임상 관련성 및 메커니즘을 검사 하는 연구에 대 한 모델을 사용 하 여 쥐에 짧은 기간 저온증 유도

Summary

이 문서는 쥐에 있는 전신 단기간 저체온증 유도의 2개의 방법을 설명합니다. 첫 번째 빠른 유도 방법은 온도의 급격한 감소를 위해 팬과 에탄올 스프레이를 사용하여 능동 냉각을 사용합니다. 두 번째 방법은 점진적 냉각 방법입니다. 이것은 이소플루란 마취의 조합과 홈더믹 히트 매트에 온도 설정의 감소를 사용하여 달성된다. 이로 인해 외부 냉각 장치를 사용하지 않고도 코어 체온이 점진적으로 감소합니다. 

Abstract

치료 저체온증 (TH)은 신경 장애의 전 임상 연구에서 신경 보호에 대한 강력한 증거를 제공 한 강력한 신경 보호 전략입니다. 강력한 전 임상 증거에도 불구 하 고, TH는 대부분의 신경 장애의 임상 시험에서 효능을 표시 하지 않은. 치료 저체온증을 채택 하는 유일한 성공적인 재판 성인에서 심장 마비와 신생아에 저 산소 허 혈 손상관련. 그것의 사용의 매개 변수에 대한 추가 조사, 그리고 사전 임상 및 임상 연구 사이의 연구 디자인 비교, 보증. 이 문서에서는 단기 저체온증 유도의 두 가지 방법을 보여줍니다. 첫 번째 방법은 에탄올 스프레이와 팬을 사용하여 쥐의 급속한 저체온증 유도를 허용합니다. 이 방법은 임상 시험에서 덜 일반적으로 사용 되었으며 다른 생리 적 효과 있을 수 있습니다 피부를 냉각 하 여 작동. 냉각은 표면적 대 부피 비율의 차이로 인해 인간 환자에서 달성 할 수있는 것보다이 기술로 훨씬 더 빠름입니다. 이와 함께, 두 번째 방법은 또한 짧은 기간 저체온증에 대한 임상적으로 달성 가능한 냉각 속도를 허용, 제시된다. 이 방법은 구현하기 쉽고 재현 가능하며 활성 피부 냉각이 필요하지 않습니다.

Introduction

TH는 장기/시스템^1,2의생존력과 기능을 보존하기 위해 신체 또는 뇌 온도를 냉각하는 관행이다. 신경보호에서 저체온증의 역할이 조사되고 뇌졸중^3,지주 혈역^4,외상성 뇌 손상^5와같은 신경 질환의 전임상 모델범위에서 이점을 보여주고 있다. 임상 적용의 관점에서, TH는 심장 마비 후 및 신생아 저산소 허혈성 상해^6에서환자에서 효능을 보여주었습니다.

TH 유도는 표면 또는 혈관 내 냉각 방법을 사용하여 달성됩니다. 대부분의 임상 저체온증 연구는 동물의 털에 물이나 에탄올을 적용하거나 냉각 담요를 사용하여 표적 온도^1을달성함으로써 표면 냉각을 수행합니다. 인간에서는 얼음 팩과 냉각 담요^7,8을사용하여 전신 표면 냉각을 달성합니다. 더 빠른 냉각은 정맥 내 또는 동맥 내 카테터를 통해 감기 식염수의 유도 주입을 결합하는 혈관 내 방법을 사용하는 환자에서 열등한 정맥 카바^9,10내의 혈관 내 냉각 장치를 배치한 것으로 나타났다. 예를 들어, 33°C의 적당한 표적 온도는^{환자(11)에서}표면 냉각을 가진 3-4h에 비해 혈관 내 냉각으로 1.5h로 도달할 수 있다. 혈관 내 접근법은 또한 최근 몇 년 동안 에 더 인기를 끌고있다 때문에 그것은 떨고 등 전신 표면 냉각에서 본 부작용의 일부를 줄이기 위해 보고 되었습니다 때문에^12,13. 유럽 의 멀티 센터, 허혈성 뇌졸중 (EUROHYP-1)에 대한 저체온증의 무작위 단계 III 임상 시험은 주로 표면 냉각^14를사용했다. 최근 이 시험에서 발표된 결과는 떨리는 것이 주요 합병증이며 목표 온도^10을달성하는 능력을 제한했을 수 있음을 보여주었다. 떨리는 반응은 주로 피부 온도에 의해 구동되는 것으로 알려져 있습니다. 설치류 혈관 내 냉각 방법^(15)을개발하기 위한 몇 가지 노력이 이루어졌지만, 인간에 사용된 것과 비교하여 기술의 매우 침습적 특성은 해당 모델에서 얻은 결과를 혼동할 위험이 있습니다.

온도는 신체의 생물학적 과정의 핵심 변조기이며 항상성에 의해 엄격하게 조절됩니다. 따라서 체온을 조작하면 관련 위험이 있을 수 있습니다. 냉각 기간은 저체온증 임상 시험의 성공을 제한할 수 있는 요인입니다. 이러한 예심은 24-72 h^11에서저체온증을 유지하는 많은 장기 냉각 방법을 사용합니다. 이 연장된 기간은 냉각 프로토콜 도중 감염을 위한 리스크를 제기합니다. 폐렴은 저체온증에서 가장 흔한 합병증으로, 시술^13을겪는 환자의 40-50 % 사이에 영향을 미칩니다. 이것은 단기 패러다임이 사용되는 저체온증의 동물 연구에서 일반적으로 볼 수있는 것과 는 대조적이다 (1-6 h)^3. 이러한 전 임상 동물 연구의 성공 가능성이 임상 시험에서 사용에 대 한 단기 저체 온 증의 적응 귀 착될 것 이다. 그 결과, 향후 임상 시험의 냉각 속도와 유사한 단기 저체온증의 동물 모델이 필요합니다. 다른 온도 매개 변수 및 단기 저체온증의 유효성에 관한 자세한 내용은 여러 검토 기사^{1,16,17,18에서}논의되었다.

여기에서 입증된 현재 실험 저체온증 모델보다 임상적으로 달성 가능한 냉각의 점진적인 모델입니다. 이 새로운 방법은 냉각 속도가 훨씬 느리므로, 대상 온도는 저체온증^11의임상 시험에서 본 사람들의 범위에 가깝습니다. 또한 특정 생리학적 효과를 가지는 직접 표면 냉각을 방지하고, 따라서 임상 시험^9,12에서가장 일반적으로 사용되는 냉각 방법이었던 혈관 내^냉각과더 유사할 수 있다. 이 모델은 동물을 2시간 이상 점차적으로 냉각한 다음 목표 온도에서 단기간에 유지보수할 수 있습니다. 또한, 급속 냉각 단기 저체온증^{방법(19)도} 입증된다. 빠른 냉각 방법은 저체온증 발병 후 대상 온도를 빠르게 달성할 수 있게 합니다. 이 방법은 점진적 냉각 방법으로 임상적으로 관련이 없지만, 잠재적으로 그것의 강력한 신경 보호 효과 약리적으로 모방하는 저체온증 신경 보호의 기계장치를 탐구하는 것을 목표로 하는 연구 결과에 유용합니다. 이 방법은 또한 신경 과학 의 외부 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있으며, 전 임상 연구의 수에 적응 할 수있다. 다른 방법에 비해 두 방법의 또 다른 장점은 저렴하고 전문 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 또한 수술 후 온난화 및 모니터링이 부주의한 수술 후 저체온증을 방지하는 데 중요하기 때문에, 연구 결과^20을혼동할 가능성이 있기 때문에 온도 데이터로거의 이식을 보여줍니다.

