Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء إزالة الفص البطني للكبد في سمك الحمار الوحشي البالغ لتمكين دراسة تجديد الكبد.
Abstract
فشل الكبد هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم، والوفيات الناجمة عن أمراض الكبد المزمنة ترتفع بشكل حاد في الولايات المتحدة. الكبد السليم قادر على تجديد من الأضرار السامة، ولكن في أمراض الكبد المتقدمة، وضعف القدرة الطبيعية للكبد لتجديد. وقد برزت حمار وحشي كنظام تجريبي قوي لدراسة التجديد. وهي نموذج مثالي لدراسة تجديد الكبد من استئصال الكبد الجزئي، وهو إجراء له صلة سريرية مباشرة تتم فيه إزالة جزء من الكبد جراحيا، تاركا الباقي سليما. لا يوجد بروتوكول قياسي لاستئصال الهيباتيك الجزئي؛ وقد استخدمت الدراسات السابقة باستخدام هذا النموذج بروتوكولات مختلفة قليلا وأفادت نتائج متباينة. الموصوفة هنا هو كفاءة، بروتوكول استنساخها لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في حمار وحشي الكبار. نحن نستخدم هذه التقنية لإثبات أن حمار وحشي قادر على تجديد غير متبلور للفص المكروب. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمزيد من الاستجواب الآليات اللازمة لتجديد الكبد في حمار وحشي.
Introduction
من بين الأعضاء الصلبة في البشر ، والكبد هو الجهاز الوحيد القادر على تجديد1. وهذا أمر بالغ الأهمية، كما الكبد هو جهاز أساسي، المسؤولة عن وظائف التمثيل الغذائي الرئيسية، وتخزين الطاقة، وإزالة السموم من الدم، وإفراز بروتينات البلازما، وإنتاج الصفراء2. يتم استبدال خلايا الكبد المفقودة بسبب الأضرار السامة أو الالتهابية في المقام الأول عن طريق تقسيم خلايا الكبد المتبقية1. نموذج تجريبي كلاسيكي واحد لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي ، حيث تتم إزالة الفصوص الفردية للكبد ، وترك الفصوص المتبقية سليمة3. تم تطوير هذا الإجراء في البداية في الفئران ، حيث تتم إزالة ما يقرب من ثلثي كتلة الكبد. بعد استئصال الكبد الجزئي في الثدييات ، يحدث التجديد التعويضي في الفصوص المتبقية حتى يستعيد الكبد كتلته الأولية. وتجدر الإشارة إلى أن كبد الثدييات لا يحل محل الفصوص المفقودة.
Zebrafish (دانيو rerio) تمثل نموذجا قابلة للسحب لدراسة تجديد الأعضاء الكبار4. الكبد حمار وحشي، في حين تختلف هيكليا عن الكبد الثدييات، و تتكون من نفس أنواع الخلايا ويخدم نفس الوظيفة كما هو الحال في الثدييات2. ويتكون من ثلاثة فصوص، مع اثنين من الفصوص الظهرية وفص بطني واحد التي تتسطح على طول الأمعاء. وقد سبق إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي، مع روايات متضاربة حول الطريقة الدقيقة للتجديد. عادة، يتم إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث عن طريق إزالة الفص البطني بأكمله. وأشارت التقارير الأولية إلى أنه بعد إزالة الفص البطني ، تم تجديده بالكامل في غضون أسبوع5،6،7، مما يشير إلى أنه على النقيض من كبد الثدييات ، فإن كبد الحمار الوحشي قادر على التجديد غير المتبلور. أظهرت الدراسات اللاحقة أن إزالة الفص البطني أدت إلى تجديد تعويضي في الفصوص الظهرية ، بدلا من تجديد الفص البطني المفقود ، وفي النهاية استعادة كتلة الكبد في غضون أسبوع8،9. كشف التنميط النسخي للفص الظهري بعد استئصال الفص البطني عن تغييرات كبيرة مرتبطة بالتجديد التعويضي10. وبالنظر إلى أن طريقة تجديد الكبد يمكن أن تختلف مع مدىالإصابة 8، تكهننا بأن التناقضات في النتائج قد تكون بسبب الاختلاف التقني في بروتوكول استئصال الكبد الجزئي بين مجموعات البحث.
يصف هذا البروتوكول إجراء لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث على حمار وحشي الكبار عن طريق إزالة الفص البطني. وستكون هذه التقنية قيمة لتقييم آليات تجديد الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأثيرت حمار وحشي وتربية وفقا للإجراءات القياسية. تمت الموافقة على التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بريغهام والنساء (2016N000405). تم صائم حمار وحشي الكبار لمدة 24 ساعة قبل بدء البروتوكول. مياه النظام يشير إلى المياه في خزانات الإسكان حمار وحشي في المرفق المائي.
1. التحضير والتخدير
- إعداد 0.016٪ Tricaine الحل في مياه النظام.
تنبيه: Tricaine هو مهيج إذا كان يأتي في اتصال مع العينين والجلد، أو الجهاز التنفسي. - إعداد اسفنجة لعقد حمار وحشي مخدر خلال بروتوكول تشريح. قطع اسفنجة كاملة إلى أرباع. باستخدام شفرة حلاقة، قم بإزالة إسفين رقيقة من الإسفنج الذي يمتد بالتوازي مع المحور الطويل من الربع الإسفنج.
- يجب أن يكون الشق طويلا بما يكفي لاستيعاب سمكة بالغة (وهذا يختلف بين أحجام مختلفة من الأسماك). على سبيل المثال، بالنسبة للأسماك البالغة 35 ملم في الطول، يجب أن يكون طول الشق 20 ملم. يتم عقد الرأس والجسم بشكل مريح في الاسفنج، ولكن الذيل يمتد الماضي حافة الاسفنج(الشكل 1B).
- نقع الاسفنج في حل Tricaine 0.016٪.
- وضع حمار وحشي الكبار (سواء ذكر أو أنثى) في 625 مل من محلول Tricaine 0.016٪.
- حضانة لمدة 6 دقائق أو حتى الأسماك لا تستجيب للمس.
- باستخدام ملقط، وإزالة بعناية الأسماك من خزان Tricaine ووضع الجانب البطيني السمك حتى في الأخدود من الاسفنج (الشكل 1A - B).
- ضع الإسفنج تحت مجهر تشريح مع إضاءة من أعلى إلى أسفل.
2. الجراحة
- باستخدام ملقط ناعم، قرصة الجلد ومقاييس medially، فقط الخلفي إلى القلب(الشكل 1B).
- باستخدام مقص الربيع محملة، وجعل خفض تحت ملقط لخلق ثقب في تجويف الجسم (الشكل 1C - D). الحرص على عدم إصابة القلب أو الأوعية الدموية الرئيسية، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
- باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق 3-4 ملم على طول البطن، ومعالجة الخلفي حتى الشق يصل في زعانف الحوض(الشكل 1D - E). عند هذه النقطة، قد يكون الفص البطني للكبد مرئيا من خلال الشق.
- اضغط على جانبي الاسفنج بيد واحدة لإجبار الأعضاء الحشوية على الخروج من تجويف الجسم. الفص البطني للكبد سوف تكون مرئية على رأس الأمعاء (الأرقام 1F, 2A-B). سيظهر الكبد كبنية وردية أو برتقالية منتشرة على الأمعاء الذهبية البنية. يتم استرداد الحيوانات المعينة كضوابط صورية في هذه المرحلة.
- الضغط على ملقط غرامة بحيث اثنين من tines لمس. مع الحفاظ على الضغط على الاسفنج ، الشريحة من علب ملقط غرامة في ما بين الكبد والأمعاء(الشكل 1G). الحرص على عدم ثقب الأمعاء، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
- تخفيف الضغط ببطء على ملقط بحيث الطنين الابتعاد عن بعضها البعض (الشكل 1H). هذا العمل انزلاق يقطع العديد من المرفقات الوريد البوابة بين الفص البطني والأمعاء (الشكل 2B)، وضروري لإزالة الفص البطني نظيفة. كرر هذه العملية حتى يتم قطع جميع اتصالات البوابة بين الكبد والأمعاء.
- قشر الفص البطني من الأمعاء باستخدام ملقط ناعم وقطع الفص البطني خالية من بقية الكبد (الشكل 1I).
- ينتج عن هذا الإجراء استئصال جزء من الهيباتيكومي ثلث(الشكل 1J).
3. الانتعاش
- إزالة بعناية الأسماك من الإسفنج ووضعها في خزان من مياه النظام.
- ماصة نظام المياه على الخياشيم لبضع دقائق حتى الأسماك تسبح من تلقاء نفسها(الشكل 1K).
- مراقبة الأسماك لمدة 2-4 ساعات قبل وضعها مرة أخرى على النظام. لا تطعم السمك لمدة 24 ساعة كاملة بعد الجراحة.
- مراقبة الأسماك يوميا طوال مدة التجربة.
- مع مرور الوقت، شق في جدار الجسم سوف تلتئم بشكل طبيعي دون الحاجة إلى الغرز (الشكل 1L،2C).
4. الفص البطني إلى تحليل طول الأمعاء
- قتل جميع الحيوانات الموجهة للتحليل في الماء المثلج لمدة 10 دقائق حتى تتوقف جميع الحركات opercular.
- إزالة الأسماك من الماء المثلج ووضعها الجانب البطني حتى في الأخدود من اسفنجة.
- باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق في جدار الجسم البطني في الموقف الأمامي الخلفي للقلب. ثم جعل اثنين من أكثر الشقوق التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي من الشق الأول على طول الطريق إلى زعانف الحوض. (الشكل 2A).
- قشر الظهر الجلد والعضلات للكشف عن الأجهزة الحشوية (الشكل 2A).
- الحصول على صور ذات مجال مشرق والفلورسنت من الأجهزة الحشوية باستخدام المجهر epifluorescence. وسيشمل مجال الرؤية هذا المنطقة التي أعيد فيها استئصال الفص البطني. ولأن الحيوانات يقتل رميا بالرصاص قبل التحليل، فإن هذا النوع من التحليل يحول دون التصوير طويل الأجل لنفس الأسماك.
5. تحليل نسبة الوزن الكبد إلى الجسم
- قتل جميع الحيوانات الموجهة للتحليل في الماء المثلج لمدة 10 دقائق حتى تتوقف جميع الحركات opercular.
- ضع السمك في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
- إضافة 25 مل من 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1x و 0.3٪ توين إلى الأنبوب.
تنبيه: الفورمالديهايد سام، وينبغي دائما معالجة الحلول التي تحتوي على الفورمالديهايد في غطاء محرك السيارة الكيميائية. - نوتات لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
- أداء أربعة يغسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1x و 0.3٪ توين.
- استرداد الأسماك مع ملقط، ولطخة الجافة على منشفة ورقية.
- سجل وزن السمك بأكمله.
- باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق في جدار الجسم البطني في الموقف الأمامي الخلفي للقلب. ثم، جعل اثنين من أكثر الشقوق التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي من الشق الأول على طول الطريق إلى زعانف الحوض. (الشكل 2A).
- قشر الظهر الجلد والعضلات للكشف عن الأجهزة الحشوية (الشكل 2A).
- الحصول على صور ذات مجال مشرق للكبد باستخدام المجهر epifluorescence.
- تشريح الكبد، ووضع قطعة من الكبد على قارب الوزن.
- سجل وزن الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل دراسة الإمكانات التجديدية لكبد حمار وحشي البالغين ، قمنا بإجراء استئصال الكبد الجزئي (PHX) في سمك الحمار الوحشي البالغ. بشكل عام، تم اختيار كبار البالغين (30-40 ملم في الطول)، تتراوح أعمارهم بين 1.5-2.5 سنة. وفي إطار التجارب الفردية، تم اختيار الحيوانات من نفس الخزان، وكانت مطابقة للعمر والحجم. كتحكم مناسب ، استخدمنا العمليات الجراحية الصورية التي تم فيها تخدير الحيوان وتلقي شقا كبيرا في جدار الجسم البطني ولكن تم استرداده دون إزالة أي أنسجة. وتراوحت معدلات البقاء على قيد الحياة للضوابط صورية من 90٪ إلى 100٪ لكل من الذكور والإناث حمار وحشي. وتراوحت معدلات البقاء على قيد الحياة للحيوانات PHX من 60٪ -75٪ لسمك الحمار الوحشي الذكور و 60٪ -90٪ لسمك الحمار الوحشي الإناث، مع جميع الوفيات التي تحدث في أول 24 ساعة بعد الجراحة.
معيار الذهب لقياس الشفاء من الكبد بعد PHX هو الكبد إلى نسبة وزن الجسم، أو LBR. وقد استخدم هذا المقايسة لقياس كل من انتعاش كتلة الكبد في كل من الثدييات11 ونماذج حمار وحشي8. لتحديد وزن الكبد بشكل موثوق ، قمنا بقياسات الوزن على الحيوانات الثابتة ، كما وصفها سابقا8. أجرينا قياسات LBR على نوع البرية، حمار وحشي غير مصاب، ووجدت أنه كما ذكر سابقا8،وكان حمار وحشي الإناث تقريبا ضعف LBR بالمقارنة مع حمار وحشي الذكور (3.3٪ لسمك الحمار الوحشي الإناث و 1.8٪ لسمك الحمار الوحشي الذكور) (الشكل 3A). قمنا بكل من صور وPHX على حمار وحشي الكبار من كلا الجنسين وتحليل LBR في 0 و 7 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة) (الشكل 3B). في 0 نقطة في البوصة ، كان للحيوانات الصورية فص بطني مرئي بوضوح ، في حين أن الفص البطني كان غائبا تماما في PHX(الشكل 3C). وتجدر الإشارة إلى أن هذا أدى إلى انخفاض كبير في معدل النسبة المئوية للأسماك (انخفاض بنسبة 30 في المائة في الأسماك الذكورية، وانخفاض بنسبة 20 في المائة في الأسماك الإناث)(الشكل 3D). في الفوج من الأسماك التي تم تحليلها في 7 نقطة في البوصة، وجدنا أن الفص البطني لم يجدد(الشكل 3E)،ومع ذلك فإن LBR من PHX والضوابط صورية كانت قابلة للمقارنة(الشكل 3F). وتشير هذه القياسات إلى أنه بحلول 7 نقطة في البوصة، استعاد الكبد كتلته بالنسبة للضوابط الصورية، ويفترض أن يكون ذلك عن طريق التجديد التعويضي في الفصوص الظهرية، بالاتفاق مع التقارير السابقة8و9.
قررنا التحقيق فيما إذا كان الفص البطني للكبد قادرا على التجدد، نظرا للوقت الكافي. الكبار Tg (fabp10a: CFP-NTR) تم اختيار الأسماك للتجريب، وهذه الأسماك تعبر CFP في خلايا الكبد، مما يسمح للتصور من الكبد باستخدام المجهر الفلوري. وقد خضعت مجموعة من الحيوانات لبروتوكول استئصال الهباتيك الجزئي الكامل البالغ الثلث. تم تحليل الحيوانات في 1 أو 36 نقطة في البوصة (الشكل 4A). لكل حيوان، تم قياس نسبة طول الفص البطني إلى الأمعاء(الشكل 4B).
كان للحيوانات التي خضعت لجراحة صورية فص بطني بارز احتل 50٪ -100٪ من طول الأمعاء ، في حين أن الحيوانات التي تعرضت لاستئصال الهيباتيك الجزئي بنسبة الثلث كان لديها فص بطني منخفض بشدة. ومن اللافت للنظر أن العديد من استئصال الهيباتيك الجزئية التي تبلغ 36 نقطة في البوصة قد زادت نسبة الفص البطني إلى الأمعاء مقارنة بحيوانات استئصال الهيباتيك الجزئية عند نقطة واحدة في البوصة(الشكل 4C). لم تكن هناك زيادة في حجم الفص البطني في ضوابط صورية. ومع ذلك ، لوحظت زيادة يعتد بها إحصائيا في حجم الفص البطني بعد التعافي من استئصال الهيباتيك الجزئي(الشكل 4D). لاحظنا أن هناك تباينا كبيرا في الاستجابة للجراحة ، مع بعض الحيوانات التي لا تظهر أي تجديد ، والبعض الآخر تجديد واضح لفص بطني محدد جيدا(الشكل 4E). هذه النتائج تثبت أن الفص البطني قادر على تجديد من استئصال الكبد الجراحية في حمار وحشي الكبار. إذا أخذنا معا، يشير عملنا إلى أن كبد الحمار الوحشي قادر على كل من التجديد غير المتبلور والتعويضي.
الشكل 1: بروتوكول استئصال الهباتيك الجزئي. (أ) رسم تخطيطي لسمك حمار وحشي بالغ ، مع المحاور الأمامية الخلفية والظهرية البطنية. (ب)بعد تخدير، يتم تضمين في اسفنجة (يظهر باللون الأزرق) بحيث يكون الجانب البطني لأعلى. وتستخدم ملقط ناعم لقرصة الجلد الخلفي فقط إلى القلب. لا يظهر الإسفنج في اللوحات اللاحقة للوضوح. (ج)تستخدم مقص لكسر الجلد الخلفي فقط إلى القلب. (D-E) وتستخدم مقص في الجرح مفتوحة الآن لجعل شق 3-4 ملم تشغيل من الأمامي إلى الخلفي، وإنهاء قبل زعانف الحوض. (F) الضغط على جانبي الإسفنج يسبب الأعضاء الحشوية لموسيقى البوب من الجرح الأكبر. (G)ملقط غرامة مع لمس كل من طنين تنزلق بين الفص البطني للكبد والأمعاء. (H) يتم استرخاء ملقط، مما تسبب لهم لكسر المرفقات الوريد البوابة بين الكبد والأمعاء. وتتكرر هذه العملية على طول الفص البطني. (I-J) يتم سحب الفص البطني من نهايته الخلفية ، في حين يتم استخدام المقص لقطع الفص البطني عن بقية الكبد. (ك)يوضع الحيوان في غرفة الإنعاش مع مياه النظام، حيث يستعيد وعيه وحقوقه بنفسه. (L) مع مرور الوقت، يتم سحب الأحشاء مرة أخرى إلى تجويف الجسم ويشفي الجرح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح حمار وحشي والانتعاش من استئصال الهيباتيك الجزئي. (أ) لتحليل الأعضاء الحشوية ، يتم قتل الحيوانات ووضع الجانب البطني على اسفنجة. أولا، يتم إجراء شق في الموضع الأمامي الخلفي للقلب (الخط الأحمر). ثم يتم إنشاء شقين يتم تشغيلها على طول المحور الأمامي الخلفي إلى زعانف الحوض (الخط الأزرق). ثم، يتم تقشير الجلد والعضلات مرة أخرى، والكشف عن الأعضاء الحشوية. وصفت هي الأمعاء والفص البطني للكبد، والوريد المركزي في هذا الفص. (ب) صورة حية من وجهة نظر بطنية من حمار وحشي تستعد لتحليل الأجهزة الحشوية. يتم تحديد الفص البطني للكبد بخط أبيض منقط. يشير المربع الأصفر في الصورة 2x إلى موقع الصورة 8x. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى اتصالات الوريد البوابي بين الأمعاء والكبد. (ج) منظر فينترال للجرح الناتج عن إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في النقاط الزمنية المشار إليها. مع مرور الوقت، شق يشفي تماما. أشرطة المقياس، 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تم قياسالتجديد التعويضي بعد استئصال الكبد الجزئي. (أ) نسب الكبد إلى وزن الجسم (LBR) لنوع البرية، حمار وحشي غير مصاب. أنثى حمار وحشي لديها ما يقرب من ضعف LBR بالمقارنة مع ذكر حمار وحشي. تمت مقارنة الحيوانات الأنثوية بالحيوانات الذكور باستخدام اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون ، ****p < 0.0001. (ب)التخطيطي مشيرا إلى أن نوع البرية حمار وحشي استخدمت لهذه التجربة. تعرضت الحيوانات لاستئصال الهيباتيك الزائف أو الجزئي (PHX)، ثم تم إصلاحها إما في 0 أو 7 أيام بعد الإصابة (dpi). تم تصوير الحيوانات الثابتة وإخضاعها لقياسات LBR. (C,E) تظهر صور تمثيلية للحيوانات التي تتعرض لخدع أو PHX عند 0 نقطة في البوصة(C)و 7 نقطة في البوصة(E). لاحظ الغياب الكامل للفصوص البطنية في PHX. لجميع الصور، هو مبين هو عرض البطني من الأجهزة الحشوية. الصور هي صور ذات مجال مشرق. يتم تحديد الفص البطني للكبد باللون الأبيض. أشرطة المقياس، 500 ميكرومتر. (D,F) شريط الرسوم البيانية من الكبد إلى الجسم نسب الوزن لكل من الذكور والإناث حمار وحشي بعد عمليات جراحية وهمية وPHX في 0 نقطة في البوصة(D)و 7 نقطة في البوصة (F). ارتفاع الشريط هو متوسط القيمة، وقضبان الخطأ تمثل SEM. في حين أن هناك انخفاضا في LBR بعد استئصال الهيباتيك الجزئي في 0 نقطة في البوصة، لا يوجد فرق كبير بين PHX والحيوانات الصورية في 7 نقطة في البوصة، مما يشير إلى استعادة LBR. تمت مقارنة عينات استئصال الهيباتيك الجزئية بالضوابط الصورية باستخدام اختبار مجموع رتبة Wilcoxon ، ns = غير مهم ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:يمكن حمار وحشي تجديد فصوصها البطنية بعد استئصال الهيباتيك الجزئي. (أ) التخطيطي مما يشير إلى أن TG (fabp10a:CFP-NTR) استخدمت لهذه التجربة. أجريت الجراحة والتحليل عن طريق التصوير في النقاط الزمنية المشار إليها. (ب)صورة مثال لتوضيح كيفية تحليل الحيوانات. تم قياس الحيوانات كميا من خلال قياس طول الفص البطني (باللون الأحمر) وطول الأمعاء (باللون الأصفر) وحساب النسبة المئوية للأمعاء التي يحتلها الفص البطني (باللون الأبيض). (ج)تظهر صورة تمثيلية للحيوانات التي تتعرض لاستئصال الهيباتيك (PHX) الصوري أو الجزئي في 1 و 36 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة). (د) مؤامرات الكمان من نسبة طول الفص البطني إلى طول الأمعاء للحيوانات التي تتعرض لاستئصال الهيباتيك وهمية أو جزئية في 1 و 36 نقطة في البوصة. تمثل كل نقطة القيمة من سمكة واحدة. القيم للأسماك الذكور باللون الأزرق، والأسماك الإناث باللون الأحمر. تمت مقارنة عينات استئصال الهيباتيك الجزئية بالضوابط الصورية باستخدام اختبار مجموع رتبة Wilcoxon ، ns = غير مهم ، * p < 0.05. (ه)يظهر مثالان على الحيوانات استئصال الهباتيك الجزئي في 36 نقطة في البوصة التي لم تتجدد، ومثالين التي لم تجديد. لجميع الصور، هو مبين هو عرض البطني من الأجهزة الحشوية. الصور هي دمج لصورة مضان CFP وصورة ذات مجال مشرق. مضان CFP موجود فقط في الكبد. يتم تحديد الفص البطني للكبد باللون الأحمر. النسبة المئوية للأمعاء التي يحتلها الفص البطني هي باللون الأبيض. أشرطة المقياس، 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاختلافات التشريحية بين سمك الحمار الوحشي ونماذج الثدييات لتجديد الكبد تمثل تحديات فريدة من نوعها لاستئصال الكبد. الكبد في حمار وحشي على مقربة من القلب والأمعاء. عن غير قصد إتلاف أي من الأعضاء يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات. لا يتم تغليف كبد حمار وحشي ، مما يجعل من الصعب فصله عن الأمعاء. الكبد يتلقى الدم الغني بالمغذيات من الأمعاء من خلال الأوردة البوابة. في الثدييات ، تتلاقى الأوردة التي تغادر الأمعاء على وريد البوابة الأولية التي تنقسم بعد ذلك عند دخولها الكبد12. في المقابل ، يتلقى كبد حمار وحشي تداول البوابة من سلسلة من الأوعية الصغيرة التي تتحرك مباشرة من الأمعاء إلى الكبد(الشكل 2B). وهكذا ، يتم توصيل كل فص من الكبد ، بالارض فوق الأمعاء ، بشكل آمن إلى الأمعاء من قبل هذه الأوعية. محاولة إزالة الفص البطني دون قطع الأوردة البوابة أولا يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى استئصال غير مكتملة (البيانات غير مبين). تصف بعض البروتوكولات الأولية سحب الفص البطني من خلال شق بسيط نسبيا ، والذي لا يسمح بقطع هذه المرفقات المدخل5،6.
تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لمواجهة هذه التحديات لتمكين إزالة الفص البطني المتسق. يتم وضع سمك الحمار الوحشي المخدر بشكل مريح في أخدود الإسفنج للحفاظ على الخياشيم رطبة وأجسامهم غير متحركة طوال مدة الإجراء. معسر الجلد فقط الخلفي إلى القلب يجعل من الممكن لوضع شق في الجلد دون الإضرار بأي من الأعضاء الداخلية. فتح شق كبير (3-4 ملم) يجعل إزالة الكبد وتقييم درجة إزالة مباشرة(الشكل 2C). الأهم من ذلك، يمكن أن يتعافى حمار وحشي من وشفاء الجرح في نهاية المطاف من هذا الحجم دون أي إغلاق الجرح الأولي. عن طريق الضغط على الإسفنج وضغط جدار الجسم ، تصبح الأعضاء الحشوية أكثر سهولة ومن الممكن تمرير علب ملقط بين الكبد والأمعاء. يمكن بعد ذلك استخدام ملقط لقطع وصلات البوابة بين الكبد والأمعاء. وبمجرد تحقيق ذلك، يمكن استخدام ملقط ناعم لتقشير الفص البطني مرة أخرى بحيث يمكن فصله عن بقية الكبد.
قمنا بقياس نسب وزن الكبد إلى الجسم (LBR) للحيوانات التي تعرضت لعمليات جراحية صورية وPHX. وجدنا أنه من قبل 7 نقطة في البوصة ، وLBR من الحيوانات PHX كانت مماثلة لضوابط(الشكل 3F). وبالنظر إلى أن الفص البطني لم يتجدد في هذه المرحلة (الشكل 3E)، استنتجنا أن التجديد حدث من خلال التعويض في الفصوص الظهرية. لمعالجة مسألة ما إذا كان الفص البطني يمكن أن يتجدد في نهاية المطاف في حمار وحشي، قمنا بإجراء PHX وفحصنا إعادة نمو الكبد. في المتوسط ، كانت نسبة طول الفص البطني إلى الأمعاء أعلى عند 36 نقطة في البوصة من 1 نقطة في البوصة ، مما يشير إلى تجديد الفص البطني(الشكل 4C-D). هناك تباين كبير في استجابة الحيوانات للإصابات ، مع بعض الحيوانات التي تعاني من نمو ضئيل جدا والبعض الآخر يعاني من انتعاش كبير في الفص البطني(الشكل 4E). نستنتج أن الكبد يمكن أن يتجدد بمزيج من التجديد غير المتبلور للفص البطني والتجديد التعويضي في الفصوص الظهرية ، وإن كان ذلك في جداول زمنية مختلفة. كما استخدمت الدراسات السابقة الهيباتيكتوم الجزئية لتحديد دور الجينات الفردية5و7و9 ومسارات الإشارات6و8و10 بعد استئصالها ، نتوقع أن هذا البروتوكول سيتقدم فهمنا للآليات الجزيئية والخلوية لتجديد الكبد في الفقاريات البالغة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
أنا.M.O. معتمد من قبل NIAAA (F32AA027135). W.G. مدعوم من قبل R01DK090311، R01DK105198، R24OD017870، وبرنامج كلوديا آدامز بار للتميز في أبحاث السرطان. دبليو جي هو باحث بيو في العلوم الطبية الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
