Summary
Detta protokoll beskriver installationen av en NMR-bioreaktor för att hålla inkapslade mänskliga celler livskraftiga i upp till 72 timmar, följt av tidsupplöst NMR-datainsamling och analys i cellen. Metoden tillämpas för att övervaka intracellulära protein-ligandinteraktioner i realtid.
Abstract
NMR i celler är ett unikt tillvägagångssätt för att observera de strukturella och dynamiska egenskaperna hos biologiska makromolekyler vid atomupplösning direkt i levande celler. Proteinveckning, kemiska modifieringar och konformationsförändringar inducerade av ligandbindning kan observeras. Därför har denna metod stor potential i samband med läkemedelsutveckling. Den korta livslängden för mänskliga celler som är begränsade i NMR-spektrometern begränsar emellertid tillämpningsområdet för NMR i cellerna. För att lösa detta problem används NMR-bioreaktorer som avsevärt kan förbättra cellprovets stabilitet över tid och, viktigare, möjliggöra realtidsregistrering av NMR-spektra i cellen. På detta sätt kan utvecklingen av processer som ligandpenetration och bindning till det intracellulära proteinmålet övervakas i realtid. Bioreaktorer begränsas ofta av låg cellviabilitet vid höga cellantal, vilket resulterar i en avvägning mellan experimentets totala känslighet och cellviabilitet. Vi rapporterade nyligen en NMR-bioreaktor som upprätthåller ett stort antal mänskliga celler metaboliskt aktiva under längre perioder, upp till 72 timmar. Denna inställning tillämpades för att övervaka protein-ligandinteraktioner och proteinkemisk modifiering. Vi introducerade också ett arbetsflöde för kvantitativ analys av NMR-data i realtid, baserat på multivariat kurvupplösning. Metoden ger koncentrationsprofiler av de kemiska arter som finns i cellerna som en funktion av tiden, som kan analyseras ytterligare för att erhålla relevanta kinetiska parametrar. Här ger vi en detaljerad beskrivning av NMR-bioreaktorns inställning och dess tillämpning för övervakning av protein-ligandinteraktioner i mänskliga celler.
Introduction
Nmr-spektroskopi (In-cell Nuclear Magnetic Resonance) har nyligen dykt upp som ett kraftfullt tillvägagångssätt för att undersöka strukturella och dynamiska egenskaper hos makromolekyler inom den cellulära miljön1,2,3,4,5,6. NMR i cellen lyckades undersöka funktionellt relevanta processer såsom proteinveckning/felveckning7,8,9, metallbindning7,10, disulfidbindningsbildning11,12 och protein-proteininteraktion13, protein-ligandinteraktion14,15,16 och nukleinsyra-ligandinteraktion17 ,18 i levande mänskliga celler. En av de begränsande faktorerna för NMR-tillämpningar i celler är cellernas korta livslängd under experimentet. Lösningen på detta problem innebär användning av NMR-bioreaktorer. I dessa anordningar appliceras ett konstant flöde av tillväxtmedium på cellerna, som hålls begränsade inom NMR-spektrometern, för att ge syre och näringsämnen och för att avlägsna giftiga biprodukter. Efter tillkomsten av NMR i celler har flera NMR-bioreaktorer utvecklats för att förbättra cellernas livskraft under längre tidsperioder, där antingen bakterier eller däggdjursceller är inkapslade i en hydrogel19,20,21,22 eller hålls i suspension och perfuseras genom användning av ett mikrodialysmembran23 . Sådana bioreaktorer har gjort det möjligt att förvärva längre NMR-experiment med ökat signal-brusförhållande (S / N)5 och, ännu viktigare, kan användas för att undersöka cellulära processer i realtid22,23,24. Tack vare NMR: s höga kemiska och konformationskänslighet kan den senare applikationen ge värdefulla insikter om kinetiken hos funktionella processer inom levande celler vid atomupplösning.
I detta protokoll visar vi hur man ställer in och driver en förbättrad bioreaktor som nyligen rapporterats25, som erhölls genom att kombinera en befintlig modulär bioreaktordesign23 med tillvägagångssättet som bygger på cellinkapsling i hydrogel som var banbrytande av andra grupper19,20,21,22,26,27 . Vi beskriver tillämpningen av bioreaktorn på NMR-studier i realtid av intracellulär protein-observerad ligandbindning i HEK293T-celler. I bioreaktorn är cellerna inkapslade med hög densitet i agarosgeltrådar och hålls mycket livskraftiga och metaboliskt aktiva i upp till 72 timmar, under vilka NMR-experiment i realtid registreras. Bioreaktorn består av ett glasrör som passar standard 5 mm NMR-sonder som är vattentäta och anslutna till en rörhållare så att den inre provkammaren har 4,2 mm inre diameter, 38 mm höjd och en volym på 526 μL. Inloppet är en 7 meter lång PEEK-kapillär (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) införd i provkammaren ner till ~ 6 mm från botten, medan utloppet är en 7 meter lång PTFE-kapillär (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) fäst på toppen av rörhållaren (figur 1). Slangen sätts koaxiellt in i en temperaturstyrd linje ansluten till ett vattenbad. Inloppet och utloppet är anslutna via PEEK-slangar till en 4-vägs 2-lägesventil ansluten till en FPLC-pump för att styra medelflödet och en avfallsbehållare.
Bioreaktorn används för att studera kinetiken i interaktionen, som tidigare rapporterats14,25, mellan två läkemedel, acetazolamid (AAZ) och metaazolamid (MZA), i humana celler med den andra isoformen av humant kolsyraanhydras (CA II), ett farmakologiskt relevant mål28,29,30, och kinetiken för bildandet av den intramolekylära disulfidbindningen, som främjas av den lilla molekylen ebselen25. 31, av den kopparfria, zinkbundna formen av humant koppar, zinksuperoxiddismutas (SOD1), ett antioxidantenzym som är inblandat i uppkomsten av amyotrofisk lateralskleros7,8,32. Slutligen utförs kvantitativ analys av NMR-data i realtid i MATLAB med hjälp av algoritmen Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS)33, genom vilken de rena spektralkomponenterna och koncentrationsprofilerna som en funktion av tiden erhålls för de observerade arterna, som kan analyseras ytterligare för att erhålla relevanta kinetiska parametrar.
Protokollet utgår från en T75-kolv med HEK293T-celler (~ 3 x 107 celler per kolv) som överuttrycker tillfälligt antingen mänsklig CA II (omärkt) eller human SOD1 (15N-märkt). Cellerna odlades och upprätthölls i T75-kolvar med DMEM-hög glukos med 1:10 passager var 3-4: e dag och transfekterades med cDNA som kodar för proteinet av intresse 48 timmar före experimentet. De steg som ingår i denna fas rapporteras i detalj på annat håll34.
Protocol
1. Inställning av reagens och lösning
- För att förbereda fullständig DMEM, tillsätt 5 ml L-glutamin 200 mM, 5 ml penicillin-streptomycin 100x och 50 ml fetalt bovint serum (FBS, 10% vol / vol slutlig koncentration) till 440 ml DMEM.
OBS: Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i 1 månad. - Bereda agaroslösning genom att lösa upp 150 mg låggelande agaros i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 85 °C för att erhålla en 1,5 % (vikt/v) lösning. Sterilisera genom filtrering med ett 0,22 μm filter. Förbered 1 ml alikvoter av agaroslösning i 1,5 ml täckta rör och förvara vid 4 ° C.
- Förbered bioreaktormediet.
- Lös upp 13,4 g DMEM-pulver i 1 liter ultrarent H2O.
OBS: Beroende på applikation kan den erforderliga slutliga volymen skilja sig åt (t.ex. för 500 ml medium, lösa upp 6,7 g pulver i 500 ml H2O). - Tillsätt 2% FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penicillin-streptomycin (100x) och 2% D2O (t.ex. för 500 ml medium, tillsätt 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 ml penicillin-streptomycin 100x och 10 ml D2O).
- Mät pH med en pH-mätare och justera vid behov till 7,4 genom att tillsätta HCl.
OBS: Vanligtvis är det ursprungliga pH-värdet mycket nära 7,4. - Filtrera bioreaktormediet med ett vakuumdrivet sterilfilter i en steril glasflaska på 250 ml eller 500 ml.
- I den laminära flödeshuven förseglar du flaskan med ett sterilt stålhuvudstycke med två slangmunstycken och ansluter dem till ett FEP-rör (o.d. = 1/8", i.d. = 1,6 mm) som kommer att anslutas till pumpen och till ett 0,22 μm PTFE-sprutfilter för luftintag.
- Lös upp 13,4 g DMEM-pulver i 1 liter ultrarent H2O.
2. Inställning av bioreaktor
- Montera flödesenheten med ett nmr-rör för andra flödesenhet, som senare kommer att ersättas med det som innehåller cellerna. Se flödesenhetens bruksanvisning för korrekt montering.
OBS: Vid denna tidpunkt bör flödesenheten redan rengöras (om inte, utför steg 4.2). - Ställ in vattenbadet som är anslutet till flödesenhetens temperaturreglering på 37 °C. Placera reservoarflaskan i vattenbadet.
- Anslut FEP-slangen på reservoarflaskan till pumpen.
- Vrid bioreaktorventilen för att "kringgå" och förfyll pumpen med medium.
- Vrid bioreaktorventilen till "flöde" och förfyll bioreaktorn med medium vid 0,1 ml/min.
3. Beredning av cellprovet
- Samla cellerna från CO2-inkubatorn .
- Ta en T75-kolv med transfekterade HEK293T-celler från CO2-inkubatorn och ta bort det förbrukade mediet.
- Tvätta cellerna två gånger med 7 ml (vardera) PBS vid rumstemperatur (~ 20 ° C).
- Använd 2 ml trypsin / EDTA för att lossa celler. Efter tillsats av lösningen, inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att lossa cellerna.
OBS: Transfekterade celler kan ta något längre tid att lossna. Inkubera vid behov cellerna vid 37 °C. - Inaktivera trypsin med 20 ml komplett DMEM; resuspendera cellerna noggrant genom pipettering upp och ner och överför dem i ett 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellerna vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Tvätta cellerna med 10 ml PBS vid rumstemperatur för att avlägsna restmediet.
- Centrifugera cellerna vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Överför cellpelleten till ett 1,5 ml täckt mikrocentrifugrör.
- Bädda in celler i agarostrådar.
- Smält en alikvot stelnad agaros vid 85 °C i ett vattenbad och förvara den därefter i lösning vid 37 °C i en blockvärmare.
- Fyll botten av flödesenheten NMR-röret med en Pasteur-pipett med 60-70 μL 1,5% agarosgel och lägg den i is. Detta kommer att skapa en ~ 5 mm hög bottenplugg som gör det möjligt att placera cellprovet inom den aktiva volymen på 1H NMR-spolen.
- Värm upp pelleten av celler erhållna i steg 3.1.8 vid 37 °C i 15−20 s i termoblocket.
- Resuspendceller i 450 μL agaroslösning. Var försiktig så att du undviker bildandet av bubblor.
- Aspirera cell-agarosupphängningen i en ~ 30 cm lång kromatografi PEEK-slang (i.d. = 0,75 mm) ansluten till en 1 ml spruta.
OBS: Före aspiration bör slangen och sprutens dödvolym förfyllas med PBS vid rumstemperatur för att undvika bildning av bubblor. Slangens längd är inte kritisk. - Låt slangen svalna i rumstemperatur i 2 min.
- Förfyll flödesenhetens NMR-rör med 100 μL PBS vid rumstemperatur.
- Gjutna trådar av celler inbäddade i agaros i flödesenheten NMR-rör genom att försiktigt trycka på sprutan.
OBS: För att fylla NMR-röret homogent, börja med att placera änden av PEEK-slangen längst ner på NMR-röret och fortsätt mot toppen medan du långsamt svänger vänster-höger. - Upprepa steg 3.2.5, 3.2.6 och 3.2.8 tills all cellagarossuspension har gjutits.
- Sätt in celler i bioreaktorn.
- Ta bort det tomma NMR-röret från flödesenheten och öka flödeshastigheten till 2 ml/min i några minuter för att avlägsna kvarvarande gasbubblor i inloppsslangen.
- Ställ in flödeshastigheten på 0,2 ml/min och sätt in NMR-röret som innehåller cellerna genom att trycka det uppåt långsamt men stadigt.
OBS: Det aktiva flödet av medium undviker återflödet av rörinnehåll genom inloppet, som annars skulle inträffa under insättningen.
4. Bioreaktor drift och rengöring
- Bioreaktoroperation under NMR-experimentet.
- Ställ in temperaturen i NMR-spektrometern på 310 K.
- Sätt i flödesenheten i spektrometern.
- Tillför bioreaktormediet med en flödeshastighet på 0,1 ml/min under hela NMR-experimentens varaktighet.
- Vid önskad tidpunkt under experimentet injicera en koncentrerad lösning av yttre molekyl till medelbehållarens flaska genom att genomborra silikonslangen med en steril långnålspruta.
OBS: Den slutliga koncentrationen av molekylen i mediet bör väljas baserat på tidigare kunskaper om celltoxicitet och, om tillgängligt, på den förutsagda/uppskattade diffusionshastigheten genom cellmembranet. - I slutet av NMR-experimentet, byt ut röret som innehåller cellerna med ett tomt rör och skölj flödesenheten med vatten.
- Bioreaktor ren-på-plats.
- Rengör flödesenheten genom att flöda följande lösningar vid 1 ml/min: 0,2 M natriumhydroxid (NaOH); 3 M citronsyra; 0,2 M NaOH, i minst 30 minuter vardera, följt av sterilfiltrerat ultrarent vatten i >2 timmar.
- Rengör och autoklavera behållarens flaska och slangaggregat efter varje körning.
5. NMR-experiment
- Inställning av NMR-experimenten.
OBS: Utför dessa steg i förväg, före beredningen av NMR-provet i cellen, för att undvika förseningar mellan cellinsamling och datainsamling.- Skapa en ny datauppsättning vid NMR-spektrometern och ställ in parametrarna för önskade NMR-experiment.
- Ställ in parametrar för 1D 1H NMR-experiment.
- Centrera 1H-bärfrekvensen vid 4,7 ppm på vattensignalen.
- Välj zgesgp-pulsprogrammet, ställ in spektralbredden till 20 ppm och en 1 000-μs 180 ° kvadratpuls för vattenundertryckning. Ställ in en fördröjning mellan skanningar på 1 s. Skaffa spektrumet med 32 skanningar.
- För celler som uttrycker omärkt CA II: välj pulsprogrammet p3919gp, ställ in spektralbredden till 30 ppm för att täcka spektrumets imino-region och justera fördröjningen för binomial vattenundertryckning så att den maximala excitationen centrerars vid de kemiska skiftningarna av signalerna av intresse (d7 = 20 μs vid 950 MHz). Ställ in en fördröjning för inter-scan på ≥1 s. Skaffa med 512 skanningar.
- För celler som uttrycker 15N-märkt SOD1: välj pulsprogrammet sfhmqf3gpph, ställ in spektralbredderna 1H och 15N till 16 respektive 50 ppm, den formade pulsförskjutnings- och excitationsbandbredden till 8,5 respektive 6 ppm och en 350 μs puls för frikopplingsschema (garp4 eller annat beroende på instrumentet). Ställ in en fördröjning mellan skanningar på 0,3 s. Skaffa med 16 skanningar och 128 steg i dimensionen 15N.
- NMR-spektraförvärv i realtid.
- När bioreaktorn har satts in i NMR-spektrometern, vänta några minuter för att möjliggöra utbyte av mediet.
OBS: Denna process övervakas enkelt från låssignalens utseende eftersom PBS ersätts med medium som innehåller 2% D2O. - Justera matchningen och inställningen av 1H-kanalen, shims magneten och beräkna 1H 90 ° hård pulslängd.
- Justera 1H-effektnivåerna i varje pulssekvens enligt 1H hård puls.
- Spela in ett första zgesgp 1H-spektrum för att kontrollera provinnehållet och fälthomogeniteten.
- Kopiera experimenten zgesgp och p3919gp/sfhmqcf3gpph till önskat tal och köa dem i förvärvsspolen.
OBS: zgesgp-spektra används endast för att kontrollera provets tillstånd och fälthomogeniteten. därför kan de antingen hoppas över eller spelas in mindre ofta. - För celler som uttrycker omärkt CA II: bearbeta p3919gp-spektra genom att tillämpa nollfyllning och exponentiell linjebreddningsfönsterfunktion (LB = 20 Hz).
- För celler som uttrycker 15N-märkt SOD1: bearbeta sfhmqcf3gpph-spektra genom att tillämpa nollfyllning och kvadratisk sinusklockfönsterfunktion (SSB = 2) i båda dimensionerna.
OBS: Storleken på de bearbetade spektra kan minskas ytterligare genom att ta bort regioner som är fria från signaler (i Topspin görs detta genom att ställa in önskade STSR- och STSI-värden).
- När bioreaktorn har satts in i NMR-spektrometern, vänta några minuter för att möjliggöra utbyte av mediet.
6. MCR-ALS-analys
- För analys av CA II-spektra importerar du 1D-spektralregioner i MATLAB R2019b.
- I programvaran skapar du en lista över experiment som ska exporteras i menyn Process Dataset List .
- Använd en modifierad version av au-programmet convbin2asc och exportera den spektralregion som är av intresse i ASCII-format för varje spektrum.
OBS: Detta skapar en textfil med namnet ascii-spec.txt i varje spektrumunderkatalog. - I MATLAB importerar du spektralregionerna med hjälp av det anpassade skriptet Load_ascii_spectra.
OBS: Detta skript kräver datauppsättningskatalogen som indata och producerar ett 2D-matrisspektra som innehåller de staplade 1D-spektra och en 1D-array cs som innehåller de kemiska skiftningarna. - Kör skriptet Load_acqus för att extrahera tidsstämplar från 1D-spektra.
OBS: Detta skript producerar en 1D-matris times_hours som innehåller tidssteget för varje spektrum uttryckt i timmar, med det ursprungliga spektrumet vid tiden = 0.
- För analys av SOD1-spektra, importera 2D-spektra i MATLAB R2020b.
- I Topspin skapar du en lista över experiment som ska exporteras på menyn Process Dataset List .
- I MATLAB importerar du 2D-spektra med hjälp av det anpassade skriptet Load_2D_spectra.
OBS: Detta skript kräver datauppsättningskatalogen som indata och producerar en 3D-matris Spectra som innehåller de staplade 2D-spektra och en 1D-array cs som innehåller de kemiska skiftningarna. - Kör skriptet Load_acqus för att extrahera tidsstämplar från 2D-spektra.
- Ange de spektralregioner som är av intresse för det anpassade skriptet Cut_2D_spectra och kör skriptet för att klippa ut 3D-undermatriser [(1H x 15N) spektralintensiteter) x tid]; omforma dem som 2D-matriser (tidpunkter x spektrala intensiteter) och sammanfoga dem.
OBS: Detta producerar en 2D-matris JoinSpec_flat som innehåller de omformade och sammanfogade spektralregionerna.
- Kör MCR-ALS 2.0 i GUI-läge.
- Öppna MCR-ALS 2.0 GUI genom att köra mcr_main skriptet.
- På fliken Dataval läser du in spektra eller JoinSpec_flat matris. Data kan plottas för kontroll.
- Utvärdera antalet komponenter antingen med Singular Value Decomposition (SVD) eller manuellt.
OBS: Antalet komponenter bör motsvara antalet distinkta arter som finns i experimentet. I detta fall n = 2, motsvarande det fria och bundna proteinet. - Välj en metod för den första uppskattningen av de rena spektra. Antingen renaste variabeldetektion eller Evolving Factor Analysis (EFA) kan användas.
- I fönstret Val av datauppsättning väljer du Fortsätt.
- Ange begränsningarna för koncentrationerna i fönstret Begränsningar: Radläge . Tillämpa en icke-negativitetsbegränsning, välj fnnls (Fast nonnegativity-constrained least-squares) som "implementation and 2 species". Applicera 1 stängningsbegränsning, ställ in begränsningen till 1, stängningsvillkoret som "lika med" och gäller för alla arter.
OBS: Detta tvingar summan av varje arts koncentrationer att vara lika med 1, så att de erhållna profilerna för varje art normaliseras med avseende på den totala proteinkoncentrationen. - Ange begränsningarna för spektra i fönstret Begränsningar: Kolumnläge . Tillämpa en icke-negativitetsbegränsning, välj fnnls som "implementering och 2 arter".
OBS: Denna begränsning bör inte tillämpas om negativa signaler finns i NMR-spektra. - I det sista fönstret anger du 50 iterationer och 0,01 konvergenskriterium. Ange utdatanamnen för Koncentrationer, Spektra och Std. avvikelse. Klicka på Fortsätt för att köra MCR-ALS-kopplingen.
OBS: Ett grafiskt fönster visar resultatet av monteringen med diagram över koncentrationsprofilerna och spektra för de rena komponenterna. - För SOD1-datauppsättningen: Använd det anpassade skriptet Rebuild_2D_spectra för att rekonstruera 2D-spektralregionerna från 1D-utdata från MCR-ALS och rita dem.
7. Trypan blått test
- Återvinn NMR-rörinnehållet med en Pasteur-pipett och överför agarosgängorna till ett 1,5 ml täckt rör.
- Ta bort restmediet genom att skölja agarostrådarna med 600 μL PBS och centrifugera dem vid 4 000 x g i 1 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 250 μL PBS och 50 μL 0,4% trypanblå lösning.
- Inkubera i 2 min med kontinuerlig pipettering.
- Tvätta två gånger med 600 μL PBS och kassera supernatanten.
- Lägg några agarostrådar på en mikroskopbild och hugga dem med rakblad för att skapa små skivor gel. Välj de tunnaste skivorna (tjocklek < 0,4 mm, helst ~ 0,2 mm) för analysen.
- Överför gelskivorna till en självtillverkad cellräkningskammare bestående av två glasskivor åtskilda av tre lager paraffinfilm (~ 0,4 mm total tjocklek) på varje sida.
OBS: En kammarbild kan också användas; gelskivorna tjockare än kammarhöjden (0,1 mm) skulle emellertid pressas och brista de inbäddade cellerna. - Skaffa bilder av celler inuti agarosen och räkna vita och blå celler.
- Beräkna cellviabilitet som (totala celler - blå celler) / totala celler.
Representative Results
Ovanstående protokoll möjliggör inkapsling av celler i trådar av hydrogel för att maximera cellviabiliteten under långa tidsperioder, vilket är nödvändigt för att undersöka intracellulära processer i realtid. I bioreaktorn hålls cellerna levande och metaboliskt aktiva upp till 72 timmar, vilket bekräftas av Trypan blue test (Figur 2a-c). I princip kan detta protokoll tillämpas för att observera ett intracellulärt protein av intresse som genomgår konformations- eller kemiska förändringar. I den första applikationen som beskrivs ovan appliceras bioreaktorn för att i realtid övervaka bindningen av två hämmare, AAZ och MZA, till CA II överuttryckt i cytosolen hos HEK293T-celler. Det första 1H-excitationsskulpteringsspektrumet (zgesgp) som registrerats används för att bedöma den totala signalintensiteten (som är proportionell mot antalet celler), närvaron av signaler från det överuttryckta proteinet och fälthomogeniteten (Figur 2d). När det gäller CA II kan den intracellulära bindningen av de två hämmarna övervakas av WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR-spektra (p3919gp) genom att observera 1H-signaler i regionen mellan 11 och 16 ppm. Dessa signaler härrör från zinkkoordinerande histidiner och andra aromatiska rester av CA II36 och störs av ligandbindning14,15. Ligandkoncentrationer kan väljas baserat på diffusionshastigheten eller, om tillgängligt, från tidigare fastställda permeabilitetsvärden14. Framgångsrik bindning bekräftas visuellt av utseendet på en ytterligare uppsättning signaler i spektralområdet av intresse, som gradvis ersätter de ursprungliga signalerna (figur 3). Tidsberoende bindningskurvor erhålls genom MCR-ALS-analys, som separerar de två uppsättningarna NMR-signaler som härrör från fri och bunden CA II (figur 4a) och samtidigt ger de relativa koncentrationsprofilerna för de två arterna (figur 4b). I den andra applikationen appliceras bioreaktorn för att övervaka bildandet av zinkbunden SOD1 intramolekylär disulfidbindning som främjas av ebselen, en glutationperoxidasmimetisk, i humana celler. Denna process övervakas genom att observera förändringar i 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37-spektra (som ger ett fingeravtryck av proteinets ryggradskonformation) orsakade av störningar i proteinstrukturen inducerad av disulfidbindningsbildningen. Ytterligare signaler som härrör från disulfidoxiderad SOD1 uppträder i 1H-15N-spektrumet och ersätter gradvis de från disulfidreducerad SOD1. MCR-ALS-analys på utvalda regioner i 2D-spektrumet separerar signalerna från de två arterna (figur 5a) och ger deras relativa koncentrationsprofiler (figur 5b). De erhållna koncentrationskurvorna kan analyseras ytterligare genom icke-linjär anpassning för att ge information om kinetiken hos de processer som studeras25.
Figur 1: Schema för bioreaktorn. Vänster: tvärsnittsvy av den tomma flödesenheten. Höger: schema för bioreaktorinställningen. PEEK-inloppsslangen visas i grönt; PTFE-utloppsslangen visas i blått. Den vänstra panelen återges med tillstånd från Luchinat et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Trypan Blue Test på inkapslade celler och provkontroll med 1H NMR. Representativa skivor av agaros innehållande inbäddade celler och betsade med Trypanblått (a) omedelbart efter gjutning och (b) efter 72 timmar i bioreaktorn; c) Cellviabilitet som en funktion av tiden i NMR-bioreaktorn under aktivt flöde (svart) och under statiska förhållanden (rött), mätt med Trypan Blue Test. d) zgesgp 1H NMR-spektra registrerade på agarosinbäddade celler som överuttrycker CA II i frånvaro (svart) och i närvaro (röd) av gasbubblor i bioreaktorn. I det senare fallet orsakar minskad fälthomogenitet linjebreddning och utseendet på lösningsmedelsundertryckningsartefakter. Intressanta spektrala egenskaper är märkta. Paneler (a-c) reproduceras med tillstånd från Luchinat et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa realtidsdata från 1H NMR i cellen erhållna på agarosinkapslade celler i bioreaktorn. Vattenfallsdiagram av 1D 1H NMR-spektra (region mellan 15,6 och 11,1 ppm) av HEK293T-celler som överuttrycker CA II och därefter behandlas med (a) 25 μM AAZ och (b) 10 μM MZA, registrerade som en funktion av tiden i NMR-bioreaktorn. Tiden för ligandbehandling visas med en pil. Spektralintensiteten (a.u.) är färgkodad från blått (lägst) till gult (högst). Denna siffra återges med tillstånd från Luchinat et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ MCR-ALS-utgång från 1D NMR-spektra. (a) 1H NMR-spektra av de rena komponenter som rekonstruerats av MCR-ALS: CA II i frånvaro av ligander (svart) och i komplexet med AAZ (röd) eller MZA (magenta); b) Relativa koncentrationsprofiler för fri (svart) och bunden CA II som en funktion av tiden vid tillsats av AAZ (röd) eller MZA (magenta) erhållen med MCR-ALS. Tider för ligandbehandling är markerade med pilar. Denna siffra återges med tillstånd från Luchinat et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativ MCR-ALS-utgång från 2D NMR-spektra. (a) 1H-15N spektralregioner (märkta I-IV) av de rena komponenterna rekonstruerade av MCR-ALS: disulfidreducerad SOD1 (svart) och disulfidoxiderad SOD1 (röd); b) Den relativa koncentrationsprofilen för de rena beståndsdelarna som en funktion av tiden vid tillsats av ebselen (märkt med en pil) erhållen med MCR-ALS. Denna siffra återges med tillstånd från Luchinat et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Syftet med att använda en bioreaktor för NMR-experiment i celler är att hålla cellerna vid liv och metaboliskt aktiva under en längre tid. Ett antal kritiska aspekter måste beaktas för att uppnå detta mål. För det första är det av största vikt att undvika bakteriell kontaminering vid framställning av cellprovet och under NMR-datainsamlingen. Om stammar av E. coli eller andra bakterier som vanligtvis används för genkloning och rekombinant proteinuttryck används i laboratoriet, kan de förorena cellerna under provberedningen. En gång i bioreaktorn kommer bakterierna att växa snabbt och utnyttja det färska tillväxtmediet och kommer att orsaka celldöd på grund av produktionen av endotoxiner. Bakteriell kontaminering upptäcks bara i ett avancerat skede, när det blir tillväxtmediet gult och grumligt. Dessutom kan ofullständig rengöring av bioreaktorn orsaka kontaminering av pumpen eller slangen med bakterier, jäst eller vanliga mögel.
Ett krav för experimentets framgång är undvikandet av gasbubbelbildning. Gasbubblor som fångas mellan agarostrådarna i NMR-spolens aktiva volym skulle införa stora magnetfältsinhomogeniteter, vilket orsakar ofullständig undertryckning av H2O-signalen och allvarlig förlust av spektral kvalitet (Figur 2d). Bubblor kan orsakas av luft som fångas i systemet eller av bildandet av gasformig CO2. Den förstnämnda kan lätt undvikas genom att spola systemet med medium innan cellprovet sätts in, medan det för att undvika det senare rekommenderas att minska koncentrationen av NaHCO3 i tillväxtmediet och att hålla alla delar av systemet vid en konstant temperatur för att minimera skillnader i CO2-lösligheten. Cellulär aerob metabolism kan också orsaka bildandet av gasformig CO2, vilket kan förhindras genom att öka flödeshastigheten.
Cellviabilitet bör kontrolleras efter varje körning av Trypan Blue Test. Det ger dock inte insikter om den metaboliska aktiviteten. För att få en mer fullständig bild av cellernas metaboliska tillstånd under bioreaktoroperationen kan 31P NMR-spektra utföras för att bedöma produktionen av ATP som en funktion av tiden23,25. En särskild sond är dock ofta nödvändig för denna mätning, vilket kan möjliggöra samtidig inspelning med 1H NMR.
När det gäller CA II underlättar närvaron av välupplösta reportersignaler i en ovanlig region i 1H-spektrumet analysen från enkla 1D NMR-spektra och kräver inte isotopanrikning under proteinuttryck. I allmänhet kan andra proteiner ge upphov till 1H-signaler som är användbara för övervakning av spektrala förändringar i andra regioner, såsom den som är typisk för proteinhydrofob kärnan mellan 0 och -1 ppm11; Dessa regioner tenderar dock att vara trånga för vikta proteiner större än ~ 10 kDa. I detta fall, som visas för SOD1, är det att föredra att berika proteinet med 15N, genom att tillhandahålla enhetligt 15N-berikat tillväxtmedium under proteinuttryck och att övervaka realtidsförändringar i 2D 1H-15N NMR-spektra. 2D-spektra importeras som en 2D-matris i MATLAB, omarrangeras till 1D-matriser och staplas före MCR-ALS-analys. Det senare tillvägagångssättet är allmänt tillämpligt på alla intracellulära proteiner som ger upphov till detekterbara signaler och ger information om proteinkonformationsförändringar på den enda resthalten. I princip kan det senare tillvägagångssättet generaliseras till nD-spektra och till andra isotopmärkningsscheman.
