Summary
Her beskriver vi de procedurer, der er udviklet i vores laboratorium til fremstilling af pulvere af små molekylekrystaller til mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) eksperimenter.
Abstract
En detaljeret protokol til fremstilling af små molekyleprøver til mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) eksperimenter er beskrevet. MicroED er udviklet til at løse strukturer af proteiner og små molekyler ved hjælp af standard elektronkryomikroskopi (cryo-EM) udstyr. På denne måde er små molekyler, peptider, opløselige proteiner og membranproteiner for nylig blevet bestemt til høje opløsninger. Protokoller præsenteres her til fremstilling af gitter af småmolekylære lægemidler ved hjælp af lægemidlet carbamazepin som et eksempel. Protokoller til screening og indsamling af data præsenteres. Yderligere trin i den overordnede proces, såsom dataintegration, strukturbestemmelse og forfining, præsenteres andetsteds. Den tid, det tager at forberede de små molekyler, anslås at være mindre end 30 min.
Introduction
Mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) er en elektronkryomikroskopi (cryo-EM) metode til bestemmelse af atomopløsningsstrukturer fra krystalleri submikrometerstørrelse 1,2. Krystaller påføres standard transmissionselektronmikroskop (TEM) gitter og fryses ved enten at kaste sig ned i flydende ethan eller flydende nitrogen. Gitre indlæses derefter i en TEM, der arbejder ved kryogene temperaturer. Krystaller er placeret på gitteret og screenet for indledende diffraktionskvalitet. Kontinuerlig rotation MicroED-data indsamles fra en delmængde af de screenede krystaller, hvor dataene gemmes ved hjælp af et hurtigt kamera som en film3. Disse film konverteres til et standard krystallografisk format og behandles næsten identisk som et røntgenkrystallografieksperiment4.
MicroED blev oprindeligt udviklet til at undersøge proteinmikrokrystaller 1,2. En flaskehals i proteinkrystallografi vokser store, velordnede krystaller til traditionelle synkrotron røntgendiffraktionseksperimenter. Da elektroner interagerer med stofstørrelsesordener stærkere end røntgenstråler, er begrænsningerne af krystalstørrelsen, der er nødvendige for at producere detekterbar diffraktion, betydeligt mindre5. Derudover er forholdet mellem elastiske og uelastiske spredningshændelser mere gunstigt for elektroner, hvilket tyder på, at mere nyttige data kan indsamles med en mindre samlet eksponering5. Konstant udvikling har gjort det muligt at indsamle MicroED-data fra de mest udfordrende mikrokrystaller 6,7,8,9.
For nylig har MicroED vist sig at være et kraftfuldt værktøj til bestemmelse af strukturerne af lægemidler med små molekyler fra tilsyneladende amorfe materialer10,11,12,13. Disse pulvere kan komme direkte fra en flaske købt reagens, en rensningskolonne eller endda fra at knuse en pille til et fint pulver10. Disse pulvere forekommer amorfe med øjet, men kan enten være helt sammensat af nanokrystaller eller blot indeholde spormængder af nanokrystallinske aflejringer i en større ikke-krystallinsk, amorf fraktion. Anvendelse af materialet på gitteret er let, og de efterfølgende trin med krystalidentifikation, screening og dataindsamling kan endda automatiseres i den nærmeste fremtid14. Mens andre kan bruge forskellige metoder til prøveforberedelse og dataindsamling, er de protokoller, der er udviklet og anvendt i Gonen-laboratoriet til forberedelse af prøver af små molekyler til MicroED og til dataindsamling, detaljeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af prøver af små molekyler
- Overfør en lille mængde (0,01 - 1 mg) pulver, væske eller faste stoffer til et lille hætteglas eller rør.
- For prøver, der allerede er i pulverform, forsegles røret med hætten, indtil prøven skal bruges. Væskeprøverne tørres i pulvere forud for forsøg på metode 1 (trin 3) eller 2 (trin 4).
BEMÆRK: Prøver opløst i væske kan anvende metode 3 (5.X) nedenfor
2. Forberedelse af TEM-net
BEMÆRK: Nogle TEM'er med autoloader-systemer kræver, at gitterene klippes og placeres i en kassette, inden de indlæses i TEM-kolonnen. Klipning involverer fysisk fastgørelse af 3 mm TEM-gitteret i en metalring, som autoloaderen kan manipulere. Dette trin og efterfølgende trin kan udføres ved hjælp af enten normale TEM-gitre eller TEM-gitre, der er blevet klippet. For disse eksperimenter er det ofte lettere at manipulere gitterene, hvis de er blevet klippet på forhånd.
- Sæt plastfilm rundt om den ene ende af et glasdæksel.
- Placer TEM-gitterene på filmen øverst på dækselglasset med kulstofsiden opad. Identificer de to sider af gitteret under et lys. Kobbersiden skinner og fremstår metallisk, mens kulstofsiden fremstår som en trist, brun farve (figur 1C, D). For klippede gitre skal kulstofsiden vende mod klipringens flade overflade.
- Placer diaset med gitter i glødudladningskammeret. Glød aflad dækslet i ca. 30 sek. ved hjælp af den negative indstilling ved 15 pA. Opbevar ristene på dækselsglasset inde i en petriskål af glas beklædt med filterpapir, inden der tilsættes prøve til ristene.
3. Anvendelse af prøve på gitre ved fremstilling af et homogent fint pulver (metode 1)
- Fjern et glødudledt TEM-gitter fra den overdækkede petriskål ved hjælp af pincet. Placer gitteret på et cirkulært filterpapir med kulstofsiden opad.
- Brug en lille spatel til at fjerne en meget lille skefuld pulver (ca. 0,1 mg) og læg den på en lille, firkantet glasdæksel lige ved siden af TEM-gitteret på filterpapiret. Placer et andet lille firkantet glasglas eller dæksel oven på pulveret.
- Gnid forsigtigt de to glasglas sammen med fingrene for at lave et fint pulver.
- Vinkl dæksedlerne, og placer dem lige over TEM-gitteret på filtrerpapiret, og fortsæt med at gnide dæksedlerne sammen, kun få cm over det glødafladede TEM-gitter (figur 1).
- Hold øje med, om pulveret falder mod gitteret. Afdæk det fintmalede pulver ved at fjerne en af de to glasdæksler. Børst forsigtigt det fine pulver af dæksedlen med et stykke filtrerpapir på TEM-gitteret (figur 1).
4. Anvendelse af prøve på gitre ved anvendelse af "rystemetoden" (metode 2)
- Tag et gitter ved hjælp af en pincet og slip det i hætteglasset eller røret med pulverprøven. Luk hætteglasset med plastikhætten for at sikre, at intet materiale slipper ud, når det rystes.
- Tag hætteglasset i hånden, ryst hætteglasset, så pulveret og gitteret begge bevæger sig i ca. 10 - 30 sekunder.
- Tøm hætteglassets indhold på et cirkulært filtrerpapir. Tag fat i gitteret på en kant, og bank let på gitterkanten på filterpapiret for at fjerne overskydende materiale fra gitteret.
BEMÆRK: Afhængigt af hætteglassets type og størrelse kan man også bruge en pincet til at fjerne TEM-gitteret uden at tømme indholdet.
5. Anvendelse af prøve på gitre ved hjælp af fordampningsmetoden (metode 3)
- Placer et gitter (klippet eller ej) på midten af et cirkulært stykke filterpapir med kulstofsiden opad og kobbersiden nedad.
- Brug en 10 μL gastæt sprøjte til at påføre en lille dråbe (ca. 1 - 3 μL) opløst forbindelse på kulstofsiden af gitteret.
- Flyt forsigtigt filterpapiret med gitter ind i et vakuumudtørringskammer. Dæk kammeret og tænd vakuumet. Lad gitterene stå under vakuum for at tørre i op til en dag.
- Sluk for støvsugeren, og lad kammeret udlufte i 5 min. Udluftning af kammeret undgår, at gitterene bevæger sig eller flyver væk, når det afdækkes.
6. Frysning og påfyldning af gitre i TEM
- Tag fat i kanten af TEM-gitteret ved hjælp af en pincet, og sørg for, at spidserne ikke punkterer nogen af gitterfirkanterne. Løft risten 1 - 2 cm over filtrerpapiret, og vinkl risten 90° i forhold til papiret nedenunder. Bank let på pincetten, mens du holder gitteret godt pincet for at fjerne løst pulver.
- Frys gitteret ved at flytte spidsen af pincetten med gitteret direkte ind i en flydende nitrogenbeholder manuelt. Denne container er typisk gitterlastestationen for TEM, men kan være enhver sikker beholder, såsom en flydende nitrogensikker termokande, der er acceptabel til overførsel eller opbevaring. Flydende nitrogen er -196 °C.
- Vent, indtil gitteret og pincetten holder op med at koge, før yderligere manipulationer.
- Under flydende nitrogen eller i nitrogendampe anbringes gitteret i prøveholderen med kulstofsiden orienteret således, at prøven rammes af strålen før kulstofstøttefilmen.
- Læg prøveholderen i TEM'en, så det sikres, at risten altid holdes ved flydende nitrogentemperaturer.
- For autoloadersystemer skal du placere de klippede gitre i en kassette i en flydende nitrogenkølet beholder. Denne kassette overføres til en shuttling-beholder, der gør det muligt for autoloader-robotteknologien at acceptere kassetten, samtidig med at prøverne holdes sikre til skift mellem autoloaderen og søjlen.
- For TEM-opsætninger med sideindgang skal du fastgøre nettet til en kommerciel TEM-holder med sideindgang. Disse holdere har en prøveforberedelsesbeholder, der er fyldt med flydende nitrogen for at muliggøre overførsel af gitteret til holderen uden opvarmning af prøven. Sideindgangsholderen indsættes direkte i TEM med prøveemnet fastgjort i enden.
7. Indsamling af MicroED-data
- Lokalisering og screening af nanokrystaller
- Åbn TEM-søjleventilerne. Juster forstørrelsen ved hjælp af håndpanelerne til den lavest mulige forstørrelse. Find strålen ved at justere intensitetsknappen på håndpanelerne, så et rundt, lyst område er synligt på den fluorescerende skærm.
- Tag et all-grid atlas ved lav forstørrelse (50 - 300x) ved hjælp af passende software14,15,16 (figur 2). Sørg for, at mikroskopet er godt justeret til både lav og høj forstørrelse, inden du indsamler MicroED-data i høj opløsning.
- Identificer gitterkvadrater uden brudt kulstof og har et synligt sort eller mørkt materiale / korn på filmen (figur 2). Naviger rundt i gitteret, enten fysisk ved hjælp af joysticket på håndpanelerne eller virtuelt på det indsamlede Atlas for at søge efter gitterfirkanter, der ikke er brudt og indeholder mikrokrystaller.
- Føj midten af hver af disse firkanter til en liste over gitterplaceringer til undersøgelse. Disse placeringer kan føjes til en notesbog, i mikroskopets brugergrænseflade eller i mikroskopautomatiseringssoftware.
- Forøg forstørrelsen til 500-1.300x, og juster den eucentriske højde på hver lagret gitterplacering, og opdater den gemte Z-værdi til de positioner, der er angivet i 7.1.4.
- Søg enten på den fluorescerende skærm eller på et hurtigt kamera ved denne højere forstørrelse efter små sorte pletter/korn på gitteret. En god prøve med ofte skarpe kanter ved høj forstørrelse, hvilket tyder på krystallinsk rækkefølge.
- Flyt en placeret potentiel krystal til midten af skærmen, og øg forstørrelsen, så TEM går i høj forstørrelsestilstand.
BEMÆRK: Dette kaldes enten høj forstørrelse, Zoom2 eller SA-tilstand på forskellige instrumenter og svarer typisk til forstørrelser på 3.000x eller højere. - Indsæt et markeret områdeblænde. Skift blænden til en større eller mindre størrelse for at sikre, at det valgte område kun er større end krystallen (figur 3).
- Skift til diffraktionstilstand ved at trykke på diffraktionsknappen på TEM-håndpanelerne, så du sikrer, at den fluorescerende skærm er indsat. Juster kameralængden ved hjælp af forstørrelsesknappen, så kanten er mindst 1 Å opløsning.
BEMÆRK: Kalibrering af diffraktionslængderne skal udføres af en servicetekniker ved hjælp af et guldvaffelgitter eller kendt prøve, inden der forsøges MicroED-eksperimenter. - Juster diffraktionsfokus, så det centrale punkt er så skarpt og lille som muligt. Brug diffraktionsskifteknapperne til at flytte den centrale stråle til midten af den fluorescerende skærm
- Indsæt strålestoppet, og sørg for, at bjælken er bag det. Løft den fluorescerende skærm. Tag en kort (ca. 1 sek.) eksponering på kameraet (figur 4).
- Undersøg det tilsvarende diffraktionsmønster. En god kandidat til indsamling af et fuldt datasæt vil have skarpe pletter, der regelmæssigt arrangeres i kolonner og rækker, og diffraktionen vil strække sig ud over 2 Å, helst mindst til 1 Å (figur 4). Gem krystalkoordinaterne i enten TEM-brugergrænsefladen eller ved at skrive dem ned.
- Gentag diffraktionsscreening for alle de potentielle krystaller af interesse på det aktuelle gitterkvadrat.
- Dataindsamling
- Centrer en screenet krystal på skærmen med høj forstørrelse (> 1.000x). Juster krystallens eucentriske højde ved hjælp af enten en automatisk rutine eller manuelt.
- Indsæt den markerede områdeåbning, der passer bedst til krystalstørrelsen og formen som bestemt i 7.1.8 (figur 3). Vip scenen i negativ og positiv retning, indtil billedet er blokeret af gitterbjælkerne (figur 3). Bemærk disse vinkler til dataindsamlingsformål.
- Bestem antallet af billeder, der kræves for at spænde over datasættets samlede vinkelkile. Det er typisk at bruge 0,5 - 1,0° kiler til hvert billede, hvor billeder læses ud hver 1. til 5. sek. afhængigt af kameraets følsomhed. For eksempel ville en kile, der spænder fra -30° til +30°, roterer med en konstant hastighed på 1° s-1 med en ramme, der udlæses hver 1s, kræve 60 samlede rammer.
- I betragtning af det maksimale samlede hældningsområde på -72° til +72° skal du begynde at rotere scenen med en konstant hastighed på 1° s-1 og derefter begynde at læse dataene ud hver 1. gang på et moderne kamera med en rullelukkerudlæsningstilstand (film 1). Denne proces kan udføres manuelt eller ved hjælp af TEM-specifik software.
- Indstil rotationshastigheden ved at angive % af den maksimale hældningshastighed, og hvornår du skal stoppe i mikroskopets brugergrænseflade eller dedikeret software. I denne undersøgelse blev dette målt til 0,3° s-1 for hver % af maksimalhastigheden, men skal verificeres uafhængigt for hvert mikroskop.
BEMÆRK: Vippe- og kameradataindsamlingen er oprettet uafhængigt her, men softwareprogrammer14 kan koordinere dette for at forenkle processen. - Kassér ca. 1° på hver side af den angivne kile i de fleste tilfælde som dødtid, hvor trinnet enten stiger op eller sænkes til den ønskede rotationshastighed.
- Indstil rotationshastigheden ved at angive % af den maksimale hældningshastighed, og hvornår du skal stoppe i mikroskopets brugergrænseflade eller dedikeret software. I denne undersøgelse blev dette målt til 0,3° s-1 for hver % af maksimalhastigheden, men skal verificeres uafhængigt for hvert mikroskop.
- Gem data i en række forskellige formater som enten individuelle rammer eller som en stak billeder (film 1).
- Konverter disse diffraktionsrammer til et typisk krystallografisk format ved hjælp af MicroED-værktøjer - tilgængelig her (https://cryoem.ucla.edu). Diffraktionsbilleder, der er gemt i SMV-format, behandles let ved hjælp af dokumenteret krystallografisk software17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MicroED er en cryoEM-metode, der udnytter de stærke interaktioner mellem elektroner og stof, hvilket gør det muligt at undersøge forsvindende små krystaller12,13. Efter disse trin forventes det at have en diffraktionsfilm i krystallografisk format indsamlet fra mikrokrystaller (film 1). Her demonstreres teknikken ved anvendelse af carbamazepin12. Resultaterne viser et kontinuerligt rotationsmikroED-datasæt fra en carbamazepinmikrokrystal identificeret på et TEM-gitter (film 1). Et godt datasæt har stærke, klare pletter, der ikke er udtværet eller opdelt, og har kun et enkelt gitter på hvert billede, der let kan følges ved at gå gennem filmen19. Disse data indekseres, integreres og skaleres let ved hjælp af standard røntgenkrystallografisoftware4. Spaltede pletter kan ses fra en krystal, der er revnet, og to orienteringer af den samme krystal er tæt justeret, men ikke helt sammenfaldende19. Flere gitter kan også forekomme, især for disse småmolekylekrystaller, hvor flere enkeltkrystaller har sat sig sammen i en klump på gitteret. Et andet almindeligt scenario opstår, hvor krystallerne er blevet frosset forkert eller behandlet for hårdt under fragmentering, og der ikke observeres diffraktion9.
Efter dataindsamling, integration og strukturløsning forventes det, at der fastlægges en struktur med høj opløsning (figur 5). At opnå en klar strukturløsning vil i sidste ende afhænge af dataenes kvalitet og fuldstændighed.
Figur 1: Forberedelse af et forklippet TEM-gitter til undersøgelse af små molekyler. A) Et rør med en lille del af prøven til undersøgelse. B) Knust prøve mellem to mikroskopglas. C) kulstofsiden af det forklippede gitter og D) kobbersiden af det forklippede gitter. E) Et forklippet TEM-gitter, efter at det knuste pulver er faldet ned på det. Skalastænger 3 mm i (C), (D) og (E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Identifikation af små molekylekrystaller i TEM . (A) Et all-grid atlas eller montage ved lav forstørrelse. (B) Et enkelt billede med lav forstørrelse, der anvendes til screening. (C) Højere forstørrelsesbillede, der bruges til at identificere mindre korn. (D) Mikrografi med høj forstørrelse af en klumpet lille molekylekrystal. Skalastang 750 μm i (A), 50 μm i (B), 10 μm i (C), 1 μm i (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Screening og justering af mikrokrystaller til MicroED-dataindsamling . (A) Mikrografi med høj forstørrelse af en mikrokrystal. (B) Mikrografi af den isolerede krystal inden for det valgte områdeblænde. (C) Den samme mikrokrystal i åbningen med trinnet vippet til -69 °. Skalabjælker alle 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempler på mikroED-data. A) mikroED-data af høj kvalitet med klare, skarpe pletter, der er egnede til strukturbestemmelse med høj opløsning. (B) Svage, udtværede MicroED-data med dårlig gitterdefinition. I dette eksempel er justeringen også slået fra, så diffraktionen kun er synlig på den ene side af billedet: (C) Dårlige MicroED-data, der viser flere gitter og splittede og/eller udtværede pletter. Indsats af blåt område forbedret nederst til højre og viser udtværede, opdelte pletter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: MicroED-struktur af carbamazepin. Atommodel vist som pinde med kulstofatomer farvet hvid, iltrød og nitrogenblå. 2Fo-F c-kortet er kontureret på 1,5 σ niveau og farvet blåt. Fo-F c-kortet , der viser hydrogener, er kontureret på 3,0 σ niveau og farvet grønt. Denne figur blev tilpasset fra de deponerede kort over EMDB-928410. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: MicroED-datasæt fra carbamazepin. Datasæt spænder næsten 90°, fra -68° til +20°. Hvert diffraktionsmønster spænder over en kile på 0,5° i gensidigt rum og svarer til en eksponering på 1s ved en eksponeringshastighed på 0,01 e- Å-2 s-1. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prøveforberedelse er typisk en iterativ proces, hvor optimeringer foretages efter sessioner med screening og dataindsamling. For prøver med små molekyler er det ofte klogt først at forsøge gitterforberedelse uden glødafladning af gitterene, da mange lægemidler har tendens til at være hydrofobe10,11. Hvis nettene har for få nanokrystallinske aflejringer, er det en god idé at prøve igen efter første lysafladning af nettene. Det kan være tilfældet, at krystallerne fra frysetørrede pulvere er for store og tykke til at indsamle gode data. I disse tilfælde kan det være muligt at indsamle data fra en kant eller tyndere del af en større krystal. Hvis dette viser sig vanskeligt, kan det være nødvendigt at male pulveret ned til en finere konsistens ved hjælp af en grovere overflade, såsom mørtel og støder.
MicroED-data indsamles typisk med TEM, der fungerer i mikroprobetilstand 4,20. Her er størrelsen af TEM-strålen, der svarer til en eksponeringshastighed på 0,01 e- Å-2 s-1, typisk omkring 10 μm i diameter, hvilket er meget større end de typiske mikrokrystaller 1,21. Signalet isoleres derefter fra de relevante krystaller ved hjælp af en valgt arealblænde (figur 3)2,20. Forskellige blændestørrelser giver mulighed for hurtig justering af opsætningen til forskellige størrelser af krystaller. Alternativt er det muligt at indsamle data med TEM, der fungerer i nanosondetilstand. Dette reducerer strålens størrelse med ca. en faktor 5. En mindre stråle svarer til en tilsvarende højere eksponeringsrate i strålefodaftrykket. Da mange TEM'er er to kondensatorlinsesystemer, vil den parallelle tilstand diktere, at strålen er en enkelt størrelse i enten mikroprobe- eller nanosondetilstand. At nå en eksponeringshastighed på 0,01 e- Å-2 s-1 i nanosonde uden at justere pistollinsen er udfordrende. Valget mellem de to er op til brugeren. En fordel ved nanosonde er, at der er mindre behov for at indsætte og trække den valgte områdeblænde mellem screening i billeddannelse og diffraktionstilstande. Men med moderne mikroskoper er indsættelse og tilbagetrækning af SA-blænden automatisk og nøjagtig. Microprobe giver større fleksibilitet i isolering af diffraktion ved at have adgang til flere størrelser af udvalgte områdeåbninger. Den større stråle i mikrosonde kan også udsætte nærliggende krystaller, mens nanosonde mere præcist kan målrette individuelle krystaller.
Den præsenterede protokol er standardmetoden til MicroED-dataindsamling for små molekyler, der anvendes i vores laboratorium10,11,12,13. Der er mange tilpasninger og ændringer, der kan implementeres. Den bedste tilgang til fremstilling af gitter med høj krystaldensitet er mest afhængig af brugerens kendskab til en given tilgang. Der er mange tilfælde, hvor stoffer er til stede som store krystaller, der er for skrøbelige til fysisk fragmentering uden at miste diffrakterende kraft19. I disse tilfælde er den nyligt tilpassede metode til fokuseret ionstrålefræsning for at tynde krystallerne for at gøre dem mere tilgængelige for MicroED 6,7,8,9,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Gonen-laboratoriet støttes af midler fra Howard Hughes Medical Institute. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T.
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
