Summary
本文描述了使用基于DNA的张力探针对免疫细胞施加的受体力进行成像的详细方案。这种方法可以实时映射受体力>4.7pN，并且可以随着时间的推移积分力。
Abstract
在两个相邻细胞之间的连接处以及细胞与细胞外基质之间的连接处传递的机械力对于调节从发育到免疫学的许多过程至关重要。因此，开发在分子尺度上研究这些力的工具至关重要。我们小组开发了一套分子张力传感器，用于量化和可视化细胞产生并传递到特定配体的力。最灵敏的一类分子张力传感器由核酸茎环发夹组成。这些传感器使用荧光团-淬灭剂对来报告DNA发夹在力下的机械延伸和展开。DNA发夹张力传感器的一个挑战是，它们是可逆的，在张力终止时快速重新折叠发夹，因此很难记录瞬态力。在本文中，我们描述了制备DNA张力传感器的协议，这些传感器可以“锁定”并防止重新折叠，以实现机械信息的“存储”。这允许记录高瞬态微微顿力，随后可以通过添加去除锁的互补核酸来“擦除”。这种在实时张力映射和机械信息存储之间切换的能力揭示了弱的、短暂的和不太丰富的力，这些力通常被T细胞用作其免疫功能的一部分。
Introduction
免疫细胞通过不断爬行和扫描靶细胞表面的抗原来防御病原体和癌细胞，并在其表面镶嵌1，2。抗原识别在T细胞受体（TCR）和靶细胞表面表达的肽主要组织相容性复合物MHC（pMHC）复合物结合时开始。由于TCR-pMHC识别发生在两个移动细胞之间的连接处，因此长期以来一直怀疑它经历了机械力。此外，这导致了TCR激活的机械传感器模型，这表明TCR力有助于其功能3，4。为了了解机械力何时、何地以及如何促进T细胞功能，必须开发工具来可视化T细胞传递的分子力。传统上，牵引力显微镜（TFM）和微柱阵列等方法用于研究细胞力5，6。然而，全聚焦方式（TFM）和微柱阵列的力灵敏度为纳牛顿（nN）尺度，因此通常不足以研究细胞受体传递的分子微孔（pN）力7。为了提高检测的力和空间分辨率，我们的实验室率先开发了分子张力探头，最初是使用聚乙二醇（PEG）聚合物7合成的。分子张力探针由可伸缩的分子“弹簧”（PEG、蛋白质、DNA）组成，两侧是荧光基团和淬灭剂，并固定在表面上。施加在探针末端的力导致其延伸，分离荧光团和淬灭剂，从而产生强烈的荧光信号（图1A）8，9，10。
在过去的十年中，我们开发了一个包含不同类别分子张力探针的库，其中包含由核酸11、蛋白质10 和聚合物8 制成的弹簧元件。其中，基于DNA的张力探头提供最高的信噪比和最大的力灵敏度，可在几pN到~20 pN11之间轻松调谐。我们已经使用这些实时DNA张力探针来研究许多不同细胞类型产生的分子力，包括成纤维细胞，癌细胞，血小板和免疫细胞11，12，13。本手稿将描述在表面上合成和组装DNA张力探针的方案，以使用常规荧光显微镜以pN力分辨率绘制分子受体力。虽然目前的程序包括对核酸进行化学修饰以引入荧光报告基因（图1B），但重要的是要注意，许多修饰和纯化步骤可以外包给定制DNA合成公司。因此，DNA张力探针技术是容易的，并且可以被更广泛的细胞生物学和机械生物学界所使用。
简而言之，为了组装DNA张力传感器，将DNA发夹杂交到一个臂上的荧光配体链和另一个臂上的淬灭锚链，然后固定在玻璃基板上（图1C，实时张力）。在没有机械力的情况下，发夹闭合，因此荧光被淬灭。然而，当施加的机械力大于F1/2 （平衡时的力导致50%的展开概率）时，发夹机械熔化，并产生荧光信号。
在实时DNA张力传感器的基础上，我们还描述了映射累积力的协议，这对于研究免疫细胞受体与其天然配体之间的相互作用特别有用。这是因为免疫受体通常显示短寿命的键3，14。使用“锁定”链对累积的力进行成像，该链优先结合以打开DNA发夹并允许存储与机械拉动事件相关的荧光信号（图1C，锁定张力）。锁定链旨在结合在机械诱导的发夹熔化时暴露的隐形结合位点，并通过阻止发夹重新折叠将发夹锁定在打开状态，从而存储张力信号并生成累积的张力图。此外，锁定链设计有八核苷酸链，这使得脚趾介导的链位移反应及其完整的互补，即“解锁”链。通过添加解锁链，绑定的锁定链从发夹结构上剥离，擦除存储的张力信号并将发夹重置回实时状态。
图 1：最先进的分子张力探头方案 。 （A）实时分子张力探针的一般设计，（B）基于DNA的张力探针构建的链，以及（C）工程化的基于DNA的张力探针及其在实时状态和锁定状态之间的切换。 请点击此处查看此图的大图。
主要方案由四个主要部分组成 - 寡核苷酸制备，表面处理，成像和数据分析。我们的实验室和其他实验室已经在幼稚和活化的OT-1 CD8 + T细胞，OT-II CD4 +细胞以及杂交瘤中成功证明了该协议，并且可以应用于询问不同的免疫细胞受体，包括T细胞受体，程序性细胞死亡受体（PD1）和淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）力。本文将OT-1 CD8+幼稚T细胞用作示例细胞系。
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Protocol
OT-1转基因小鼠被饲养在埃默里大学动物资源设施部。所有实验均在机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议下获得批准和实施。
1. 寡核苷酸制备
- 将配体链DNA溶解在水中（18.2 MΩ电阻率，在整个方案中使用）。涡旋并用台式离心机旋转溶液。调整水量，使最终浓度为1 mM。通过使用纳米滴分光光度计测量260nm处的吸光度来验证浓度，并根据寡核苷酸的消光系数确定最终浓度。
注意：配体链在每个末端都有一个修饰，5'胺和3'生物素，以与荧光团偶联并呈递生物素化配体。配体链中的胺基团需要与荧光团偶联。由于其高亮度和光稳定性，Cy3B染料用于这种偶联，但通常不商业提供，需要内部偶联。因此，下一节描述了胺和NHS酯染料之间的偶联。对于无法使用核酸修饰设施或资源的最终用户，可以从提供明亮且光稳定染料的定制DNA合成供应商处购买修饰的核酸，例如Alexa和Atto系列染料。 - 准备 10x PBS 和 1 M NaHCO3 溶液。将 10 μL 的 1 mM 胺配体链溶液 （10 nmol） 与 10 μL 的 10x PBS、10 μL 的 1 M NaHCO3 和 60 μL 的 H2O 混合。 使用前立即将 50 μg Cy3B NHS 酯溶解在 10 μL DMSO 中，并加入混合物中，总反应体积为 100 μL。 最后加入 Cy3B NHS 酯。允许在室温下反应1小时或4°C过夜。
- 通过将胺锁定链与 Atto647N NHS 酯共轭来制备 Atto647N 锁定链。准备 10x PBS 和 1 M NaHCO3 溶液。将 10 μL 的 1 mM 胺锁定链溶液 （10 nmol） 与 10 μL 的 10x PBS、10 μL 的 1 M NaHCO3 和 60 μL 的 H2O 混合。 使用前立即将 50 μg Atto647N NHS 酯溶解在 10 μL DMSO 中，并加入混合物中，总反应体积为 100 μL。 最后加入 Atto647N NHS 酯。允许在室温下反应1小时或4°C过夜。
- 反应后，通过P2脱盐凝胶过滤除去副产物，多余的染料和盐。用H2O稀释反应混合物至总体积为300μL，这适用于随后的HPLC纯化步骤。向离心装置中加入 650 μL 水合 P2 凝胶，并以 18，000 x g 离心 1 分钟。除去装置底部的液体，将反应混合物加入含有P2凝胶的柱中，以18，000× g 旋转1分钟，并将反应混合物收集在装置底部。
注意：P2凝胶应在用H2O使用前至少4小时水合。 - 使用指定用于寡核苷酸纯化的C18色谱柱，用溶剂A：H2O中的0.1M TEAA和B：乙腈作为流动相，在50分钟内以0.5mL/min的流速纯化10-100% B的线性梯度洗脱。将脱盐反应混合物注入反相HPLC中，使用500 μL进样环进行纯化。收集具有DNA吸光度峰（260nm）和荧光团吸光峰（Cy3B为560nm，Atto647N为647nm）的产物，并在真空离心浓缩器中干燥过夜（见 图2A）。
- 将干燥的低聚染料产物在 100 μL 水中复溶。用纳米滴分光光度计测定Cy3B配体链和Atto647N锁定链的浓度。确保染料标记比例接近1：1。如果需要，在测定寡核苷酸浓度时校正染料的260nm吸光度。
- 使用 3-HPA 作为底物，在 50% ACN/H2O 中、0.1% TFA 和 5 mg/mL 柠檬酸铵中使用 MALDI-TOF-MS 验证纯化产物，使用 0.5 μL 产物在 1-5 μM 下进行 MALDI-TOF-MS 样品制备。示例质谱如图 2B所示。
- 将发夹链和淬灭锚链溶解在水中，并确保储备溶液的浓度在50至100μM之间。
注意：发夹链未经修改，可以直接从供应商处定制合成。锚链具有硫醇锚固基团和淬灭剂BHQ2，可以直接从供应商处定制合成。 - 将所有寡核苷酸等分。对于短期使用和储存，将这些寡核苷酸储存在4°C。 对于长期储存，冷冻并保持在-20°C。 此时，所有寡核苷酸都已准备好进行DNA张力探针组装。
注意：重复冻融循环对于寡核苷酸没有问题。
2. 表面处理
注意：DNA发夹张力探针底物的制备需要两天时间。DNA发夹张力探针将在玻璃盖玻片上功能化。
- 第一天
- 将 25 mm 盖玻片放在 50 mL 烧杯中的聚四氟乙烯架上。每个架子最多可容纳 8 个盖玻片。将盖玻片浸入水中三次冲洗。
- 将 40 mL 比例为 1：1 （v：v） 的乙醇溶液与水混合到装有架子和盖玻片的烧杯中，并使用石蜡膜密封烧杯。
- 在超声波清洁器（工作频率35 KHz）中超声处理烧杯15分钟以清洁盖玻片。超声处理后，丢弃液体并用水冲洗装有架子和盖玻片的烧杯至少 6 次，以去除任何剩余的有机溶剂。
- 通过将硫酸和过氧化氢按3：1的比例混合来制备新鲜的食人鱼溶液。要制备 40 mL 食人鱼溶液，请先将 30 mL 硫酸加入干净的 50 mL 烧杯中，然后缓慢加入 10 mL H2O2。食人鱼溶液在加入H2O2后会迅速加热并起泡。用玻璃移液管的末端轻轻混合食人鱼。
- 接下来，将固定盖玻片的架子转移到装有轻轻混合的食人鱼溶液用于蚀刻的烧杯中（图3A）。让食人鱼溶液羟基化并在室温下清洁盖玻片30分钟。食人鱼蚀刻后，使用钢或聚四氟乙烯镊子将架子转移到干净的 50 mL 烧杯中，并用水再次冲洗至少 6 次。
注意：大量的有机物质可能会与食人鱼溶液发生剧烈反应，并可能导致爆炸。小心并始终在通风橱中使用食人鱼溶液。确保穿上实验室外套、手套和安全护目镜。切勿将新鲜的食人鱼溶液存放在密封容器中。
注意：过氧化氢与硫酸的比例应保持在1：2（v：v）以下，不应超过1：1。当用盖玻片将架子浸入食人鱼溶液中时，请缓慢而小心地将它们放入溶液中。蚀刻后不要立即丢弃溶液，因为它仍然活跃且热。将其放在烧杯中过夜，然后再将其倒入酸性废物容器中。 - 将装有盖玻片的架子浸入装有 40 mL 乙醇的 50 mL 烧杯中以除去水分。丢弃乙醇并重复 3 次以确保已除去水。
- 然后将架子浸入 3% 氨丙基三乙氧基硅烷 （APTES） （v/v） 中，在室温下与盖玻片上的 -OH 反应 1 小时（图 3B）。
注意：乙醇可以用丙酮代替。 - 将表面浸入40mL乙醇中冲洗6次，然后在80°C的烤箱中干燥20分钟。冷却后，将干燥的胺改性盖玻片储存在-20°C以备将来使用（长达6个月）。
- 用石蜡膜覆盖直径为10厘米的塑料培养皿的底部内侧。石蜡膜可防止盖玻片在培养皿内滑动，并有助于将后续功能化步骤的溶液保持在盖玻片上。将冷却的胺改性盖玻片放入培养皿中。要功能化的一侧应朝上。
- 为了改变盖玻片上的胺基团，在0.1M NaHCO3 中加入300μL的0.5%w/v硫辛酸PEG NHS（LA-PEG-SC）和2.5%w/v mPEG NHS（mPEG-SC）到每个盖玻片上，并在室温下孵育1小时（图3C）。对于每张 25 毫米的盖玻片，称取 1.5 毫克 LA-PEG-SC 和 7.5 毫克 mPEG-SC。在添加到表面之前立即溶解NHS试剂，因为它们在室温下在水溶液中的半衰期很短（~10分钟）。反应后，用水冲洗表面3次。
注意：NHS反应可以在4°C下进行过夜。NHS试剂在4°C水解前具有更长的半衰期，约为4-6小时。这将导致为期三天的表面准备程序。 - 将 100 μL 含有 1 mg/mL 磺基-NHS 乙酸酯的 0.1 M NaHCO3 加入一组“夹心”盖玻片（两个盖玻片彼此朝向，中间有反应缓冲液）。允许钝化至少30分钟。为了节省试剂，此步骤可以使用 50 μL 1 mg/mL 磺基-NHS 乙酸酯来完成。钝化后用水冲洗三次。
- 向每个盖玻片中加入 0.5 mL 金纳米颗粒（AuNP，8.8 nm，单宁酸，0.05 mg/mL），并在室温下孵育 30 分钟（图 3D）。为了保存试剂，此步骤也可以通过夹两个盖玻片来完成。确保先前步骤中的系统中不存在盐，以避免金纳米颗粒聚集。此步骤后，请勿让盖玻片干燥。
- 同时，在 PCR 管中以 1 m NaCl 和 300 nM 的比例预杂交形成 DNA 张力探针的 4.7 pN 发夹、Cy3B 配体链和 BHQ2 锚链。通过将溶液加热至95°C5分钟来退火，然后在热循环仪中通过将温度降低到20°C超过30分钟来逐渐冷却。
- 用金纳米颗粒孵育30分钟后用水冲洗盖玻片三次。向退火的DNA溶液中加入额外的BHQ2锚链（来自100μM储备液），使BHQ2锚链和Cy3B配体链之间的比例为10：1。此时，DNA溶液应包含300 nM的张力探针构建体和2.7 μM BHQ2链。每两个盖玻片添加 100 μL 以制作“三明治”（图 3E）。
- 小心地将湿的实验室组织球放入培养皿中（远离盖玻片），并用石蜡膜密封培养皿，以防止溶液变干。用箔纸盖住培养皿，并在4°C下孵育过夜。
- 第二天
- 用 1x PBS 洗掉盖玻片上多余的探头。在落射荧光显微镜下检查DNA张力探针表面质量。
- 在1x PBS中制备40μg/ mL链霉亲和素，并在室温下在盖玻片上孵育30分钟（图3F）。通常，100 μL 足以用于 25 mm 盖玻片。孵育后用PBS冲洗3次，以洗去过量的链霉亲和素。
- 在 1x PBS 中制备 40 μg/mL 生物素化抗体/配体。每个三明治加入 50-100 μL，并在室温下孵育 30 分钟（图 3G）。孵育后用PBS冲洗三次，以洗去过量的生物素化抗体/配体。
- 仔细组装带有表面的清洁成像室。拧紧腔室时，表面很容易破裂。向成像室中加入 0.5-1 mL 的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS），并使其准备好用细胞成像（图 3H）。
3. 成像细胞受体力
- 在 HBSS 中以 1-2 x 106 个细胞/mL 制备感兴趣的免疫细胞。
注意：本文以OT-1 CD8+幼稚细胞为例。按照制造商的说明，使用带有MACS分离器的MACS小鼠CD8 + T细胞分离试剂盒从处死小鼠的脾脏中纯化OT-1 CD8 +幼稚T细胞a。通过去除磁耗竭抗体混合物结合的任何非 CD8+ T 细胞来分离和富集 CD8+ T 细胞。将纯化的OT-1 CD8 +幼稚T细胞以2 x 106个细胞/mL重悬于HBSS中，并在使用前保持在冰上。 - 在添加配体或电镀细胞之前，在荧光显微镜（100倍物镜）下检查DNA发夹张力探针表面的质量以进行质量控制。从至少 5 个不同位置和 3 次重复对 DNA 发夹张力探针表面的 Cy3B 通道中的平均背景强度进行成像和量化。保持成像采集条件一致，以便该值可以用作表面质量和探头密度的可靠标记（图4C）。
注意：根据文献12，在表面制备的前几次量化每个金纳米颗粒的DNA链数和每μm2的金纳米颗粒数，这可以用作表面质量的另一个可靠标志。 - 将~4 x 10 4 - 10 x 104细胞板到每个DNA张力探针功能化的盖玻片上，并允许它们在室温下附着和扩散~15分钟。
- 当细胞接种到DNA发夹张力探针上并开始扩散时，用100倍物镜对Cy3B通道中产生的荧光信号进行成像（图3I）。
- 细胞开始在Cy3B通道的DNA发夹张力探针表面上产生实时张力信号后，在Cy3B和Atto647N通道中获取图像（TIRF显微镜比落射荧光提供更好的信噪比）。随后，将Atto647N链以终浓度为200nM的成像室中加入以进行机械选择性杂交。
- 孵育10分钟后，快速轻轻地去除含有荧光Atto647N锁定链的缓冲液，并用新鲜的Hank平衡盐代替。再次在Cy3B和Atto647N通道中成像，并与斐济软件15确定皮尔逊的相关系数。
- 在研究感兴趣的时间点，将非荧光锁定链引入成像室中的细胞以存储张力信号。准备锁定链原液（100μM）并以1μM的终浓度添加到细胞中。 轻轻移液混合。锁定的持续时间可能会有所不同，但建议使用 10 分钟。
- 根据需要采集落射荧光中的延时电影或终点图像，以进行定性张力映射和定量分析（图3J 和 图5）。
注意： 如果需要在多个时间点进行张力测量，请通过添加解锁链来开始擦除存储的张力信号。为避免过度冲洗，使用2μM处较高终浓度的解锁链来启动与锁定链的脚趾介导的链置换反应3分钟，从而擦除存储的信号（图3J）。用HBSS轻轻冲洗掉多余的寡核苷酸。DNA发夹张力探针表面和细胞已准备好进行另一轮张力存储和映射。如果研究中只有一个时间点感兴趣，则不需要解锁张力信号。
4. 数据分析
注意：图像分析使用斐济软件进行，定量分析使用分析软件进行。
- 使用“插件”菜单下“注册”中的“更正 3D 漂移”命令校正图像采集过程中的任何漂移。
- 使用“进程”菜单下的“减去”命令删除图像的相机背景。
- 使用“分析”菜单下的共定位函数确定 Pearson 相关系数。
- 平均并减去来自三个不同局部背景区域的未打开探针产生的荧光背景。使用图像J手 绘选择 工具在背景减去图像或RICM（反射干涉对比显微镜）图像上绘制细胞的ROI。 使用 “分析”菜单下的 “ 测量”工具测量ROI的任何感兴趣指标，例如，综合荧光强度和张力占用率（图6）。
- 导出测量值，使用分析软件进行定量分析。
- 使用任何分析软件绘制数据。
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Representative Results
在这里，我们显示了具有代表性的表面质量控制图像（图4）。高质量的表面应在RICM通道中具有干净的背景（图4B），在Cy3B通道中应具有均匀的荧光强度（图4C）。在相同的成像设备和相同的荧光成像采集条件下，在使用DNA探针进行实验时，每次背景荧光强度应一致且可重现。我们建议在每组单独实验之前将其用作表面质量控制的标记。
在本文中，我们展示了一些代表性数据（图5），以OT-1幼稚CD8 + 细胞作为模型细胞类型，其特异性识别鸡卵清蛋白。CD3ε抗体作为系统的阳性对照，同源抗原pMHC N4（SIINFEKL）作为示例。将细胞接种在用4.7 pN DNA发夹探针功能化的底物上，这些探针呈递抗CD3ε或pMHC N4。30 分钟后，捕获 RICM 中的细胞扩散和 Cy3B 通道中的实时张力，并以 1 μM 的终浓度引入锁定链。张力锁定的延时结果表明，由于发夹锁定和信号积累，TCR-antiCD3ε和TCR-pMHC张力信号均被放大。此外，TCR-pMHC N4相互作用在实时（0 min）中表现出较弱的力信号，这可能是由于其键寿命短。锁定链记录了这些短暂的机械拉动事件，这有助于定量分析。此外，锁定揭示了TCR-pMHC力积累时的模式，这与抗CD3ε对照完全不同，类似于免疫突触的“靶心”模式。荧光信号的定量在步骤4.4中描述。我们通常使用张力占用率（定义为接触区域上具有张力信号的区域百分比）和每个细胞的综合荧光强度作为指标来评估> 4.7 pN的累积张力。
图2：寡核苷酸制备示例。 （A）Cy3B配体链纯化的HPLC色谱图;（B） 产品的马尔迪-托夫-质谱图谱;（C）计算质量和发现起始材料和标记寡核苷酸的m/z峰的表。 请点击此处查看此图的大图。
图3：DNA张力探针底物的功能化和实验程序。步骤在相应的协议中描述。请点击此处查看此图的大图。
图 4：质量良好的 DNA 张力探针表面示例。 （A）原子力显微镜（AFM）表征DNA张力探针表面;以及 （B） RICM 和 （C） Cy3B 通道中 DNA 张力探针表面的原始显微镜图像。 请点击此处查看此图的大图。
图5：成功实验的原始显微镜图像示例。 图像显示OT-1幼稚CD8 + 细胞产生针对（A）抗CD3ε和（B）pMHC N4的TCR力。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：数据处理和定量分析的示例。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：成功和不成功的曲面和张力映射的示例 。 （A）与在RICM中pMHC N4表面上扩散的细胞相比，不会扩散的细胞。（B）OT-1细胞扩散但没有在具有低DNA张力探针密度的抗CD3ε表面上产生任何张力信号。（C）图片显示成功的表面是淡粉红色的，不成功的表面是无色的。（D）Cy3B通道中的图像显示来自旧DNA储液的荧光聚集体。（E）RICM通道和Cy3B通道中的图案，可能是由于洗涤不充分或步骤之间的意外表面干燥造成的。（F）RICM和Cy3B通道中的图像显示了使用不同大小的Au NP的效果。（G）OT-1细胞的RICM和Cy3B图像，这些图像不产生张力信号，而是耗尽DNA。比例尺 = 5 μm。请注意，此处显示的原始数据是由不同的组成员从3个显微镜使用不同的图像采集设置收集的，因此具有不同的荧光背景水平。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
通过此处提供的详细程序，可以制备DNA发夹张力探针底物，以绘制和量化免疫细胞产生的受体张力。当细胞被接种到DNA发夹张力探针底物上时，当受体以化学和机械方式感知配体时，它们会着陆，附着和扩散，后者由我们的探针检测到。然而，在某些情况下，细胞可能无法扩散（图7A）或无法产生张力信号。这通常是表面化学问题的结果，需要排除故障（表1).低配体密度是导致细胞扩散失败的最常见问题之一。这可能是多种因素的结果，例如配体降解，DNA链降解，APTES和/或LA-PEG-NHS，聚集的金纳米颗粒或玻璃盖玻片清洁不足。通过比较成功实验和失败实验（图7B），可以快速评估问题的根源。例如，来自背景测量的具有强荧光信号的表面表明DNA探针的固定是成功的。低背景强度提示添加链霉亲和素和生物素化配体之前的制备步骤存在问题。如果问题是由配体引起的，可以通过将其涂覆在载玻片上或以10μg/ mL的96孔板中的孔来检查其质量，以测试细胞粘附。这是pMHC配体和抗CD3抗体配体活性的有用功能测试。通过观察Au NP孵育步骤后功能化盖玻片的颜色变化（淡粉红色），可以评估问题是由DNA降解还是DNA孵育前的步骤引起的（图7C).DNA链质量可以通过HPLC和MALDI-TOF-MS进行验证，其中单个DNA样品如果降解将显示多个峰。通过将紫外-可见光谱和TEM图像与制造商提供的表征进行比较，可以确认金NP的质量。如果配体、DNA链和Au NP的质量经过验证，并且这些试剂不会导致表面问题，我们建议更换试剂，包括APTES、LA-PEG-NHS、硫酸和H2O2 用于未来的表面处理，而不是花时间精确定位表面化学问题的原因。除了会导致DNA探针底物严重失效的低密度问题外，还有一些小问题可能会影响数据质量。由于表面制备具有多个孵育步骤，因此表面制备过程中使用的缓冲液应新鲜，过滤并保持在4°C下储存以避免污染。如果表面被污染，它将在RICM通道中可见，并可能导致奇怪的荧光背景。除污染外，随着时间的推移，DNA储备溶液中还会形成聚集体，这可能导致Cy3B通道（图 7D).通常，几个聚合不会影响数据质量;但是，如果细胞落在具有此类缺陷的区域，则数据分析的可靠性较低。有时，在RICM和Cy3B通道中都可以观察到影响张力映射的不规则图案，这可能是由于APTES步骤后的洗涤不足，或者在金颗粒功能化到表面上的步骤中表面意外干燥（图 7E).这些模式可能会影响张力映射，具体取决于其严重程度。为了保存抗体或pMHC等相对珍贵的试剂，我们建议在使用抗体/配体对DNA发夹张力探针进行功能化之前，始终检查表面质量（参见2.2.1和3.3）。尽管这种表面处理方案在我们手中是强大而可靠的，但请注意，它并不总是能很好地容忍某些步骤的改变。例如，当使用碱蚀刻和等离子体蚀刻而不是食人鱼蚀刻时，探针密度很可能会降低，并且存在更多的表面缺陷。金NP大小和封端试剂的改变可能会显著影响表面功能化结果（图7F).例如，我们发现5和10nm的Au NPs不能很好地与硫辛酸修饰的表面结合，这导致表面处理后的DNA最小。然而，8.8 nm和13 nm的Au NPs可以以更高的密度与硫辛酸表面结合，这已经在RICM（粗糙度）和Cy3B通道（荧光强度）中观察到。
一旦制备出高质量的DNA发夹张力探针表面，就可以对感兴趣的细胞进行实验，并使用荧光显微镜获取数据。实时张力可以用配备高NA（数值孔径）物镜和EMCCD的普通荧光显微镜捕获。但请注意，我们已经观察到，由于特定小鼠的条件，原代T细胞偶尔会在DNA张力探针表面上显示伪影。有趣的是，这种伪影更有可能发生在老年小鼠身上。例如，我们观察到荧光的负消耗而不是开启的荧光信号（图7G）。在这种情况下，请终止实验并使用新一批细胞重做。在使用非荧光锁定链进行受体力的定量分析之前，需要使用荧光Atto647N锁定链确认张力信号的存储和擦除。初始锁定10分钟后，Atto647N信号应与Cy3B信号强烈共定位，因为它反映了孵育期间的张力历史。由于 Cy3B 信号不仅反映张力历史，还反映移除锁定链后的实时力，因此 Cy3B 信号的一小部分可能没有伴随 Atto647N 信号（图 3J）。为了对张力进行更定量的分析，我们建议使用非荧光锁定链，这将消除Cy3B和Atto647N之间的势能转移，并避免在图像采集之间过度清洗。请注意，添加锁定链将不可避免地导致轻微的荧光背景增加，因为热力学将驱动发夹和锁定链之间的一些微小杂交，可以在定量前减去。人们可以量化锁定程序后每个细胞的综合强度，以研究某个受体产生的力。此外，锁定的动力学可能反映了受体对其配体的2D k开启和k关闭。
| 问题 | 可能的原因 | 溶液 |
| AuNP孵育后表面不呈粉红色 | 蚀刻不足 | 包括食人鱼蚀刻后的碱蚀刻步骤。在0.5M KOH中在冰浴中用超声处理将盖玻片蚀刻1小时。 |
| APTES是水解的 | 使用新的 APTES | |
| NHS试剂水解 | 使用新的 PEG-NHS 试剂 | |
| PEG-NHS试剂在添加到表面之前经过水解 | 工作速度更快 | |
| 金NP已聚合 | 使用新的金NP | |
| 盖玻片上的残留水稀释了金NP | 在添加 Au NP 之前，请确保没有/很少的水残留物 | |
| 细胞不会在表面上扩散 | 低 DNA 探针密度 | 如果表面不是粉红色，请按照上述方法进行故障排除。如果Au NP功能化正常，则合成并使用新的DNA |
| 配体密度低 | 使用新的链霉亲和素和配体试剂 | |
| 细胞不会在配体上扩散 | 检查配体包被表面上的细胞扩散，如果细胞仍然没有扩散，包括文献12中所述的粘附分子。 | |
| 细胞扩散良好，但即使使用抗体对照，也没有张力信号或仅观察到非常弱的张力信号 | 受体-配体相互作用没有力传递 | 那 |
| 力是短暂的或力信号稀疏 | 使用锁定寡核苷酸 | |
| 表面钝化不好 | 增加磺基-NHS 醋酸浓度，最高可达 10 mg/mL | |
| 在 Atto647N 中未观察到锁定信号 | 寡核苷酸已降解 | 与 MALDI-TOF-MS 核对 |
| 锁定信号通过实时探头进行反定位 | 受体力高于锁定核苷酸的工作范围 | 如前所述，使用参考文献12中的19 pN实时发夹探头。 |
表 1：使用 DNA 的张力探头系统进行故障排除。
机械信息存储的应用对于绘制免疫细胞产生的受体力特别有用，免疫细胞通常是短暂的且数量较少。通过单分子光谱测量确定，通过施加~10 pN的力来观察峰键寿命，寿命范围从小于100毫秒到几秒钟不等。这种短持续时间的键很难用传统的DNA发夹张力探针成像捕获15。这种机械存储系统的另一个用途是当目标受体的密度在细胞表面16上相对较低时，这导致信号稀疏，通常很难用传统的DNA发夹张力探针与背景区分开来。这种低密度受体力可以通过使用该策略累积的张力映射来揭示。请注意，我们特别限制此策略对免疫细胞的应用，因为与成纤维细胞或血小板中的整合素（高达或大于56 pN）相比，已知免疫细胞中存在的力处于较低状态（TCR<19 pN）12，13，15。原因是根据光镊测量，当负载小于20 pN时，杂交速率常数khyb不会受损，该范围在106 M-1 S-1范围内。此外，预计在20 pN力
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH Grants R01GM131099，NIH R01GM124472和NSF CAREER 1350829的支持。我们感谢NIH四聚体设施的pMHC配体。这项研究得到了埃默里综合糖组学核心的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
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