När det gäller applicering på olika typer av celler bör protokollet enkelt anpassas till olika cellinjer och kräver inte att proteinet av intresse uttrycks direkt i cellerna. Därför kan andra metoder för NMR i celler kombineras med detta protokoll, där makromolekylen av intresse produceras rekombinant eller syntetiseras och därefter sätts in i cellerna genom elektroporering eller genom andra leveransmetoder1,9,38. Vid arbete med olika cellinjer eller provberedningsprotokoll kan parametrar som agaroskoncentrationen, trådtjockleken och den slutliga celldensiteten i agarostrådarna behöva optimeras empiriskt. Vidare är tillämpligheten av protokollet som beskrivs här begränsat till celler som tolererar agarosinkapsling. Andra celltyper kan kräva olika hydrogelformuleringar, medan en annan inställning rekommenderas vid analys av celler som växer inbyggt i suspension, till exempel med användning av ett koaxialt mikrodialysmembran för att säkerställa näringsdiffusion samtidigt som suspenderade celler hålls begränsade i NMR-röret23.
Jämfört med andra NMR-bioreaktorkonstruktioner19,20,21,22 förlitar sig den enhet som beskrivs här på en kommersiellt tillgänglig flödesenhet, anpassad med mindre modifieringar. Därför kan enheten enkelt replikeras i olika laboratorier med hög reproducerbarhet. Dessutom möjliggör det standardiserad drift och full överensstämmelse med strikta laboratoriesäkerhetsbestämmelser, om det behövs. Sammantaget bör bioreaktorns flexibilitet och användarvänlighet möjliggöra många andra tillämpningar av NMR-lösningen, både i celler och in vitro, utöver dem som redan rapporterats23,25. Så småningom kan samma bioreaktordesign tillämpas på prover som liknar mer av den fysiologiska miljön i en vävnad, såsom sfäroider eller organoider, förutsatt att lämpliga byggnadsställningar hittas för att hålla sådana prover vid liv - eller till och med upprätthålla deras tillväxt - i NMR-spektrometern.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete har fått stöd av iNEXT-Discovery, bidragsnummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program, av Instruct-ULTRA, bidragsnummer 731005, ett EU H2020-projekt för att vidareutveckla Tjänsterna från Instruct-ERIC, och av Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN-bidrag 20177XJCHX. Författarna erkänner stödet från Instruct-ERIC, ett Landmark ESFRI-projekt, genom JRA Award nummer 815 och användningen av resurser från CERM / CIRMMP Italy Centre. Vi tackar Matteo Pennestri (Bruker, Storbritannien) för att ha gett stöd till InsightMR-flödesenhetsdriften.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| D2O | Sigma-Aldrich | 453366 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10313-021 | |
| DMEM, high glucose, powder | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030 | |
| Low-gelling agarose, powder | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| NaHCO3, powder | Carlo Erba | 478537 | |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| NaOH, pellets | Sigma-Aldrich | 30620 | |
| Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | T8154 | Hazard statement(s): H350 may cause cancer. |
| Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe | Bruker | n/a | All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible. |
| InsightMR flow unit | Bruker | n/a | |
| P-920 pump module from ÄKTA FPLC | GE Healthcare | n/a | Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit. |
References
- Inomata, K., et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells. Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).
- Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, Pt 2 108-118 (2017).
- Dzatko, S., et al. Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).
- Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation. Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).
- Tanaka, T., et al. High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).
- Siegal, G., Selenko, P.
- Banci, L., et al. Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR. Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).
- Luchinat, E., et al. In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants. Nature Communications. 5, 5502 (2014).
- Theillet, F. -X., et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).
- Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).
- Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. Visualization of redox-controlled protein fold in living cells. Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).
- Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR. Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).
- Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR. Scientific Reports. 5, 14456 (2015).
- Luchinat, E., et al. Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).
- Luchinat, E., et al. Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR. ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).
- DeMott, C. M., et al. Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening. ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).
- Krafcikova, M., et al. Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).
- Broft, P., et al. In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
- Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. A bioreactor for in-cell protein NMR. Journal of magnetic resonance. 202 (2), San Diego, Calif. 140-146 (2010).
- Kubo, S., et al. A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).
- Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells. Chemical Communications. 53 (81), Cambridge, England. 11245-11248 (2017).
- Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions. Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).
- Cerofolini, L., et al. Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).
- Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR. Communications Biology. 3, (2020).
- Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution. Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).
- Koczula, K. M., et al. Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche. Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).
- Alshamleh, I., et al. Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).
- Supuran, C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).
- Neri, D., Supuran, C. T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).
- Alterio, V., Di Fiore, A., D'Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms. Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).
- Capper, M. J., et al. The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation. Nature Communications. 9 (1), 1693 (2018).
- Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
- Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
- Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).
- Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).
- Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).
- Schanda, P., Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds. Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).
- Ogino, S., et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).
