Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Temperaturkontrollerad montering och karakterisering av ett droppgränssnitt Bilayer

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Detta protokoll beskriver användningen av ett återkoppling temperaturstyrt värmesystem för att främja lipid monolayer montering och droppe gränssnitt bilayer bildas för lipider med förhöjda smälttemperaturer och kapacitans mätningar för att karakterisera temperaturdrivna förändringar i membranet.

Abstract

Metoden droplet interface bilayer (DIB) för montering av lipid bilayers (dvs. DIBs) mellan lipidbelagda vattenhaltiga droppar i olja erbjuder viktiga fördelar jämfört med andra metoder: DIB är stabila och ofta långvariga, bilayerområdet kan justeras reversibelt, broschyrasymmetrin styrs lätt via droppkompositioner och vävnadsliknande nätverk av bilayers kan erhållas genom angränsande många droppar. Formning DIBs kräver spontan montering av lipider i lipidmonödlägg med hög densitet vid droppens ytor. Medan detta sker lätt vid rumstemperatur för vanliga syntetiska lipider, misslyckas en tillräcklig monolayer eller stabil bilayer att bildas vid liknande förhållanden för lipider med smältpunkter över rumstemperatur, inklusive vissa cellulära lipidextrakt. Detta beteende har sannolikt begränsat sammansättningen – och kanske den biologiska relevansen – av DIB i modellmembranstudier. För att ta itu med detta problem presenteras ett experimentellt protokoll för att noggrant värma oljereservoaren som är värd för DIB-droppar och karakterisera effekterna av temperaturen på lipidmembranet. Specifikt visar detta protokoll hur man använder en termiskt ledande aluminiumfixtur och resistiva värmeelement som styrs av en återkopplingsslinga för att förskriva förhöjda temperaturer, vilket förbättrar monoskiktsmontering och bilayerbildning för en bredare uppsättning lipidtyper. Membranets strukturella egenskaper, liksom termotropa fasövergångar hos lipider som består av bilayer, kvantifieras genom att mäta förändringarna i dib:s elektriska kapacitans. Tillsammans kan detta förfarande bidra till att utvärdera biofysiska fenomen i modellmembran över olika temperaturer, inklusive att bestämma en effektiv smälttemperatur(TM)för flerkomponents lipidblandningar. Denna förmåga kommer således att möjliggöra närmare replikering av naturliga fasövergångar i modellmembran och uppmuntra bildandet och användningen av modellmembran från en bredare mängd membranbeståndsdelar, inklusive de som bättre fångar heterogeniteten hos deras cellulära motsvarigheter.

Introduction

Cellmembran är selektivt genomsläppliga barriärer bestående av tusentalslipidtyper 1, proteiner, kolhydrater och steroler som kapslar in och delar upp alla levande celler. Att förstå hur deras sammansättningar påverkar deras funktioner och avslöja hur naturliga och syntetiska molekyler interagerar med, följer, stör och flyttar cellmembran är därför viktiga forskningsområden med omfattande konsekvenser inom biologi, medicin, kemi, fysik och materialteknik.

Dessa mål för upptäckt drar direkt nytta av beprövade tekniker för montering, manipning och studier av modellmembran – inklusive lipid bilayers monterade från syntetiska eller naturligt förekommande lipider – som efterliknar sammansättningen, strukturen och transportegenskaperna hos deras cellulära motsvarigheter. Under de senaste åren har droppgränssnittet bilayer (DIB) metod2,3,4 för att konstruera en plana lipid bilayer mellan lipidbelagda vattendroppar i olja fått betydande uppmärksamhet5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23, och har visat praktiska fördelar jämfört med andra metoder för modellmembranbildning: DIB-metoden är enkel att utföra, kräver ingen sofistikerad tillverkning eller beredning (t.ex. "målning") av ett substrat för att stödja membranet, ger konsekvent membran med överlägsen livslängd, möjliggör standardelektrofysiologiska mätningar och förenklar bildandet av modellmembran med asymmetriska broschyrkompositioner3. Eftersom bilayer bildas spontant mellan droppar och varje droppe kan skräddarsys i position och smink, DIB-tekniken har också lockat stort intresse för att utveckla cellinspirerade materialsystem som bygger på användningen av stimuli-responsivamembran 18,24,25,26,27,28,29,balanserad compartmentalization och transport14,30,31, och vävnadsliknande material17,23,32,33,34,35,36.

Majoriteten av publicerade experiment på modellmembran, inklusive de med DIB, har utförts vid rumstemperatur (RT, ~20-25 °C) och med en handfull syntetiska lipider (t.ex. DOPC, DPhPC, etc.). Denna praxis begränsar omfattningen av biofysiska frågor som kan studeras i modellmembran och, baserat på observation, kan det också begränsa de typer av lipider som kan användas för att montera DIB. Till exempel monterar en syntetisk lipid som DPPC, som har en smälttemperatur på 42 °C, inte tätt packade monoskikt eller bildar DIB vid RT37. DIB-formation vid rumstemperatur har också visat sig vara svårt för naturliga extrakt, såsom de från däggdjur (t.ex. hjärnans totala lipidextrakt, BTLE)38 eller bakterier (t.ex. Escherichia coli totalt lipidextrakt, ETLE)37, som innehåller många olika typer av lipider och kommer från celler som bor vid förhöjda temperaturer (37 °C). Att möjliggöra studier av olika kompositioner ger därmed möjligheter att förstå membranmedrerade processer under biologiskt relevanta förhållanden.

Att höja oljans temperatur kan tjäna två syften: det ökar kinetiken hos monolayerenheten och det kan orsaka att lipider genomgår en smältövergång för att nå en vätskestörningsfas. Båda konsekvenserna hjälper till i monolayerenheten39, en föres närvarande för en DIB. Förutom uppvärmning för bilayerbildning kan kylning av membranet efter bildandet användas för att identifiera termotropa övergångar i enkla lipid bilayers38, inklusive de i naturliga lipidblandningar (t.ex. BTLE) som kan vara svåra att upptäcka med hjälp av kalorimetri. Förutom att bedöma termotropa övergångar av lipider kan exakt varierande temperaturen på DIB användas för att studera temperaturinducerade förändringar imembranstrukturen 38 och undersöka hur lipidsammansättning och fluiditet påverkar kinetiken hos membranaktiva arter (t.ex. porbildande peptider och transmembranproteiner37), inklusive däggdjurs- och bakteriella modellmembran vid en fysiologiskt relevant temperatur (37 °C).

Häri kommer en beskrivning av hur man monterar en modifierad DIB-oljebehållare och använder en återkopplingstemperaturregulator för att möjliggöra monoskiktsmontering och bilayerbildning vid temperaturer högre än RT att förklaras. Särskiljande från ett tidigare protokoll40ingår uttryckliga detaljer om integration av instrumentering som behövs för att mäta och kontrollera temperaturen parallellt med montering och karakterisering av DIB i oljebehållaren. Förfarandet kommer således att göra det möjligt för en användare att tillämpa denna metod för att bilda och studera dib-ämnen över en rad olika temperaturer i olika vetenskapliga sammanhang. Dessutom ger de representativa resultaten specifika exempel på de typer av mätbara förändringar i både membranstruktur och jontransport som kan uppstå när temperaturen varierar. Dessa tekniker är viktiga tillägg till de många biofysiska studier som kan utformas och utföras effektivt i DIB, inklusive att studera kinetiken hos membranaktiva arter i olika membransammansättningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Uppvärmd fixturberedning

  1. Samla 2 stycken 1 mm tjockt isolerande gummi trimmat till 25 mm x 40 mm i bredd respektive längd, 2 stycken av ett 6 mm tjockt gummi som också är 25 mm x 40 mm, en förberedd aluminiumbasfixturenhet och en akryloljebehållare som passar i visningsfönstret på aluminiumbasfixturen (se figurerna S1, S2 och S3 för detaljer om tillverkning och en exploderad monteringsvy). Förbered aluminiumfixturen först genom att fästa på botten av fixturen ett glaslocksvisningsfönster med UV-härdbart lim och vidhäftning 1 resistivt värmeelement på toppen av varje 25 mm x 25 mm sidofläns av fixturen.
  2. Placera de tunnare gummibitarna på mikroskopets scen så att varje pjäss långkant tangentiell till scenöppningen enligt figur1.
  3. Placera aluminiumbasfixturen ovanpå de isolerande dynorna med fixturens visningsfönster centrerat ovanför objektivet. Korrekt justering krävs för att avbilda de anslutna dropparna.
  4. Placera en tjockare gummibit ovanpå varje resistivt värmeelement och använd ett mikroskopstegsklämma för att hålla den på plats. Dessa delar skyddar värmeelementen från skador orsakade av scenklämmorna och isolerar mot oavsiktlig elektrisk kortslutning mellan värmeelementen och både aluminiumfixturen och mikroskopstadiet.
  5. Böj försiktigt mätänden på ett termoelement för att uppnå en 90° vinkel vid ~ 4 mm från änden.
  6. Sätt in termoelementens böjda spets i aluminiumfixturens nedre vänstra hörn och fäst den försiktigt med låsskruven.
  7. Placera akrylbehållaren i aluminiumfixturens brunn. Detta görs innan hexadecaneolja tillsätts till brunnen (steg 1.8) i aluminiumfixturen för att minimera risken för att fånga luftbubblor mellan visningsfönstret och botten av akrylbehållaren, vilket kan hindra utsikten över dropparna.
    OBS: Olja som tillsätts i aluminiumfixturens visningsfack används för att matcha brytningsindexen för akryl och glas för tydligare avbildning av dropparna i akrylbehållaren. Således är det värt att notera att olja i aluminiumfixturens brunn inte kommer i kontakt med innehållet i akrylbehållaren och rigorös rengöring av aluminiumfixturen krävs inte.
  8. Dispensera ~1 000 μL hexadekanolja i aluminiumfixturens brunn (dvs. mellan väggarna i akrylbehållaren och aluminiumfixturen), var noga med att inte överfylla. Oljenivån i aluminiumfixturens brunn bör vara så hög som möjligt för att maximera ytan för värmeöverföring, samtidigt som oljan inte kan spillas över fixturens kanter på mikroskopsteget eller objektivlinsen.
  9. Dela ut ~1 000 μL hexadekanolja i akrylbehållaren, samtidigt som du är medveten om att inte överfylla.
    OBS: Akrylbehållaren ska alltid rengöras noggrant mellan försöken. Användaren måste använda ett regemente bestående av på varandra följande sköljningar med etylalkohol och avjoniserat vatten följt av torkning i en desiccatorskål i över 12 timmar.

Figure 1
Figur 1:Uppvärmd scenmontering. Bilder visar monteringen av den termiskt ledande fixturen och oljebehållaren för DIB-bildning; siffror under varje bild identifierar motsvarande steg i protokollet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

2. Instrumentering för samtidig återkoppling temperaturreglering och elektrisk karakterisering av en DIB

OBS: Detta protokoll integrerar följande instrument för att möjliggöra återkopplingstemperaturreglering och samtidig elektrisk karakterisering av en DIB: en persondator (PC) med två tillgängliga USB-anslutningar (Universal Serial Bus), en patchklämmaförstärkare parad till ett dedikerat dataförvärvssystem (DAQ-1), en vågformsgenerator, en andra programmerbar DAQ (DAQ-2) med spänningsutgångs- och temperaturinmatningsmoduler och en strömförsörjnings-/förstärkare. I följande steg beskrivs de nödvändiga anslutningarna av dessa instrument (som illustreras i figur 2a) som behövs för att isolera mätningen och kontrollen av temperaturen från samtidig elektrofysiologi hos en DIB. Substitutioner för likvärdiga instrument får göras vid behov.

  1. Upprätta utdata- och indataanslutningar till DAQ-2-modulerna.
    1. Välj två par skruvterminaler på spänningsutgångsmodulen för differentialspänningsanslutningar och anslut trådledningar till dessa platser. Udda nummerterminaler är gemensamma markanslutningar, och de jämna talterminalerna är ojordade utgångar, som visas i (figur 2c). Anslut vart och ett av dessa två par blyledningar till separata skruvterminal-BNC-adaptrar och anslut sedan varje adapter till en separat BNC-kabel som används för att dirigera spänningssignaler till andra instrument.
      OBS: I denna inställning tilldelas differentialanslutningar vid plintarna 0 och 1 för temperaturregleringsutgången till effektförstärkaren, medan ett annat par anslutningar vid plintarna 6 och 7 är avsedda för spänningsutgång som ska skickas till dropparna via patchklämman.
    2. Med hänvisning till (figur 2c), välj en uppsättning termoelementterminaler (t.ex. terminalerna 2 och 3 betecknas som TC1-paret) på termoelementingångsmodulen och anslut termoelementtrådarna till den.

Figure 2
Figur 2:Systemledningar. En ritning över de anordningar och ledningar som krävs för systemet visas ia, medan en detaljerad titt på DAQ-2-anslutningarna anges ib. Illustrationen i (c) visar vattenhaltiga droppar på hydrogelbelagda elektroder nedsänkta i olja för DIB-formation. De två elektroderna är anslutna till de jordade respektive ojordade (V+) anslutningarna på plåsterklämförstärkarens huvudförstärkare. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. När elektriska anslutningar till DAQ-2-modulerna har gjorts ansluter du DAQ-2-chassit till en dator via en USB-anslutning och ansluter till en elektrisk strömkälla. Bekräfta sedan framgångsrik drivrutins- och programvaruinstallation före användning med en kommersiell programvara.
  2. Konfigurera och anslut en effektförstärkare mellan DAQ-2 och resistiva värmeelement.
    1. Konfigurera förstärkaren så att den fungerar i förstärkningsläge med fast förstärkning med en förstärkning på 10X.
    2. Anslut BNC-kabeln från plintarna 0 och 1 på spänningsutgångsmodulen (figur2b)till ingångsanslutningarna på effektförstärkaren med hjälp av en bananjack-BNC-adapter.
    3. Använd ytterligare BNC-adaptrar och kablar, anslut strömförstärkarens utgångsterminaler till båda uppsättningarna av värmeelement, som är kopplade parallellt med varandra och förstärkaren för att säkerställa att båda elementen upprätthåller samma spänningsfall under användning.
  3. Upprätta nödvändiga anslutningar för elektrofysiologiutrustningen.
    1. Anslut en BNC-kabel från plintarna 6 och 7 på spänningsutgångsmodulen(figur 2b)till de bakre växlade externa kommando BNC-kontakterna på baksidan av patchklämman.
    2. Anslut en andra BNC-kabel mellan vågformsgeneratorns utgång och frontbrytarens externa kommandoanslutning på baksidan av patchklämmanförstärkaren.
      OBS: Dessa två anslutningar ger alternativa metoder för att generera spänningsvågformer som appliceras på droppelektroderna via patchklämman. Vågformsgeneratorn är särskilt användbar för att generera triangulära vågformsspänningar som används för att mäta membrankapitans. Användaren kan bestämma vilka, om någon av dem, som är nödvändiga för sin egen applikation.
    3. Med en tredje BNC-kabel, anslut utgången av den uppmätta strömmen som finns på frontpanelen på patchklämman till en tillgänglig analog ingångS BNC-kontakt på framsidan av DAQ-1.
    4. Med en fjärde BNC-kabel, anslut utgången av uppmätt membranspänning (på baksidan av patchklämmanförstärkaren) till en separat analog ingångskontakt på DAQ-1. Detta möjliggör digitalisering av spänningen som appliceras över elektroderna.
    5. Med de två droppelektroderna beredda och stödda på mikromanipulatorer enligt beskrivningen i steg 7-9 i ref.40, anslut elektrodledningarna till patchklämmans huvudtage, som är fäst via kabel till patchklämmanförstärkaren.
      OBS: Huvudstegens roll är att styra spänningen mellan elektroderna och mäta den resulterande strömmen, som omvandlas till en proportionell spänning som får uteffekt av patchklämman till DAQ-1.
    6. Anslut DAQ-1 till en dator via en USB-anslutning och anslut motsvarande strömförsörjningskablar till både patchklämman och DAQ-1.
  4. Ström på all mätutrustning.
    OBS: Den kanske viktigaste detaljen i denna inställning är att se till att mA-A-anslutningarna (power amplifier output) är elektriskt isolerade från korrigeringsklämman förstärkarens huvudenhet, som använder en känslig krets för att mäta pA-nA-nivåströmmar i en DIB.

3. Återkoppling temperaturkontroll av droppe gränssnitt bilayers

OBS: Följande steg för att använda systemet för temperaturkontroll av återkoppling baseras på ett anpassat grafiskt användargränssnitt (GUI) som skapats för att implementera proportionellt integrerad (PI) temperaturkontroll för återkoppling40,41 (se Kompletterande kodningsfiler). Andra programvaru- och kontrollalgoritmer kan användas i stället. En kopia av detta program tillhandahålls läsaren med kompletterande information för papperet, men användaren är ansvarig för att konfigurera den för sin egen utrustning och behov.

  1. Starta DAQ-2-programvaran på datorn och öppna temperaturkontrollprogramfilen. När gui-programmet öppnas öppnar du programmet igen genom att klicka på mappikonen längst ned till vänster i gui-programmet och välja temperaturkontrollprogrammet (bild 3).
  2. Ange lämpliga numeriska värden för den proportionella kontrollökningen(KP)och den integrerade kontrollökningen (KI).
    OBS: KP- och KI-värdena 0,598 respektive 0,00445 visade sig fungera bra i installationen. Dessa värden fastställdes iterativt genom simulering med hjälp av en systemmodell som innehåller parametrar som erhållits från uppmätta öppna uppvärmningssvar (se figur 4). Vid öppen uppvärmning ärden föreskrivna värmeeffekten oberoende av den uppmätta temperaturen. Däremot består sluten uppvärmning av att kontinuerligt justera den applicerade effekten på värmarna på ett sätt som hjälper till att driva den uppmätta temperaturen närmare önskad temperatur. Detta uppnås häri med hjälp av ett PI-kontrollsystem.
  3. För att testa temperaturregleringsschemat anger du önskad bördpunktstemperatur (över rumstemperatur) och aktiverar sedan återkopplingstemperaturregleringen i gui-systemet. Observera den uppmätta temperatursignalen under återkoppling (sluten ögla), som visas i gui-snittet under de närmaste minuterna. Om oljans uppmätta temperatur kraftigt överskrider önskad temperatur, reagerar för långsamt på förändringar eller misslyckas med att konvergera till önskad börvärde, måste användaren justera kontrollvinsterna för att uppnå önskad sluten slingprestanda.
    OBS: Programmet definierar en mättnadsgräns för den effekt (och därmed spänning) som levereras till de resistiva värmeelementen. Till exempel förbrukar två element som rapporteras häri upp till 5 W ström vardera. Att koppla dem parallellt innebär att den totala strömförbrukningen inte får överstiga 10 W. Användaren rekommenderas att överväga den maximala mängd ström som ska levereras till enheterna och vet att denna gräns kan påverka hastigheten med vilken det slutna loopsystemet kommer att svara på önskade temperaturförändringar. Högre effektvärmeelement möjliggör snabbare uppvärmning och högre bördpunktstemperaturer men kräver högre tillförda strömmar för uppvärmning.
  4. Med systemet justerat till acceptabel sluten slingprestanda anger du önskad oljetemperatur för DIB-formation som bördpunkt i gui.With the system tuned to acceptable closed-loop performance, enter the desired oil temperature for DIB formation as the set point in the GUI.
    OBS: Till exempel gav en börstemperatur på 60 °C goda resultat i experiment med BTLE-liposomer i vattendroppar37. Användaren hänvisas någon annanstans2,40 för protokoll som förklarar DIB-montering mellan droppar som hänger på elektroder av trådtyp och konfiguration av elektrofysiologiutrustning med hjälp av patchklämmaförstärkaren, DAQ-1 och elektrofysiologimätningsprogram. Specifikt kan protokollet av Najem, et al.40 följas noggrant fram till steg 13. Utöver det steget används ett något annorlunda tillvägagångssätt för framgångsrik monolayer- och bilayerbildning när man använder lipider som kräver uppvärmning för att främja monoskikt eller bilayerbildning.
  5. Sänk spetsarna på silver/silverklorid (Ag/AgCl) elektroder i oljan tills de nästan vidrör botten av akrylbehållaren. Denna positionering av elektrodspetsarna är avgörande för att hålla droppen på elektroden i uppvärmd olja, där konvektiva strömmar i oljan har observerats för att lossa droppar från de hydrogelbelagda elektroderna (Figur 2c).
  6. Pipett en 250 nL droppe vattenhaltig lipidlösning som innehåller 2 mg/ml BTLE, 100 mM kaliumklorid (KCl) och 10 mM 3-(N-morfino) propansulfonsyra (MOPS) på varje elektrodspets och låt dem inkubera i den uppvärmda oljan i minst 10 minuter för att främja monolayerbildning.
  7. Täck huvudscenen och den uppvärmda scenfixturen med en jordad Faraday-bur.
  8. För dropparna i försiktig kontakt genom att långsamt
    manipulera elektrodernas horisontella lägen tills användaren ser dropparna deformeras från kontakt eller börja förskjuta varandra och vänta några minuter tills bilayerbildningen börjar. Om en bilayer inte har bildats efter flera minuter kan dropparna tvångsas ihop mer för att underlätta bilayerbildningen. Bildandet av en tunnad interfacial bilayer kan bekräftas genom visuell inspektion (figur 5a) eller genom att mäta ökningen av amplituden hos en kvadratvågforms kapacitiv ström inducerad av en vågformsgenerator som matar ut en 10 mV, 10 Hz triangulärspänning 22. Låt bilayern jämvikta i minst 10 minuter för att nå ett stabilt interfacialt område, vid inledande bildandet och före efterföljande karakterisering vid den ursprungliga börvärdet.
    OBS: Typen av olja kan ha en betydande inverkan på gallring, membrantjocklek och kontaktvinkel mellan droppar. I allmänhet, ju mindre oljemolekylen desto lättare kan den förbli i den hydrofobiska kärnan i gallan som upptas av lipid asylkedjor. Oljeretention ökar både monoskikts- och bilayerspänningar och tjocklek och minskar kontaktytan och kontaktvinkeln mellan dropparna. Dessa mått innebär ett svagare vidhäftningstillstånd. Större, skrymmande molekyler utövar motsatt effekt. Till exempel är squalene en skrymmande molekyl än alkaner som hexadecane, vilket gör att den lätt kan uteslutas mellan monoskikt under gallring. Som sådan är DIB som bildas i squalene tunnare, de visar högre kontaktområden och vinklar, och de uppvisar högre fria energier av bildandet22,42 (ett mått på droppdroppar vidhäftning).

4. Karakterisering av temperaturberoende beteenden i DIB

OBS: Många fysiska processer kan studeras i DIB-baserade modellmembran, inklusive hur temperaturförändringar påverkar membranets struktur och transportegenskaper. Följande steg bör utföras efter framgångsrik bilayerbildning vid önskad temperatur.

  1. Mät membranets nominella kapacitans samtidigt som temperaturen på oljebadet sänks från en börvärde som gör det möjligt att identifiera termotropa fasövergångar för lipiderna imembranet 38.
    1. Högerklicka på temperaturdiagrammet på gui-fönstret och rensa de visade data. Detta säkerställer att tillräckligt med utrymme i bufferten är tillgängligt för efterföljande inspelningar.
    2. Använd vågformsgeneratorn som är ansluten till patchklämmans förstärkare, applicera en triangulär spänningsvågform (t.ex. 10 mV, 10 Hz) över DIB-elektroderna och registrera det inducerade strömsvaret genom gallan.
    3. Kyl bilayer genom att minska börvärdets temperatur i steg om 5 °C och vänta minst 5 minuter vid den nya steady state temperaturen mellan temperaturförändringar tills önskad temperatur uppnås. Alternativt kan du prova att passivt kyla bilayer genom att stänga av återkopplingskontrollsystemet. Var dock medveten om att experiment som implementerar passiv kylning från 50-60 °C resulterade i högre kolescenshastigheter.
    4. När oljebadet och bilayer har svalnat till önskad minimitemperatur högerklickar du på temperaturdiagrammet i GUI igen och exporterar temperaturdata kontra tid till ett kalkylbladsprogram. Stoppa den aktuella inspelningen.
    5. Från den uppmätta strömmen beräknar du den nominella kapacitansen för den kvadratiska vågströmsresponsen jämfört med tiden under kylperioden.
    6. Rita nominell kapacitans (C) jämfört med temperatur (T) för att observera hur membran kapacitansen förändrades. Hitta ickemonotoniska förändringar i C kontra T för att identifiera TM.
      OBS: Nominell kapacitans kan beräknas utifrån amplituden av kvadratvågström43 (| Jag|) använda relationen | Jag| = C dv/dt, där dv/dt är lika med fyra gånger produkten av spänningsförstärkningen (| V|) frekvens ( f )förden applicerade triangulära spänningen. Från dessa ekvationer, C = | I|/(4| V|f).
  2. På samma sätt, bedöma bilayerns kvasistatiska specifika kapacitans (Cm) vid fasta temperaturer genom att successivt öka temperaturen på oljebadet och bilayerområdet.
    1. Ändra bördpunktstemperaturen i steg om 10 °C med hjälp av gui-systemet och låt systemet balansera till den nya temperaturen.
      1. Utför steg 4.1.2 för att initiera mätning av kapacitiv ström och inspelning.
      2. Byt bilayerområdet genom att noggrant justera elektrodernas positioner med hjälp av mikromanipulatörerna (dvs. att separera elektroderna minskar bilayerområdet). Låt fyrkantsvågsströmmen nå en steady state-amplitud och samla in bilder av DIB för att möjliggöra beräkning av membranområde kontra tid genom att använda en kamera monterad på mikroskopet för att avbilda bilayern sett från mikroskopets öppning. Lägg samtidigt till en digital tagg i den aktuella inspelningsprogramvaran för att markera motsvarande tidspunkt för bildsamling.
        OBS: Mikromanipulatörer möjliggör exakt kontroll av elektroderna och därmed en skonsam kontakt mellan dropparna. Grov manipulering av dropparna kan leda till ett misslyckat experiment genom sammanslagning av dropparna eller genom att orsaka en droppe att falla av elektroden. Som diskuterats någonannanstans 22beräknas bilayer-området utifrån kontaktlängden mellan droppar, som visas som överlappande cirklar i en nedifrån och nedbild. Dropparnas positioner och dimensioner och kontaktlinjens längd kan beräknas med hjälp av en bildbehandlingsprogramvara eller med andra vetenskapliga programmeringsverktyg.
      3. Upprepa steg 4.2.1.2 minst 4 gånger för att få totalt 5 DIB-bilder och steady state-regioner med bilayerström.
    2. Upprepa steg 4.2.1 vid varje önskad temperatur.
    3. Vid de taggade tidspunkterna som motsvarar steady-state bilayer-områden för förvärvade bilder analyserar du de aktuella inspelningarna och DIB-bilderna för att extrahera C- och A-data för varje temperatur.
    4. Diagram C kontra A-data för varje temperatur och beräkna lutningen på en regression i första ordningen, som representerar bilayers Cm vid varje temperatur22.
    5. Plotvärden på Cm erhållna från steg 4.2.4 jämfört med T.
    6. Undersök Cm- och T-data för icke-monotona variationer för att identifiera smälttemperaturer, TM.
  3. Utvärdera dynamiken i spänningsberoende jonkanalbildning genom att generera en dc-spänningsstegingång över bilayer.
    1. Ställ in initial spänning på önskat stegvärde i mV (t.ex. 100 mV).
    2. Ställ in slutspänning och stegstorlek på ett värde som är högre än önskat steg (t.ex. 110 mV slutspänning och 110 mV stegstorlek).
    3. Ställ in önskad varaktighetstid för stegingången i sekunder (t.ex. 90 s).
    4. Välj önskad polaritet för steginmatningen (t.ex. positiv).
    5. Byt plåstrets spännförstärkare för att skicka kommandospänningen från GUI/spänningsutgångsmodulen till huvudsteget.
    6. Initiera aktuella inspelningar.
    7. Slå på spänningen och registrera den inducerade strömresponsen, som ska uppvisa ett S-format svar på en kritisk spänning (t.ex. ~ 70 mV för 1 μg / mL Mz i 2 mg / mL BTLE).
  4. Separat kan dynamiska strömspänningsrelationer för ett membran erhållas vid önskade temperaturer för att avslöja spänningsberoende relationer, såsom jonkanalbeteenden.
    1. Byt patchklämmaförstärkaren för att skicka kommandospänningen från vågformsgeneratorn till huvudstage och initiera ströminspelningar.
    2. På vågformsgeneratorn, mata ut en kontinuerlig sinusformad vågform med önskad amplitud, förskjutning och frekvens.
    3. Registrera det inducerade aktuella svaret över en eller flera cykler.
    4. Upprepa efter önskemål för olika sinusvågsamlituder och frekvenser och temperaturer.

Figure 3
Bild 3: Gui för temperaturreglering. Den här siffran belyser och märker de kritiska steg som krävs för att använda programmets GUI för att styra temperaturen på oljebadet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar hur aluminiumfixturen och akryloljebehållaren bereds på mikroskopstadiet för DIB-formation. Monteringsstegen 1.2-1.4 tjänar till att termiskt isolera fixturen från scenen för effektivare uppvärmning. Steg 1.5-1.7 visar hur termoelementet fästs korrekt på fixturen och placerar oljebehållaren, och steg 1.8 -1.9 visar rekommenderade platser för dispensering av olja i dessa bitar.

Figur 2 beskriver de komponenter som används för att fastställa temperaturreglering för återkoppling och utföra elektriska mätningar på en DIB: en pc, en effektförstärkare med fast förstärkning, en patchklämmaförstärkare och ett DAQ-system (eller motsvarande instrument för att applicera spänning och mäta pA-nA-nivåströmmar), en andra DAQ med lämpliga analoga ingångar och utgångar, en vågformsgenerator och den monterade aluminiumfixturen med anslutna resistiva värmare. DAQ-2 använder två moduler(figur 2b). En 4-kanalig, ±10 V, 16-bitars analog spänningsutgångsmodul används för att initiera de oberoende spänningar som levereras till strömförstärkarens ingång (blå anslutning i figur 2a) och en extern kommandoingång på patchklämmanförstärkaren (grön anslutning). Spänningsutgångsmodulen begränsas av en maximal utgångsström på 46 mA och en maximal utgångsspänning på 10 V, medan varje värmeelement som används häri förbrukar så mycket som 5 W effekt (~ 180 mA max) vid en maximal spänning på 28 V. Av denna anledning ingick strömförsörjningen/förstärkaren för att förstärka utgångsspänningen och komplettera den medföljande strömmen som behövs för att driva värmeelementen (trådbundna parallellt) som är anslutna till aluminiumfixturen. En 4-kanalig 24-bitars termoelementingång används för att digitalisera temperaturmätningar från oljebehållaren nära DIB (gul anslutning). Eftersom termoelementingångsmodulen tillåter upp till 4 termoelement kan användaren överväga att övervaka temperaturen på andra platser i fixturen. Om det görs måste de också överväga vilken signal eller kombination av signaler som används för jämförelse med önskad bördpunktstemperatur i återkopplingsslingan.

Dessa utgångar och uppmätta signaler styrs via två program: 1) det anpassade GUI för temperaturkontroll; och 2) programvara för elektrofysiologimätning. Bild 3 visar en skärmbild av det gränssnitts- och protokoll som innehåller anteckningar till motsvarande steg i protokollet. Gui används för att definiera nyckelparametrar (ställpunktstemperatur, PI-styrvinster, spänningsgränser), jämföra den uppmätta temperaturen med börvärdestemperaturen och beräkna styrsignalen som levereras till förstärkaren och sedan värmeelementen och registrera data om temperaturen och anbringad spänning kontra tid. Detta program inkluderar också förmågan att styra spänningen som appliceras på DIB-elektroder (figur 2c) via patchklämmanförstärkaren. Separat används mätprogramvara för att konfigurera mätningar av både spänningen som appliceras på DIB-elektroderna och den inducerade strömmen genom lipidbilayer. En spänning som står i proportion till DIB-strömmen matas ut av patchklämman och skickas via BNC-kabel till DAQ-1 (anslutning visas inte).

Figur 4 ritar temperaturförändringen och den absoluta elkraft som skickas till värmarna jämfört med tiden under både öppna och slutna uppvärmningsscenarier. För den förstnämnda applicerades en godtycklig ingångsspänning motsvarande ~5,2 W effekt på värmarna, vilket resulterade i en exponentiell temperaturökning med en tidskonstant på ~ 125 s och ett stabilt tillstånd ΔT ≈ 4,5 °C / W efter en första fördröjning på ~ 20 s. Dessa egenskaper hos open-loop-systemet användes för att konstruera en modell av det slutna loopsystemet i en simuleringsprogramvara (se figur S4 för detaljer) som kan användas för att bestämma värden för de proportionella och integrerade kontrollvinsterna. De slutna och simulerade modellsvaren i figur 4 representerar således de uppmätta och simulerade svaren från den inställda PI-styrenheten, med KP- och KI-värdena 0,598 respektive 0,00445, till en börvärdestemperatur 20 °C högre än RT. Jämfört med öppet slinga-fodralet bekräftar både simuleringen och mätningarna den ökade svarshastigheten i det slutna loopsystemet (tidskonstant ~ 63 s). Minskningen av uppvärmningstiden sker på bekostnad av högre initialt tillämpad effekt. Ändå förblev den önskade börvärdestemperaturen och den uppmätta oljetemperaturen inom 0,6 °C i stabilt tillstånd, vilket ansågs lämpligt för användning. Den totala tillförda kraften är begränsad inom programmet under sluten slinga för att inte överskugga den totala effektgränsen på 10 W för de två värmarna.

Temperaturkontrollsystemet användes för att visa upp temperaturberoendet av lösningsmedel i en DIB som bildats av BTLE-lipider och dess inverkan på membranacitansen (figur 5). BTLE lipider valdes för denna mätning eftersom uppvärmning krävs för DIB-bildning på grund av en lipidfasövergång som sker mellan 35-42 °C38. Protokollet som beskrivs häri utfördes för att initiera bilayer bildandet vid 60 °C. Efter membranbildning och jämvikt kan temperaturen successivt sänkas eller höjas efter behov för att karakterisera membranets svar. Figur 5a visar till exempel representativa mätningar av obehandlad kapacitiv ström (kvadratformad vågform) och temperatur kontra tid under en uppvärmningscykel från RT till ~60 °C. Observera att amplituden hos den kapacitiva strömvågformen minskar med mer än hälften när temperaturen stiger, vilket orsakas av att olja används i membranets hydrofobiska kärna. Denna förändring förtjockar gränssnittet och ändrar den laterala spänningen i bilayer22,37,38.

Uppgifterna i figur 5b dokumenterar förändringar i C (normaliserade med kapacitans vid 27 °C) jämfört med T under en fullständig kylvärmecykel efter den första bilayerbildningen vid 60 °C. Precis som i figur 5a, när temperaturen stiger, sjunker kapacitansen. Men vad denna presentation visar tydligare är de ickemonotoniska förändringar som uppstår vid temperaturer mellan ~ 30-42 ° C, vilket representerar den kollektiva smälttemperaturen, TM, under vilken lipidblandningen övergår mellan en vätskebeställd och en vätskesjukdom termotropisk fas. Temperaturen där den ickemonotoniska förändringen i kapacitans inträffar motsvarar en förändring i bilayertjockleken från uteslutandet av olja frånmembranet 38. Observera också att hysteresen som visas mellan uppvärmningscykeln och kylcykeln beror på irreversibla förändringar i bilayerområdet som uppstår mellan efterföljande cykler, som vanligtvis utfördes 10 minuters mellanrum.

På samma sätt visar figur 6ab hur kvasistatiska mätningar av C mvid olika temperaturer kan användas för att identifiera TM. Här varierar membranets område successivt genom att manuellt öka avståndet mellan droppelektroderna. Under detta experiment skjuts dropparna först ihop för att främja maximalt membranområde före efterföljande minskningar i kontaktområdet med stegvisa separationer mellan elektroderna. Vid varje kontaktnivå bedöms bilayerns nominella kapacitans utifrån den inducerade strömmen och dess yta bestäms genom bildanalys. Plottning C mot A möjliggör en linjär regression, där lutningen representerar värdet Cm enligt figur 6a. Att upprepa denna procedur över fleratemperaturer (figur 6b) visar att Cm minskar med nästan 50% vid temperaturer över TM,vilket bekräftar en ökning av membranets hydrofoba tjocklek på grund av uppvärmningsinducerat hexadecane-upptag (se figur S5 för fullständiga C- kontra A-data). Vid högre temperaturer minskar det extra lösningsmedlet i membranet också det maximala kontaktområdet mellan dropparna och därmed maximal nominell kapacitans. Att sänka temperaturen vänder dessa effekter. DIB-bilden i figur 6c visar att när temperaturen (25 °C) är långt under TMkan membranet stabilt anta ett mycket självhäftande tillstånd - även under spänningen hos sträckta droppar orsakade av väl åtskilda elektroder. Detta är resultatet av fullständig uteslutning av hexadecane från bilayer, vilket ökar vidhäftningsenergin hos dropparna. I detta tillstånd kan bilayerområdet inte ändras på ett tillförlitligt sätt genom manipulering av elektroderna och hindrar förmågan att noggrant mäta specifik kapacitans (se figur S5 för mer information).

Slutligen visar de representativa uppgifterna i figur 7 hur temperaturförändringar kan påverka beteendet hos porbildande arter som skapar jon som leder kanaler genom en DIB. Monazomycin (Mz), ett positivt laddat antibiotikum som bildar katjonselektiva kanaler genom gallan vid tillräckliga transmembranpotentialer37,44, valdes för att visa detta förhållande. Dessa mätningar utfördes på en BTLE-baserad (2 mg/ml slutlig koncentration i båda dropparna) DIB dopad med Mz (1 μg/ml slutlig koncentration i båda dropparna). De ström- och spänningsspår som visas i figur 7a erhölls genom applicering av sinusformade membranspänningar och mätning av den inducerade strömmen vid två olika temperaturer. Pilarna och efterföljande tal i figur 7a hjälper till att visualisera de på varandra följande kvartalen av sinusformad spänning med avseende på tid. Denna typ av mätning utförs ofta för att undersöka spänningen beroende av ström genom jonkanaler. Uppgifterna här visar att en ökning av dib-temperaturen från 27 °C till 45 °C gör att tröskeln för kanalbildning stiger från ~|100 mV| till ~|110 mV|. Denna förändring, som sannolikt drivs av den högre membrantjockleken på grund av absorberad olja, visar att energibarriären för införing har stigit. Hysteresen i dessa kurvor - som betecknar minnesbeständighet - kan orsakas av spänningsinducerade förändringar i antingen bilayerområdet eller kinetiken för Mz kanalbildning och inaktivering44.

För att hjälpa till att separera dessa faktorer i DIB kan tillfälliga förändringar i jonström mätas som svar på en DC-stegspänning. Figur 7b visar den uppmätta strömtätheten för samma Mz-dopade BTLE-membran vid samma spänningsnivå (+90 mV) och två olika temperaturer (27 °C och 45 °C). Uppgifterna visar tydligt att kinetiken i kanalsvaren är helt annorlunda. I synnerhet vid 27 °C uppvisar membranet en snabbare, större ökning av strömmen som sedan följs av ett övergående förfall (det senare är ett resultat av att Mz-kanaler flyttar över bilayer till ett inaktivt tillstånd44). Svaret är mycket mer dämpat vid 45 °C, där den S-formadeökningen av strömmen inte fortsätter med en efterföljande droppe. Skillnader som dessa är användbara för att bedöma kinetiken i kanalsvar och förstå hur dessa kan bidra till membranets totala dynamiska motstånd.

Figure 4
Bild 4:Öppen slinga jämfört med sluten slinguppvärmning. Panela jämförtidsvaren för det uppmätta och simulerade (Se SI) slutna slingsystemet med ett temperatursteg på +20 °C med den öppna värmeresponsen under fast anbringad effekt. Panel( b) visar den effekt som avleds av varje system. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5:Mätning av kapacitans och varierande temperatur. Det typiska kvadratiska vågformsströmsvaret på en 10 mV, 10 Hz triangulär vågformsinmatning på ett BTLE lipidmembran som genomgår en fasövergång visas i (a). Lipids fasövergång kan också ses i områdets mätdata som visas ovanför panelen (a). Kapacitans som normaliserats med initial kapacitans vid 27 °C visas i panelbsom ritas upp som en temperaturfunktion för en uppvärmnings- och kylcykel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6:Särskilda kapacitansmätningar Panel avisar nominell kapacitans jämfört med bilayerareal som erhållits vid på varandra följande kontaktytor för två olika temperaturer. Linjära regressioner till varje uppsättning används för att bestämma deras respektive värden för CM. Panel b) ritar CM mot T, medanpanel cvisar den stabila kapacitiva strömvågformen (vänster) och kontaktytan (höger) under försök till droppseparation vid 25 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7:Spänningsberoende membranresistens och jonkanalskinetik kontra temperatur. Panel avisarhur   strömspänningsförhållandet förändras med temperaturen för BTLE DIB som bildas mellan droppar som innehåller 1 μg/ml Mz. Pilarna och talen representerar de successiva delarna av den applicerade sinusvågen. Skillnaderna i dessa spår illustrerar hur temperaturen flyttar spänningströskeln för Mz-insättning, vilket identifieras som spänningens storlek där inducerad ström ökar kraftigt. På samma sätt visarpanel bden slagtemperatur som orsakas av en dc-stegspänning på 90 mV. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur S1: Aluminiumfixtur. Denna ritning visar de nödvändiga dimensionerna och funktionerna för tillverkning av aluminiumfixturen som är basen på det uppvärmda stadiet. De 25,2 mm X 26 mm platta fläckarna intill oljebrunnen utformades för att möjliggöra en maximal mängd ytkontakt mellan fixturen och värmeelementen för värmeledning. På samma sätt valdes aluminium för basfixturmaterialet på grund av dess höga värmeledningsförmåga. Skruvhålet M3 X 0,5 mm som kallas ut i trycket används för att säkra och placera termoelementet i oljebrunnen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Figur S2: Akrylsubstrat. Akrylsubstratet är relativt enkelt att tillverka, utan kritiska enastående funktioner, förutom profilen. Ytterprofilen designades med Poka-ok i åtanke så att akrylsubstratet endast kan orienteras i fixturen på ett sådant sätt att det ger gott om utrymme för termoelementet att passa i oljebrunnen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Figur S3: Uppvärmd scenmontering. En sprängskiss över det monterade uppvärmda stadiet har tillhandahållits för att hjälpa experimenteraren under den första installationen. Notera också det område som markeras av den streckade cirkeln, eftersom detta är den idealiska positionen för att fylla aluminiumfixturen med olja under protokollsteg 1.8. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Bild S4: Öppna loopdata och modellpanelen Simulink. a) visar de öppna temperatursvaren på olika dc-effektnivåer som användes för att bedöma systemets fördröjningstid, td, tidskonstanten, τoch open-loop uppvärmningsvinsten, α,i systemet. Fördröjningstiden representerar tidsfördröjningen innan temperaturen börjar stiga (~20 s). Varje värde av τ (markerat med *, ~125 s) definieras som den tid som krävs för att 63,2% av den totala temperaturökningen ska inträffa. Panel b visar den stadiga temperaturförändringen (∆T)jämfört med den applicerade kraften. Lutningen på de data som ritades i b användes för att beräkna α, vilket representerar förhållandet mellan temperaturförändring och tillförd effekt. Dessa parametrar användes i modellen som visas i panel (c) och tillhandahölls som en kompletterande fil för att justera PI-styrenheten för att uppnå ett önskat slutet temperaturkontrollsvar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Figur S5: Ytterligare specifika kapacitansdata. De tomter som visas i figur 6a,b sammanställdes från denna CM-datauppsättning. Detta område visar också på oförmågan att exakt mäta kapacitans vid temperaturer på 25 °C och lägre, därför uteslöts denna mätning från datamängden. De områdesförändringar som krävs för en noggrann Cm-mätning kräver överdriven kraft för att appliceras på dropparna från mikromanipulatorerna, vilket orsakar severförvrängning av droppformen och kontaktområdet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfiler. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som beskrivs häri innehåller instruktioner för montering och drift av ett experimentellt system för att kontrollera temperaturen på den olja och droppar som används för att bilda DIB. Det är särskilt fördelaktigt för att möjliggöra DIB-bildning med lipider som har smälttemperaturer över RT. Dessutom, genom att exakt variera temperaturen på oljebehållaren, kan bilayer temperaturen manipuleras för att studera effekterna av förhöjda temperaturer på olika membran egenskaper och egenskaper, inklusive kapacitans, område, tjocklek, inducerad termotropa fas förändringar, kinetik av membran-aktiva arter och energier av vidhäftning av bilayergränssnitt 37,38.

Protokollet består av tre delar före användning i en DIB-studie: 1) förberedelse och montering av den uppvärmda scenfixturen; 2) sammankoppling av de olika instrumenten, och 3) bekräfta lämplig temperaturkontrollprestanda med valda proportionella och integrerade kontrollvinster. Viktigast i del 2 måste användaren se till att undvika delade ledningsvägar mellan uteffektförstärkarens (>mA-strömmar) och patchklämmahuvudet (pA-nA-strömmar). En oavsiktlig kortslutning kan orsaka permanenta skador på huvudbilden. Dessutom bidrar säkerställandet av att datorn och alla instrument är anslutna till en gemensam växelströmskraft, och användningen av en jordad Faraday-bur nära huvudentappen och droppelektroderna till att minimera bullret i bilayerströmsmätningar. När installationen i del 2 är klar måste användaren först bedöma oljebehållarens öppna värmerespons genom att applicera en fast spänning på värmeelementen och registrera den efterföljande temperaturökningen (som visas i figur 4a). Denna typ av exponentiellt svar kan användas för att definiera och simulera en enkel modell av det slutna loopsystemet för olika värden för kontrollvinster (se figur S4 för mer information). De kontrollvinster som rapporteras häri gör det möjligt för systemet att värma till önskad temperaturnivå snabbt (~ 2 minuter) och med lite överskridande och upprätthålla börvärde exakt. Men de specifika vinster som krävs beror på värmeelementens effektnivå samt armaturens geometri som stöder oljebehållaren. När lämpliga värden för kontrollvinster har fastställts och återkopplingskontrollsystemet fungerar som önskat kan användaren sedan börja montera och karakterisera en DIB.

Protokollet ändrar inte processen för DIB-bildning eller karakterisering, men det finns begränsningar och överväganden. Att höja oljans temperatur kan påverka hur droppar hänger på elektroderna, på grund av minskningar av monoskiktspänning och oljetäthet som ökar droppslappning och konvektiva strömmar i oljan som kan flytta dropparna. Därför föreslår protokollet att elektrodernas spetsar sänks till nära substratets bottenyta så att droppar stöds och hålls stilla av akrylbehållaren. Användaren bör bedöma hur mycket substratet kan förvränga dropparna (om de sänks för långt) och överväga denna förvrängning vid beräkning av gallans område från bilder av DIB som diskuterats på annat håll22.

Medan det beskrivna systemet är begränsat till uppvärmning av oljebadet, kan en Peltier-kylanordning användas i stället för de resistiva värmeelementen om testning vid temperaturer under RT behövs. I det här fallet måste användaren dock överväga fryspunkten för oljefasen. Många alkaner fryser på temperaturer högre än 0 °C; hexadecane beskrivs häri fryser vid 18 °C. Om oljan fryser kommer droppar inte längre att vara flyttbara och en bilayer mellan dropparna kan bli instabil eller brista.

För en tidigare oprövad lipidkomposition är viktiga okända ämnen den inkubationstid och temperatur som krävs för att möjliggöra tillräcklig monoskiktsmontering vid droppens ytor. Den allmänna regeln är att värma oljan till en temperatur över TM, där lipidrörlighet förbättras vilket möjliggör snabbare lateral diffusion och hårdare förpackning vid oljevattengränssnittet45, och vänta tillräckligt länge så att monolayerförpackningen vid oljevattengränssnittet är hög. Användaren kan granska publicerad litteratur eller överväga sina egna kompletterande mätningar för att bestämma lämpliga tids- och temperaturvärden: interfacial spänningsmätningar på en hänge droppe goniometer kan användas för att bedöma den tid som krävs för monolayerenhet 46 och differentialskanning calorimetry används ofta för att identifiera termotropa övergångar av lipider38. Eller ett iterativt tillvägagångssätt kan eftersträvas för att identifiera lämplig tid och temperatur där bilayerbildningen är konsekvent, membranet är stabilt i mer än några minuter och bilayerens motstånd är >1 GΩ. I nyligen genomförda studier med E. coli totala lipid extrakt (ETLE)37 och BTLE38,47 en starttemperatur >50 °C leder konsekvent till stabil bilayer bildas. På samma sätt kan den lägsta stabila temperaturen efter DIB för en viss lipidtyp också variera mellan lipidval. Till exempel kan ETLE DIB kylas till 25 °C37, medan DPPC DIB med en komponent alltid sammansvälts under TM~40 °C38. Observation har visat att BTLE DIBS visar att 27 °C är en säker minimitemperatur för att upprätthålla en stabil bilayer.

Våra representativa resultat visar att temperaturförändringar kan påverka egenskaperna hos den resulterande DIB. Uppgifterna i figur 5 visar att membranets nominella kapacitans minskar när temperaturen stiger. Eftersom kapacitans, C, är direkt proportionell mot Bilayer-området, Aoch omvänt proportionell mot tjocklek, d, som anges av

Equation 1, (1)

en minskning av C kan manifesteras genom en minskning av A,en ökning av d, eller båda (förutsatt att en fast dielektrisk tillståndsivitet, ε). Dessa relationer motiverar användningen av kapacitansmätningar och DIB-bilder för att bedöma förändringar i C, Aoch C mjämfört med temperatur för att avgöra vilka effekter som är signifikanta. Uppgifterna i figur 5 och figur 6 för BTLE DIBs visar att både C och Cm (som representerar förhållandet ε/d)minskar med nästan 50 % när temperaturen stiger från 30 C till 60 C. Tillsammans tyder dessa på att högre temperatur förtjockar bilayern på grund av en ökad löslighet hos lipidernas acylkedjor i hexadekan48. Den extra oljan i membranet kan också påverka bilayerens interfacial spänning och kontaktvinkeln mellan dropparna22,38. Dessa effekter kan kvantifieras genom att analysera bilder av en DIB med användarspecificerade tidsintervaller för att övervaka bilayerområdet och kontaktvinkeln under uppvärmning och kylning.

Temperaturens favör hos olja i membranet kan också användas för att bedöma termotropa smälttemperaturer hos lipiderna och påverka jonkanalkinetiken. Smälttemperaturen för en lipidblandning kan definieras genom att lokalisera ickemonotoniska förändringar i C- och T-relationer som i figur 6. De aktuella mätningarna i figur 7 visar vidare att temperaturinducerade förändringar i fas (dvs. fluiditet) och tjocklek kan påverka tröskelspänningen för införing av jonoforer som Mz. Dessa fysiska associationer är viktiga för att förstå jonkanalbeteenden i modellmembran, särskilt i scenarier som syftar till att replikera kroppstemperaturmiljöer. Men de kan också vara användbara för att justera bilajéns ledningsförmåga i applikationer som neuromorfadatorenheter 47 Till exempel är ökad kanalkinetik en önskvärd funktion när man tillverkar enheter som uppvisar minnesbeständighet som behöver efterlikna hjärnans hastighet, funktionalitet och kortsiktiga plasticitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Ekonomiskt stöd gavs av National Science Foundation Grant CBET-1752197 och Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Bioengineering Nummer 170 teknik bioengineering lipid bilayer droppgränssnitt bilayer feedback temperaturkontroll kapacitansmätningar jonkanal biovetenskap
Temperaturkontrollerad montering och karakterisering av ett droppgränssnitt Bilayer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter