Summary
Este artículo describe dos métodos de inducción de hipotermia de corta duración de cuerpo entero en ratas. El primer método, de inducción rápida, emplea el enfriamiento activo utilizando ventiladores y aerosol de etanol para una rápida disminución de la temperatura. El segundo método es un método de enfriamiento gradual. Esto se logra utilizando la combinación de anestesia con isoflurano y la reducción de los ajustes de temperatura en la estera de calor homeotérmica. Esto resulta en una disminución gradual de la temperatura corporal central sin el uso de ningún dispositivo de enfriamiento externo.
Abstract
La hipotermia terapéutica (TH) es una poderosa estrategia neuroprotectora que ha proporcionado evidencia sólida para la neuroprotección en estudios preclínicos de trastornos neurológicos. A pesar de la fuerte evidencia preclínica, la TH no ha demostrado eficacia en los ensayos clínicos de la mayoría de los trastornos neurológicos. Los únicos ensayos exitosos que emplearon hipotermia terapéutica se relacionaron con el paro cardíaco en adultos y la lesión isquémica hipóxica en neonatos. Se justifican investigaciones adicionales sobre los parámetros de su uso y comparaciones del diseño del estudio entre los estudios preclínicos y clínicos. Este artículo demuestra dos métodos de inducción de hipotermia de corta duración. El primer método permite la inducción rápida de hipotermia en ratas utilizando aerosol de etanol y ventiladores. Este método funciona enfriando la piel, que se ha utilizado con menos frecuencia en ensayos clínicos y puede tener diferentes efectos fisiológicos. El enfriamiento es mucho más rápido con esta técnica de lo que se puede lograr en pacientes humanos debido a las diferencias en la relación superficie-volumen. Junto con esto, también se presenta un segundo método, que permite una velocidad de enfriamiento clínicamente alcanzable para la hipotermia de corta duración. Este método es fácil de implementar, reproducible y no requiere enfriamiento activo de la piel.
Introduction
TH es la práctica de enfriar la temperatura corporal o cerebral con el fin de preservar la viabilidad y la función del órgano/sistema1,2. El papel de la hipotermia en la neuroprotección ha sido investigado y ha demostrado beneficios en una serie de modelos preclínicos de enfermedades neurológicas como el ictus3,la hemorragia subaracnoidea4y la lesión cerebral traumática5. En cuanto a las aplicaciones clínicas, la TH ha demostrado eficacia en pacientes post-paro cardíaco y en lesión hipóxico-isquémica neonatal6.
La inducción de la TH se logra utilizando métodos de enfriamiento superficial o endovascular. La mayoría de los estudios preclínicos de hipotermia realizan el enfriamiento de la superficie mediante la aplicación de agua o etanol al pelaje del animal, o mediante el uso de una manta de enfriamiento para alcanzar la temperatura objetivo1. En los seres humanos, el enfriamiento sistémico de la superficie se logra mediante el uso de bolsas de hielo y mantas de enfriamiento7,8. Se ha demostrado un enfriamiento más rápido en pacientes que utilizan métodos endovasculares, que acoen una infusión de inducción de solución salina fría a través de un catéter intravenoso o intraarterial, con la colocación de un dispositivo de enfriamiento endovascular dentro de la vena cava inferior9,10. Por ejemplo, se puede alcanzar una temperatura objetivo moderada de 33 °C en 1,5 h con enfriamiento endovascular en comparación con 3-4 h con enfriamiento superficial en pacientes11. El enfoque endovascular también se ha vuelto más popular en los últimos años porque se ha informado que reduce algunos de los efectos secundarios observados en el enfriamiento sistémico de la superficie, como los escalofríos12,13. El ensayo clínico europeo multicéntrico aleatorizado de fase III de hipotermia para accidente cerebrovascular isquémico (EUROHYP-1) utilizó principalmente el enfriamiento superficial14. Los resultados publicados recientemente de este ensayo mostraron que los escalofríos eran una complicación importante y podrían haber limitado la capacidad de alcanzar la temperatura objetivo10. Se sabe que la respuesta temblorosa es impulsada principalmente por la temperatura de la piel. Se han realizado algunos esfuerzos para desarrollar un método de enfriamiento endovascular con roedores15,pero la naturaleza altamente invasiva de la técnica en comparación con la utilizada en humanos, corre el riesgo de confundir cualquier resultado obtenido de ese modelo.
La temperatura es el modulador clave de los procesos biológicos en el cuerpo y está estrechamente regulada por la homeostasis. Por lo tanto, cualquier manipulación de la temperatura corporal puede tener riesgos asociados. La duración del enfriamiento es un factor que puede haber limitado el éxito de los ensayos clínicos de hipotermia. Estos ensayos utilizan un método de enfriamiento de larga duración, y muchos mantienen la hipotermia de 24 a 72 h11. Esta duración prolongada plantea un riesgo de infección durante el protocolo de enfriamiento. La neumonía es la complicación más frecuente de la hipotermia, afectando a entre el 40-50% de los pacientes que se someten al procedimiento13. Esto contrasta con lo que normalmente se ve en estudios en animales de hipotermia donde se utiliza un paradigma de corta duración (1-6 h)3. El éxito de estos estudios preclínicos en animales probablemente resultará en la adaptación de la hipotermia de corta duración para su uso en ensayos clínicos. Como resultado, es necesario tener un modelo animal de hipotermia de corta duración que se asemeje a las tasas de enfriamiento de futuros ensayos clínicos. Más detalles relacionados con otros parámetros de temperatura y la validez de la hipotermia de corta duración se han discutido en varios artículos de revisión1,16,17,18.
Aquí se demuestra un modelo gradual de enfriamiento que es clínicamente más alcanzable que los modelos experimentales actuales de hipotermia. Este novedoso método tiene una tasa de enfriamiento mucho más lenta y, por lo tanto, el tiempo hasta la temperatura objetivo está más cerca del rango de los observados en los ensayos clínicos de hipotermia11. También evita el enfriamiento directo de la superficie, que tiene efectos fisiológicos específicos, y puede, por lo tanto, ser más comparable al enfriamiento endovascular, que ha sido el método de enfriamiento más utilizado en los ensayos clínicos9,12. Este modelo permite que los animales se enfríen gradualmente durante 2 h seguido de un corto período de mantenimiento a la temperatura objetivo. Además, también se demuestra el método de hipotermia de corta duración de enfriamiento rápido19. El método de enfriamiento rápido permite alcanzar la temperatura objetivo rápidamente después del inicio de la hipotermia. Si bien este enfoque no es tan clínicamente relevante como el método de enfriamiento gradual, es útil para los estudios que tienen como objetivo explorar los mecanismos de la neuroprotección de la hipotermia para imitar potencialmente sus poderosos efectos neuroprotectores farmacológicamente. Este método también tiene aplicaciones potenciales fuera de la neurociencia y podría adaptarse a cualquier número de estudios preclínicos. Otra ventaja de ambos métodos en comparación con otros enfoques es que son baratos y no requieren equipo especializado. Finalmente, este protocolo también demuestra la implantación de dataloggers de temperatura, ya que el calentamiento postoperatorio y el monitoreo de los mismos son importantes para prevenir la hipotermia postoperatoria inadvertida, con su potencial para confundir los resultados del estudio20.
Protocol
Todos los procedimientos experimentales estaban de acuerdo con el Código australiano de prácticas para el cuidado y uso de animales con fines científicos y fueron aprobados por el Comité de Ética y Cuidado de Animales de la Universidad de Newcastle (A-2013-343 y A-2020-003). Además de los métodos de inducción de hipotermia que se describen a continuación, los siguientes protocolos se realizan rutinariamente junto con la hipotermia: canulación de la línea femoral para controlar la presión arterial y la frecuencia cardíaca21,y accidente cerebrovascular experimental22.
1. Implantación del datalogger
NOTA: El dispositivo de registro de datos utilizado en este protocolo no era capaz de proporcionar lectura en tiempo real de la temperatura corporal. La lectura es posible una vez que el registrador de datos se ha eliminado del animal y se ha conectado de nuevo a la computadora. Como resultado, la sonda de temperatura rectal se utiliza para proporcionar información en tiempo real durante el proceso de enfriamiento y recalentamiento. Además, la sonda rectal también es vital para este método porque la estera de calor quirúrgica en la que se coloca al animal durante el procedimiento está regulada por el sistema de sonda rectal. El registrador de datos también tiene un valioso propósito de proporcionar datos de temperatura en ratas despiertas y que se mueven libremente y es importante para garantizar que la temperatura corporal normal se mantenga después del recalentamiento. Por lo tanto, ambos dispositivos de monitoreo de temperatura son importantes para este protocolo.
- Anestesiar a la rata Wistar macho de 10-12 semanas de edad con isoflurano (5% para inducción y 2-2.5% para mantenimiento) en una mezcla de 50% N2 y 50% O2.
- Después de la inducción, coloque a la rata en la posición prona en una estera de calor quirúrgica.
- Coloque la rata de modo que la nariz esté sentada en el cono de la nariz. Asegure la nariz con cinta quirúrgica para asegurarse de que no se escapen gases.
- Afeitar el pelaje de la parte inferior derecha del abdomen e inyectar el sitio por vía subcutánea con un anestésico local, Bupivacaína 0.2 mL, 0.05%.
- Aplique una solución antiséptica en la región recién afeitada.
- Usando herramientas quirúrgicas esterilizadas, haga una incisión longitudinal de 2 cm a lo largo de la región abdominal derecha, proximal al muslo derecho. Haga la incisión lo suficientemente profunda como para exponer el espacio en el pliegue ventral del muslo.
- Use hemostáticos y fórceps para crear un "bolsillo" debajo de la piel que sea lo suficientemente grande como para sostener el dispositivo.
- Inserte el dispositivo de registro de datos de monitoreo de temperatura en el bolsillo y cierre el músculo y la piel con suturas de seda 5-0. El método subcutáneo descrito aquí se prefiere al método intra-peritoneal, ya que es menos invasivo y permite una mejor recuperación después del procedimiento.
- Asegúrese de que el registrador de datos y la sonda rectal estén calibrados de forma cruzada para el monitoreo de la temperatura (consulte Discusión).
- Asegúrese de que el registrador de datos no descanse contra la alfombra de calor del animal después de la inserción, ya que esto influirá en las lecturas de temperatura.
Figura 1: Implantación del dispositivo datalogger. (A) Los paneles de izquierda a derecha muestran una incisión de aproximadamente 2 cm que se realiza en el lado derecho de la parte inferior del abdomen de la rata. (B) El datalogger de monitoreo de temperatura se insertó por vía subcutánea en la incisión de bolsillo. (C) La incisión se cerró con suturas de nylon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Inducción de hipotermia activa (rápida) para estudios mecanicistas
- Configuración para la hipotermia (consulte la Figura 2). Coloque dos soportes de retorta con abrazaderas a cada lado del cuerpo de la rata.
- Conecte un ventilador de 60 mm 12 v/130 mA a cada soporte de retorta para asegurarse de que los ventiladores estén dirigidos hacia la parte inferior de la espalda de la rata. La distancia entre la abrazadera y la rata es de aproximadamente 20 cm. El ventilador utilizado debe tener una velocidad de 4.000 rpm.
- Tenga una lámpara de calor para animales lista, ya sea a un lado o en un tercer soporte de retorta.
- Comience la hipotermia ajustando la estera de calor del animal a la temperatura objetivo deseada. En este ejemplo, 32,5 °C es la temperatura objetivo (3,75 en la unidad de control de temperatura).
- Encienda ambos ventiladores y aplique de tres a cuatro aerosoles de etanol al 70% (botella de spray de plástico estándar) en la parte inferior de la espalda de la rata. Ruffle piel de animal al rociar para una inducción de enfriamiento más rápida.
NOTA: El etanol se utiliza como una solución preferida sobre el agua porque tiene una tasa de evaporación más rápida y, por lo tanto, da como resultado una inducción de hipotermia más rápida. - Tenga cuidado de no sobresaturar el pelaje, ya que esto puede contribuir a sobrepasar la temperatura objetivo.
NOTA: Los ventiladores acelerarán la evaporación del etanol y el proceso de enfriamiento. - Permita intervalos cortos entre las aplicaciones de etanol mientras vigila de cerca la temperatura rectal de la rata.
- Suspenda cualquier aplicación adicional de etanol una vez que la temperatura rectal alcance dentro de 1 ° C de la temperatura objetivo.
- Apague ambos ventiladores una vez que la temperatura haya alcanzado los 0,5 °C de la temperatura objetivo (33 °C en este caso).
NOTA: Apagar los ventiladores antes de alcanzar la temperatura objetivo ayuda a evitar que la rata se enfoble en exceso más allá de la temperatura requerida. - Deje que la temperatura baje a 32.5 ° C.
- Si se produce un sobreenfriamiento, use una lámpara de calor animal para calentar ligeramente al animal de nuevo al objetivo. La asistencia de un ventilador se puede utilizar para evitar un rebasamiento de recalentamiento.
- Una vez que se alcance la temperatura objetivo y se haya estabilizado, continúe monitoreando la temperatura. La temperatura generalmente se mantendrá muy estable durante el resto del período de hipotermia sin la necesidad de pulverización, uso de ventiladores o uso de lámpara de calor.
- Para volver a calentar al animal al final de la hipotermia, ajuste la temperatura de la estera de calor a 37 ° C (6 en la unidad de control de temperatura utilizada en este ejemplo) y permita que el animal se termregule durante un período de 30 minutos.
NOTA: La configuración de temperatura en las unidades de control de temperatura puede variar y, por lo tanto, puede ser necesario determinar la configuración de la hipotermia objetivo y la normotermia en dispositivos individuales.
3. Inducción de hipotermia de inicio gradual clínicamente alcanzable sin enfriamiento activo de la piel
- Lograr la hipotermia reduciendo la temperatura de la estera de calor homeotérmica regulada por la temperatura central en pequeños incrementos a la temperatura objetivo requerida. En el ejemplo ilustrado(Figura 3B),se utilizó un incremento de 1 °C cada 30 minutos.
- Enfríe el animal a la temperatura objetivo durante el período deseado (2 h en el ejemplo descrito). Una vez enfriado, manténgalo en el objetivo durante el intervalo deseado. Por lo general, no se requiere ninguna intervención adicional si se mantienen en la estera de calor homeotérmica establecida para la temperatura objetivo deseada.
- No es necesario ningún enfriamiento externo con este protocolo, ya que la anestesia impide la regulación normal de la temperatura corporal central.
NOTA: Los requisitos de isoflurano disminuyen con hipotermia. En la mayoría de los animales, una concentración inicial de isoflurano del 2% se puede reducir en incrementos del 0,1% cada 20-30 min al 1,5% para mantener estable la frecuencia respiratoria (>50 respiraciones / min), la frecuencia cardíaca y la presión arterial, y preservar la supresión de las respuestas reflejas. - Para volver a calentar al animal después de la hipotermia, ajuste la alfombra de calor para permitir que el animal se vuelva a calentar durante el intervalo deseado. En el ejemplo, el recalentamiento con un solo ajuste a 37 ° C (6 en la unidad de control de temperatura FHC utilizada en el ejemplo) se logró durante un período de 30 minutos.
- Para estudios a largo plazo que requieran recuperación animal, mantenga a los animales en una jaula que se coloque a la mitad sobre una estera de calor para permitir que el animal se termorregule y para evitar la hipotermia postoperatoria inadvertida.
- Se puede administrar paracetamol rectal (250 mg/kg) para la recuperación y el alivio del dolor ovrenight. También se pueden administrar inyecciones subcutáneas de solución salina (2 x 1,5 ml) para prevenir la deshidratación por anestesia y procedimientos quirúrgicos.
Representative Results
La Figura 3A es una representación de cómo una rata Wistar responde a la hipotermia utilizando el enfoque de enfriamiento rápido. La inducción de hipotermia se logra mediante el uso de ventiladores y pulverización de etanol al 70%. La hipotermia a un objetivo de 32,5 °C se alcanza en 15 min. Se debe tener cuidado para garantizar una interacción delicada entre el uso de los ventiladores / lámpara de calor y el aerosol de etanol para mantener la temperatura objetivo. Como se puede ver en la Figura 3A,se observa un ligero rebasamiento de la temperatura, que puede ocurrir si no se cesa el enfriamiento desde aproximadamente 0,5 ° C por encima de la temperatura objetivo. El objetivo se mantiene y estabiliza a los 30 minutos y el recalentamiento se inicia a la 1,5 h.
La Figura 3B muestra el protocolo gradual en el que la temperatura objetivo a 33 °C se alcanza a las 2 h y se mantiene durante 30 min antes del recalentamiento a las 2,5 h. Aquí, la temperatura se ajusta en incrementos que prolongan la duración necesaria para alcanzar la temperatura objetivo. Las líneas punteadas verticales en ambos gráficos representan la duración del enfriamiento.
La Figura 3A y la Figura 3B se obtienen del dispositivo datalogger. Al comienzo del experimento, el datalogger está programado para iniciar el registro antes de la implantación. Al final del experimento, el registrador de datos se retira del animal y se conecta al lector de temperatura proporcionado a través del puerto USB. El software (por ejemplo, eTemperature) lee y genera los datos, que luego se pueden exportar a un software de hoja de cálculo.
Figura 2: Establecimiento del protocolo de enfriamiento rápido. (A) Dos ventiladores (flecha negra) se situaron sobre la región lumbar de la rata. Al inicio de la hipotermia, ambos ventiladores se encendieron y se aplicó aerosol de etanol en la parte inferior de la espalda. La combinación de etanol y el ventilador facilita y acelera la hipotermia para alcanzar rápidamente la temperatura objetivo. (B) Se utilizó una lámpara de calor (flecha blanca) para prevenir el sobregiro de la hipotermia. Una vez que se alcanzó la temperatura objetivo, se utilizó la lámpara de calor para evitar que la temperatura del núcleo de la rata bajara. Una vez que el objetivo se ha estabilizado, la lámpara de calor y/o el ventilador restante se apagaron. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Inducción de hipotermia utilizando métodos activos (A) y graduales (B). (A) La temperatura objetivo se alcanzó en 15 min utilizando el proceso de enfriamiento activo y se mantuvo durante 60 min en el ejemplo anterior antes de que el animal fuera recalentado. (B) La temperatura objetivo se alcanzó en 2 h utilizando el método de enfriamiento gradual y se mantuvo durante 30 minutos antes de que el animal fuera recalentado. Las regiones sombreadas en ambos gráficos representan puntos de tiempo en los que se mantuvo la temperatura objetivo. Las líneas perpendiculares punteadas en ambos gráficos se refieren a la duración total del enfriamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los procedimientos descritos aquí son fáciles de implementar, no invasivos y proporcionan disminuciones confiables y reproducibles en la temperatura corporal central a una temperatura objetivo deseada.
Hay varios pasos críticos en el método de enfriamiento rápido que incluyen los siguientes. No sobresaturar el aerosol de etanol: se debe tener cuidado de no remojar al animal en etanol, ya que esto interferirá con los resultados. Monitorear al animal durante la inducción de la hipotermia: se debe tener cuidado para monitorear de cerca las respuestas de los animales a la inducción rápida de la hipotermia. Una estrecha vigilancia de la temperatura rectal es importante para asegurarse de que la temperatura no vaya por debajo del objetivo deseado; si esto sucede, apague los ventiladores y permita que la lámpara de calor vuelva a calentar suavemente al animal hasta el objetivo requerido.
En ambos métodos, la monitorización fisiológica es importante para garantizar un ajuste adecuado de la dosis anestésica. Para el enfriamiento prolongado, la dosis anestésica inadecuada puede prolongar la duración del enfriamiento. En este caso, la concentración de isoflurano se puede aumentar hasta que se logre una velocidad de enfriamiento adecuada. Otro paso crítico es la calibración cruzada de los dispositivos de temperatura. Cuando se utiliza una estera de calor regulada por sonda de temperatura y un registrador de datos en el mismo experimento, es una buena práctica calibrar el datalogger con la sonda rectal, in vivo, ya que puede haber variaciones menores en la temperatura registrada de los dos dispositivos.
Estos métodos son adecuados para estudios que desean explorar el uso de la hipotermia como un tratamiento potencial para los trastornos neurológicos. El objetivo específico del estudio debe dictar qué método se utiliza. Ambos métodos se pueden clasificar como enfriamiento sistémico de la superficie, sin embargo, el segundo método no requiere ningún enfriamiento activo. El modelo de enfriamiento gradual descrito anteriormente tiene importantes aplicaciones potenciales para el uso de la hipotermia en el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico. La hipotermia de larga duración y sus complicaciones resultantes representan un desafío para los pacientes ancianos con accidente cerebrovascular. Además, la respuesta temblorosa hace que sea difícil alcanzar la temperatura objetivo en algunos pacientes10. Si bien los medicamentos contra los escalofríos pueden ayudar a reducir la respuesta de escalofríos, el enfriamiento gradual de corta duración podría mejorar el problema de manera más efectiva. También es probable que tener un período de enfriamiento más corto reduzca la incidencia de neumonía que a menudo se informa en los ensayos. Otro beneficio potencial de este método de corta duración es que la velocidad de recalentamiento podría no ser tan importante en comparación con el enfriamiento de larga duración. Los primeros estudios clínicos de enfriamiento de larga duración en pacientes con accidente cerebrovascular con infartos grandes encontraron que el recalentamiento rápido condujo a grandes elevaciones en la presión intracraneal (PIC), lo que empeoró el resultado y a menudo fue fatal. Esto llevó al desarrollo de paradigmas de recalentamiento gradual, que extendieron aún más la duración general del enfriamiento. El enfriamiento de corta duración solo mantiene la temperatura objetivo durante un período corto y es menos probable que resulte en ICP de rebote. Trabajos previos que han investigado el tratamiento de la hipotermia para la elevación de la PIC, utilizando un protocolo de enfriamiento rápido y recalentamiento similar al descrito aquí, no han mostrado elevación de la PIC de rebote después del recalentamiento23,24.
Los ensayos clínicos de hipotermia para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico no han podido traducir los beneficios de la hipotermia que se informan en estudios experimentales. El desajuste en las tasas de enfriamiento y la duración entre los modelos experimentales y los pacientes, son variables importantes que pueden explicar esta discrepancia. Tener un modelo experimental de hipotermia que se asemeje mejor a la tasa clínica de enfriamiento permitirá una investigación más informada sobre los beneficios de la hipotermia como medida de tratamiento para los pacientes con accidente cerebrovascular.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por la Universidad de Newcastle, Hunter Medical Research Institute (HMRI) Dalara Early Research Career Researcher Fellowship, NSW Health Early-Mid Career Research Fellowship y National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem | AJA214-20LPL | Diluted with deionized water to give 70 % ethanol |
| Antiseptic solution (Chlorhexidine) | David Craig | A2957 | |
| Anaesthetic (Marcain) | Aspen | PS13977 | |
| Brushless fan motor | Sirocco | YX2505 | 2 x 12 V/130 mA |
| Heat lamp | Reptile One | AC220 | 240 V 50/60 Hz |
| Heat pad | FHC, Inc | 40-90-2 | |
| Rectal probe | FHC, Inc | 40-90-5D-02 | |
| Temperature controller | FHC, Inc | 40-90-8D | |
| Temperature Datalogger | Maxim | DS1922L-F5 |
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