Summary
이 프로토콜은 캡슐화된 인간 세포를 최대 72시간 동안 생존할 수 있도록 유지하기 위한 NMR 생물반응기의 설정에 대해 설명하고, 이어서 시간 분해된 세포 내 NMR 데이터 수집 및 분석을 설명한다. 이 방법론은 세포 내 단백질-리간드 상호작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 적용된다.
Abstract
세포 내 NMR은 살아있는 세포에서 직접 원자 분해능에서 생물학적 거대 분자의 구조적 및 동적 특성을 관찰하는 독특한 접근법입니다. 단백질 폴딩, 화학적 변형, 및 리간드 결합에 의해 유도된 형태적 변화가 관찰될 수 있다. 따라서이 방법은 약물 개발의 맥락에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나, NMR 분광계에 국한된 인간 세포의 짧은 수명은 세포 내 NMR의 적용 범위를 제한한다. 이러한 문제를 극복하기 위해, NMR 생물반응기는 시간에 따른 세포 샘플 안정성을 크게 향상시킬 수 있고, 중요하게는 세포 내 NMR 스펙트럼의 실시간 기록을 가능하게 할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포내 단백질 표적에 대한 리간드 침투 및 결합과 같은 과정의 진화가 실시간으로 모니터링될 수 있다. 생물반응기는 종종 높은 세포 수에서 낮은 세포 생존력에 의해 제한되며, 이는 실험의 전반적인 민감도와 세포 생존 능력 사이의 트레이드 오프를 초래한다. 우리는 최근에 최대 72 시간까지 장기간 동안 많은 수의 인간 세포를 대사 적으로 활성 상태로 유지하는 NMR 생물 반응기를보고했습니다. 이 설정은 단백질-리간드 상호작용 및 단백질 화학적 변형을 모니터링하기 위해 적용되었다. 또한 다변량 곡선 분해능을 기반으로 실시간 NMR 데이터의 정량적 분석을 위한 워크플로우를 도입했습니다. 이 방법은 시간의 함수로서 세포에 존재하는 화학 종의 농도 프로파일을 제공하며, 이는 관련 운동 파라미터를 얻기 위해 추가로 분석될 수 있다. 여기서 우리는 NMR 생물반응기 셋업 및 인간 세포에서 단백질-리간드 상호작용을 모니터링하기 위한 이의 응용에 대한 상세한 설명을 제공한다.
Introduction
세포 내 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 최근 세포 환경 내에서 거대 분자의 구조적 및 동적 특성을 조사하는 강력한 접근법으로 부상했습니다1,2,3,4,5,6. 세포내 NMR은 단백질 폴딩/미스폴딩7,8,9, 금속 결합7,10, 이황화 결합 형성11,12, 단백질-단백질 상호작용13, 단백질-리간드 상호작용14,15,16, 핵산-리간드 상호작용17과 같은 기능적으로 관련된 과정의 조사에 성공했다. ,18 살아있는 인간 세포에서. 세포내 NMR 적용의 제한 인자 중 하나는 실험 동안 세포의 짧은 수명이다. 이 문제에 대한 해결책은 NMR 생물 반응기의 사용을 포함합니다. 이들 장치에서, 성장 배지의 일정한 흐름이 NMR 분광계 내에 국한된 상태로 유지되는 세포에 적용되어 산소 및 영양분을 제공하고 독성 부산물을 제거한다. 세포 내 NMR의 출현 이후, 박테리아 또는 포유동물 세포가 하이드로겔19,20,21,22에 캡슐화되거나 미세투석막의 사용을 통해 현탁액 및 관류에 유지되는 더 오랜 기간 동안 세포 생존력을 향상시키기 위해 여러 NMR 생물반응기 설계가 개발되었다23 . 이러한 생물반응기는 증가된 신호-대-잡음비(S/N)5로 더 긴 NMR 실험의 획득을 허용하였고, 더욱 더 중요한 것은 세포 과정을 실시간으로 조사하는 데 사용될 수 있었다22,23,24. NMR의 높은 화학적 및 형태적 감도 덕분에, 후자의 적용은 원자 분해능에서 살아있는 세포 내의 기능적 과정의 동역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서, 우리는 개선된 생물반응기를 설치하고 운영하는 방법을 최근에 보고되었다25, 이는 기존의 모듈형 생물반응기 설계23과 다른 그룹에 의해 개척된 하이드로젤의 세포 캡슐화에 의존하는 접근법을 결합하여 얻어졌다19,20,21,22,26,27 . 우리는 HEK293T 세포에서 리간드 결합을 관찰하는 세포내 단백질의 실시간 세포내 NMR 연구에 생물반응기를 적용하는 것을 기술한다. 생물반응기에서, 세포는 아가로스 겔 실에서 고밀도로 캡슐화되고 최대 72시간 동안 고도로 생존가능하고 대사적으로 활성인 상태로 유지되며, 이 동안 실시간 세포 내 NMR 실험이 기록된다. 생물반응기는 방수되고 튜브 홀더에 연결된 표준 5mm NMR 프로브에 맞는 유리 튜브로 구성되어 내부 샘플 챔버의 내부 직경 4.2mm, 높이 38mm 및 부피 526μL를 갖습니다. 입구는 바닥에서 ~6mm까지 샘플 챔버에 삽입된 7미터 길이의 PEEK 모세관(o.d. = 1/32", 즉 = 0.5mm)이며, 배출구는 튜브 홀더의 상단에 부착된 7미터 길이의 PTFE 모세관 (o.d. = 1/32", 즉 = 0.5mm)입니다(그림 1). 튜브는 수조에 연결된 온도 제어 라인에 동축으로 삽입됩니다. 입구와 출구는 PEEK 튜빙을 통해 매체 흐름 및 폐기물 용기를 제어하기 위한 FPLC 펌프에 부착된 4방향, 2-위치 밸브에 연결됩니다.
생물반응기는 이전에 보고된 두 약물, 아세타졸아미드(AAZ)와 메타졸아미드(MZA) 사이의 상호작용의 동역학을 연구하기 위해 적용되며, 인간 탄산 탈수효소(CA II)의 두 번째 이소형을 갖는 인간 세포에서, 약리학적으로 관련된 표적28,29,30, 및 소분자 ebselen25에 의해 촉진된 분자내 이황화 결합의 형성의 동역학, 도 31에 나타낸 바와 같이, 구리가 없는, 아연-결합된 형태의 인간 구리는, 근위축성 측삭 경화증의 발병에 연루된 항산화효소인 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1)7,8,32이다. 마지막으로, 실시간 NMR 데이터의 정량적 분석은 다변량 곡선 분해능-교대 최소 제곱(MCR-ALS) 알고리즘(33)을 사용하여 MATLAB에서 수행되며, 이를 통해 관찰된 종에 대해 시간의 함수로서 순수한 스펙트럼 성분 및 농도 프로파일이 얻어지고, 즉 관련 운동 파라미터를 얻기 위해 추가로 분석될 수 있다.
프로토콜은 인간 CA II (비표지) 또는 인간 SOD1 (15N 표지)을 일시적으로 과발현하는 HEK293T 세포 (플라스크 당 ∼3 x 107 세포)의 T75 플라스크에서 시작한다. 세포를 성장시키고 DMEM 고 글루코스를 갖는 T75 플라스크에서 3-4일마다 1:10 계대배양하여 유지시키고, 실험 48시간 전에 관심있는 단백질을 코딩하는 cDNA로 형질감염시켰다. 이 단계에 관련된 단계들은 다른 곳에서도 상세히 보고된다34.
Protocol
1. 시약 및 용액 설정
- 완전한 DMEM을 준비하려면 5 mL L-글루타민 200 mM, 페니실린-스트렙토마이신 5 mL 100x 및 소 태아 혈청 50 mL (FBS, 10% vol/vol 최종 농도)를 440 mL DMEM에 첨가한다.
참고: 이 용액은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다. - 85°C에서 저겔화 아가로스 150mg을 인산완충식염수(PBS) 10mL에 용해시켜 아가로스 용액을 제조하여 1.5%(w/v) 용액을 얻었다. 0.22 μm 필터로 여과하여 멸균하십시오. 1.5 mL 캡핑된 튜브에 아가로스 용액 1 mL 분취량을 준비하고 4°C에서 보관한다.
- 생물반응기 배지를 준비한다.
- 13.4g의 DMEM 분말을 1L의 초순수 H2O에 녹인다.
참고: 용도에 따라 필요한 최종 부피가 다를 수 있습니다(예: 500mL 배지의 경우 500mL H2O에 분말 6.7g을 용해). - 2% FBS, 10 mM NaHCO3, 1x 페니실린-스트렙토마이신 (100x), 및 2% D2O (예를 들어, 500 mL 배지에 대해, FBS 10 mL, NaHCO3 0.4 g, 페니실린-스트렙토마이신 100x, 및 D2O 10 mL 5 mL를 첨가한다).
- pH 측정기를 사용하여 pH를 측정하고 필요한 경우 HCl을 추가하여 7.4로 조정하십시오.
참고: 일반적으로 초기 pH는 7.4에 매우 가깝습니다. - 생물반응기 배지를 멸균 250 mL 또는 500 mL 유리 병에 진공 구동 멸균 필터로 여과한다.
- 층류 후드에서 두 개의 호스 노즐이 있는 멸균 강철 헤드피스로 병을 밀봉하고 펌프에 연결될 FEP 튜브(o.d. = 1/8", 즉 = 1.6mm)와 공기 흡입을 위한 0.22μm PTFE 주사기 필터에 연결합니다.
- 13.4g의 DMEM 분말을 1L의 초순수 H2O에 녹인다.
2. 생물반응기 설정
- 두 번째 유동 유닛 NMR 튜브를 사용하여 유동 유닛을 조립하고, 이는 나중에 세포를 함유하는 것으로 대체될 것이다. 올바른 어셈블리에 대한 흐름 장치 작동 지침을 참조하십시오.
참고: 이 시점에서 흐름 단위는 이미 청소되어야 합니다(그렇지 않은 경우 4.2단계 수행). - 유량 장치 온도 제어에 연결된 수조를 37°C로 설정합니다. 저수지 병을 수조에 넣으십시오.
- 저수지 병의 FEP 튜브를 펌프에 연결하십시오.
- 생물 반응기 밸브를 "우회"로 돌리고 펌프를 매체로 미리 채 웁니다.
- 생물반응기 밸브를 "흐름"으로 돌리고 생물반응기를 0.1mL/min의 배지로 미리 채웁니다.
3. 세포 시료의 제조
- CO2 인큐베이터에서 세포를 수집하십시오.
- 형질감염된 HEK293T 세포의 T75 플라스크를 CO2 인큐베이터로부터 취하고, 사용된 배지를 제거한다.
- 세포를 실온 (∼20°C)에서 PBS 7 mL (각각)로 두 번 세척한다.
- 2mL의 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 분리합니다. 용액을 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 세포를 분리한다.
참고: 형질감염된 세포는 분리되기까지 약간 더 오래 걸릴 수 있습니다. 필요한 경우, 세포를 37°C에서 인큐베이션한다. - 20 mL의 완전한 DMEM으로 트립신을 불활성화시키고; 세포를 위아래로 피펫팅하여 철저하게 재현탁하고 50 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
- 세포를 실온에서 5분 동안 800 x g 에서 원심분리하고 상청액을 버린다.
- 세포를 실온에서 PBS 10 mL로 세척하여 잔류 배지를 제거하였다.
- 세포를 실온에서 5분 동안 800 x g 에서 원심분리하고 상청액을 버린다.
- 세포 펠릿을 1.5 mL 캡핑된 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
- 세포를 아가로스 실에 포함시킵니다.
- 응고된 아가로오스의 한 분취량을 수조에서 85°C에서 용융시키고, 이어서 이를 블록 히터 내에서 37°C에서 용액 중에 유지한다.
- 파스퇴르 피펫으로 유량 유닛 NMR 튜브의 바닥을 1.5 % 아가로스 겔 60-70 μL로 채우고 얼음에 넣으십시오. 이렇게 하면 셀 샘플을 1H NMR 코일의 활성 부피 내에 배치할 수 있는 ~5mm 높이의 바닥 플러그가 생성됩니다.
- 단계 3.1.8에서 수득된 세포의 펠렛을 37°C에서 15-20 s 동안 가열하여 열블록한다.
- 세포를 450 μL의 아가로스 용액에 재현탁시킨다. 거품의 형성을 피하십시오.
- 세포-아가로스 현탁액을 1 mL 주사기에 연결된 ∼30 cm 길이의 크로마토그래피 PEEK 튜빙 (즉, = 0.75 mm)으로 흡인시킨다.
참고 : 흡인 전에 주사기의 튜브 및 죽은 부피는 거품의 형성을 피하기 위해 실온에서 PBS로 미리 채워야합니다. 튜브의 길이는 중요하지 않습니다. - 튜브를 실온에서 2 분 동안 식히십시오.
- 유동 유닛 NMR 튜브를 실온에서 100 μL의 PBS로 미리 채운다.
- 아가로오스에 매립된 세포의 실을 주사기를 부드럽게 밀어서 유동 유닛 NMR 튜브 내로 캐스팅한다.
참고: NMR 튜브를 균일하게 채우려면 PEEK 튜브의 끝을 NMR 튜브의 아래쪽에 놓고 왼쪽-오른쪽으로 천천히 스윙하면서 위쪽으로 진행하십시오. - 모든 셀-아가로스 현탁액이 주조될 때까지 단계 3.2.5, 3.2.6 및 3.2.8을 반복한다.
- 세포를 생물반응기에 삽입한다.
- 유량 장치에서 빈 NMR 튜브를 제거하고 몇 분 동안 유량을 2mL/min으로 높여 입구 튜브의 잔류 가스 버블을 제거합니다.
- 유속을 0.2 mL/min으로 설정하고 셀이 들어있는 NMR 튜브를 천천히 그러나 꾸준히 위쪽으로 밀어 넣습니다.
참고: 매체의 활성 흐름은 입구를 통한 튜브 내용물의 역류를 방지하며, 그렇지 않으면 삽입 중에 발생합니다.
4. 생물반응기 작동 및 세척
- NMR 실험 동안 생물반응기 작동.
- NMR 분광계의 온도를 310K로 설정합니다.
- 분광계에 유량 장치를 삽입합니다.
- 세포 내 NMR 실험의 전체 기간 동안 0.1 mL/min의 유속으로 생물반응기 배지를 공급하십시오.
- 실험 동안 원하는 시간에, 멸균된 긴 바늘 주사기로 실리콘 튜브를 관통하여 외부 분자의 농축된 용액을 배지 저장소 병에 주입한다.
참고: 배지에서 분자의 최종 농도는 세포 독성에 대한 이전 지식과 가능한 경우 세포막을 통한 예측 / 추정 된 확산 속도에 따라 선택되어야합니다. - NMR 실험이 끝나면 세포가 들어있는 튜브를 빈 튜브로 교체하고 유동 장치를 물로 헹구십시오.
- 생물 반응기는 제자리에 깨끗합니다.
- 다음 용액을 1 mL/min으로 흘려서 유동 유닛을 청소하십시오: 0.2 M 수산화나트륨 (NaOH); 3 M 시트르산; 0.2 M NaOH, 각각 적어도 30분 동안, 이어서 >2 h 동안 멸균 여과된 초순수를 사용하였다.
- 각 실행 후 저수지 병과 튜브 어셈블리를 청소하고 오토클레이브하십시오.
5. NMR 실험
- NMR 실험의 설정.
참고: 세포 내 NMR 샘플을 준비하기 전에 세포 수집과 데이터 수집 사이의 지연을 피하기 위해 이러한 단계를 미리 수행하십시오.- NMR 분광계에서 새 데이터 세트를 만들고 원하는 NMR 실험에 대한 매개 변수를 설정합니다.
- 1D 1H NMR 실험에 대한 매개 변수를 설정합니다.
- 1H 반송파 주파수를 물 신호에 4.7ppm으로 집중시킵니다.
- zgesgp 펄스 프로그램을 선택하고 스펙트럼 폭을 20ppm으로 설정하고 물 억제를 위해 1,000μs 180° 정사각형 펄스를 설정합니다. 스캔 간 지연을 1초로 설정합니다. 32 스캔으로 스펙트럼을 획득하십시오.
- 표지되지 않은 CA II를 발현하는 세포의 경우: p3919gp 펄스 프로그램을 선택하고, 스펙트럼의 이미노 영역을 커버하기 위해 스펙트럼 폭을 30ppm으로 설정하고, 최대 여기가 관심 신호의 화학적 이동에 집중되도록 이항 물 억제에 대한 지연을 조정한다(950MHz에서 d7 = 20 μs). 스캔 간 지연을 ≥1초로 설정합니다. 512 스캔으로 획득하십시오.
- 15N 표지된 SOD1을 발현하는 셀의 경우: sfhmqf3gpph 펄스 프로그램을 선택하고, 1H 및 15N 스펙트럼 폭을 각각 16 및 50 ppm으로 설정하고, 형상화된 펄스 오프셋 및 여기 대역폭을 각각 8.5 및 6 ppm으로 설정하고, 디커플링 방식을 위한 350 μs 펄스를 포함한다(장비에 따라 garp4 또는 기타). 스캔 간 지연을 0.3초로 설정합니다. 15N 차원에서 16개의 스캔과 128개의 증분으로 획득합니다.
- 실시간 NMR 스펙트럼 획득.
- 생물반응기가 NMR 분광계에 삽입되면, 배지의 교환이 가능하도록 몇 분 동안 기다리십시오.
참고: 이 프로세스는 PBS가 2% D2O를 포함하는 매체로 대체될 때 잠금 신호의 모양으로부터 쉽게 모니터링됩니다. - 1H 채널의 정합 및 튜닝을 조정하고, 자석을 심지하고, 1H 90 ° 하드 펄스 길이를 계산하십시오.
- 1H 하드 펄스에 따라 각 펄스 시퀀스에서 1H 전력 레벨을 조정합니다.
- 첫 번째 zgesgp 1H 스펙트럼을 기록하여 샘플 함량 및 필드 균질성을 확인합니다.
- zgesgp 및 p3919gp/sfhmqcf3gpph 실험을 원하는 숫자로 복사하고 획득 스풀러에 큐에 넣습니다.
참고: zgesgp 스펙트럼은 샘플의 상태와 필드 균질성을 제어하기 위해서만 사용됩니다. 따라서 건너 뛰거나 덜 자주 기록 할 수 있습니다. - 표지되지 않은 CA II를 발현하는 세포에 대해: 제로 충전 및 지수 라인 확장 윈도우 함수(LB = 20 Hz)를 적용하여 p3919gp 스펙트럼을 처리한다.
- 15N 표지된 SOD1을 발현하는 세포에 대해: 제로 충전 및 제곱된 사인벨 윈도우 함수(SSB=2)를 두 차원 모두에 적용하여 sfhmqcf3gpph 스펙트럼을 처리한다.
참고: 처리된 스펙트럼의 크기는 신호가 없는 영역을 제거하여 더 줄일 수 있습니다(Topspin에서는 원하는 STSR 및 STSI 값을 설정하여 수행됩니다).
- 생물반응기가 NMR 분광계에 삽입되면, 배지의 교환이 가능하도록 몇 분 동안 기다리십시오.
6. MCR-ALS 분석
- CA II 스펙트럼 분석을 위해 MATLAB R2019b에서 1D 스펙트럼 영역을 가져옵니다.
- 소프트웨어에서 프로세스 데이터 세트 목록 메뉴에서 내보낼 실험 목록을 만듭니다.
- au 프로그램 convbin2asc의 수정된 버전을 사용하여 각 스펙트럼에 대해 관심 스펙트럼 영역을 ASCII 형식으로 내보냅니다.
참고: 이렇게 하면 각 스펙트럼 하위 디렉터리에 ascii-spec.txt라는 텍스트 파일이 만들어집니다. - MATLAB에서 사용자 지정 스크립트 Load_ascii_spectra을 사용하여 스펙트럼 영역을 가져옵니다.
참고: 이 스크립트는 데이터 세트 디렉토리를 입력으로 필요로 하며 누적된 1D 스펙트럼과 화학적 이동을 포함하는 1D 배열 cs를 포함하는 2D 배열 스펙트럼을 생성합니다. - Load_acqus 스크립트를 실행하여 1D 스펙트럼에서 타임스탬프를 추출합니다.
참고: 이 스크립트는 시간 단위로 표현된 각 스펙트럼의 시간 증가분을 포함하는 1D 배열 times_hours를 생성하며, 시간의 초기 스펙트럼은 0입니다.
- SOD1 스펙트럼을 분석하려면 MATLAB R2020b에서 2D 스펙트럼을 가져옵니다.
- Topspin에서 프로세스 데이터 집합 목록 메뉴에서 내보낼 실험 목록을 만듭니다.
- MATLAB에서 사용자 지정 스크립트 Load_2D_spectra을 사용하여 2D 스펙트럼을 가져옵니다.
참고: 이 스크립트는 데이터 세트 디렉토리를 입력으로 필요로 하며 누적된 2D 스펙트럼과 화학적 이동을 포함하는 1D 배열 cs를 포함하는 3D 배열 스펙트럼을 생성합니다. - Load_acqus 스크립트를 실행하여 2D 스펙트럼에서 타임스탬프를 추출합니다.
- 사용자 지정 스크립트 Cut_2D_spectra에서 관심 스펙트럼 영역을 지정하고 스크립트를 실행하여 3D 하위 배열 [(1H x 15N) 스펙트럼 강도) x 시간]을 자릅니다. 2D 배열 (시간 점 x 스펙트럼 강도)으로 모양을 바꾸고 함께 결합하십시오.
참고: 이렇게 하면 재구성되고 결합된 스펙트럼 영역을 포함하는 JoinSpec_flat 2D 어레이가 생성됩니다.
- GUI 모드에서 MCR-ALS 2.0을 실행합니다.
- mcr_main 스크립트를 실행하여 MCR-ALS 2.0 GUI를 엽니다.
- 데이터 선택 탭에서 스펙트럼 또는 JoinSpec_flat 행렬을 로드합니다. 검사를 위해 데이터를 플로팅할 수 있습니다.
- 단수 값 분해(SVD) 또는 수동으로 구성 요소의 수를 평가합니다.
참고 : 구성 요소의 수는 실험에 존재하는 별개의 종의 수와 일치해야합니다. 이 경우 n=2, 유리 및 결합 단백질에 상응한다. - 순수 스펙트럼의 초기 추정을 위한 방법을 선택하십시오. 가장 순수한 변수 감지 또는 진화 요인 분석 (EFA)을 사용할 수 있습니다.
- 데이터 세트 선택 창에서 계속을 선택합니다.
- 농도에 대한 제약조건을 제약 조건: 행 모드 창에서 설정합니다. 부정성이 아닌 제약 조건을 적용하고 fnnls (빠른 부정성 제한 최소 제곱)를 "구현 및 2 종"으로 선택하십시오. 1 개의 클로저 제약 조건을 적용하고, 제약 조건을 1로 설정하고, 클로저 조건을 "동일"으로 설정하고 모든 종에 적용하십시오.
참고 : 이것은 각 종 농도의 합이 1과 같게하여 각 종의 얻은 프로파일이 총 단백질 농도에 대해 정규화되도록합니다. - 제약조건 : 열 모드 창에서 스펙트럼에 대한 제약조건을 설정합니다. 부정성이 아닌 제약 조건을 적용하고 fnnls를 "구현 및 2 종"으로 선택하십시오.
참고: 음의 신호가 NMR 스펙트럼에 존재하는 경우에는 이 제약 조건을 적용하면 안 됩니다. - 마지막 창에서 50회 반복과 0.01 수렴 기준을 설정합니다. 농도, 스펙트럼 및 Std. 편차에 대한 출력 이름을 지정합니다. 계속 을 클릭하여 MCR-ALS 피팅을 실행합니다.
참고: 그래픽 창에는 농도 프로파일의 플롯과 순수 성분의 스펙트럼이 있는 피팅 결과가 표시됩니다. - SOD1 데이터 세트의 경우: 사용자 지정 스크립트 Rebuild_2D_spectra을 사용하여 MCR-ALS의 1D 출력에서 2D 스펙트럼 영역을 재구성하고 플로팅합니다.
7. 트리판 블루 테스트
- NMR 튜브 함량을 파스퇴르 피펫으로 회수하고, 아가로스 실을 1.5 mL 캡핑된 튜브로 옮긴다.
- 600 μL의 PBS로 아가로스 실을 헹구어 잔류 배지를 제거하고, 이를 실온에서 1분 동안 4,000 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 250 μL의 PBS 및 50 μL의 0.4% 트리판 블루 용액을 첨가한다.
- 연속 피펫팅으로 2 분 동안 배양하십시오.
- 상층액을 버리는 600 μL의 PBS로 두 번 세척한다.
- 현미경 슬라이드에 몇 개의 아가로스 실을 놓고 면도날로 잘라 작은 젤 조각을 만듭니다. 분석을 위해 가장 얇은 조각(두께 < 0.4mm, 이상적으로는 ~0.2mm)을 선택합니다.
- 겔 조각을 양쪽에 파라핀 필름 (~ 0.4 mm 총 두께)의 세 층으로 이격 된 두 개의 유리 슬라이드로 구성된 자체 제작 셀 카운팅 챔버로 옮깁니다.
참고 : 챔버 슬라이드도 사용할 수 있습니다. 그러나, 챔버 높이 (0.1 mm)보다 두꺼운 겔 슬라이스는 압착되어 임베디드 셀을 파열시킬 것이다. - 아가로스 내부의 세포 이미지를 획득하고 흰색과 파란색 세포를 계산합니다.
- 세포 생존율을 (총 세포 - 청색 세포) / 총 세포로 계산하십시오.
Representative Results
상기 프로토콜은 하이드로젤의 실에 세포를 캡슐화하여 실시간으로 세포 내 과정을 조사하는 데 필요한 오랜 기간 동안 세포 생존율을 극대화 할 수있게합니다. 생물반응기에서, 세포는 트리판 블루 테스트에 의해 확인된 바와 같이 72 h까지 살아 있고 대사적으로 활성으로 유지된다 (도 2a-c). 원칙적으로, 이 프로토콜은 임의의 형태적 또는 화학적 변화를 겪는 관심있는 세포내 단백질을 관찰하기 위해 적용될 수 있다. 위에서 기술한 첫 번째 적용에서, 생물반응기는 HEK293T 세포의 시토졸에서 과발현된 CA II에 대한 두 개의 억제제, AAZ 및 MZA의 결합을 실시간으로 모니터링하기 위해 적용된다. 기록된 첫 번째 1H 여기 조각 스펙트럼(zgesgp)은 전체 신호 강도(세포 수에 비례함), 과발현된 단백질로부터의 신호의 존재 및 필드 균질성을 평가하는데 사용된다(도 2d). CA II의 경우, 두 억제제의 세포내 결합은 11 내지 16 ppm 사이의 영역에서 1H 신호를 관찰함으로써 WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR 스펙트럼 (p3919gp)에 의해 모니터링될 수 있다. 이들 신호는 CA II36의 아연-배위 히스티딘 및 다른 방향족 잔기로부터 발생하고, 리간드 결합14,15 시에 교란된다. 리간드 농도는 확산 속도에 기초하여 또는 이용 가능한 경우, 이전에 결정된 투과성 값14로부터 선택될 수 있다. 성공적인 결합은 관심 스펙트럼 영역에서 추가적인 신호 세트의 출현에 의해 시각적으로 확인되며, 이는 점진적으로 원래의 신호를 대체합니다 (그림 3). 시간 의존적 결합 곡선은 MCR-ALS 분석에 의해 얻어지며, MCR-ALS 분석은 자유 및 결합 CA II로부터 발생하는 두 세트의 NMR 신호를 분리하고(도 4a), 동시에 두 종의 상대적 농도 프로파일을 제공한다(도 4b). 두 번째 적용에서, 생물반응기는 인간 세포에서 글루타티온 퍼옥시다제 모방체인 에블렌에 의해 촉진된 아연 결합된 SOD1 분자내 이황화 결합의 형성을 모니터링하기 위해 적용된다. 이 과정은 이황화 결합 형성에 의해 유도된 단백질 구조의 교란에 의해 야기된 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 스펙트럼(단백질 골격 입체 형태의 지문을 제공함)의 변화를 관찰함으로써 모니터링된다. 디술피드 산화된 SOD1로부터 발생하는 추가적인 신호는 1H-15N 스펙트럼에서 나타나고, 점차적으로 디술피드-환원된 SOD1로부터의 신호들을 대체한다. 2D 스펙트럼의 선택된 영역에 대한 MCR-ALS 분석은 두 종에서 발생하는 신호를 분리하고(그림 5a), 이들의 상대적 농도 프로파일을 제공한다(도 5b). 수득된 농도 곡선은 연구25 하의 공정의 동역학에 대한 정보를 제공하기 위해 비선형 피팅에 의해 추가로 분석될 수 있다.
도 1: 생물반응기의 반응식. 왼쪽: 빈 흐름 장치의 단면도입니다. 오른쪽: 생물반응기 설정의 계획. PEEK 입구 튜브는 녹색으로 표시됩니다. PTFE 출구 튜브는 파란색으로 표시됩니다. 왼쪽 패널은 Luchinat et al.25의 허가를 받아 복제됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 1H NMR에 의해 확인된 캡슐화된 세포 및 샘플에 대한 트리판 블루 테스트. 포매된 세포를 함유하는 아가로오스의 대표적인 슬라이스는 (a) 캐스팅 직후 및 (b) 생물반응기에서 72시간 후 트리판 블루로 염색되고; (c) 활성 유동 (검정) 및 정적 조건 하에서의 NMR 생물반응기 (적색) 하에서의 시간의 함수로서의 세포 생존율은 트리판 블루 테스트에 의해 측정된다. (d) zgesgp 1H NMR 스펙트럼은 생물 반응기 내의 가스 기포의 부재 (검정) 및 존재 (적색) 하에 CA II를 과발현하는 아가로스 포매된 세포 상에 기록된다. 후자의 경우, 필드 균질성 감소는 라인 확대 및 용매 억제 아티팩트의 출현을 야기한다. 흥미로운 스펙트럼 특징에 레이블이 붙어 있습니다. 패널 (a-c)은 Luchinat et al.25의 허가를 받아 복제됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 생물반응기 내의 아가로스 캡슐화된 세포 상에서 얻어진 대표적인 실시간 실시간 세포 내 1H NMR 데이터. CA II를 과발현하는 HEK293T 세포의 1D 1H NMR 스펙트럼(15.6 및 11.1 ppm 사이의 영역)의 폭포 플롯을 (a) 25 μM AAZ 및 (b) 10 μM MZA로 후속적으로 처리하여, NMR 생물반응기에서 시간의 함수로서 기록하였다. 리간드 처리의 시간은 화살표로 표시된다. 스펙트럼 강도(a.u.)는 파란색(가장 낮음)에서 노란색(가장 높음)까지 색상으로 구분됩니다. 이 그림은 Luchinat et al.25의 허가를 받아 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 1D NMR 스펙트럼으로부터 출력되는 대표적인 MCR-ALS 스펙트럼. (a) MCR-ALS에 의해 재구성된 순수한 성분의 1H NMR 스펙트럼: 리간드가 없는 경우(검정) 및 AAZ(적색) 또는 MZA(마젠타)와의 복합체에서 CA II; (b) MCR-ALS에 의해 수득된 AAZ(적색) 또는 MZA(마젠타)의 첨가시 시간의 함수로서 자유(검정) 및 결합된 CA II의 상대적 농도 프로파일. 리간드 처리 시간은 화살표로 표시됩니다. 이 그림은 Luchinat et al.25의 허가를 받아 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 2D NMR 스펙트럼으로부터의 대표적인 MCR-ALS 출력. (a) MCR-ALS에 의해 재구성된 순수 성분의 1H-15N 스펙트럼 영역(라벨링된 I-IV): 디술피드-환원된 SOD1(검정) 및 디술피드-산화된 SOD1(적색); (b) MCR-ALS에 의해 수득된 에벨렌의 첨가시 시간의 함수로서 순수한 성분의 상대적 농도 프로파일(화살표로 표시됨). 이 그림은 Luchinat et al.25의 허가를 받아 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
세포 내 NMR 실험을 위해 생물반응기를 사용하는 목적은 세포를 장기간 생존시키고 대사적으로 활성으로 유지하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 여러 가지 중요한 측면을 고려해야합니다. 첫째, 세포 샘플을 준비할 때와 NMR 데이터 수집 동안 박테리아 오염을 피하는 것이 가장 중요하다. 유전자 클로닝 및 재조합 단백질 발현에 일반적으로 사용되는 대장균 또는 기타 박테리아의 균주가 실험실에서 사용되는 경우 샘플 준비 중에 세포를 오염시킬 수 있습니다. 일단 생물반응기에 들어가면, 박테리아는 신선한 성장 배지를 이용하여 빠르게 성장할 것이며, 내독소의 생성으로 인해 세포 사멸을 야기할 것이다. 박테리아 오염은 성장 배지를 노란색과 탁하게 변할 때 진보 된 단계에서만 발견됩니다. 또한, 생물반응기의 불완전한 세척은 박테리아, 효모 또는 일반적인 곰팡이로 펌프 또는 튜브를 오염시킬 수 있습니다.
실험의 성공을위한 요구 사항은 가스 버블 형성을 피하는 것입니다. NMR 코일의 활성 부피에서 아가로스 스레드 사이에 갇힌 가스 버블은 큰 자기장 불균질성을 도입하여 H2O 신호의 불완전한 억제와 스펙트럼 품질의 심각한 손실을 초래합니다 (그림 2d). 기포는 시스템에 갇힌 공기 또는 기체 CO2의 형성으로 인해 발생할 수 있습니다. 전자는 세포 샘플을 삽입하기 전에 시스템을 배지로 플러싱하여 쉽게 피할 수 있으며, 후자를 피하기 위해서는 성장 배지에서 NaHCO3의 농도를 줄이고 CO2 용해도의 차이를 최소화하기 위해 시스템의 모든 부분을 일정한 온도로 유지하는 것이 좋습니다. 세포 호기성 신진 대사는 또한 유속을 증가시킴으로써 예방될 수 있는 기체 CO2의 형성을 야기할 수 있다.
세포 생존력은 Trypan Blue Test에 의해 각각 실행 된 후에 확인되어야합니다. 그러나, 그것은 대사 활성에 대한 통찰을 제공하지 않는다. 생물반응기 작동 동안 세포의 대사 상태에 대한 보다 완전한 그림을 얻기 위해, 31P NMR 스펙트럼을 수행하여 ATP의 생산을 time23,25의 함수로서 평가할 수 있다. 그러나 이 측정에는 전용 프로브가 필요한 경우가 많으며, 이로 인해 1H NMR로 동시에 레코딩할 수 있습니다.
CA II의 경우, 1H 스펙트럼의 비정상적인 영역에서 잘 분해된 리포터 신호의 존재는 간단한 1D NMR 스펙트럼으로부터의 분석을 용이하게 하고, 단백질 발현 동안 동위원소 농축을 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 다른 단백질은 0 내지 -1 ppm11 사이의 단백질 소수성 코어의 전형적인 것과 같은 다른 영역에서의 스펙트럼 변화를 모니터링하는데 유용한 1H 신호를 발생시킬 수 있고; 그러나 이러한 영역은 ~ 10kDa보다 큰 접힌 단백질로 붐비는 경향이 있습니다. 이때, SOD1에 대해 나타낸 바와 같이, 단백질을 15N으로 풍부하게 하고, 단백질 발현 시 균일하게 15N이 농축된 성장 배지를 제공함으로써, 2D 1H-15N NMR 스펙트럼의 실시간 변화를 모니터링하는 것이 바람직하다. 2D 스펙트럼은 MATLAB에서 2D 어레이로 가져와서 1D 배열로 재배열하고 MCR-ALS 분석 전에 스택됩니다. 후자의 접근법은 일반적으로 검출가능한 신호를 발생시키는 임의의 세포내 단백질에 적용가능하며, 단일 잔기 수준에서 단백질 형태적 변화에 대한 정보를 제공한다. 원칙적으로, 후자의 접근법은 nD 스펙트럼 및 다른 동위원소 표지 체계로 일반화 될 수 있습니다.
상이한 유형의 세포로의 적용과 관련하여, 프로토콜은 상이한 세포주에 쉽게 적응되어야 하며, 관심있는 단백질이 세포에서 직접 발현될 것을 요구하지 않는다. 따라서, 세포내 NMR에 대한 다른 접근법은 이러한 프로토콜과 조합될 수 있으며, 여기서 관심있는 거대분자는 재조합적으로 생성되거나, 합성되고, 이어서 전기천공 또는 다른 전달 방법에 의해 세포 내로 삽입된다1,9,38. 상이한 세포주 또는 샘플 준비 프로토콜로 작업할 때, 아가로스 실에서의 아가로스 농도, 실 두께 및 최종 세포 밀도와 같은 파라미터가 경험적으로 최적화되어야 할 수도 있다. 더욱이, 여기에 기재된 프로토콜의 적용가능성은 아가로스 캡슐화를 용인하는 세포로 제한된다. 다른 세포 유형은 다른 하이드로겔 제형을 필요로 할 수 있지만, 현탁액에서 자연적으로 자라는 세포를 분석할 때, 예를 들어 NMR tube23에 갇힌 세포를 유지하면서 영양 확산을 보장하기 위해 동축 미세투석막을 사용하는 것이 좋습니다.
다른 NMR 생물 반응기 설계19,20,21,22와 비교하여, 여기에 설명된 장치는 상업적으로 이용가능한 유동 유닛에 의존하며, 약간의 변형으로 적응된다. 따라서이 장치는 재현성이 높은 다른 실험실에서 쉽게 복제 할 수 있습니다. 또한 표준화 된 작동과 필요한 경우 엄격한 실험실 안전 규정을 완벽하게 준수 할 수 있습니다. 전반적으로, 생물반응기의 유연성 및 작동의 용이성은 이미 보고된 바와 같은 것들 이외에 세포 및 시험관내 모두에서 NMR 용액의 많은 다른 응용을 허용해야 한다23,25. 결국, 동일한 생물반응기 설계가 구상체 또는 오가노이드와 같은 조직의 생리적 환경과 더 유사한 샘플에 적용될 수 있는데, 단, NMR 분광계에서 그러한 샘플을 살아 있게 유지하거나 심지어 성장을 유지하기 위한 적절한 스캐폴드가 발견된다면 말이다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 iNEXT-Discovery, 보조금 번호 871037, 유럽 집행위원회의 Horizon 2020 프로그램, Instruct-ULTRA, 보조금 번호 731005, Instruct-ERIC의 서비스를 더욱 발전시키기위한 EU H2020 프로젝트 및 Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN grant 20177XJCHX가 지원합니다. 저자들은 JRA 어워드 번호 815를 통해 랜드마크 ESFRI 프로젝트인 Instruct-ERIC의 지원과 CERM/CIRMMP 이탈리아 센터의 자원 사용을 인정합니다. InsightMR 유량 장치 작동을 지원해 주신 Matteo Pennetri(Bruker, UK)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| D2O | Sigma-Aldrich | 453366 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10313-021 | |
| DMEM, high glucose, powder | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030 | |
| Low-gelling agarose, powder | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| NaHCO3, powder | Carlo Erba | 478537 | |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| NaOH, pellets | Sigma-Aldrich | 30620 | |
| Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | T8154 | Hazard statement(s): H350 may cause cancer. |
| Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe | Bruker | n/a | All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible. |
| InsightMR flow unit | Bruker | n/a | |
| P-920 pump module from ÄKTA FPLC | GE Healthcare | n/a | Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit. |
References
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