Protocol

모든 실험 절차는 과학적 목적을 위해 동물의 관리 및 사용을위한 호주 관행 규범에 따라 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회 (A-2013-343 및 A-2020-003)에 의해 승인되었습니다. 아래에 설명된 저체온증 유도 방법 외에도, 다음과 같은 프로토콜은 저체온증과 함께 일상적으로 수행됩니다: 혈압과 심박수를 모니터링하는 대모랄 라인^{캐너레이션(21)}및 실험적인^{뇌졸중(22).}

1. 데이터로거 이식

참고: 이 프로토콜에 사용된 데이터로거 장치는 체온을 실시간으로 판독할 수 없었습니다. 데이터 로거가 동물에서 제거되고 컴퓨터에 다시 연결되면 판독이 가능합니다. 그 결과, 직장 온도 프로브는 냉각 및 재웜 과정에서 실시간 정보를 제공하는 데 사용됩니다. 또한, 직장 프로브는 또한 이 방법에 필수적이다 때문에 수술 중에 동물이 배치되는 수술 열 매트는 직장 프로브 시스템에 의해 조절되기 때문이다. datalogger는 또한 자유롭게 움직이는, 깨어 있는 쥐에 있는 온도 데이터를 제공하는 귀중한 목적을 제공하고 정규 화 후 정상 체온이 유지되도록 하는 데 중요합니다. 따라서 이 프로토콜에는 두 온도 모니터링 장치가 모두 중요합니다.

1. 50% N₂ 및 50% O₂ 혼합물에서 이소플루란(유도용 5%, 유지 보수의 경우 2-2.5%)을 가진 10-12주 된 남성 외식 위스타 쥐를 마취시합니다.
2. 유도에 따라, 수술 열 매트에 경향이 위치에 쥐를 배치합니다.
3. 코가 코 콘에 앉아 있도록 쥐를 배치합니다. 수술용 테이프로 코를 고정하여 가스가 빠져나가지 않도록 하십시오.
4. 오른쪽 아래 복부에서 털을 면도하고 국소 마취제, 부피바카인 0.2 mL, 0.05 %로 피하 부위를 피하한다.
5. 갓 면도된 부위에 방부제 용액을 적용합니다.
6. 살균 수술 도구를 사용하여 오른쪽 허벅지에 근접한 오른쪽 복부 부위를 따라 2cm 세로 절개를 합니다. 복부 허벅지 주름의 공간을 노출할 수 있을 만큼 절개를 깊게 만듭니다.
7. hemostats와 집게를 사용하여 장치를 보유 할 만큼 큰 피부 아래에 '포켓'을 만듭니다.
8. 온도 모니터링 데이터로거 장치를 주머니에 넣고 5-0 실크 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 닫습니다. 여기에 기재된 피하 방법은 덜 침습적이고 절차 후 더 나은 회복을 허용하기 때문에 복막 내 방법에 바람직하다.
9. 온도 모니터링을 위해 데이터 로거와 직장 프로브가 교차 보정되었는지 확인합니다(토론 참조).
10. 데이터 로거가 삽입 후 동물의 열 매트에 대해 쉬지 않도록 하십시오.

도 1: 데이터로거 장치의 이식. (A)왼쪽에서 오른쪽으로 패널이 쥐의 하복부 의 오른쪽에 약 2cm의 절개를 표시한다. (B)온도 모니터링 데이터로거는 포켓 절개에 피하삽입하였다. (C)절개는 나일론 봉합사로 닫혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 기계학 연구를위한 활성 (빠른) 저체온증의 유도

1. 저체온증을 위해 설정합니다(그림 2참조). 쥐의 몸 의 양쪽에 클램프가있는 두 개의 레토르트 스탠드를 놓습니다.
2. 60mm 12 v/130 mA 팬을 각 레토르트 스탠드에 부착하여 팬이 쥐의 허리를 향하도록 합니다. 클램프와 쥐 사이의 거리는 약 20cm입니다. 사용된 팬의 속도는 4,000rpm이어야 합니다.
3. 옆면이나 세 번째 레토르트 스탠드에 동물 열램프를 준비하십시오.
4. 원하는 대상 온도에 동물 열 매트를 조정 하 여 저체온증을 시작 합니다. 이 예에서, 32.5°C는 목표 온도(온도 제어 부상에서 3.75)이다.
5. 두 팬을 켜고 쥐의 허리에 70 % 에탄올 (표준 플라스틱 스프레이 병)의 3 ~ 4 스프레이를 적용합니다. 더 빠른 냉각 유도를 위해 살포 할 때 동물 모피를 주름.
   참고: 에탄올은 증발 속도가 빠르기 때문에 물에 비해 바람직한 용액으로 사용되므로 더 빠른 저체온증 유도가 발생합니다.
6. 이는 목표 온도의 과다 촬영에 기여할 수 있기 때문에 모피를 과포화하지 않도록 주의하십시오.
   참고: 팬들은 에탄올 증발및 냉각 공정을 가속화합니다.
7. 쥐의 직장 온도를 주시하면서 에탄올 응용 프로그램 사이의 짧은 간격을 허용합니다.
8. 직장 온도가 목표 온도의 1 °C 이내로 도달하면 에탄올의 추가 적용을 중단하십시오.
9. 온도가 목표 온도의 0.5 °C 이내에 도달하면 두 팬을 끕니다 (이 경우 33 °C).
   참고: 대상 온도에 도달하기 전에 팬을 끄면 쥐가 필요한 온도를 초과하여 과냉각되는 것을 방지할 수 있습니다.
10. 온도가 32.5 °C로 떨어지도록 합니다.
    1. 과냉각이 발생하면 동물 열램프를 사용하여 동물을 다시 대상으로 약간 따뜻하게 하십시오. 한 팬의 도움으로 인해 오버슈트가 다시 발생하지 않도록 할 수 있습니다.
11. 목표 온도에 도달하고 안정화되면 온도를 계속 모니터링합니다. 온도는 일반적으로 살포, 팬 의 사용 또는 열 램프의 사용없이 저체온증 기간의 나머지 부분에 대한 매우 안정적으로 유지됩니다.
12. 저체온증의 끝에서 동물을 다시 데우기 위해 열 매트 온도를 다시 37 °C (이 예에 사용되는 온도 제어 장치에 6)로 조정하고 동물이 30 분 동안 열조절을 할 수 있도록합니다.
    참고: 온도 제어 장치의 온도 설정은 다를 수 있으므로 개별 장치에서 대상 저체온증 및 normothermia에 대한 설정을 결정해야 할 수 있습니다.

3. 활성 피부 냉각 없이 임상적으로 달성 가능한 점진적 발병 저체온증의 유도

1. 필요한 목표 온도로 작은 증분에서 주부열 매트를 규제하는 코어 온도의 온도를 감소시킴으로써 저체온증을 달성한다. 그림 예에서(도 3B),30분마다 1°C 증분이 사용되었다.
2. 원하는 기간 동안 온도를 대상으로 동물을 냉각시(설명된 예에서 2h). 냉각되면 원하는 간격을 위해 대상에서 유지합니다. 일반적으로 원하는 대상 온도에 대해 설정된 홈더믹 히트 매트에서 유지되는 경우 더 이상 개입이 필요하지 않습니다.
3. 마취가 코어 체온의 정상적인 조절을 방지하기 때문에 이 프로토콜에는 외부 냉각이 필요하지 않습니다.
   참고: 저체온증으로 이소플루란 요구 사항이 감소합니다. 대부분의 동물에서는 2%의 시작 이소플루란 농도를 20-30분마다 0.1%씩 감소시킬 수 있어 안정된 호흡률(>50 호흡/분), 심박수 및 혈압을 유지하고 반사 반응억제를 유지할 수 있다.
4. 저체온증 후 동물을 다시 데우기 위해 열 매트를 조정하여 동물이 원하는 간격으로 다시 따뜻하도록 합니다. 예에서, 37°C(예에 사용된 FHC 온도 제어 부상에서 6)로 의 단일 조정으로 재보온은 30분 동안 달성되었다.
   1. 동물 회복이 필요한 장기 연구의 경우, 동물이 열 조절을 허용하고 우발적 인 수술 후 저체온증을 피하기 위해 열 매트 위에 반쯤 놓인 케이지에 동물을 유지하십시오.
   2. 직장 파라세타몰 (250 mg/kg) 복구 및 ovrenight 통증 완화를 위해 관리 될 수 있습니다. 피하 식염수 주사 (2 x 1.5 mL)는 마취 및 외과 수술로 인한 탈수를 방지하기 위해 주어질 수 있습니다.

Representative Results

도 3A는 Wistar 쥐가 급속냉각 접근법을 사용하여 저체온증에 어떻게 반응하는지를 나타내는 표현이다. 저체온증 유도는 팬과 70 %의 에탄올 스프레이의 사용에 의해 달성된다. 32.5°C의 표적에 저체온증은 15분 에서 달성된다. 대상 온도를 유지하기 위해 팬/열램프와 에탄올 스프레이를 사용하는 것 사이의 섬세한 상호 작용을 보장하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 도 3A에서볼 수 있듯이, 약간의 온도 오버슈트가 관찰되며, 이는 냉각이 목표 온도보다 약 0.5°C에서 중단되지 않으면 발생할 수 있다. 대상은 30분 마크에서 유지 및 안정화되고 1.5h에서 다시 예열이 시작됩니다.

도 3B는 목표 온도가 33°C로 2h에서 도달하고 2.5h로 다시 들기 전에 30분 동안 유지되는 점진적 프로토콜을 나타낸다. 여기서 온도는 목표 온도에 도달하는 데 필요한 지속 시간을 연장하는 증분으로 조정됩니다. 두 그래프의 수직 점선은 냉각 기간을 나타냅니다.

도 3A 및 도 3B는 데이터로거 장치에서 가져옵니다. 실험이 시작될 때 데이터로거는 이식 전에 레코딩을 시작하도록 프로그래밍됩니다. 실험이 끝나면 데이터로거는 동물에서 제거되고 USB 포트를 통해 제공된 온도 판독기에 연결됩니다. 소프트웨어(예: e온도)는 데이터를 읽고 생성하여 스프레드시트 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다.

그림 2: 급속 냉각 프로토콜의 설정. (A)두 개의 팬(검정 화살표)이 쥐의 하부 후면 영역에 위치하였다. 저체온증 개시시, 두 팬이 켜졌고 에탄올 스프레이가 허리에 적용되었습니다. 에탄올과 팬의 조합은 저체온증을 용이하게 하고 가속화하여 목표 온도를 빠르게 달성합니다. (B)저체온증 오버슈트를 방지하기 위해 열램프(흰색 화살표)를 사용하였다. 목표 온도에 도달하면, 열램프는 쥐 코어 온도가 더 낮은 떨어지는 것을 방지하기 위해 사용되었다. 대상이 안정화되면 열램프 및/또는 남은 팬이 꺼졌습니다.

도 3: 활성(A) 및 점진적(B) 방법을 이용한 저체온증 유도제(A) 표적 온도는 활성 냉각 공정을 이용하여 15분 만에 도달하고 동물이 다시 따뜻우리화되기 전에 위의 예에서 60분 동안 유지하였다. (B)점진적 냉각 방법을 사용하여 2시간 동안 표적 온도에 도달하고 동물이 다시 따뜻우기 전에 30분 동안 유지하였다. 두 그래프의 그늘진 영역은 목표 온도가 유지되는 시간 지점을 나타냅니다. 두 그래프의 점선 수직 선은 전체 냉각 지속 시간을 참조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에 설명된 절차는 쉽게 구현되고, 비침습적이며, 코어 체온에서 원하는 목표 온도로 안정적이고 재현 가능한 감소를 제공한다.

다음과 같은 신속한 냉각 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 에탄올 스프레이를 과포화하지 마십시오 - 이 결과를 방해하기 때문에 에탄올에 동물을 담그지 않도록주의해야합니다. 저체온증 유도 중에 동물을 모니터링- 주의는 밀접하게 빠른 저체온증 유도에 동물 반응을 모니터링하기 위해 취해야한다. 직장 온도의 가까운 시계는 온도가 원하는 대상 이하로 이동하지 않도록하는 것이 중요합니다 - 이 경우, 팬을 끄고 열 램프가 부드럽게 필요한 대상까지 동물을 다시 따뜻하게 할 수 있도록.

두 방법 모두에서 생리적 모니터링은 마취 용량의 적절한 조정을 보장하는 것이 중요합니다. 장기간 냉각을 위해, 부적당한 마취량은 냉각의 기간을 연장할 수 있습니다. 이 경우 적절한 냉각 속도가 이루어질 때까지 이소플루란 농도를 증가시킬 수 있다. 또 다른 중요한 단계는 온도 장치의 교차 보정입니다. 동일한 실험에서 온도 프로브 규제 히트 매트 및 datalogger를 사용하는 경우, 두 장치의 기록된 온도에 약간의 변화가 있을 수 있기 때문에 생체 내에서, 직장 프로브와 데이터 로거를 교차 보정하는 것이 가장 좋습니다.

이러한 방법은 신경 장애에 대 한 잠재적인 치료로 저체 온 증의 사용을 탐구 하고자 하는 연구에 적합. 연구의 특정 목표는 어떤 방법이 사용되는지 지시해야 합니다. 두 방법 모두 전신 표면 냉각으로 분류할 수 있지만 두 번째 방법은 활성 냉각을 필요로 하지 않습니다. 위에서 설명한 점진적 냉각 모델은 허혈성 뇌졸중 치료에 저체온증을 사용하기위한 중요한 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 장기 저체온증과 그로 인한 합병증은 노인 뇌졸중 환자에게 도전을 제기합니다. 더욱이, 떨리는 반응은 일부^{환자(10)에서}표적 온도를 달성하기 어렵게 만든다. 반대로 떨리는 약물은 떨리는 반응을 감소시키는 것을 도울 수 있는 동안, 짧은 기간 점진적 냉각은 문제를 보다 효과적으로 개량할 수 있었습니다. 더 짧은 냉각 기간을 갖는 것은 또한 종종 예심에서 보고된 폐염의 부각을 감소시킬 가능성이 높습니다. 이 단기 기간 방법의 또 다른 잠재적이 장점은 장시간 냉각과 비교할 때 다시 웜링 속도가 중요하지 않을 수 있다는 것입니다. 큰 경색을 가진 치기 환자에 있는 긴 기간 냉각의 아주 초기 임상 연구 결과는 빠른 재동이 결과를 악화시키고 수시로 치명적인 두개내 압력 (ICP)에 있는 큰 고도로 이끌어 낸다는 것을 것을을 발견했습니다. 이로 인해 점진적인 재온 패러다임이 개발되어 냉각의 전반적인 지속 시간을 더욱 연장했습니다. 짧은 지속 시간 냉각은 단기간에만 목표 온도를 유지하며 반등ICP가 발생할 가능성이 낮을 수 있습니다. ICP 고도에 대한 저체온증 치료를 조사한 이전 연구는 여기에 설명된 것과 유사한 급속 냉각 및 재웜 프로토콜을 사용하여^23,24를다시 모은 후 반등 ICP 고도가 보이지 않았다.

허혈성 뇌졸중 치료를 위한 저체온증의 임상 시험은 실험적인 연구 결과에서 보고된 저체온증의 이득을 번역할 수 없었습니다. 냉각 속도와 실험 모델과 환자 사이의 지속 시간 불일치는 이러한 불일치를 설명 할 수있는 중요한 변수입니다. 더 나은 냉각의 임상 속도와 유사한 저체온증의 실험 모델을 갖는 것은 뇌졸중 환자에 대한 치료 측정으로 저체온증의 이점에 대한 보다 정보에 입각한 조사를 허용합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem	AJA214-20LPL	Diluted with deionized water to give 70 % ethanol
Antiseptic solution (Chlorhexidine)	David Craig	A2957
Anaesthetic (Marcain)	Aspen	PS13977
Brushless fan motor	Sirocco	YX2505	2 x 12 V/130 mA
Heat lamp	Reptile One	AC220	240 V 50/60 Hz
Heat pad	FHC, Inc	40-90-2
Rectal probe	FHC, Inc	40-90-5D-02
Temperature controller	FHC, Inc	40-90-8D
Temperature Datalogger	Maxim	DS1922L-F5