In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.
Celspreiding is een dynamisch proces waarbij een cel die in media is opgehangen zich hecht aan een substraat en zichzelf afvlakt van een afgeronde naar een dunne en uitgespreide vorm. Na de aanhechting tussen cel en substraat vormt de cel een dun vel lamellipodie dat uit het cellichaam komt. In de lamellipodia polymeriseren bolvormige actine (G-actine) monomeren tot een dicht filamenteus actine (F-actine) gaaswerk dat tegen het plasmamembraan duwt, waardoor de mechanische krachten worden geleverd die nodig zijn om de cel te verspreiden. Met name de moleculaire spelers die de actinepolymerisatie in lamellipodia beheersen, zijn essentieel voor veel andere cellulaire processen, zoals celmigratie en endocytose.
Sinds het verspreiden van cellen continue lamellipodie vormt die de hele celperiferie overspannen en voortdurend naar buiten uitzetten, zijn celspreidingstesten een efficiënt hulpmiddel geworden om de kinetiek van lamellipodiële uitsteeksels te beoordelen. Hoewel verschillende technische implementaties van de celverspreidingstest zijn ontwikkeld, ontbreekt momenteel een gedetailleerde beschrijving van de workflow, die zowel een stapsgewijs protocol als rekentools voor gegevensanalyse zou bevatten. Hier beschrijven we de experimentele procedures van de celverspreidingstest en presenteren we een open-source tool voor kwantitatieve en onbevooroordeide analyse van celranddynamiek tijdens het verspreiden. In combinatie met farmacologische manipulaties en/of gen-dempingstechnieken is dit protocol vatbaar voor een grootschalig scherm van moleculaire spelers die lamellipodiële uitsteeksels reguleren.
Lamellipodiale uitsteeksels zijn prominente cytoskeletstructuren gevormd aan de voorkant van een migrerende cel. In lamellipodia creëert polymerisatie van actine met behulp van het Arp2/3-complex en formines een snelgroeiend vertakt actinegaaswerk dat tegen het plasmamembraanduwt 1,2. De duwkracht die door het actinenetwerk wordtgegenereerd,drijft de cel fysiek naar voren1,3,4,5. Uitputting van het Arp2/3-complex of verstoring van signaleringsroutes die essentieel zijn voor lamellipodiële uitsteeksels, tasten vaak de celmigratie aan6, 7. Hoewel migratie van lamellipodia-deficiënte cellen ook is gemeld8,9, is het belang van lamellipodie bij celmigratie duidelijk , aangezien uitputting van deze uitstekende structuur het vermogen van de cel om zich door complexe biologische micromilieus te bewegen6,10verstoort .
Een belangrijke belemmering voor het begrijpen van de regulatie van lamellipodia in migrerende cellen is de natuurlijke variabiliteit in lamellipodiële uitsteekkinetiek, grootte en vorm11,12,13,14. Bovendien hebben recente studies aangetoond dat lamellipodia complex uitstekend gedrag vertonen, waaronder fluctuerende, periodieke en versnellende uitsteeksels14,15. In vergelijking met de zeer variabele lamellipodia van migrerende cellen6,16, zijn lamellipodia gevormd tijdens celverspreiding uniformer12. Aangezien de uitstekende activiteit van het verspreiden en migreren van cellen wordt aangedreven door identieke macromoleculaire assemblages, waaronder een vertakt actinenetwerk, contractiele actomyosinebundels en op integrin gebaseerde celmatrixadhesie17,18, zijn spreidcellen veel gebruikt als model voor het onderzoeken van de regulatie van lamellipodiadynamiek.
Celspreiding is een dynamisch mechanochemisch proces waarbij een cel in suspensie zich eerst aan een substraat hecht door adhesies op basis van integrin17,19,20 en vervolgens verspreidt door actinegebaseerde uitsteeksels21,22,23uit te breiden . Tijdens de verspreidingsfase steken lamellipodia afkomstig van het cellichaam isotropisch en aanhoudend uit met weinig tot geen intrekking of vertraging12. De meest gebruikte celverspreidingsprotocollen zijn eindpunttesten, waarbij spreidcellen op verschillende tijdstippen na plating19,24worden gefixeerd . Deze tests, hoewel snel en eenvoudig, zijn beperkt in hun diagnostische vermogen om veranderingen in de dynamische kenmerken van lamellipodia te detecteren. Om de moleculaire mechanismen te bepalen die de lamellipodiedynamiek beheersen, pionierde de Sheetz-groep met het gebruik van kwantitatieve analyse van levende verspreidingscellen en ontdekte veel fundamentele eigenschappen van celranduitsteeksels11,12,22. Deze studies hebben aangetoond dat de levende celspreidingstest een robuuste en krachtige techniek is in de gereedschapskist van een celbiologisch laboratorium. Desondanks zijn een gedetailleerd protocol en een open-source computationele tool voor een live-cell spreading assay momenteel niet beschikbaar voor de celbiologiegemeenschap. Hiertoe schetst ons protocol de procedures voor het weergeven van levende verspreidingscellen en biedt het een geautomatiseerde tool voor beeldanalyse. Om deze methode te valideren, gebruikten we Arp2/3-remming als een experimentele behandeling en toonden we aan dat het remmen van de functie van het Arp2/3-complex de celspreiding niet arresteerde, maar een aanzienlijke vermindering van de uitsteeksnelheid van cellen veroorzaakte, evenals de stabiliteit van celranduitsteeksels, waardoor gekartelde celranden ontstonden. Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van live-cell imaging en geautomatiseerde beeldanalyse een nuttig hulpmiddel is voor het analyseren van celranddynamica en het identificeren van moleculaire componenten die lamellipodia reguleren.
De beschreven celspreidingstest maakt het mogelijk om continu morfologische veranderingen(bijv. celgrootte en -vorm) en celrandbewegingen(d.w.z. uitsteeksnelheid en intrekfrequentie) te volgen, die kenmerken zijn die ontbreken in de meeste celspreidingsprotocollen19,24. Hoewel veelgebruikte eindpuntcelspreidingstesten de bepaling van de celspreidingssnelheid mogelijk maken, slagen deze assays er niet in om de temporele dynamiek van celrandbewegi…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Connaught Fund New Investigator Award aan S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subsidies RGPIN-2015-05114 en RGPIN-2020-05881), University of Manchester en University of Toronto Joint Research Fund en University of Toronto XSeed Program.
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
Fiji Software | ImageJ | ||
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
Spyder | Anaconda | ||
Stage top incubator | Tokai Hit | ||
Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |