Summary
本文描述了大鼠全身短时间体温过低诱导的两种方法。第一种快速感应方法，使用风扇和乙醇喷雾剂进行主动冷却，以快速降低温度。第二种方法是渐进冷却方法。这是通过异黄素麻醉和降低家庭热垫上的温度设置的组合实现的。这样，核心体温就会逐渐降低，而无需使用任何外部冷却设备。
Abstract
治疗性体温过低（TH）是一种强大的神经保护策略，为神经系统疾病临床前研究的神经保护提供了有力的证据。尽管有确凿的临床前证据，TH在大多数神经系统疾病的临床试验中并没有显示出疗效。唯一成功的治疗性体温过低试验与成人心脏骤停和新生儿缺血性损伤有关。有必要进一步研究其使用的参数，并研究临床前研究与临床研究之间的设计比较。本文演示了短时间体温过低诱导的两种方法。第一种方法允许使用乙醇喷雾剂和风扇快速使大鼠体温过低。这种方法通过冷却皮肤来起作用，这种冷却在临床试验中不太常见，并且可能具有不同的生理影响。由于表面积与体积比的差异，使用这种技术的冷却速度比人类患者实现的要快得多。此外，还提出了第二种方法，允许在临床上实现短期体温过低的冷却率。这种方法易于实施，可重复，不需要主动皮肤冷却。
Introduction
TH是冷却身体或大脑温度，以保持器官/系统1，2的生存能力和功能的做法。已对体温过低在神经保护中的作用进行了调查，并在一系列神经系统疾病的临床前模型中显示出益处，如中风3、亚拉希诺伊德出血4和创伤性脑损伤5。在临床应用方面，TH在患者心脏骤停后和新生儿缺氧缺血损伤中显示出疗效。
TH 感应是使用表面或血管内冷却方法实现的。大多数临床前体温过低的研究通过将水或乙醇涂在动物的毛皮上，或使用冷却毯达到目标温度1来进行表面冷却。在人类中，系统性表面冷却是通过使用冰袋和冷却毯子7，8实现的。使用血管内方法的患者表现出更快速的冷却，通过静脉或动脉内导管将冷盐水的感应输注与低劣静脉卡瓦9、10内放置血管内冷却装置相结合。例如，在1.5小时内可以达到33°C的中等目标温度，血管内冷却与3-4小时相比，患者11的表面冷却。血管内方法近年来也越来越流行，因为据报道，它减少了一些副作用，在全身表面冷却，如颤抖12，13。欧洲多中心，随机三期临床试验的缺血性中风（EUROHYP-1）大多使用表面冷却14。最近公布的试验结果表明，发抖是一种严重的并发症，可能限制了达到10度目标温度的能力。众所周知，发抖的反应主要是由皮肤温度引起的。已经做出了一些努力来开发一种啮齿动物血管内冷却方法15，但与人类使用的技术相比，这种技术具有高度侵入性，有可能混淆从该模型获得的任何结果。
温度是人体生物过程的关键调节器，由平衡严格控制。因此，任何对体温的操纵都可能带来相关的风险。冷却持续时间是限制体温过低临床试验成功的一个因素。这些试验使用长期冷却方法，许多保持体温过低从24-72小时11。这种延长的持续时间在冷却协议期间存在感染风险。肺炎是体温过低最常见的并发症，影响40-50%的患者谁接受程序13。这与动物研究中通常看到的体温过低形成鲜明对比，在动物研究中，使用短期范式（1-6小时）3。这些临床前动物研究的成功将可能导致适应短期体温过低，用于临床试验。因此，有必要有一个动物模型的短期体温过低，类似于未来临床试验的冷却率。有关其他温度参数及短期体温过低的有效性的进一步详情，已在数项检讨第1、16、17、18条中讨论。
这里演示的是一个逐渐冷却的模型，比目前的实验性体温过低模型在临床上更容易实现。这种新方法的冷却速度要慢得多，因此，瞄准温度的时间更接近于在体温过低的11临床试验中看到的范围。它还避免了直接表面冷却，这有特定的生理影响，因此，可以更可比的血管内冷却，这是临床试验中最常用的冷却方法9，12。此模型允许动物在 2 小时以上逐渐冷却，然后在目标温度下进行短期维护。此外，还演示了快速冷却短时体温过低方法19。快速冷却方法允许在体温过低后快速达到目标温度。虽然这种方法在临床上不如渐进冷却方法相关，但它对于旨在探索体温过低神经保护机制的研究在药理学上可能模仿其强大的神经保护作用是有用的。这种方法在神经科学之外也有潜在的应用，可以适应任何数量的临床前研究。与其他方法相比，这两种方法的另一个优点是价格低廉，不需要专业设备。最后，本协议还演示了温度数据记录器的植入，因为术后加热及其监测对于防止术后不经意间体温过低非常重要，其有可能混淆研究结果20。
Protocol
所有实验程序均符合《澳大利亚科学用途动物护理和使用守则》，并经纽卡斯尔大学动物护理和伦理委员会批准（A-2013-343和A-2020-003）。除了下面描述的体温过低诱导方法外，以下方案通常与体温过低一起进行：股骨线调节，以监测血压和心率21，实验性中风22。
1. 数据记录器植入
注：本协议中使用的数据记录器设备无法实时读取体温。一旦数据记录器从动物身上移除并连接回计算机，就可以读出。因此，直肠温度探头用于在冷却和重新温暖过程中提供实时信息。此外，直肠探针对于这种方法也至关重要，因为动物在手术过程中放置的手术热垫由直肠探针系统调节。数据记录器还具有在自由移动、清醒的老鼠中提供温度数据的宝贵目的，对于确保在重新温暖后保持正常的体温非常重要。因此，两种温度监测设备都对本协议很重要。
- 麻醉10-12周大的雄性Wistar大鼠与异黄素（5%用于诱导和2-2.5%的维护）在50%N2 和50%O2 混合物。
- 上岗后，将大鼠置于手术热垫的易发位置。
- 将鼠的位置，使鼻子坐在鼻锥中。用手术带固定鼻子，确保没有气体逸出。
- 从右下腹部剃掉皮毛，皮下注射局部麻醉剂，Bupivacaine 0.2 mL，0.05%。
- 将防腐剂溶液应用于刚剃光的区域。
- 使用绝育手术工具，沿着右腹部区域（右大腿近）进行2厘米的纵向切口。使切口足够深，以暴露在腹腔大腿折痕的空间。
- 使用造械器和钳子在皮肤下创建一个足够大的"口袋"来容纳设备。
- 将温度监测数据记录器设备插入口袋，使用 5-0 丝绸缝合线关闭肌肉和皮肤。此处描述的皮下方法比腹内方法更受欢迎，因为它侵入性较小，并且允许在手术后更好地恢复。
- 确保数据记录器和直肠探头交叉校准以进行温度监测（参见讨论）。
- 确保数据记录器在插入后不会靠在动物的热垫上，因为这将影响温度读数。
图1：数据记录器装置的植入（A）面板从左到右显示大鼠下腹部右侧约2厘米的切口。（B） 温度监测数据记录器被皮下插入口袋切口。（C） 切口用尼龙缝合线封闭。请单击此处查看此图的较大版本。
2. 机械研究活性（快速）体温过低诱导
- 设置为体温过低（见 图2）。在老鼠身体的两侧放置两个带有夹子的反驳站。
- 在每个反驳支架上安装一个 60 mm 12 v/130 mA 风扇，确保风扇朝向鼠的下背部。夹子和大鼠之间的距离约为20厘米。使用的风扇必须具有 4，000 rpm 的速度。
- 在第三个反驳站边或第三个反驳架上准备好动物热灯。
- 通过将动物热垫调整到所需的目标温度，开始体温过低。在此示例中，32.5 °C 是目标温度（温度控制单元为 3.75）。
- 打开两个风扇，在鼠的下背部喷洒三到四个70%乙醇（标准塑料喷雾瓶）。喷洒以加快冷却感应速度时，会擦毛动物毛皮。
注：乙醇被用作首选溶液，而不是水，因为它的蒸发速度更快，因此导致更快速的体温过低诱导。 - 小心不要使毛皮过饱和，因为这会导致目标温度过高。
注意：风扇将加速乙醇蒸发和冷却过程。 - 在使用乙醇的同时，请留意大鼠的直肠温度。
- 一旦直肠温度达到目标温度的 1 °C 以内，停止进一步使用乙醇。
- 一旦温度达到目标温度的 0.5 °C（此例为 33 °C），请关闭两个风扇。
注意：在达到目标温度之前关闭风扇有助于防止大鼠过度冷却超过所需温度。 - 让温度降至 32.5 °C。
- 如果确实出现过热，请使用动物热灯对动物进行温和加热，以达到目标。一个风扇的辅助可用于防止重新温暖的过冲。
- 一旦达到目标温度并稳定下来，请继续监测温度。在体温过低的剩余时间里，温度通常会保持非常稳定，无需喷洒、使用风扇或使用热灯。
- 要在体温过低时重新加热动物，请将热垫温度调整回 37 °C（本示例中使用的温度控制单元为 6），并允许动物在 30 分钟内进行热调节。
注：温度控制装置上的温度设置可能有所不同，因此，可能需要确定单个设备上的目标体温过低和标准体温设置。
3. 诱导临床上可以实现的渐进性发病体温过低，而无需主动皮肤冷却
- 通过将核心温度调节的家用热垫的温度以小增量降低到所需的目标温度来降低体温过低。在图示示例 （图 3B）中，每 30 分钟使用 1 °C 的增量。
- 冷却动物，以在预期期间内瞄准温度（例如，2 小时）。冷却后，保持在预期间隔的目标。通常，如果它们被保存在为所需目标温度设置的温热垫上，则无需进一步干预。
- 由于麻醉会阻止核心体温的正常调节，因此本协议无需外部冷却。
注：异氟化素要求随着体温过低而下降。在大多数动物中，起始异黄素浓度为2%，每20-30分钟可以0.1%的增量降低到1.5%，以保持稳定的呼吸速率（>50次呼吸/分钟）、心率和血压，并保持抑制反射反应。 - 要在体温过低后重新加热动物，请调整热垫，让动物在所需的间隔内重新温暖。在示例中，在 30 分钟内实现了对 37 °C（例如所用 FHC 温度控制单元的 6°C）的单次调整，实现了重新温暖。
- 对于需要动物恢复的长期研究，将动物关在笼子里，笼子里一半放在热垫上，让动物保持温度调节，避免术后不经意的体温过低。
- 直肠扑热息痛（250毫克/千克）可用于恢复和卵巢疼痛缓解。也可以注射皮下盐水（2 x 1.5 mL），以防止麻醉和外科手术脱水。
Representative Results
图3A 是威星大鼠使用快速冷却方法对体温过低的反应的表示。通过使用风扇和 70% 乙醇喷雾实现体温过低感应。体温过低至32.5°C的目标在15分钟内实现。必须小心谨慎，以确保使用风扇/热灯和乙醇喷雾剂之间有微妙的相互作用，以保持目标温度。从 图3A可以看出，观察到轻微的温度超标，如果冷却不停止从约0.5°C高于目标温度，可能发生。目标在 30 分钟标记时保持稳定，并在 1.5 h 时开始重新温暖。
图 3B 显示了目标温度达到 33 °C 的逐渐协议，在 2 小时达到目标温度时达到 30 分钟，然后在 2.5 小时重新升温。在这里，温度以增量调整，从而延长达到目标温度所需的持续时间。两个图形中的垂直虚线表示冷却的持续时间。
图 3A 和 图 3B 是从数据记录器设备获得的。在实验开始时，数据记录器被编程为在植入之前开始录制。在实验结束时，数据记录器从动物身上移除，并通过 USB 端口连接到提供的温度读取器。该软件（例如，电子温度）读取并生成数据，然后可以导出到电子表格软件。
图2：设置快速冷却协议。（A）两个风扇（黑箭头）位于老鼠的下背部区域。在体温过低时，两个风扇都打开，乙醇喷雾剂被涂在下背部。乙醇和风扇的结合促进和加速体温过低，以迅速达到目标温度。（B） 热灯（白箭头）用于防止体温过低。达到目标温度后，热灯用于防止鼠芯温度下降。一旦目标稳定下来，热灯和/或剩余风扇就会关闭。请点击这里查看此图的较大版本。
图3：使用活性（A）和渐进（B）方法进行体温过低诱导。 （A）使用主动冷却过程在15分钟内达到目标温度，并在上述示例中维持60分钟，然后动物才重新保温。（B） 使用渐进冷却方法在2小时内达到目标温度，并在动物重新保温前保持30分钟。两个图形中的阴影区域表示维持目标温度的时间点。两个图形中的点垂直线是指整体冷却持续时间。 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
此处描述的程序易于实施，无侵入性，并且提供可靠且可重复的核心体温降低到所需的目标温度。
快速冷却方法有几个关键步骤，包括以下步骤。不要过度饱和乙醇喷雾 - 必须注意不要浸泡在乙醇中的动物，因为这将干扰结果。在体温过低的诱导护理期间监测动物，以密切监测动物对快速体温过低诱导的反应。密切观察直肠温度对于确保温度不会低于预期目标非常重要-如果发生这种情况，关闭风扇，让热灯轻轻地将动物重新加热到所需的目标。
在这两种方法中，生理监测对于确保麻醉剂量的适当调整非常重要。对于长时间的冷却，麻醉剂量不足可能会延长冷却时间。在这种情况下，异黄素浓度可以增加，直到达到适当的冷却率。另一个关键步骤是温度装置的交叉校准。在同一实验中使用温度探头调节热垫和数据记录器时，最好在体内用直肠探头对数据记录器进行校准，因为两个设备的记录温度可能有小的变化。
这些方法适合那些希望探索使用体温过低作为神经系统疾病的潜在治疗方法的研究。研究的具体目的应决定使用哪种方法。这两种方法可归类为系统表面冷却，但第二种方法不需要任何主动冷却。上述渐进冷却模型在缺血性中风治疗中具有使用体温过低的重要潜在应用。长期体温过低及其引起的并发症对老年中风患者构成挑战。此外，颤抖的反应使得一些患者难以达到目标温度10。虽然抗颤动药物可以帮助减少颤抖反应，但短期逐渐冷却可以更有效地改善问题。缩短冷却期也有可能降低试验中经常报告的肺炎发病率。这种短期方法的另一个潜在好处是，与长时间冷却相比，重新温暖的速度可能没有那么重要。早期对大梗塞中风患者长期冷却的临床研究发现，快速再热导致颅内压力（ICP）大幅升高，恶化了结果，而且往往是致命的。这导致逐渐恢复温暖模式的发展，这进一步延长了冷却的总体持续时间。短期冷却仅维持短期目标温度，不太可能导致 ICP 反弹。先前对ICP高程体温过低的治疗进行了研究，使用了与这里描述的类似的快速冷却和再热方案，在23、24日重新温暖之后，ICP高程没有出现反弹。
缺血性中风治疗体温过低的临床试验未能转化为实验研究中报告的体温过低的好处。冷却率和实验模型与患者之间持续时间的不匹配是可能导致这种差异的重要变量。拥有更类似于临床冷却率的体温过低的实验模型，可以更知情地调查体温过低作为中风患者的治疗措施的好处。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由纽卡斯尔大学亨特医学研究所（HMRI）达拉拉早期研究职业研究员奖学金、新南威尔士州健康早期-中期职业研究研究金以及澳大利亚国家健康和医学研究理事会（NHMRC）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem | AJA214-20LPL | Diluted with deionized water to give 70 % ethanol |
| Antiseptic solution (Chlorhexidine) | David Craig | A2957 | |
| Anaesthetic (Marcain) | Aspen | PS13977 | |
| Brushless fan motor | Sirocco | YX2505 | 2 x 12 V/130 mA |
| Heat lamp | Reptile One | AC220 | 240 V 50/60 Hz |
| Heat pad | FHC, Inc | 40-90-2 | |
| Rectal probe | FHC, Inc | 40-90-5D-02 | |
| Temperature controller | FHC, Inc | 40-90-8D | |
| Temperature Datalogger | Maxim | DS1922L-F5 |
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