Summary
Här beskriver vi de procedurer som utvecklats i vårt laboratorium för framställning av pulver av småmolekylära kristaller för mikrokristallelektrondiffraktion (MicroED) experiment.
Abstract
Ett detaljerat protokoll för beredning av småmolekylära prover för mikrokristallelektrondiffraktionsexperiment (MicroED) beskrivs. MicroED har utvecklats för att lösa strukturer av proteiner och små molekyler med hjälp av standard elektronkryomikroskopi (kryo-EM) utrustning. På detta sätt har små molekyler, peptider, lösliga proteiner och membranproteiner nyligen bestämts till höga upplösningar. Protokoll presenteras här för att förbereda galler av småmolekylära läkemedel med läkemedlet karbamazepin som exempel. Protokoll för screening och insamling av data presenteras. Ytterligare steg i den övergripande processen, till exempel dataintegrering, strukturbestämning och förfining presenteras på annat håll. Den tid som krävs för att förbereda småmolekylära nät uppskattas till mindre än 30 minuter.
Introduction
Mikrokristallelektrondiffraktion (MicroED) är en elektronkryomikroskopimetod (kryo-EM) för bestämning av atomupplösningsstrukturer från submikrometerstora kristaller 1,2. Kristaller appliceras på standardtransmissionselektronmikroskop (TEM) galler och fryses genom att antingen kasta sig i flytande etan eller flytande kväve. Galler laddas sedan i en TEM som arbetar vid kryogena temperaturer. Kristaller är placerade på gallret och screenade för initial diffraktionskvalitet. Kontinuerlig rotation MicroED-data samlas in från en delmängd av de skärmade kristallerna, där data sparas med hjälp av en snabb kamera som en film3. Dessa filmer konverteras till ett standardkristallografiskt format och bearbetas nästan identiskt som ett röntgenkristallografiexperiment4.
MicroED utvecklades ursprungligen för att undersöka proteinmikrokristaller 1,2. En flaskhals inom proteinkristallografi växer stora, välordnade kristaller för traditionella synkrotronröntgendiffraktionsexperiment. Eftersom elektroner interagerar med materieordningar som är starkare än röntgenstrålar är begränsningarna för kristallstorleken som behövs för att producera detekterbar diffraktion betydligt mindre5. Dessutom är förhållandet mellan elastiska och oelastiska spridningshändelser mer gynnsamt för elektroner, vilket tyder på att mer användbara data kan samlas in med en mindre total exponering5. Konstant utveckling har gjort det möjligt att samla in MicroED-data från de mest utmanande mikrokristallerna 6,7,8,9.
Nyligen har MicroED visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att bestämma strukturerna för småmolekylära läkemedel från uppenbarligen amorfa material 10,11,12,13. Dessa pulver kan komma direkt från en flaska köpt reagens, en reningskolonn eller till och med från att krossa ett piller till ett fint pulver10. Dessa pulver verkar amorfa för ögat, men kan antingen helt bestå av nanokristaller eller bara innehålla spårmängder av nanokristallina avlagringar i en större icke-kristallin, amorf fraktion. Applicering av materialet på nätet är enkelt, och de efterföljande stegen för kristallidentifiering, screening och datainsamling kan till och med automatiseras inom en snar framtid14. Medan andra kan använda olika metoder för provberedning och datainsamling, beskrivs här de protokoll som utvecklats och används i Gonen-laboratoriet för att förbereda prover av små molekyler för MicroED och för datainsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av småmolekylära prover
- Överför en liten mängd (0,01 - 1 mg) pulver, vätska eller fasta ämnen till en liten injektionsflaska eller slang.
- För prover som redan är i pulverform, försegla röret med locket tills provet behövs. Torka vätskeproverna till pulver före försök med metod 1 (steg 3) eller 2 (steg 4).
OBS: Prover upplösta i vätska kan använda metod 3 (5.X) nedan
2. Förbereda TEM-nät
Vissa TEM med autoladdare kräver att gallren klipps av och placeras i en kassett innan de laddas i TEM-kolonnen. Klippning innebär att fysiskt säkra 3 mm TEM-gallret i en metallring som autoladdaren kan manipulera. Det här steget och efterföljande steg kan utföras med antingen normala TEM-rutnät eller TEM-rutnät som har klippts bort. För dessa experiment är det ofta lättare att manipulera rutnäten om de har klippts i förväg.
- Vik plastfilm runt ena änden av ett glaslock.
- Placera TEM-gallren på filmen på ovansidan av lockbilden med kolfibersidan uppåt. Identifiera de två sidorna av rutnätet under ett ljus. Kopparsidan lyser och verkar metallisk, medan kolsidan verkar ha en tråkig, brun färg (figur 1C, D). För klippta rutnät ska kolfibersidan vara vänd mot klippringens plana yta.
- Placera glidbanan med galler i glödutloppskammaren. Glöd urladdar locket i cirka 30 sekunder med negativ inställning vid 15 pA. Förvara gallren på omslaget inuti en petriskål av glas fodrad med filterpapper innan du lägger provet till gallret.
3. Applicering av provet på galler genom att skapa ett homogent fint pulver (metod 1)
- Ta bort ett glödurladdat TEM-galler från den täckta petriskålen med pincett. Placera gallret på ett cirkulärt filterpapper med kolsidan uppåt.
- Ta med en liten spatel bort en mycket liten skopa pulver (ca 0,1 mg) och placera den på ett litet, fyrkantigt glastäcke precis bredvid TEM-gallret på filterpapperet. Placera en annan liten fyrkantig glasskiva eller täckglas ovanpå pulvret.
- Gnid försiktigt de två glasskivorna med fingrarna för att göra ett fint pulver.
- Vinkla täckglasen och placera dem precis ovanför det tvärgående elektromagnetiska rutnätet på filterpapperet och fortsätt att gnugga ihop täckglasen, bara några cm ovanför det glödurladdade TEM-gallret (figur 1).
- Observera om pulvret faller mot gallret. Avtäck det finmalda pulvret genom att ta bort ett av de två glaslocken. Borsta försiktigt bort det fina pulvret från täckglaset med en bit filterpapper på TEM-gallret (figur 1).
4. Applicera prov på rutnät genom att använda "skakningsmetoden" (metod 2)
- Ta ett galler med en pincett och släpp det i injektionsflaskan eller röret med pulverprov. Stäng injektionsflaskan med plastlocket för att säkerställa att inget material läcker ut när det skakas.
- Ta tag i injektionsflaskan i handen och skaka injektionsflaskan så att både pulvret och gallret rör sig i cirka 10-30 sekunder.
- Töm injektionsflaskans innehåll på ett runt filterpapper. Ta tag i gallret på en kant och knacka försiktigt på rutnätskanten på filterpapperet för att ta bort överflödigt material från gallret.
OBS: Beroende på typ av injektionsflaska och storlek kan man också använda pincett för att ta bort TEM-gallret utan att tömma innehållet.
5. Applicering av provet på galler med indunstningsmetoden (metod 3)
- Placera ett rutnät (klippt eller inte) på mitten av ett cirkulärt filterpapper med kolsidan uppåt och kopparsidan nedåt.
- Använd en 10 μL gastät spruta och applicera en liten droppe (ca 1 - 3 μL) upplöst förening på kolsidan av gallret.
- Flytta försiktigt filterpapperet med galler till en vakuumtorkningskammare. Täck kammaren och sätt på vakuumet. Låt gallren stå under vakuum för att torka i upp till en dag.
- Stäng av vakuumet och låt kammaren ventilera i 5 minuter. Genom att ventilera kammaren undviker man att gallren rör sig eller flyger iväg när den är avtäckt.
6. Frysning och påfyllning av galler i det totala driftskompatibilitetsmåttet
- Ta tag i kanten på TEM-rutnätet med en pincett och se till att spetsarna inte punkterar någon av rutnätrutorna. Lyft gallret 1 - 2 cm ovanför filterpapperet och vinkla gallret 90° mot papperet nedanför. Knacka försiktigt på pincetten medan du håller gallret ordentligt pincett för att ta bort eventuellt löst pulver.
- Frys gallret genom att flytta pincettspetsen med gallret direkt i en behållare med flytande kväve för hand. Denna behållare är vanligtvis nätladdningsstationen för TEM, men kan vara vilken säker behållare som helst, såsom en flytande kvävesäker termos, är acceptabel för överföring eller lagring. Flytande kväve är -196 °C.
- Vänta tills gallret och pincetten slutar koka innan ytterligare manipuleringar.
- Under flytande kväve eller i kväveångor, placera gallret i provhållaren med kolsidan orienterad så att provet kommer att träffas av strålen före kolbärarfilmen.
- Fyll provhållaren i det tvärgående elektromagnetiska underlaget och se till att gallret alltid hålls vid flytande kvävetemperaturer.
- För autoloader-system, placera de klippta gallren i en kassett i en flytande kvävekyld behållare. Denna kassett överförs till en skyttelbehållare än tillåter autoloader robotik att acceptera kassetten samtidigt som proverna hålls säkra för skytteltrafik mellan autoloader och kolonnen.
- För TEM-inställningar med sidoingång, säkra nätet på en kommersiell TEM-hållare med sidoingång. Dessa innehavare har en provberedningsbehållare som är fylld med flytande kväve för att tillåta överföring av gallret till hållaren utan att värma provet. Sidoingångshållaren sätts in i TEM direkt med provexemplaret säkrat i slutet.
7. Insamling av MicroED-data
- Lokalisering och screening av nanokristaller
- Öppna TEM-kolonnventilerna. Justera förstoringen med hjälp av handpanelerna till lägsta möjliga förstoring. Hitta strålen genom att justera intensitetsknappen på handpanelerna så att ett runt, ljust område syns på lysrörsskärmen.
- Ta en atlas med alla rutnät med låg förstoring (50 - 300x) med lämplig programvara14,15,16 (figur 2). Se till att mikroskopet är väl anpassat för både låg och hög förstoringsavbildning innan du samlar in högupplösta MicroED-data.
- Identifiera rutnätsrutor utan brutet kol och ha ett synligt svart eller mörkt material/korn på filmen (figur 2). Navigera runt rutnätet, antingen fysiskt med joysticken på handpanelerna, eller virtuellt på den samlade Atlas, för att söka efter rutnätrutor som inte är trasiga och innehåller mikrokristaller.
- Lägg till mitten av var och en av dessa rutor i en lista över rutnätsplatser för undersökning. Dessa platser kan läggas till i en anteckningsbok, i mikroskopets användargränssnitt eller i mikroskopautomatiseringsprogram.
- Öka förstoringen till 500-1 300x och justera den eucentriska höjden vid varje lagrad rutnätsplats och uppdatera det sparade Z-värdet till de positioner som anges i 7.1.4.
- Sök antingen på den fluorescerande skärmen eller på en snabb kamera med denna högre förstoring efter små svarta fläckar / korn på rutnätet. Ett bra prov med ofta skarpa kanter vid hög förstoring, vilket tyder på kristallin ordning.
- Flytta en placerad potentiell kristall till mitten av skärmen och öka förstoringen så att TEM går in i högt förstoringsläge.
OBS: Detta kallas antingen hög förstoring, Zoom2 eller SA-läge på olika instrument och motsvarar vanligtvis förstoringar på 3 000x eller högre. - Infoga en markerad områdesbländare. Ändra bländaren till en större eller mindre storlek för att säkerställa att det valda området bara är större än kristallen (bild 3).
- Växla till diffraktionsläge genom att trycka på diffraktionsknappen på TEM-handpanelerna och försäkra dig om att lysröret är isatt. Justera kameralängden med förstoringsknappen så att kanten har minst 1 Å upplösning.
OBS: Kalibrering av diffraktionslängderna bör utföras av en servicetekniker med hjälp av ett guldvåffelgaller eller känt prov innan man försöker med MicroED-experiment. - Justera diffraktionsfokus så att den centrala punkten är så skarp och liten som möjligt. Använd diffraktionsväxelknapparna och flytta mittstrålen till mitten av lysröret
- Sätt i strålstoppet och se till att strålen är bakom den. Lyft den fluorescerande skärmen. Ta en kort (cirka 1 s) exponering på kameran (bild 4).
- Kontrollera motsvarande diffraktionsmönster. En bra kandidat för att samla in en fullständig datamängd kommer att ha skarpa fläckar som regelbundet ordnas i kolumner och rader, och diffraktionen kommer att sträcka sig till över 2 Å, helst minst till 1 Å (figur 4). Spara kristallkoordinaterna antingen i TEM-användargränssnittet eller genom att skriva ner dem.
- Upprepa diffraktionsscreening för alla potentiella kristaller av intresse på den aktuella rutnätsrutan.
- Datainsamling
- Centrera en skärmad kristall på skärmen med hög förstoring (> 1 000x). Justera kristallens eucentriska höjd med antingen en automatisk rutin eller för hand.
- Sätt in den valda områdesöppning som bäst passar kristallens storlek och form enligt 7.1.8 (bild 3). Luta scenen i negativ och positiv riktning tills bilden täcks av rutnätsstaplarna (bild 3). Observera dessa vinklar för datainsamlingsändamål.
- Fastställ antalet bildrutor som krävs för att sträcka sig över datauppsättningens totala vinkelkil. Det är typiskt att använda kilar på 0,5 - 1,0° för varje bildruta, med bildrutor som läses upp var 1:e till 5:e sekund beroende på kamerans känslighet. Till exempel skulle en kil som sträcker sig från -30 ° till + 30 °, som roterar med en konstant hastighet av 1 ° s-1 med en ram som läses ut var 1: e, kräva 60 ramar totalt.
- Med tanke på det maximala totala lutningsområdet -72° till +72°, börja rotera scenen med en konstant hastighet av 1° s-1 och börja sedan läsa ut data var 1:e sekund på en modern kamera med rullande slutaravläsningsläge (Film 1). Denna process kan utföras manuellt eller med hjälp av TEM-specifik programvara.
- Ställ in rotationshastigheten genom att ange % av den maximala lutningshastigheten och när den ska stanna i mikroskopets användargränssnitt eller dedikerad programvara. I denna undersökning uppmättes detta till 0,3 ° s-1 för varje % av högsta hastighet men måste verifieras oberoende för varje mikroskop.
OBS: Lutnings- och kameradatainsamlingen ställs in oberoende här, men program14 kan samordna detta för att förenkla processen. - Kassera ungefär 1° på vardera sidan av den angivna kilen i de flesta fall som dödtid, där steget antingen ökar eller saktar ner till önskad rotationshastighet.
- Ställ in rotationshastigheten genom att ange % av den maximala lutningshastigheten och när den ska stanna i mikroskopets användargränssnitt eller dedikerad programvara. I denna undersökning uppmättes detta till 0,3 ° s-1 för varje % av högsta hastighet men måste verifieras oberoende för varje mikroskop.
- Spara data i olika format, antingen som enskilda bildrutor eller som en bunt bilder (Film 1).
- Konvertera dessa diffraktionsramar till ett typiskt kristallografiskt format med hjälp av MicroED-verktyg -tillgängliga här (https://cryoem.ucla.edu). Diffraktionsbilder som sparas i SMV-format bearbetas enkelt med dokumenterad kristallografisk programvara17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MicroED är en kryoEM-metod som utnyttjar de starka interaktionerna mellan elektroner och materia, vilket möjliggör undersökning av försvinnande små kristaller12,13. Efter dessa steg förväntas den ha en diffraktionsfilm i kristallografiskt format som samlats in från mikrokristaller (film 1). Här demonstreras tekniken med karbamazepin12. Resultaten visar en kontinuerlig rotation MicroED dataset från en karbamazepin mikrokristall identifierad på ett TEM-rutnät (Film 1). Ett bra dataset har starka, tydliga fläckar som inte är utsmetade eller delade, och har bara ett enda gitter på varje bildruta som enkelt kan följas genom att gå igenom filmen19. Dessa data indexeras, integreras och skalas enkelt med hjälp av standard röntgenkristallografiprogramvara4. Delade fläckar kan ses från en kristall som har knäckts, och två orienteringar av samma kristall är nära inriktade, men inte riktigt sammanfallande19. Flera gitter kan också förekomma, särskilt för dessa småmolekylära kristaller, där flera enskilda kristaller har fastnat ihop i en klump på gallret. Ett annat vanligt scenario inträffar där kristallerna har frysts felaktigt eller behandlats för hårt under fragmentering, och ingen diffraktion observeras9.
Efter datainsamling, integration och strukturlösning förväntas en högupplöst struktur bestämmas (figur 5). Att få en tydlig strukturlösning beror i slutändan på dataens kvalitet och fullständighet.
Figur 1: Beredning av ett förklippt TEM-rutnät för undersökning av små molekyler . a) Ett rör med en liten del prov för undersökning. (B) Krossat prov mellan två objektglas. (C) Kolsidan av det förklippta gallret och (D) kopparsidan av det förklippta gallret. (E) Ett förklippt TEM-rutnät efter det att det krossade pulvret har tappats på det. Skalstänger 3 mm i (C), (D) och (E). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Identifiering av småmolekylära kristaller i TEM . (A) En atlas eller montage för alla rutnät vid låg förstoring. (B) En enda bild med låg förstoring som används för screening. (C) Högre förstoringsbild som används för att identifiera mindre korn. (D) Hög förstoringsmikrografi av en klumpad småmolekylär kristall. Skalstapel 750 μm in (A), 50 μm in (B), 10 μm in (C), 1 μm in (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Screening och inriktning av mikrokristaller för datainsamling med MicroED. (A) Mikrografi med hög förstoring av en mikrokristall. (B) Mikrografi av den isolerade kristallen inom det valda områdets öppning. (C) Samma mikrokristall i bländaren med steget lutat till -69 °. Skalstänger alla 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på MicroED-data . a) Högkvalitativa MicroED-data med tydliga, skarpa fläckar lämpliga för högupplöst strukturbestämning. (B) Svaga, utsmetade MicroED-data med dålig gitterdefinition. I det här exemplet är justeringen också avstängd så att diffraktionen bara är synlig på ena sidan av bilden (C) Dåliga MicroED-data som visar flera gitter och delade och / eller utsmetade fläckar. Infällt blått område förstärkt längst ner till höger som visar utsmetade, delade fläckar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: MikroED-struktur av karbamazepin. Atommodell visas som pinnar med kolatomer färgade vita, syreröda och kväveblå. 2Fo-F c-kartan är konturerad på 1,5 σ nivå och färgad blå. Fo-F c-kartan som visar väten är konturerad på 3,0 σ nivå och färgad grön. Denna siffra anpassades från de deponerade kartorna i EMDB-928410. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Film 1: MicroED-datauppsättning från karbamazepin. Datasetet sträcker sig över nästan 90°, från -68° till +20°. Varje diffraktionsmönster spänner över en kil på 0,5° i det ömsesidiga rummet och motsvarar en exponering på 1s vid en exponeringshastighet på 0,01 e- Å-2 s-1. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Provberedning är vanligtvis en iterativ process där optimeringar görs efter sessioner med screening och datainsamling. För småmolekylära prover är det ofta klokt att först försöka förbereda galler utan att lysa ur gallren, eftersom många läkemedel tenderar att vara hydrofoba10,11. Om gallren har för få nanokristallina avlagringar är det en bra idé att försöka igen efter att näten först glödtömts. Det kan vara så att kristallerna från frystorkade pulver är för stora och tjocka för att samla in bra data. I dessa fall kan det vara möjligt att samla in data från en kant eller tunnare del av en större kristall. Om detta visar sig vara svårt kan det vara nödvändigt att mala pulvret till en finare konsistens med en grövre yta, såsom en mortel och stöt.
MikroED-data samlas vanligtvis in med TEM i mikrosondläge 4,20. Här är storleken på TEM-strålen som motsvarar en exponeringshastighet på 0,01 e- Å-2 s-1 typiskt cirka 10 μm i diameter, vilket är mycket större än de typiska mikrokristallerna 1,21. Signalen isoleras sedan från kristallerna av intresse med hjälp av en vald områdesöppning (figur 3)2,20. Olika bländarstorlekar möjliggör snabb justering av inställningen till olika storlekar av kristaller. Alternativt är det möjligt att samla in data med TEM som arbetar i nanosondläge. Detta minskar strålens storlek med ungefär en faktor 5. En mindre stråle motsvarar en proportionellt högre exponeringshastighet i strålfotavtrycket. Eftersom många TEM är två kondensorlinssystem, kommer det parallella tillståndet att diktera att strålen är en enda storlek i antingen mikrosond- eller nanosondläge. Att nå en exponeringshastighet på 0,01 e-Å-2 s-1 i nanosond utan att justera pistollinsen är utmanande. Valet mellan de två är upp till användaren. En fördel med nanosond är att det finns mindre behov av att infoga och dra in den valda områdesöppningen mellan screening i bild- och diffraktionslägen. Men med moderna mikroskop är insättning och indragning av SA-bländaren automatisk och korrekt. Microprobe erbjuder större flexibilitet vid isolering av diffraktion genom att ha tillgång till flera storlekar av utvalda områdesöppningar. Den större strålen i mikrosond kan också exponera närliggande kristaller, medan nanosond mer exakt kan rikta sig mot enskilda kristaller.
Det presenterade protokollet är standardmetoden för MicroED-datainsamling för små molekyler som används i vårt laboratorium10,11,12,13. Det finns många anpassningar och modifieringar som kan genomföras. Det bästa sättet att göra galler med hög kristalldensitet är mest beroende av användarens förtrogenhet med ett givet tillvägagångssätt. Det finns många fall där droger är närvarande som stora kristaller som är för ömtåliga för att fysiskt fragmenteras utan att förlora diffracting kraft19. I dessa fall har den nyligen anpassade metoden för fokuserad jonstrålefräsning förtunnat kristallerna för att göra dem mer tillgängliga för MicroED 6,7,8,9,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Gonens laboratorium stöds av medel från Howard Hughes Medical Institute. Denna studie stöddes av National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T.
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
