostras e coleta de dados, aqui são detalhados os protocolos desenvolvidos e utilizados no laboratório de Gonen para a preparação de amostras de pequenas moléculas para MicroED e para a coleta de dados.
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Protocol
1. Preparação de amostras de pequenas moléculas
- Transfira uma pequena quantidade (0,01 - 1 mg) de pó, líquido ou sólidos para um pequeno frasco ou tubo.
- Para amostras já em pó, sele o tubo usando a tampa até que a amostra seja necessária. Secar as amostras líquidas em pós antes das tentativas do método 1 (passo 3) ou 2 (passo 4).
NOTA: As amostras dissolvidas em líquido podem utilizar o método 3 (5.X) abaixo
2. Preparação de grades de ETM
NOTA: Alguns TEMs com sistemas de carregador automático exigem que as grades sejam cortadas e colocadas em um antes de carregar na coluna TEM. O clipping envolve a fixação física da grade de TEM de 3 mm em um anel de metal que o carregador automático pode manipular. Esta etapa e as etapas subsequentes podem ser executadas usando grades TEM normais ou grades TEM que foram cortadas. Para esses experimentos, muitas vezes é mais fácil manipular as grades se elas tiverem sido cortadas antes do tempo.
- Embrulhe filme plástico em torno de uma extremidade de uma lâmina de tampa de vidro.
- Coloque as grades de TEM sobre o filme na parte superior da tampa com o lado de carbono voltado para cima. Identifique os dois lados da grade sob uma luz. O lado de cobre brilha e parece metálico, enquanto o lado de carbono aparece de cor marrom (Figura 1C,D). Para grades cortadas, o lado de carbono deve estar voltado para a face plana do anel de clipe.
- Coloque a lâmina com grades na câmara de descarga de brilho. Descarga de brilho da tampa por aproximadamente 30 s usando a configuração negativa em 15 pA. Guarde as grades na tampa dentro de uma placa de Petri de vidro forrada com papel filtro antes de adicionar amostra às grades.
3. Aplicação de amostra em grades criando um pó fino homogêneo (Método 1)
- Remova uma grade de MET descarregada com brilho da placa de Petri coberta usando uma pinça. Coloque a grade em um papel de filtro circular com o lado de carbono voltado para cima.
- Usando uma espátula pequena, remova uma colher muito pequena de pó (aproximadamente 0,1 mg) e coloque-a em uma pequena tampa de vidro quadrada ao lado da grade de MET no papel de filtro. Coloque outra pequena lâmina de vidro quadrada ou tampa em cima do pó.
- Com os dedos, esfregue suavemente as duas lâminas de vidro juntas para fazer um pó fino.
- Incline as lamínulas e posicione-as logo acima da grade do ETM no papel filtro e continue a esfregar as lamínulas juntas, apenas alguns centímetros acima da grade do ETM descarregado com brilho (Figura 1).
- Observe para ver se o pó está caindo em direção à grade. Descubra o pó finamente moído removendo uma das duas lamínulas de vidro. Escove suavemente o pó fino da lamínula usando um pedaço de papel de filtro na grade de ETM (Figura 1).
4. Aplicação da amostra às grelhas através da aplicação do método de "agitação" (método 2)
- Pegue uma grade usando uma pinça e solte-a no frasco ou tubo de amostra de pó. Feche o frasco para injetáveis utilizando a tampa de plástico para garantir que nenhum material escapará quando agitado.
- Agarrando o frasco na mão, agite o frasco para injetáveis de tal forma que o pó e a grelha se movam durante aproximadamente 10 a 30 s.
- Esvazie o conteúdo do frasco para injetáveis num papel de filtro circular. Agarrando a grade em uma borda, toque suavemente na borda da grade no papel de filtro para remover qualquer excesso de material da grade.
NOTA: Dependendo do tipo de frasco e tamanho, pode-se também usar pinças para remover a grade de ETM sem esvaziar o conteúdo.
5. Aplicação de amostra a grelhas utilizando o método de evaporação (método 3)
- Coloque uma grade (cortada ou não) no centro de um pedaço circular de papel filtro com o lado de carbono voltado para cima e o lado de cobre voltado para baixo.
- Usando uma seringa estanque ao gás de 10 μL, aplique uma pequena gota (aproximadamente 1 - 3 μL) de composto dissolvido no lado de carbono da grade.
- Mova suavemente o papel de filtro com grades para uma câmara de dessecação a vácuo. Tampe a câmara e ligue o vácuo. Deixe as grades sob vácuo para secar por até um dia.
- Desligue o vácuo e deixe a câmara ventilar por 5 min. A ventilação da câmara evita que as grades se movam ou voem para longe quando ela é descoberta.
6. Congelamento e carregamento de grades no ETM
- Pegue a borda da grade de ETM usando um conjunto de pinças, garantindo que as pontas não furem nenhum dos quadrados da grade. Levante a grade de 1 a 2 cm acima do papel filtro e incline a grade a 90° em relação ao papel abaixo. Bata suavemente na pinça enquanto mantém a grade firmemente pinçada para remover qualquer pó solto.
- Congele a grade movendo a ponta da pinça com a grade diretamente em um recipiente de nitrogênio líquido manualmente. Este recipiente é tipicamente a estação de carregamento de rede para o TEM, mas pode ser qualquer recipiente seguro, como uma garrafa térmica segura de nitrogênio líquido, é aceitável para transferência ou armazenamento. O nitrogênio líquido é de -196 °C.
- Espere até que a grade e a pinça parem de ferver antes de novas manipulações.
- Sob nitrogênio líquido ou em vapores de nitrogênio, coloque a grade no porta-amostras com o lado do carbono orientado de tal forma que a amostra será atingida pelo feixe antes do filme de suporte de carbono.
- Coloque o porta-amostras no MET garantindo que a grade seja mantida sempre a temperaturas de nitrogênio líquido.
- Para sistemas de carregador automático, coloque as grades cortadas em um em um recipiente refrigerado por nitrogênio líquido. Este é transferido para um contêiner de transporte que permite que a robótica do carregador automático aceite o, mantendo as amostras seguras para o transporte entre o carregador automático e a coluna.
- Para configurações de TEM de entrada lateral, fixe a grade a um suporte de TEM de entrada lateral comercial. Estes suportes têm um recipiente de preparação de amostra que é preenchido com azoto líquido para permitir a transferência da grelha para o suporte sem aquecer a amostra. O suporte de entrada lateral é inserido no MET diretamente com a amostra presa na extremidade.
7. Coleta de dados MicroED
- Localização e triagem de nanocristais
- Abra as válvulas da coluna TEM. Ajuste a ampliação usando os painéis manuais para a menor ampliação possível. Encontre o feixe ajustando o botão de intensidade nos painéis de mão de modo que uma área redonda e brilhante seja visível na tela fluorescente.
- Pegue um atlas de grade inteira em uma ampliação baixa (50 - 300x) usando um software apropriado14,15,16 (Figura 2). Certifique-se de que o microscópio esteja bem alinhado para imagens de baixa e alta ampliação antes de coletar dados MicroED de alta resolução.
- Identificar quadrados de grade sem carbono quebrado e ter um material/grãos pretos ou escuros visíveis no filme (Figura 2). Navegue pela grade, seja fisicamente usando o joystick nos painéis de mão, ou virtualmente no Atlas coletado, a fim de procurar quadrados de grade que não estejam quebrados e contenham microcristais.
- Adicione o centro de cada um desses quadrados a uma lista de locais de grade para investigação. Esses locais podem ser adicionados a um notebook, na interface do usuário do microscópio ou em um software de automação de microscópio.
- Aumente a ampliação para 500-1.300x e ajuste a altura eucêntrica em cada local de grade armazenado e atualize o valor Z salvo para as posições anotadas em 7.1.4.
- Pesquise na tela fluorescente ou em uma câmera rápida nesta ampliação mais alta para pequenos pontos pretos / grãos na grade. Uma boa amostra com frequência tem bordas afiadas em alta magnificação, sugerindo ordem cristalina.
- Mova um cristal potencial localizado para o centro da tela e aumente a ampliação de tal forma que o MET entre no modo de alta ampliação.
NOTA: Isso é conhecido como modo de alta ampliação, Zoom2 ou SA em diferentes instrumentos e normalmente corresponde a ampliações de 3.000x ou superiores. - Insira uma abertura de área selecionada. Mude a abertura para um tamanho maior ou menor para garantir que a área selecionada seja apenas maior que o cristal (Figura 3).
- Mude para o modo de difração pressionando o botão de difração nos painéis manuais de TEM, garantindo que a tela fluorescente seja inserida. Ajuste o comprimento da câmera usando o botão de ampliação de forma que a borda tenha pelo menos 1 Å de resolução.
NOTA: A calibração dos comprimentos de difração deve ser realizada por um engenheiro de serviço usando uma grade de waffle de ouro ou espécime conhecido antes de tentar experimentos MicroED. - Ajuste o foco de difração de forma que o ponto central seja o mais nítido e pequeno possível. Usando os botões de deslocamento de difração, mova o feixe central para o centro da tela fluorescente
- Insira a parada do feixe e certifique-se de que o feixe esteja atrás dele. Levante a tela fluorescente. Faça uma exposição curta (aproximadamente 1 s) na câmera (Figura 4).
- Inspecione o padrão de difração correspondente. Um bom candidato para coletar um conjunto de dados completo terá pontos nítidos que são regularmente organizados em colunas e linhas, e a difração se estenderá para além de 2 Å, de preferência pelo menos até 1 Å (Figura 4). Salve as coordenadas de cristal na interface do usuário do TEM ou anote-as.
- Repita a triagem de difração para todos os cristais potenciais de interesse no quadrado da grade atual.
- Recolha de dados
- Centralize um cristal blindado na tela em uma ampliação alta (> 1.000x). Ajuste a altura eucêntrica do cristal usando uma rotina automática ou manualmente.
- Insira a abertura de área selecionada que melhor se adapte ao tamanho e à forma do cristal, conforme determinado no ponto 7.1.8 (Figura 3). Incline o palco nas direções negativa e positiva até que a imagem seja ocluída pelas barras da grade (Figura 3). Observe esses ângulos para fins de coleta de dados.
- Determine o número de quadros que serão necessários para abranger a cunha angular total do conjunto de dados. É típico usar cunhas de 0,5 a 1,0° para cada quadro, com quadros sendo lidos a cada 1 a 5s, dependendo da sensibilidade da câmera. Por exemplo, uma cunha que se estende de -30° a +30°, girando a uma taxa constante de 1° s-1 com um quadro lido a cada 1s, exigiria 60 quadros totais.
- Considerando a faixa de inclinação total máxima de -72° a +72°, comece a girar o estágio a uma taxa constante de 1° s-1 e, em seguida, comece a ler os dados a cada 1s em uma câmera moderna com um modo de leitura do obturador rolante (Filme 1). Esse processo pode ser realizado manualmente ou por meio de softwares específicos para ETM.
- Defina a taxa de rotação especificando a % da velocidade máxima de inclinação e quando parar na interface do usuário do microscópio ou no software dedicado. Nesta investigação, isso foi medido como sendo 0,3° s-1 para cada % de velocidade máxima, mas precisará ser verificado independentemente para cada microscópio.
NOTA: A inclinação e a coleta de dados da câmera são configuradas independentemente aqui, mas os programas de software14 podem coordenar isso para simplificar o processo. - Descarte aproximadamente 1° de cada lado da cunha especificada na maioria dos casos como tempo morto, onde o estágio está aumentando ou diminuindo para a velocidade de rotação desejada.
- Defina a taxa de rotação especificando a % da velocidade máxima de inclinação e quando parar na interface do usuário do microscópio ou no software dedicado. Nesta investigação, isso foi medido como sendo 0,3° s-1 para cada % de velocidade máxima, mas precisará ser verificado independentemente para cada microscópio.
- Salve dados em vários formatos como quadros individuais ou como uma pilha de imagens (Filme 1).
- Converta esses quadros de difração para um formato cristalográfico típico usando ferramentas MicroED - disponíveis aqui (https://cryoem.ucla.edu). Imagens de difração salvas em formato SMV são prontamente processadas usando software cristalográfico documentado17,18.
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Representative Results
O MicroED é um método crioEM que aproveita as fortes interações entre elétrons e matéria, o que permite a investigação de cristais pequenosque desaparecem12,13. Após essas etapas, espera-se ter um filme de difração em formato cristalográfico coletado de microcristais (Filme 1). Aqui, a técnica é demonstrada com o uso da carbamazepina12. Os resultados mostram um conjunto de dados MicroED de rotação contínua a partir de um microcristal de carbamazepina identificado em uma grade de MET (Filme 1). Um bom conjunto de dados tem pontos fortes e claros que não são manchados ou divididos, e tem apenas uma única rede em cada quadro que pode ser facilmente seguida ao percorrer o filme19. Esses dados são facilmente indexados, integrados e dimensionados usando o software padrão de cristalografia de raios X4. Manchas divididas podem ser vistas a partir de um cristal que foi rachado, e duas orientações do mesmo cristal estão intimamente alinhadas, mas não exatamente coincidentes19. Múltiplas redes também podem ocorrer, particularmente para esses cristais de moléculas pequenas, onde vários cristais individuais ficaram presos em um aglomerado na grade. Outro cenário comum ocorre quando os cristais foram congelados incorretamente ou tratados de forma muito severa durante a fragmentação, e nenhuma difração é observada9.
Após a coleta de dados, integração e solução da estrutura, espera-se que uma estrutura de alta resolução seja determinada (Figura 5). A obtenção de uma solução de estrutura clara dependerá, em última análise, da qualidade e integridade dos dados.
Figura 1: Preparação de uma grade de MET pré-recortada para investigação de moléculas pequenas . (A) Um tubo com uma pequena porção de amostra para investigação. (B) Amostra triturada entre duas lâminas de microscópio. (C) O lado carbono da grade pré-cortada e (D) o lado de cobre da grade pré-cortada. (E) Uma grade de ETM pré-cortada após o pó triturado ter sido jogado sobre ela. Barras de escala de 3mm em (C), (D) e (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de cristais de pequenas moléculas no MET . (A) Um atlas ou montagem em toda a grade em baixa ampliação. (B) Uma única imagem de baixa magnificação usada para triagem. (C) Imagem de maior magnificação utilizada para identificar grãos menores. (D) Micrografia de alta magnificação de um cristal de pequena molécula aglomerado. Barra de escala de 750 μm em (A), 50 μm em (B), 10 μm em (C), 1 μm em (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Triagem e alinhamento de microcristais para coleta de dados de MicroDE . (A) Micrografia de alta magnificação de um microcristal. (B) Micrografia do cristal isolado dentro da abertura da área selecionada. (C) O mesmo microcristal na abertura com o estágio inclinado a -69°. Barra de escala de 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de dados MicroED (A) dados MicroED de alta qualidade com pontos claros e nítidos adequados para a determinação de estruturas de alta resolução. (B) Dados de MicroED fracos e manchados com definição de rede pobre. Neste exemplo, o alinhamento também está desativado, de modo que a difração só é aparente em um lado da imagem (C) Dados microED pobres mostrando várias redes e pontos divididos e/ou manchados. Inset de área azul reforçada no canto inferior direito mostrando manchas divididas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Estrutura MicroED da Carbamazepina. Modelo atômico mostrado como varas com átomos de carbono coloridos de branco, vermelho oxigênio e azul nitrogênio. O mapa 2Fo-F c é contornado no nível de 1,5 σ e colorido em azul. O mapa Fo-F c mostrando hidrogênios é contornado no nível 3.0 σ e colorido de verde. Esta figura foi adaptada dos mapas depositados do EMDB-928410. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Conjunto de dados MicroED da carbamazepina. O conjunto de dados abrange quase 90°, de -68° a +20°. Cada padrão de difração abrange uma cunha de 0,5° no espaço recíproco e corresponde a uma exposição de 1s a uma taxa de exposição de 0,01 e- Å-2 s-1. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
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Discussion
A preparação da amostra é tipicamente um processo iterativo, onde as otimizações são feitas após sessões de triagem e coleta de dados. Para amostras de moléculas pequenas, muitas vezes é prudente tentar primeiro a preparação da grade sem descarga de brilho das grades, uma vez que muitos fármacos tendem a ser hidrofóbicos10,11. Se as grades tiverem poucos depósitos nanocristalinos, é uma boa ideia tentar novamente após a primeira descarga de brilho das grades. Pode ser o caso de os cristais de pós liofilizados serem muito grandes e espessos para coletar bons dados. Nesses casos, pode ser possível coletar dados de uma borda ou parte mais fina de um cristal maior. Se isso for difícil, pode ser necessário moer o pó até uma consistência mais fina usando uma superfície mais áspera, como argamassa e pilão.
Os dados de microED são tipicamente coletados com o ETM operando em modo de microssonda 4,20. Aqui, o tamanho do feixe de MET que corresponde a uma taxa de exposição de 0,01 e-Å-2 s-1 é tipicamente em torno de 10 μm de diâmetro, que é muito maior do que os microcristais típicos 1,21. O sinal é então isolado dos cristais de interesse usando uma abertura de área selecionada (Figura 3)2,20. Vários tamanhos de abertura permitem o ajuste rápido da configuração para tamanhos variados de cristais. Alternativamente, é possível coletar dados com o MET operando no modo nano probe. Isso reduz o tamanho do feixe em aproximadamente um fator de 5. Um feixe menor corresponde a uma taxa de exposição proporcionalmente maior na pegada do feixe. Como muitos TEMs são dois sistemas de lentes condensadoras, a condição paralela ditará que o feixe seja de tamanho único no modo microssonda ou nanossonda. Atingir uma taxa de exposição de 0,01 e-Å-2 s-1 em nano sonda sem ajustar a lente da pistola é um desafio. A escolha entre os dois cabe ao usuário. Uma vantagem da nanossonda é que há menos necessidade de inserir e retrair a abertura da área selecionada entre a triagem nos modos de imagem e difração de operação. No entanto, com microscópios modernos a inserção e retração da abertura SA é automática e precisa. A microssonda oferece maior flexibilidade no isolamento da difração por ter acesso a vários tamanhos de aberturas de área selecionadas. O feixe maior na microssonda também pode expor cristais próximos, enquanto a nanosonda pode atingir com mais precisão cristais individuais.
O protocolo apresentado é a abordagem padrão para coleta de dados de MicroED para pequenas moléculas utilizadas em nosso laboratório10,11,12,13. Há muitas adaptações e modificações que poderiam ser implementadas. A melhor abordagem para fazer grades com alta densidade de cristais é mais dependente da familiaridade do usuário com uma determinada abordagem. Há muitos casos em que as drogas estão presentes como grandes cristais que são frágeis demais para se fragmentarem fisicamente sem perder o poder difratante19. Nestes casos, o método recentemente adaptado de moagem focalizada por feixe iônico para afinar os cristais para torná-los mais acessíveis ao MicroED 6,7,8,9,22.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O laboratório Gonen é apoiado por fundos do Howard Hughes Medical Institute. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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