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Biology

Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular

doi: 10.3791/62369 Published: May 22, 2021
* These authors contributed equally

Summary

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos experimentais de um ensaio de difusão celular que é baseado em microscopia de células vivas. Fornecemos uma ferramenta computacional de código aberto para a segmentação imparcial de células fluorescentes rotuladas e análise quantitativa da dinâmica da lamellipodia durante a disseminação celular.

Abstract

A disseminação celular é um processo dinâmico no qual uma célula suspensa em mídia se conecta a um substrato e se achata de uma forma arredondada para uma forma fina e espalhada. Seguindo o acessório de substrato celular, a célula forma uma fina folha de lamellipodia emanando do corpo celular. Na lamellipodia, os monômeros globulares (G-actin) polimerizam-se em uma densa malha de ato desordenada (F-actin) que empurra contra a membrana plasmática, fornecendo assim as forças mecânicas necessárias para que a célula se espalhe. Notavelmente, os atores moleculares que controlam a polimerização de actina na lamellipodia são essenciais para muitos outros processos celulares, como migração celular e endocitose.

Uma vez que a disseminação de células forma lamellipodia contínua que abrange toda a periferia celular e se expande persistentemente para fora, ensaios de disseminação celular tornaram-se uma ferramenta eficiente para avaliar a cinética das protrusões lamellipodial. Embora várias implementações técnicas do ensaio de disseminação de células tenham sido desenvolvidas, uma descrição detalhada do fluxo de trabalho, que incluiria um protocolo passo a passo e ferramentas computacionais para análise de dados, está atualmente em falta. Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais do ensaio de disseminação celular e apresentamos uma ferramenta de código aberto para análise quantitativa e imparcial da dinâmica da borda celular durante a disseminação. Quando combinado com manipulações farmacológicas e/ou técnicas de silenciamento de genes, este protocolo é favorável a uma tela em larga escala de jogadores moleculares que regulam saliências lamellipodiais.

Introduction

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As saliências lamellipodias são estruturas citoesqueléticos proeminentes formadas na frente de uma célula migratória. Em lamellipodia, a polimerização do actin com o auxílio do complexo Arp2/3 e formins cria um trabalho de malha de actina ramificada de rápido crescimento que empurra contra a membrana plasmática1,2. A força de empurrão gerada pelo trabalho de malha de actina impulsiona fisicamente a célula para a frente1,3,4,5. Esgotamento do complexo Arp2/3 ou interrupção de vias de sinalização essenciais para saliências lamellipodias muitas vezes prejudicam a migração celular6, 7. Embora a migração de células deficientes de lamellipodia também tenha sido relatada8,9, a importância da lamellipodia na migração celular é evidente como o esgotamento dessa estrutura protrusiva perturba a capacidade da célula de se mover através de microambientes biológicos complexos6,10.

Um grande empecilho para entender a regulação da lamellipodia em células migratórias é a variabilidade natural na cinética de protrusão lamellipodial, tamanho e forma11,12,13,14. Além disso, estudos recentes demonstraram que a lamellipodia apresenta comportamentos salitivos complexos, incluindo saliências flutuantes, periódicas e aceleradas14,15. Em comparação com a lamellipodia altamente variável das células migratórias6,16, a lamellipodia formada durante a disseminação celular são mais uniformes12. Uma vez que a atividade strusiva de células disseminadas e migratórias é impulsionada por conjuntos macromoleculares idênticos, que incluem uma rede de actina ramificada, feixes de actomyosina contracttil e aderências de matriz celular baseada em integrin17,18, células disseminadas têm sido amplamente utilizadas como modelo para investigar a regulação da dinâmica da lamellipodia.

A disseminação celular é um processo mecanoquímico dinâmico onde uma célula em suspensão primeiro adere a um substrato através de aderências baseadas em integrin17,19,20 e, emseguida,se espalha estendendo as saliências baseadas em actina21,22,23. Durante a fase de disseminação, a lamellipodia emanando do corpo celular protuberante e persistentemente com pouca ou nenhuma retração ou paralisação12. Os protocolos de disseminação de células mais usados são os ensaios de pontos finais, onde as células de disseminação são fixadas em vários momentos após o revestimento19,24. Estes ensaios, embora rápidos e simples, são limitados em seu poder de diagnóstico para detectar alterações nas características dinâmicas da lamellipodia. Para determinar os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica da lamellipodia, o grupo Sheetz foi pioneiro no uso da análise quantitativa de células vivas e descobriu muitas propriedades fundamentais das saliências de borda celular11,12,22. Esses estudos demonstraram que o ensaio de disseminação de células vivas é uma técnica robusta e poderosa na caixa de ferramentas de um laboratório de biologia celular. Apesar disso, um protocolo detalhado e uma ferramenta computacional de código aberto para um ensaio de espalhamento de células vivas estão atualmente indisponíveis para a comunidade de biologia celular. Para isso, nosso protocolo descreve os procedimentos de imagens ao vivo espalhando células e fornece uma ferramenta automatizada de análise de imagens. Para validar este método, utilizamos a inibição de Arp2/3 como tratamento experimental e mostramos que inibir a função do complexo Arp2/3 não dedundo a propagação celular, mas causou uma redução significativa na velocidade de saliência celular, bem como a estabilidade das saliências da borda celular, dando origem a bordas celulares irregulares. Esses dados demonstram que a combinação de imagens de células vivas e análise automatizada de imagens é uma ferramenta útil para analisar a dinâmica das bordas celulares e identificar componentes moleculares que regulam a lamellipodia.

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Protocol

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1. Semeadura celular

NOTA: O protocolo de disseminação de células descrito foi realizado utilizando fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) expressando PH-Akt-GFP (um marcador fluorescente para PIP3/PI(3,4)P2). Esta linha celular foi gerada pela integração genomicamente de uma construção de expressão para PH-Akt-GFP (Addgene #21218) pela edição de genes mediada pelo CRISPR. No entanto, outros marcadores fluorescentes que são expressos transitoriamente ou integrados no genoma também podem ser usados neste ensaio. Para a segmentação de imagem ideal, recomendamos o uso de marcadores fluorescentes que são distribuídos uniformemente no citoplasma, por exemplo, GFP citosolic.

  1. Cultura um prato de 10 cm de células para 90% de confluência.
  2. Uma vez que as células tenham atingido a confluência adequada, coloque uma tampa de 22 mm x 22 mm (#1,5; 0,17 mm de espessura) em um prato de cultura celular de 35 mm. Cubra com 400 μL de fibronectina que foi diluída em PBS para uma concentração final de 2,5 μg/mL.
    NOTA: O número de tampas necessárias para o ensaio é determinado pelo número de condições experimentais e réplica técnica.
  3. Coloque o prato de 35 mm com a tampa revestida de fibronectina em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 1 hora.
  4. Retire o prato com a tampa da incubadora. Aspire a fibronectina e lave a tampa com PBS, encanar suavemente ao redor da tampa de duas a três vezes.
  5. Aspire a mídia de cultura celular a partir do prato de 10 cm de células e lave o prato com PBS.
  6. Adicione 650 μL de 0,05% de trypsin-EDTA ao prato 90% confluente de células, inclinando o prato para distribuir uniformemente a enzima. Coloque o prato com o trypsin na incubadora por 1 minuto.
  7. Remova o prato com as células da incubadora. Adicione 10 mL de mídia de cultura celular em um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione rapidamente mais 10 mL de mídia no prato para saciar o trypsin.
  8. Pipeta 1 mL das células experimentpsinizadas no tubo centrífuga de 15 mL, a fim de diluir as células. Pipeta o conteúdo do tubo para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células dentro da mídia. Para tipos de células com alta propensão à agregação, a filtragem de células através de um coador de células (tamanho de malha de 100 μm) é recomendada para minimizar a ocorrência de aglomerados celulares.
  9. Do tubo, pipeta 500 - 1000 μL de células diluídas no prato de 35 mm contendo o deslizamento de tampa.
  10. Agite suavemente o prato para espalhar uniformemente as células. Certifique-se de que o deslizamento de tampa esteja em uma confluência de ~10% (~50.000 células/mL) e ajuste o volume de células diluídas conforme necessário.
    NOTA: O objetivo de ter células em uma confluência tão baixa é garantir que haja 1-2 células polarizadas em cada campo de visão que serão usadas para focar o objetivo durante toda a aquisição de difusão celular.
  11. Passagem 1/5 das células restantes no prato de 10 cm em um prato de 6 cm por condição de tratamento. Coloque os pratos perequiclados e o prato de 35 mm com a tampa na incubadora durante a noite.
    NOTA: Estas serão as células que serão analisadas para difundir dinâmicas.

2. Incubação de Medicamentos e Recuperação celular

  1. Adicione 5 mL de mídia de cultura celular em cada um dos dois tubos de centrífugas de 15 mL, e 20 mL de DMEM livre de fenol vermelho em cada um dos dois tubos de centrífuga de 50 mL.
    NOTA: O número de pares de tubos (15 mL + 50 mL) deve corresponder ao número de condições experimentais.
  2. Para testar a importância do Arp2/3 para a disseminação celular, pipeta seja o inibidor farmacológico de Arp2/3, CK-666, ou o tratamento de controle, como o DMSO, em cada par de tubos de centrífuga até a concentração desejada.
  3. Retire os pratos de 6 cm (ver Passo 1.11) da incubadora e aspire a mídia. Lave os pratos com PBS quente.
  4. Adicione o conteúdo dos tubos de centrífugas de CK-666 ou DMSO em cada um dos pratos com passagem. Rotule cada prato com o tratamento correto da droga e coloque os pratos na incubadora por uma hora.
  5. Retire os pratos da incubadora e aspire a mídia. Lave os pratos com PBS quente, a fim de remover completamente toda a mídia vermelha fenol restante.
  6. Adicione 230 μL de 0,05% de trypsin-EDTA a cada prato de 6 cm e incubar células por 1 minuto.
    NOTA: Se aplicável, a trippsina pode ser substituída por um bloqueador de adesão celular não proteolítica.
  7. Retire os pratos da incubadora. Para cada tratamento, adicione 5 mL de DMEM livre de fenol suplementado com drogas em um tubo de centrífuga de 15 mL designado como "Tubo B". Adicione mais 5 mL da mesma mídia no prato relevante para saciar o trypsin. Transfira o conteúdo do prato para um tubo de centrífuga de 15 mL designado como "Tubo A".
  8. Transfira 1 mL de células do tubo A para o tubo B. Repita para cada tratamento.
  9. Coloque os tubos A e B na incubadora por 45 minutos para permitir que as células se recuperem da experimentação. Solte ligeiramente a tampa dos tubos de centrífuga antes de colocá-los na incubadora para permitir a penetração de CO2.
    NOTA: A duração do tempo de recuperação pode variar para diferentes tipos de células. Embora em nossos experimentos a recuperação de 45 minutos tenha tido um efeito insignificante na viabilidade celular, alguns tipos de células podem sofrer anoikis quando mantidos em suspensão por muito tempo. Por isso, recomendamos determinar o tempo ideal de recuperação empiricamente. O tempo ideal de recuperação permite que células rápidas e síncrogas se espalhem sem células mortas ou apoptóticas na amostra.

3. Preparação da Câmara Magnética

  1. Certifique-se de que todas as partes de uma Câmara Magnética celular de 1 poço que possa acomodar uma cobertura quadrada de 22 mm x 22 mm foram limpas antes do uso.
  2. Retire o prato de 35 mm com o deslizamento (ver Passo 1.11) da incubadora. Aspire a mídia de cultura celular e lave o deslizamento com PBS quente.
  3. Remova a mancha de cobertura da placa de 35 mm usando um par de fórceps e coloque suavemente a mancha na placa inferior da câmara magnética.
  4. Coloque a junta de silicone em cima da tampa.
    NOTA: Uma junta de silicone mal colocada é a causa mais comum de uma câmara magnética com vazamento. Certifique-se de que a junta repousa no travessão da placa inferior e não suba além do travessão.
  5. Coloque o corpo principal na placa inferior.
    NOTA: Faça esta parte muito lentamente. Uma boa dica é segurar a placa inferior com uma mão enquanto coloca o corpo principal em cima. Isso garante que os ímãs do corpo principal não levantem a placa inferior para cima, o que poderia potencialmente deslocar e quebrar a tampa.
  6. Adicione 1 mL de DMEM livre de fenol suplementado a medicamentos à câmara magnética. Pegue um tecido sem fiapos e desça cuidadosamente o invólucro entre o corpo principal e a placa inferior, a fim de verificar se há vazamentos.
    NOTA: Se houver vazamento, aspire rapidamente a mídia e prossiga novamente a partir da etapa 3.4.
  7. Abaixe a tampa transparente sobre o corpo principal para fechar a câmara magnética.
  8. Pulverize um tecido de laboratório primeiro com água e limpe o fundo da câmara magnética (o deslizamento de cobertura, não a parte metálica). Em seguida, pulverize um segundo tecido de laboratório com uma pequena quantidade de 70% de etanol e limpe, tomando cuidado para não quebrar a tampa.

4. Aquisição de Imagens

  1. Pré-aqueça a incubadora superior do estágio e o aquecedor objetivo para 37 °C e coloque o nível de CO2 na incubadora superior do estágio para 5%.
    NOTA: Se a incubadora superior do estágio não estiver conectada a uma fonte de CO2, a mídia de cultura celular deve ser complementada com HEPES de 25 mM para manter o pH constante 7.4.
  2. Aplique uma quantidade suficiente de óleo de imersão ao objetivo de óleo pré-aquecido 60X, 1.4 N.A.
    NOTA: Usamos um objetivo de imersão de óleo de 60X, 1.4 N.A. neste protocolo devido ao seu campo de visão razoavelmente grande e excelente eficiência de coleta de luz. Se for necessário um campo de visão maior, um objetivo de ampliação mais baixo (por exemplo,20x) pode ser usado desde que a relação sinal-ruído das imagens seja superior a 2,5.
  3. Leve tanto a câmara magnética completa quanto o tubo B (Passo 2.9) para o microscópio confocal. Coloque a câmara magnética na incubadora superior do palco.
    NOTA: Coloque a câmara magnética suavemente no palco para evitar a criação de bolhas no óleo de imersão.
  4. Defina o foco para as células fluorescentes usando o canal GFP. Certifique-se de que a borda da célula está afiada e bem definida.
  5. Remova a tampa transparente da câmara magnética e a pipeta de 500 μL do tubo B para a câmara magnética. Coloque a tampa transparente de volta em cima da câmara magnética.
  6. Para identificar células ideais para análise de difusão celular, procure por "halos" de células que ainda não se anexaram ao deslizamento de tampas, mas não estão mais rolando. As células que estão nos estágios iniciais do anexo coverlip também são grandes candidatos, mas a aquisição de imagens deve ser rápida para capturar a propagação.
  7. Configure a aquisição de imagem de lapso de tempo para o canal verde para incluir quatro campos de exibição, visualizados em intervalos de 6 segundos.
    NOTA: Devido à alta variabilidade da velocidade de saliência lamellipodia entre diferentes tipos de células, a taxa de quadros ideal deve ser determinada empiricamente. O intervalo de imagem de 6 segundos usado em nossos experimentos é um bom ponto de partida para a análise de muitas células mesenquimais e epiteliais. No entanto, as células que se espalham muito rapidamente (por exemplo,células imunes) podem exigir uma taxa de quadros muito maior (menor intervalo de imagem). A taxa de quadros ideal para filmes de espalhamento de células garante um deslocamento de 2-5 pixels da borda da célula saliente entre os quadros subsequentes. Considerando a precisão do encaixe da curva usado para identificar o platô de propagação celular, a taxa de quadro ideal também deve garantir 50-100 medições do deslocamento da borda celular durante a fase de expansão rápida da expansão celular. O número de campos de visão deve ser ajustado dependendo do tempo de exposição, da distância entre os pontos de aquisição e da velocidade de movimento do estágio. Os usuários são aconselhados a determinar o número máximo de campos de visão que podem ser adquiridos com a taxa de quadros desejada.
  8. Depois de identificar um campo de visão adequado, salve as coordenadas X e Y do estágio do microscópio. Proceda com a identificação de outros três campos de visão que estão relativamente próximos um do outro no deslizamento de cobertura. Guarde as coordenadas do estágio do microscópio para cada campo de visão desejado.
    NOTA: Recomenda-se otimizar fortemente o caminho de movimento do palco entre os campos de visão, a fim de minimizar qualquer movimento amostral desnecessário. Essa otimização pode ser realizada manualmente ou automaticamente. O movimento excessivo da amostra retarda a aquisição e pode fazer com que as células se distribuam fora de vista à medida que estão descendo.
  9. Adquira imagens por 15 minutos a uma taxa de quadro de 6 segundos e salve os arquivos. Se for necessário mais aquisições, repita a partir da Etapa 4.6.

5. Análise da área celular, circularidade e dinâmica de saliência durante a disseminação celular

  1. Prepare imagens para processamento e análise de dados
    NOTA: O software requer uma imagem em formato .tiff e um tamanho de pixel como parâmetros de entrada. Ambos os requisitos podem ser cumpridos usando o software de aquisição ou Fiji (neste protocolo). Se esses requisitos forem cumpridos, proceda à etapa 5.2.
    1. Instale a versão mais recente do aplicativo Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Abra uma imagem de lapso de tempo usando Fiji.
    3. Copie o tamanho do pixel da imagem selecionando Propriedades > de imagem. Copie e cole o tamanho do pixel em μm para Bloco de Notas/Word.
    4. Para a análise da área de disseminação celular e da circularidade, salve a imagem de lapso de tempo como uma pilha de imagens de tiff. O software de análise de compilação personalizada não suporta formatos de arquivo proprietários. Salve a pilha de imagens de tiff de células individuais selecionando Arquivo > Salvar como > Tiff.
  2. Instale o Python IDE (Spyder) e os pacotes necessários (PySimpleGUI e tifffile) para processamento e análise de dados.
    NOTA: A instalação do Python e dos pacotes só é necessária para a configuração inicial.
    1. Os filmes de lapso de tempo serão analisados no Spyder IDE usando um script Python de compilação personalizada. Para baixar o Spyder IDE, baixe o distribuidor Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual) que inclui Spyder IDE e a maioria das bibliotecas e pacotes necessários para esta análise.
    2. Instale a Anaconda e inicie o Spyder através do Anaconda Navigator.
    3. Na aba do console IPython (localizada na seção inferior direita do Spyder), copie e cole o seguinte comando: indique instale PySimpleGUI e pressione a tecla enter. A execução deste comando instalará o pacote necessário para iniciar a interface gráfica do usuário (GUI).
    4. No mesmo console, copie e cole o seguinte comando: pip instale o arquivo e pressione a tecla Enter. A execução deste comando instalará o pacote necessário para salvar imagens como arquivos de tiff.
    5. Baixe todos os scripts python dos arquivos suplementares ou dos scripts mais atualizados do GitHub em: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Quantificar a área celular e os fatores de forma celular durante a disseminação celular
    1. Abra o script principal de análise "cell_spreading_GUI.py" selecionando a opção de arquivo aberto no painel superior do Spyder ou usando o atalho Ctrl + O.
    2. Abra a gui de análise de expansão da célula selecionando "Executar arquivo" no painel superior ou usando o atalho F5.
    3. Clique na guia Área de Difusão celular (Figura 3A).
    4. Selecione a imagem de tiff a ser analisada usando o botão de navegação.
      NOTA: O arquivo selecionado deve ser um arquivo de tiff.
    5. Especifique o diretório de destino onde as saídas de dados (por exemplo, máscaras de células, valores) serão salvas.
    6. Especifique as configurações de saída de dados:
      1. Salve máscaras: Salve máscaras celulares geradas durante o processo de segmentação.
      2. Dados de exportação: Exporte uma planilha excel (.xlsx) que contenha todos os dados de análise para a pasta de destino.
        A área celular, a circularidade e a proporção de todas as células em expansão serão salvas como uma planilha do Excel na pasta de destino. A área celular é calculada como:
        Equation 1 
        A circularidade celular é uma medida de quão perto uma célula está de uma célula perfeitamente redonda. É calculado como:
        Equation 2 
        onde A e P são a área celular e o perímetro celular, respectivamente. A proporção da célula representa o quão alongada a célula é. Uma célula que se espalha deve ter uma proporção próxima de 1. A proporção é calculada como:
        Equation 3 
      3. Salve contornos: Salve as imagens de sobreposição do contorno do limite da célula na pasta de destino.
    7. Especifique as configurações de segmentação
      1. Mostrar segmentação: Mostrar o resultado de segmentação no console Spyder durante o processo de análise.
      2. Menor área celular (μm2): Digite o valor mínimo para a área celular, incluindo valores de área das células nos estágios iniciais de apego. Objetos com uma área menor do que este limiar não serão considerados como células disseminoras. Esse número afetará o processo de segmentação.
    8. Especifique os parâmetros de imagem.
      1. Intervalo de aquisição (s): Digite a frequência da aquisição da imagem em segundos.
      2. Tamanho do pixel (μm): Digite o tamanho do pixel que foi registrado ao preparar imagens para análise.
      3. Profundidade da broca da imagem: Digite a profundidade do bit da câmera/detector.
    9. Clique em Executar. Se um erro surgir, uma mensagem de erro aparecerá no console do Spyder. Caso contrário, o processo de análise de imagem será mostrado no console.
      NOTA: A primeira imagem a aparecer na seção console/Plots (dependendo das configurações spyder) mostra todas as células identificadas no campo de exibição. Caixas verdes colocadas ao redor das células indicam células disseminar que são adequadas para segmentação e análise. Caixas cinzentas indicam células que não são adequadas para análise. O número total de células de espalhamento identificadas também aparecerá na guia Console. O software traça a área celular (em azul) e a circularidade celular (em vermelho) em função do tempo. Esses gráficos permitem que os usuários avaliem a precisão da segmentação celular. Uma segmentação bem sucedida produz uma curva monotonicamente crescente para a área celular. Para obter uma curva representativa da área de propagação celular, a fase de defasagem deve ser removida manualmente do gráfico. A fase de defasagem inclui medidas da área celular antes que a célula comece a se espalhar. A fase de defasagem é indicada por flutuações rápidas, conforme representado no enredo da área celular(Figura 3C à direita).

6. Quantifique a dinâmica da borda celular durante a disseminação celular usando kymografos

  1. Antes de executar a análise, corte os filmes crus de células disseminados para criar séries temporidas de células espalhadas individuais.
    1. Use a ferramenta Retângulo na barra de ferramentas Fiji para selecionar manualmente uma região de interesse (ROI) que encapsula uma única célula. (Para garantir que o ROI encapsula totalmente a célula de disseminação, use a função de pergaminho para inspecionar o ROI em todos os pontos de tempo.)
    2. Clique com o botão direito do mouse no ROI e selecione Duplicar.
    3. Verifique a pilha duplicada e clique em OK.
  2. Abra o script principal de análise "cell_spreading_GUI.py" selecionando o botão Arquivo Aberto na barra de ferramentas do Spyder ou usando o atalho Ctrl + O. Se a GUI já foi aberta, vá diretamente para o Passo 6.3.
  3. Abra a gui de análise de expansão da célula selecionando o arquivo Executar no painel superior ou usando o atalho F5 (Figura 3B).
  4. Clique na guia gerador &analysis do gerador e análise de Kymograph.
  5. Use o botão de navegação para selecionar a imagem de tiff para a análise.
    NOTA: Formatos de arquivo proprietários, por exemplo, nd2, lif, zen, não são suportados pelo script.
  6. Especifique a pasta de destino para salvar os dados de saída (máscaras e valores de células).
  7. Especifique as configurações de saída.
    1. Dados de exportação: Exporte uma planilha excel (.xlsx) para a pasta de destino que contém posições relativas de borda celular e eventos de retração dos kymographs.
  8. Especifique os parâmetros de imagem:
    1. Intervalo de aquisição (s): Digite a frequência de aquisição de imagens em segundos.
    2. Tamanho do pixel (μm): Digite o tamanho do pixel que foi registrado ao preparar imagens para a análise no Passo 5.1.3.
    3. Menor área celular (μm2): Digite o valor mínimo para a área celular, incluindo valores de área das células nos estágios iniciais de apego. Objetos com uma área menor do que este limiar não serão considerados como células disseminoras. Esse número afetará o processo de segmentação.
    4. Profundidade da broca da imagem: Digite a profundidade do bit da câmera/detector.
  9. Clique em Executar. Se um erro surgir, uma mensagem de erro aparecerá no console do Spyder. Caso contrário, um resumo das quantificações da dinâmica de saliência será mostrado no console. Haverá 4 pares de frequência de retração e medidas de velocidade de saliência, que são extraídos de 4 kymografos gerados das partes superior, inferior, esquerda e direita da célula. A frequência de retração é calculada como:
    Equation 4 
    NOTA: Este número demonstra com que frequência o lamellipodium se retrai ao longo da propagação. A velocidade média de saliência é medida pela inclinação entre o início da saliência e o ponto de planalto no kymograph. Uma figura de kymograph sumária será mostrada no console após a segmentação. Para salvar a figura de resumo, clique com o botão direito do mouse na figura e salve a imagem.

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Representative Results

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O protocolo acima descreve os procedimentos experimentais para a imagem de células vivas de células disseminadas e uma ferramenta computacional para a análise quantitativa da dinâmica de disseminação celular. A ferramenta computacional pode ser usada em um formato de baixo ou alto rendimento para identificar os atores moleculares que regulam o maquinário de polimerização de actina na borda principal da célula.

A representação esquemática dos procedimentos experimentais é retratada na Figura 1. O ensaio de disseminação celular foi realizado em fibroblastos de embriões de camundongos imortalizados expressando o domínio de elogia pleckstrina (PH) da proteína Akt quinase marcada com eGFP25. As células foram destacadas com trippsina-EDTA e foram autorizadas a se recuperar em suspensão por 45 minutos. Durante a etapa de recuperação, as células reabasteceram seus receptores de integrin na membrana plasmática, conforme indicado pelo apego rápido e síncrono das células recuperadas às tampas revestidas de fibronectina(Figura 2). Sem o período de recuperação, as células disseminadas apresentaram uma ampla distribuição do tamanho da célula indicando uma alta variabilidade no início da disseminação celular(Figura 2A e B). Em seguida, as células foram banhadas em um deslizamento fiducial marcado e sua dinâmica de difusão foi visualizada por microscopia confocal de disco giratório(esquemas mostrados na Figura 1A - H). Ao longo da aquisição de imagens, consideramos campos de visão que apresentavam células com uma relação sinal-ruído de 2,5 ou mais. Esta foi uma consideração importante, pois a segmentação de imagem subsequente é sensível à intensidade de fluorescência das células em relação ao fundo. Em nossos experimentos, adquirimos imagens a cada 6 segundos por 15minutos (esquemas mostrados na Figura 1I-J). De acordo com os relatórios anteriores16, a imagem a uma taxa de quadro de 6 segundos garantiu resolução temporal suficiente para capturar a dinâmica dos eventos individuais de saliência e retração, permitindo-nos adquirir vários campos de visão em paralelo. As imagens resultantes do lapso de tempo foram analisadas usando o software Python de construção personalizada(Figura 3).

Uma quantificação imparcial da disseminação celular foi realizada utilizando-se dois procedimentos analíticos distintos: (i) Perfil morfodinâmico das células disseminadas(Figura 3A, C e 4) e(ii)análise de kymógrafo da dinâmica da borda celular(Figura 3B e 5). A análise da propagação celular por perfil morfodinâmico envolve a detecção automatizada das células disseminárias e fiduciárias no campo de visão(Figura 3C à esquerda),seguida por uma segmentação de imagem quadro a quadro e detecção do limite celular espalhando. A segmentação é realizada pela intensidade global que corta os quadros individuais. O valor do limiar é calculado como o mínimo local entre os modos de primeira e segunda intensidade no histograma de imagem26. Imagens com um histograma unimodal e distorcido para a direita são segmentadas pelo algoritmo de limiar de triângulo27. Após a segmentação celular, foram computadas as características morfodinâmicas das células disseminadas (ou seja, área celular, proporção e circularidade celular)(Figura 3C direita).

Consistente com os resultados publicados12,28, a disseminação celular foi impulsionada por uma expansão isotrópica de lamellipodia, conforme indicado por uma forma sigmoidal no enredo da área celular representativa (Figura 3C direita, curva azul e S1). O enredo da área mostrou que a área celular aumentou aproximadamente 3 vezes antes de atingir um platô(Figura 4A e B). Durante todo o processo de disseminação celular, as células permaneceram circulares (circularidade = 0,70 ± 0,076) e apresentaram bordas celulares salientes semelhantes a véus, que são indicativas de saliências lamellipodial(Figura 4C).

Para validar o ensaio de disseminação celular, inibimos o Arp2/3 com 100 μM CK-666 por 1 hora e 45 minutos e avaliamos o efeito deste tratamento na dinâmica de difusão celular. De acordo com os relatórios anteriores13, a supressão da atividade Arp2/3 não resultou em uma diminuição significativa da velocidade de propagação celular(Figura 4A e B, curva rosa). No entanto, a análise da forma celular revelou uma diferença significativa na circularidade do controle e das células tratadas CK-666 (Controle: 0,70 ± 0,08 vs. CK-666: 0,54 ± 0,09, p < 0. 1 x 10-3)(Figura 4C). Enquanto as células de controle permaneceram circulares até o planalto, as células inibidas arp2/3 adquiriram uma forma poligonal que foi mantida ao longo do curso de disseminação(Figura 4A). Juntos, esses resultados experimentais demonstram que o ensaio de disseminação celular descrito revela alterações moderadas na morfodinâmica celular causadas por perturbações da máquina de polimerização de actina.

Embora o perfil morfodinâmico seja muitas vezes suficiente para detectar alterações brutas na dinâmica de disseminação celular, esta análise tem capacidade limitada de identificar componentes citoesqueléticos específicos que regulam os ciclos de retração da borda celular, levando-nos a implementar uma ferramenta de análise de kymograph imparcial(Figura 5 linhas esquerdas e tracejadas). A análise da velocidade da borda celular revelou uma diminuição moderada, mas significativa, na velocidade média de saliência das células inibidas arp2/3 em comparação com o controle (Controle: 37,1 ± 12,87 nm/s vs. CK-666: 28,7 ± 13,4 nm/s, p = 0. 9 x 10-3) (Figura 5C). Além disso, a dinâmica da borda de controle celular e das células inibidas arp2/3 foram notavelmente diferentes(Figura 5A e D). As células de controle se projetaram persistentemente com pouca ou nenhuma retração durante a fase de rápida expansão, que durou cerca de 200 segundos, e apresentaram retrações intermitentes durante a fase do planalto(Figura 5A e D). Em contraste, a expansão das células inibidas arp2/3 foi intervindo por eventos de retração, denotados pelos pontos vermelhos nos gráficos(Figura 5B e D). A quantificação da frequência de retração mostrou que as células inibidas arp2/3 retraíram 26% mais frequentemente do que as células de controle (Controle: 0,18 ± 0,22 s-1 vs. CK-666: 0,24 ± 0,19 s-1, p = 0,03) (Figura 5D). Esses dados demonstram a alta sensibilidade da análise do kymógrafo na detecção de alterações leves na dinâmica lamellipodial.

Figure 1
Figura 1: O fluxo de trabalho experimental de um ensaio de espalhamento celular. (A - H) Esquemas do ensaio de espalhamento da célula. (A) Uma tampa de 22 mm x 22 mm é revestida com fibronectina diluída em PBS para uma concentração final de 2,5 μg/mL. (B) Um prato confluente de 10 cm de fibroblastos embrionários de camundongos expressos ph-Akt-GFP (MEFs) é lavado com PBS e tratado com 0,05% de trippsina-EDTA. As células tratadas com trippsina são então divididas em um tubo de centrífuga de 15 mL e um prato de cultura tecidual de 6 cm, ambos contendo mídia de cultura celular. (C) A partir do tubo de centrífuga de 15 mL, 500-1000 μL é pipetado sobre o deslizamento revestido de fibronectina. (D) O prato de 6 cm e o prato de 35 mm com o deslizamento contendo as células pouco semeadas são colocados em uma incubadora de 37 °C durante a noite. Uma vez polarizadas, essas células fornecerão o quadro de foco para a aquisição de expansão celular. (E) Uma hora antes da aquisição da imagem, a mídia do prato de 6 cm é substituída por DMEM livre de fenol-vermelho complementado com HEPES e a droga de interesse. Após 1 hora, as células são tratadas com 0,05% de trippsina-EDTA e transferidas para um tubo de centrífugas de 15 mL (Tubo A) contendo o DMEM livre de fenol hepes/drogado. As células do tubo A são então diluídas em outro tubo de centrífuga de 15 mL (Tubo B), que é colocado na incubadora por 45 minutos. (F) À medida que as células se recuperam, a câmara magnética é preparada de baixo para cima: primeiro a placa inferior é colocada sobre uma superfície plana, em seguida, o deslizamento de tampa com as células polarizadas, a junta de silicone, o corpo principal da câmara e, finalmente, a tampa transparente são colocadas em cima. (G) 1 mL de DMEM livre de fenol suplementado por drogas é pipetado para a câmara magnética, que é então levada para o estágio do microscópio. Um plano CFI Apo Lambda 60X Oil objetivo é selecionado para aquisição de imagem. (H) A tampa transparente é removida e 500 μL do conteúdo do tubo B são intubados na câmara magnética. (I) Para aquisição de imagens, os campos de visão apropriados conterão "halos" verdes, que são células suspensas que ainda não se anexaram ao deslizamento de tampas. (J) As células são imagens por 15 minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: O efeito do tempo de recuperação na propagação celular. As células mantidas em suspensão pelo tempo indicado (etapa de recuperação celular no protocolo) foram banhadas em tampas revestidas de fibronectina por 15 minutos, fixadas com 4% de paraformaldeído e imaged por microscopia de contraste de fase. (A) Painéis superiores: imagens de contraste de fase adquiridas com um objetivo de 20X. Painéis inferiores: máscaras celulares segmentadas por bacias hidrográficas com as áreas de célula codificadas por cores. (B) Quantificação da área celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Interface gráfica do Usuário (GUI) e os princípios de trabalho do software de processamento e análise de imagens. (A) A GUI da guia "Área de difusão celular". Consulte a etapa 5.3 para obter instruções. (B) A GUI da guia "Gerador & análise de Kymograph". Consulte a etapa 6 para obter instruções. (C) O pipeline de processamento de imagem do software. O software identifica pela primeira vez a disseminação de células (rotuladas por uma caixa de delimitação verde) em todo o campo de visão. As células disseminados são identificadas com base em seu valor de intensidade, circularidade e proporção. As células de disseminação identificadas são então segmentadas quadro a quadro usando limiares de intensidade global. Cada máscara binária é processada por filtragem mediana e enchimento binário do orifício seguido de fechamento morfológico para suavizar a borda da célula. O contorno vermelho corresponde ao limite celular segmentado. A área, a proporção e a circularidade da célula da célula são extraídos do mapa celular binário. O gráfico mostra a área e a circularidade de uma célula representativa ao longo do tempo. Após a semeadura celular, as células não começam a se espalhar imediatamente, dando origem à fase de defasagem vista no gráfico. Após a fase de defasagem, as células se espalham rapidamente durante a fase de expansão rápida e eventualmente atingem uma fase de platô. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos da análise da área de disseminação celular após a inibição de Arp2/3. (A) Imagens representativas de MEFs que expressam PH-Akt-GFP espalhando-se em uma mancha de cobertura revestida de fibronectina ao longo de 3 minutos. A linha vermelha indica o limite celular extraído pelo algoritmo de segmentação celular. Painéis superiores: 0,1% células tratadas com DMSO. Painéis inferiores: 100 μM CK-666 (inibidor Arp2/3). (B) Um gráfico mostrando a área de disseminação celular ao longo do tempo. A área de disseminação celular foi quantificada como mudança de dobra em relação à área média de propagação celular das células de controle. Linhas azuis e rosas representam controle e células inibidas arp2/3, respectivamente. As regiões sombreadas indicam o desvio padrão superior e inferior da área de disseminação celular. (C) Um gráfico de barras com pontos de dados individuais mostrando a circularidade celular média do controle e células inibidas arp2/3. Todas as barras de erro representam desvio padrão. *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (não significativo, p > 0,05) conforme detectado pelos t-testes paramétricos dos alunos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos da análise do kymógrafo das células disseminadas após a inibição de Arp2/3. (A - B) Imagens representativas e kymógrafos extraídos de células tratadas com DMSO (controle) de 0,1% e células tratadas com 100 μM CK-666 (inibidor Arp2/3). Painéis esquerdos: imagens em escala de cinza invertidas de uma célula controlada e inibida por Arp2/3. As linhas tracejadas correspondem às linhas pré-definidas onde os kymógrafos foram extraídos. Painéis certos: os kymografos são extraídos ao longo das linhas tracejadas mostradas nas imagens em escala de cinza. Os limites da trama são codificados por cores para combinar com as linhas tracejadas nas imagens em escala de cinza. A linha tracejada em cada parcela indica a inclinação da curva a partir da qual a velocidade média de saliência foi calculada. Para identificar a fase do planalto, foi montada uma curva de crescimento logístico nos pontos de dados e o planalto foi derivado do parâmetro, c (Figura Suplementar 1). Os pontos vermelhos denotam os eventos de retração. (C) Um gráfico de barras com pontos de dados individuais mostrando as velocidades médias de saliência do controle e células inibidas arp2/3. Todas as barras de erro representam desvio padrão. (D) Um gráfico de barras com pontos de dados individuais mostrando a frequência de eventos de retração do controle e células inibidas arp2/3. (C - D) *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (não significativo, p > 0,05) como detectado por testes não paramétricos Mann-Whitney. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Um kymograma representativo e o resultado do ajuste da curva. Um kymógrafo extraído de uma célula que se espalha. A linha de traço azul corresponde à distância da borda da célula em relação ao primeiro quadro. A linha vermelha sólida corresponde à curva montada. Para aumentar a confiança do encaixe da curva, os pontos de dados brutos foram primeiro suavizadas por um filtro Savitzky-Golay. Após o ajuste da curva, o parâmetro c, a partir da equação logística, foi utilizado para identificar o ponto do planalto. O ponto de dados brutos mais próximo de c é designado como o ponto de planalto. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

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O ensaio de disseminação de células descrito permite o rastreamento contínuo de alterações morfológicas (por exemplo, tamanho e forma da célula) e movimentos de borda celular(ou seja, velocidade de saliência e frequência de retração), que são características ausentes na maioria dos protocolos de disseminaçãocelular 19,24. Embora os ensaios de disseminação de células de ponto final comumente usados permitam a determinação da velocidade de expansão celular, esses ensaios não conseguem resolver a dinâmica temporal dos movimentos das bordas celulares. A falta de informações temporais limita a capacidade de detectar e quantificar alterações nos ciclos de retração lamellipodial.

Nosso software de processamento e análise de imagens realiza uma análise simplificada das células disseminadas, desde a segmentação celular até a quantificação de dados. As análises manuais de imagem da disseminação celular geralmente envolvem uma seleção tendenciosa de um valor limiar ou a aplicação de um algoritmo de segmentação automatizado, que não é adequado para experimentos de alto throughput onde muitas imagens precisam ser analisadas. Nosso software é, portanto, projetado para detectar e segmentar células de difusão de forma automatizada, além de quantificar dinâmicas de saliência e descritores morfológicos. Juntos, essas características tornam o protocolo descrito favorável para triagens de grande rendimento de vias de sinalização e jogadores moleculares que regulam a lamellipodia.

Para garantir que a análise das células disseminar é robusta e precisa, algumas etapas críticas do protocolo devem ser realizadas com cuidado extra. O primeiro passo do ensaio de disseminação celular envolve o revestimento de células fluorescentes com uma densidade muito baixa em um deslizamento revestido de fibronectina no dia anterior à imagem(Figura 1A-D). Essas células polarizadas permitem o foco preciso das bordas salientes das células que se espalham durante a aquisição da imagem. Se a densidade de células polarizadas é muito alta, as células que se espalham têm uma alta chance de pousar ou se sobrepor com as células polarizadas, o que pode levar a uma falha de segmentação celular. O período de recuperação pós-trippsinização é mais um passo crítico neste protocolo. As células tratadas com a droga de interesse, por exemplo, DMSO ou CK-666, são separadas do prato de cultura celular por trypsin-EDTA (Passo 2), seguidas por um período de recuperação de 45 minutos(Figura 1E). Esta etapa de recuperação permite que as células se recuperem do decote proteolítico das proteínas da superfície celular por trypsina19,24 e sincroniza o início da propagação celular(Figura 2). Se a etapa de recuperação for omitida, a variabilidade célula-celular na área de disseminação celular aumenta, reduzindo a consistência do fenótipo biológico.

Durante a aquisição da imagem, qualquer deriva amostral inevitavelmente diminui a qualidade e precisão da análise de disseminação celular, especialmente a análise do kymograph. Para minimizar a deriva da amostra, algumas medidas devem ser tomadas. Primeiro, o usuário deve otimizar o movimento do palco durante a aquisição da imagem. A otimização inclui minimizar a viagem de estágio entre os campos de visão e reduzir a velocidade de movimento do palco. Em segundo lugar, é essencial fixar firmemente a amostra no estágio do microscópio. Se essas medidas sugeridas não eliminarem a deriva da amostra, o processamento pós-aquisição deve ser considerado. Entre muitas ferramentas computacionais proprietárias e de código aberto, recomendamos usar o plugin Fiji "Registro baseado em descritor" para corrigir mudanças de imagem e alinhar os filmes de células disseminadas (instruções podem ser encontradas em: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)).

Deve-se notar que a análise quantitativa das áreas celulares e da dinâmica das bordas realizadas pelo software depende fortemente da precisão da segmentação celular. Para garantir uma segmentação precisa, recomendamos visualizar a propagação celular usando um sistema de imagem confocal, de preferência um microscópio confocal de disco giratório que oferece alta resolução, baixa fotobleaching/fototoxicidade e alta relação sinal-ruído. Um microscópio confocal remove eficientemente a fluorescência fora de foco emitida pelas células disseminadas, o que diminuiria a precisão de segmentação da imagem e o rastreamento do limite celular. Se um microscópio widefield for usado para aquisição de imagens, o processamento pós-aquisição adicional, por exemplo, a desconvolução de imagem, pode ser necessário para remover a fluorescência fora do foco e melhorar a precisão da segmentação celular. Portanto, deve-se considerar a escolha do sistema de imagem.

Dentro do software descrito, dois algoritmos de segmentação de imagem foram implementados e otimizados para detectar de forma confiável células rotuladas com proteínas fluorescentes fracas a moderadamente brilhantes, como proteínas fluorescentes verde e vermelha citosolic (GFP e RFP)26,27. No entanto, esses algoritmos de segmentação têm uma faixa dinâmica limitada e não são adequados para detectar células rotuladas com proteínas fluorescentes ou corantes extremamente brilhantes. Em nossas mãos, esses algoritmos tendem a subsegmentar células extremamente brilhantes devido à distorção do histograma de imagem em direção a pixels de alta intensidade. Para amostras brilhantes, as intensidades das imagens podem ser controladas ajustando o tempo de exposição ou a potência de saída do laser de excitação.

Com essas considerações em mente, este protocolo de difusão de células vivas é uma ferramenta robusta e poderosa para estudar a dinâmica da lamellipodia. A plataforma automatizada de análise de imagens é adequada para muitas investigações biológicas, por exemplo, triagem de alto conteúdo de fatores moleculares/sinalizadores que regulam as saliências lamellipodiais.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (bolsas RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

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References

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Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular
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Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).More

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).

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