Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analyse af cellekantdynamik under cellespredning

doi: 10.3791/62369 Published: May 22, 2021
* These authors contributed equally

Summary

I denne protokol præsenterer vi de eksperimentelle procedurer i en cellespredningsanalyse, der er baseret på levende cellemikroskopi. Vi leverer et open source beregningsværktøj til uvildig segmentering af fluorescerende mærkede celler og kvantitativ analyse af lamellipodia dynamik under cellespredning.

Abstract

Cellespredning er en dynamisk proces, hvor en celle, der er ophængt i medier, fastgøres til et substrat og samkopierer sig selv fra en afrundet til en tynd og spredt form. Efter celle-substrat vedhæftet fil, cellen danner et tyndt ark lamellipodia stammer fra cellekroppen. I lamellipodien polymeriseres kugleformede actin (G-actin) monomerer til et tæt filamentous actin (F-actin) meshwork, der skubber mod plasmamembranen, hvilket giver de mekaniske kræfter, der kræves for, at cellen kan sprede sig. Især de molekylære spillere, der styrer actin polymerisering i lamellipodia er afgørende for mange andre cellulære processer, såsom celle migration og endokytose.

Da sprede celler danner kontinuerlig lamellipodi, der spænder over hele cellen periferien og vedvarende udvide udad, celle sprede assays er blevet et effektivt redskab til at vurdere kinetik lamellipodial fremspring. Selv om flere tekniske implementeringer af cellespredningsanalysen er blevet udviklet, mangler der i øjeblikket en detaljeret beskrivelse af arbejdsgangen, som vil omfatte både en trinvis protokol og beregningsværktøjer til dataanalyse. Her beskriver vi de eksperimentelle procedurer i cellespredningsanalysen og præsenterer et open source-værktøj til kvantitativ og upartisk analyse af cellekantdynamik under spredning. Når denne protokol kombineres med farmakologiske manipulationer og/eller genhæmningsteknikker, kan den tilpasses en storstilet skærm af molekylære afspillere, der regulerer lamellipodiale fremspring.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lamellipodial fremspring er fremtrædende cytoskeletale strukturer dannet på forsiden af en migrerende celle. I lamellipodia skaber polymerisering af actin ved hjælp af Arp2/3-komplekset og forminer et hurtigt voksende forgrenet actin meshwork, der skubber mod plasmamembranen1,2. Den skubbekraft , der genereres af det actin meshwork , driver fysisk cellen fremad1,3,4,5. Udtømning af Arp2/3-komplekset eller afbrydelse af signalveje , der er afgørende for lamellipodiale fremspring , forringer oftecellemigrationen 6, 7. Selv om migration af lamellipodia-mangelfulde celler også er blevet rapporteret8,9, betydningen af lamellipodi i celle migration er tydeligt som udtømning af denne fremspringende struktur gennemsyrer cellens evne til at bevæge sig gennem komplekse biologiske mikromiljøer6,10.

En væsentlig hindring for at forstå reguleringen af lamellipodi i migrerende celler er den naturlige variation i lamellipodial protrusion kinetik, størrelse og form11,12,13,14. Desuden har nylige undersøgelser vist, at lamellipodia udviser kompleks fremspringende adfærd, herunder svingende, periodiske og accelererende fremspring14,15. Sammenlignet med de meget variable lamellipodier af migrerende celler6,16, lamellipodia dannet under cellespredning er mereensartet 12. Da fremspringende aktivitet spredning og migrerende celler er drevet af identiske makromolekylære forsamlinger, som omfatter en forgrenet actin netværk, kontraktil actomyosin bundter, og integrin-baserede celle-matrix vedhæftninger17,18, sprede celler er blevet udbredt som en model for at undersøge reguleringen af lamellipodia dynamik.

Cellespredning er en dynamisk mekanokemisk proces , hvor en celle i suspension først klæber til et substrat gennem integrinbaserede vedhæftninger17,19,20 og derefter spredes ved at udvide actin-baserede fremspring21,22,23. Under spredningsfasen stikker lamellipodier, der stammer fra cellekroppen, isotropisk og vedvarende med lidt eller ingen tilbagetrækning eller hingst12. De mest anvendte cellespredningsprotokoller er endpoints assays, hvor spredning af celler rettes på forskellige tidspunkter efter plating19,24. Disse assays, selv om hurtig og enkel, er begrænset i deres diagnostiske magt til at opdage ændringer i de dynamiske funktioner i lamellipodia. For at bestemme de molekylære mekanismer, der styrer lamellipodiadynamik, var Sheetz-gruppen banebrydende for brugen af kvantitativ analyse af levende spredeceller og afdækkede mange grundlæggende egenskaber ved cellekantfremspring11,12,22. Disse undersøgelser har vist, at levende celle sprede analyse er en robust og kraftfuld teknik i værktøjskassen i en celle biologi laboratorium. På trods af dette er en detaljeret protokol og open source-beregningsværktøj til en spredning af levende celler i øjeblikket ikke tilgængeligt for cellebiologisamfundet. Til dette formål skitserer vores protokol procedurerne for billeddannelse af levende sprede celler og giver et automatiseret billedanalyseværktøj. For at validere denne metode brugte vi Arp2/3-hæmning som en eksperimentel behandling og viste, at hæmning af Arp2/3-kompleksets funktion ikke arresterede cellespredning, men forårsagede en betydelig reduktion i cellefremspringshastigheden samt stabiliteten af cellekantfremspring, hvilket gav anledning til takkede cellekanter. Disse data viser, at kombinationen af live-celle billeddannelse og automatiseret billedanalyse er et nyttigt værktøj til at analysere cellekant dynamik og identificere molekylære komponenter, der regulerer lamellipodia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Cellesåning

BEMÆRK: Den beskrevne cellespredningsprotokol blev udført ved hjælp af musefosfosiske fibroblaster (MEF'er), der udtrykker PH-Akt-GFP (en fluorescerende markør for PIP3/PI(3,4)P2). Denne cellelinje blev genereret ved genomisk at integrere en ekspressionskonstruktion til PH-Akt-GFP (Addgene #21218) ved CRISPR-medieret genredigering. Andre lysstofrør, der udtrykkes forbigående eller integreres i genomet, kan dog også bruges i denne analyse. For optimal billedsegmentering anbefaler vi at bruge fluorescerende markører, der er jævnt fordelt i cytoplasmaet, f.eks. cytosolic GFP.

  1. Kultur en 10 cm skål celler til 90% sammenløb.
  2. Når cellerne har opnået den rette sammenløb, skal du placere en 22 mm x 22 mm coverslip (#1,5; 0,17 mm tykkelse) i en 35 mm cellekultur skål. Coverlipet belægges med 400 μL fibronectin, der er fortyndet i PBS, til en endelig koncentration på 2,5 μg/mL.
    BEMÆRK: Antallet af coverlips, der kræves til analysen, bestemmes af antallet af forsøgsbetingelser og tekniske replikaer.
  3. 35 mm skålen anbringes med den fibronectinbelagte coverlip i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 1 time.
  4. Fjern skålen med coverlip fra inkubatoren. Aspirér fibronectin og vask coverlip med PBS ved forsigtigt pipetter omkring coverslip to til tre gange.
  5. Indsug cellekulturmediet fra cellernes 10 cm skål og vask skålen med PBS.
  6. Tilsæt 650 μL på 0,05% trypsin-EDTA til 90% sammenflydende skål af celler, vippe skålen til jævnt at fordele enzymet. Placer skålen med trypsin i inkubatoren i 1 minut.
  7. Fjern skålen med cellerne fra inkubatoren. Der tilsættes 10 mL cellekulturmedier til et 15 mL centrifugerør. Tilføj hurtigt yderligere 10 mL medier i skålen for at slukke trypsin.
  8. Pipetter 1 mL af de trypsiniserede celler ind i 15 mL centrifugerøret for at fortynde cellerne. Pipetter indholdet af røret op og ned for at sikre en jævn fordeling af celler i mediet. For celletyper med høj aggregerings tilbøjelighed anbefales filtrering af celler gennem en cellefumning (100 μm maskestørrelse) for at minimere forekomsten af celleklumpning.
  9. Fra røret pipettes 500 - 1000 μL fortyndede celler i 35 mm skålen, der indeholder coverlip.
  10. Ryst forsigtigt skålen for at sprede cellerne jævnt ud. Sørg for, at coverlip er på en ~ 10% sammenløb (~ 50.000 celler / mL) og justere mængden af fortyndede celler efter behov.
    BEMÆRK: Formålet med at have celler ved så lav sammenløb er at sikre, at der er 1-2 polariserede celler i hvert synsfelt, der vil blive brugt til at fokusere målet i hele cellespredning erhvervelse.
  11. Passage 1/5 af de resterende celler i 10 cm skålen i en 6 cm skål pr. Behandlingstilstand. Placer de passerede retter og 35 mm skålen med coverlip i inkubatoren natten over.
    BEMÆRK: Dette vil være de celler, der vil blive analyseret for spredning dynamik.

2. Inkubation af lægemidler og cellegenopretning

  1. Der tilsættes 5 mL cellekulturmedier til hver af to 15 mL centrifugerør og 20 mL phenolrødt DMEM i hver af to 50 mL centrifugerør.
    BEMÆRK: Antallet af rørpar (15 mL + 50 mL) skal svare til antallet af forsøgsbetingelser.
  2. For at teste Arp2/3's betydning for cellespredning skal du pipette enten den farmakologiske hæmmer af Arp2/3, CK-666 eller kontrolbehandlingen, såsom DMSO, ind i hvert par centrifugeringsrør op til den ønskede koncentration.
  3. Fjern de passerede 6 cm retter (se trin 1.11) fra inkubatoren, og indsug mediet. Vask opvasken med varm PBS.
  4. Tilsæt indholdet af CK-666- eller DMSO-supplerede 15 mL centrifugerør i hver af de passerede retter. Mærk hver skål med den korrekte lægemiddelbehandling og læg opvasken i inkubatoren i en time.
  5. Fjern opvasken fra inkubatoren, og indsug mediet. Vask opvasken med varm PBS for grundigt at fjerne alle de resterende phenol røde medier.
  6. Der tilsættes 230 μL på 0,05% trypsin-EDTA til hver 6 cm skål og inkuber celler i 1 minut.
    BEMÆRK: Hvis det er relevant, kan trypsin erstattes af en ikke-proteolytisk celle vedhæftningsblokker.
  7. Fjern opvasken fra inkubatoren. Til hver behandling tilsættes 5 mL lægemiddeltilskudt phenolrødt frit DMEM til et 15 mL centrifugerør, der er udpeget som "Tube B". Tilsæt yderligere 5 mL af det samme medie i den relevante skål for at slukke trypsin. Indholdet af skålen overføres til et 15 mL centrifugerør, der er betegnet som "Tube A".
  8. Der overføres 1 mL celler fra rør A til rør B. Gentag for hver behandling.
  9. Placer rør A og B i inkubatoren i 45 minutter for at give cellerne mulighed for at komme sig efter trypsinisering. Hætten af centrifugerørene løsnes en smule, før de placeres i inkubatoren, så der er mulighed for CO 2-penegengivelse.
    BEMÆRK: Varigheden af restitutionstiden kan variere for forskellige celletyper. Selvom 45 minutter lang restitution i vores eksperimenter havde en ubetydelig effekt på celle levedygtighed, kan nogle celletyper gennemgå anoikis, når de opretholdes i suspension for længe. Derfor anbefaler vi at bestemme den optimale restitutionstid empirisk. Den optimale restitutionstid muliggør hurtig og synkron cellespredning uden døde eller apptotiske celler i prøven.

3. Forberedelse af magnetisk kammer

  1. Sørg for, at alle dele af et 1 well Chamlide Cell Magnetic Chamber, der kan rumme en 22 mm x 22 mm firkantet coverlip, er blevet rengjort før brug.
  2. 35 mm skålen fjernes med coverlipet (se trin 1.11) fra inkubatoren. Indsug cellekulturmediet, og vask coverlip'en med varm PBS.
  3. Fjern coverlip fra 35 mm skålen ved hjælp af et par pincet og læg forsigtigt coverlipet på bundpladen i det magnetiske kammer.
  4. Placer silikonepakningen oven på dækslet.
    BEMÆRK: En forkert placeret silikonepakning er den mest almindelige årsag til et utæt magnetisk kammer. Sørg for, at pakningen hviler i bundpladens indrykning og ikke stiger ud over indrykningen.
  5. Fastgør hovedkroppen på bundpladen.
    BEMÆRK: Gør denne del meget langsomt. Et godt tip er at holde bundpladen med den ene hånd, mens hovedkroppen placeres på toppen. Dette sikrer, at hovedkroppens magneter ikke løfter bundpladen op, hvilket potentielt kan fortrænge og knække dækslet.
  6. Der tilsættes 1 mL lægemiddeltilskudt phenolrødt frit DMEM til magnetkammeret. Tag et fnugfrit væv og dup forsigtigt kabinettet mellem hovedkroppen og bundpladen for at kontrollere eventuelle lækager.
    BEMÆRK: Hvis der er lækage, skal du hurtigt indsuge mediet og fortsætte igen fra trin 3.4.
  7. Sænk det gennemsigtige dæksel ned på hovedkroppen for at omslutte det magnetiske kammer.
  8. Sprøjt først et laboratorievæv med vand og tør bunden af det magnetiske kammer (coverlipet, ikke metaldelen). Derefter sprøjtes et andet laboratorievæv med en lille mængde 70% ethanol og tørres, idet du er forsigtig med ikke at knække coverlip.

4. Erhvervelse af billeder

  1. Forvarm faseopinkubatoren og den objektive varmelegeme til 37 °C, og sæt CO2-niveauet i fasetopinkubatoren til 5 %.
    BEMÆRK: Hvis fasetopinkubatoren ikke er forbundet med en CO2-forsyning, skal cellekulturmediet suppleres med 25 mM HEPES for at opretholde konstant pH 7.4.
  2. Påfør en tilstrækkelig mængde nedsænkningsolie på det forvarmede oliemål 60X, 1,4 N.A.
    BEMÆRK: Vi bruger et 60X, 1.4 N.A. oliedysningsmål i denne protokol på grund af dets rimeligt store synsfelt og fremragende lysindsamlingseffektivitet. Hvis der kræves et større synsfelt, kan der anvendes et lavere forstørrelsesmål(f.eks.20x), så længe signal-til-støj-forholdet på billederne er større end 2,5.
  3. Bring både det færdige magnetiske kammer og rør B (trin 2.9) til konfokalt mikroskop. Placer det magnetiske kammer på scenen top inkubator.
    BEMÆRK: Placer det magnetiske kammer forsigtigt på scenen for at undgå at skabe bobler i nedsænkningsolien.
  4. Sæt fokus på fluorescerende celler ved hjælp af GFP-kanalen. Sørg for, at cellekanten er skarp og veldefineret.
  5. Det gennemsigtige dæksel af magnetkammeret og pipetten 500 μL fjernes fra rør B til magnetkammeret. Placer det gennemsigtige dæksel tilbage på toppen af det magnetiske kammer.
  6. For at identificere celler, der er ideelle til cellespredningsanalyse, skal du søge efter "glorier" af celler, der endnu ikke er fastgjort til coverlipet, men som ikke længere ruller rundt. Celler, der er i de tidligste stadier af coverslip vedhæftet fil er også store kandidater, men billedopsamling skal være hurtig for at fange spredning.
  7. Konfigurer tidsforskydningsbilledet for den grønne kanal til at omfatte fire synsfelter, der afbildes med 6 sekunders mellemrum.
    BEMÆRK: På grund af lamellipodia-fremspringshastighedens høje variationshastighed blandt forskellige celletyper bør den optimale billedhastighed bestemmes empirisk. Billeddiagnostisk interval på 6 sekunder, der anvendes i vores eksperimenter, er et godt udgangspunkt for analysen af mange mesenchymale og epitelceller. Celler, der spredes meget hurtigt(f.eks.immunceller), kan dog kræve en meget højere billedhastighed (kortere billedinterval). Den optimale billedhastighed for cellespredningsfilm sikrer en forskydning på 2-5 pixel af den fremspringende cellekant mellem efterfølgende rammer. I betragtning af nøjagtigheden af kurvetilpasning, der anvendes til at identificere plateauet for cellespredning, bør den optimale billedhastighed også sikre 50-100 målinger af cellekantforskydning i den hurtige ekspansionsfase af cellespredning. Antallet af synsfelter skal justeres afhængigt af eksponeringstiden, afstanden mellem anskaffelsespunkterne og stage-bevægelseshastigheden. Brugere rådes til at bestemme det maksimale antal synsfelter, der kan erhverves med den ønskede billedhastighed.
  8. Når du har identificeret et passende synsfelt, skal du gemme X- og Y-koordinaterne for mikroskopstadiet. Fortsæt med at identificere tre andre synsfelter, der er relativt tæt på hinanden på coverlip. Gem mikroskopstadiets koordinater til alle ønskede synsfelt.
    BEMÆRK: Det anbefales på det kraftigste at optimere stadiebevægelsesstien mellem synsfelter for at minimere unødvendig prøvebevægelse. En sådan optimering kan udføres enten manuelt eller automatisk. Overdreven prøvebevægelse forsinker anskaffelsen og kan få cellerne til at rulle ud af syne, når de er faldende.
  9. Anskaf billeder i 15 minutter med en billedhastighed på 6 sekunder, og gem filerne. Hvis der kræves flere anskaffelser, skal du gentage startende ved trin 4.6.

5. Analyse af celleområde, cirkularitet og fremspringsdynamik under cellespredning

  1. Forberede billeder til databehandling og -analyse
    BEMÆRK: Softwaren kræver et billede i .tiff format og en pixelstørrelse som inputparametre. Begge krav kan opfyldes ved hjælp af anskaffelsessoftwaren eller Fiji (i denne protokol). Hvis disse krav er opfyldt, skal du gå videre til trin 5.2.
    1. Installer den nyeste version af Fiji-programmet (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Åbn et time-lapse-billede ved hjælp af Fiji.
    3. Kopier billedets pixelstørrelse ved at vælge Egenskaber for > billede. Kopier og indsæt pixelstørrelsen i μm til Notesblok/Word.
    4. Til analyse af cellespredningsområde og cirkularitet skal du gemme time-lapse-billedet som en tiff-billedstak. Den brugerdefinerede analysesoftware understøtter ikke beskyttede filformater. Gem den enkelte celletakst billedstak ved at vælge Filer > Gem som > Tiff.
  2. Installer Python IDE (Spyder) og de nødvendige pakker (PySimpleGUI og tifffile) til databehandling og analyse.
    BEMÆRK: Installationen af Python og pakker er kun påkrævet til den indledende opsætning.
    1. Time-lapse-filmene analyseres i Spyder IDE ved hjælp af et Custom-build Python-script. Hvis du vil hente Spyder IDE, skal du downloade Anaconda-distributøren (https://www.anaconda.com/products/individual), som omfatter Spyder IDE og de fleste af de nødvendige biblioteker og pakker til denne analyse.
    2. Installer Anaconda og start Spyder gennem Anaconda Navigator.
    3. Under fanen IPython-konsol (placeret nederst til højre i Spyder) skal du kopiere og indsætte følgende kommando: pip install PySimpleGUI og tryk på enter-tasten. Hvis du kører denne kommando, installeres den pakke, der er nødvendig for at starte den grafiske brugergrænseflade.
    4. Kopier og indsæt følgende kommando i samme konsol: pip install tifffile, og tryk på Enter. Hvis du kører denne kommando, installeres den pakke, der er nødvendig for at gemme afbildninger som tiff-filer.
    5. Download alle Python-scripts fra de supplerende filer eller de mest opdaterede scripts fra GitHub på: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Kvantificere faktorer for celleområde og celleform under cellespredning
    1. Åbn hovedanalysescriptet "cell_spreading_GUI.py" ved at vælge indstillingen åbn fil i det øverste panel i Spyder eller ved hjælp af genvejen Ctrl + O.
    2. Åbn den grafiske gui for cellespredning ved at vælge "Kør fil" i det øverste panel eller ved hjælp af genvejen F5.
    3. Klik på fanen Celleopslagsområde (Figur 3A).
    4. Vælg det tiff-billede, der skal analyseres ved hjælp af knappen Gennemse.
      BEMÆRK: Den valgte fil skal være en tiff-fil.
    5. Angiv den destinationsmappe, hvor dataoutput (f.eks. cellemasker, værdier) skal gemmes.
    6. Angiv indstillingerne for dataoutput:
      1. Gem masker: Gem cellemasker, der er genereret under segmenteringsprocessen.
      2. Eksporter data: Eksporter et Excel-regneark (.xlsx), der indeholder alle analysedataene, til destinationsmappen.
        Celleområde, cirkularitet og højde-bredde-forhold for alle spredningsceller gemmes som et Excel-regneark i destinationsmappen. Celleområdet beregnes som:
        Equation 1 
        Cellecirulariteten er et mål for, hvor tæt en celle er på en helt rund celle. Den beregnes som:
        Equation 2 
        hvor A og P er henholdsvis celleområdet og celle omkredsen. Cellens højde-bredde-forhold repræsenterer, hvor langstrakt cellen er. En spredende celle skal have et højde-bredde-forhold tæt på 1. Højde-bredde-forholdet beregnes som:
        Equation 3 
      3. Gem konturer: Gem cellerammekonturen overlejringsbilleder i destinationsmappen.
    7. Angive indstillinger for segmentering
      1. Vis segmentering: Vis segmenteringsresultatet i Spyder-konsollen under analyseprocessen.
      2. Mindste celleområde (μm2): Angiv minimumværdien for celleområdet, herunder områdeværdier for celler i de indledende faser af fastgørelse. Objekter med et område, der er mindre end denne tærskel, betragtes ikke som spredning af celler. Dette nummer påvirker segmenteringsprocessen.
    8. Angiv billedparametrene.
      1. Anskaffelsesintervaller: Angiv hyppigheden af billedanskaffelsen på få sekunder.
      2. Pixelstørrelse (μm): Angiv den pixelstørrelse, der blev optaget under forberedelse af billeder til analyse.
      3. Billedbitdybde: Angiv kameraets/detektorens bitdybde.
    9. Klik på Kør. Hvis der opstår en fejl, vises en fejlmeddelelse i Spyders konsol. Ellers vises billedanalyseprocessen i konsollen.
      BEMÆRK: Det første billede, der vises i konsollen/plots-sektionen (afhængigt af Spyder-indstillingerne), viser alle de celler, der er identificeret i synsfeltet. Grønne bokse placeret omkring cellerne angiver spredning af celler, der er egnede til segmentering og analyse. Grå bokse angiver celler, der ikke er egnede til analyse. Det samlede antal identificerede spredningsceller vises også under fanen Konsol. Softwaren afbilder celleområdet (i blåt) og cellecirularitet (med rødt) som en funktion af tiden. Disse grafer giver brugerne mulighed for at evaluere nøjagtigheden af cellesegmentering. En vellykket segmentering giver en monotont stigende kurve for celleområdet. For at opnå en repræsentativ kurve af cellespredningsområdet skal forsinkelsesfasen fjernes manuelt fra grafen. Forsinkelsesfasen omfatter målinger af celleområdet, før cellen begynder at sprede sig. Forsinkelsesfasen angives ved hurtige udsving, som repræsenteret i celleområdeområdet(figur 3C til højre).

6. Kvantificere cellekantdynamik under cellespredning ved hjælp af kymographs

  1. Før du kører analysen, beskære de rå film for at sprede celler for at skabe tidsserier af individuelle sprede celler.
    1. Brug rektangelværktøjet på fijiværktøjslinjen til manuelt at vælge et interesseområde, der indkapsler en enkelt celle. (Brug rullefunktionen til at inspicere investeringsafkastet på alle tidspunkter for at sikre, at investeringsafkastet indkapsler spredningscellen fuldt ud).
    2. Højreklik på investeringsafkastet, og vælg Dupliker.
    3. Marker Dubletstakken , og klik på OK.
  2. Åbn hovedanalysescriptet "cell_spreading_GUI.py" ved at vælge knappen Åbn fil på Spyders værktøjslinje eller ved hjælp af genvejen Ctrl + O. Hvis gui'en allerede er åbnet, skal du gå direkte til trin 6.3.
  3. Åbn gui'en for cellespredningsanalyse ved at markere Kør fil i det øverste panel eller ved hjælp af genvejen F5 (Figur 3B).
  4. Klik på fanen Kymograph generator & analysis.
  5. Brug knappen Gennemse til at vælge tiff-billedet til analysen.
    BEMÆRK: Proprietære filformater, f.eks.
  6. Angiv den destinationsmappe, hvor outputdataene skal gemmes (cellemasker og værdier).
  7. Angiv outputindstillingerne.
    1. Eksporter data: Eksporter et Excel-regneark (.xlsx) til destinationsmappen, der indeholder relative cellekantplaceringer og tilbagetrækningshændelser for kymografierne.
  8. Angiv billedparametrene:
    1. Anskaffelsesinterval (er): Angiv billedopsamlingsfrekvensen på få sekunder.
    2. Pixelstørrelse (μm): Angiv den pixelstørrelse, der blev optaget under forberedelse af billeder til analysen i trin 5.1.3.
    3. Mindste celleområde (μm2): Angiv minimumværdien for celleområdet, herunder områdeværdier for celler i de indledende faser af fastgørelse. Objekter med et område, der er mindre end denne tærskel, betragtes ikke som spredning af celler. Dette nummer påvirker segmenteringsprocessen.
    4. Billedbitdybde: Angiv kameraets/detektorens bitdybde.
  9. Klik på Kør. Hvis der opstår en fejl, vises en fejlmeddelelse i Spyders konsol. Ellers vises en oversigt over fremspringsdynamikken i konsollen. Der vil være 4 par tilbagetrækningsfrekvens og fremspringshastighedsmålinger, som udvindes fra 4 kymographs genereret fra toppen, bunden, venstre og højre del af cellen. Tilbagetrækningsfrekvensen beregnes som:
    Equation 4 
    BEMÆRK: Dette nummer viser, hvor ofte lamellipodium trækker sig tilbage i løbet af spredning. Den gennemsnitlige fremspringshastighed måles ved hældningen mellem fremspringets begyndelse og plateaupunktet på kymographen. En sammenfattende kymograph figur vil blive vist i konsollen efter segmentering. Hvis du vil gemme oversigtsfiguren, skal du højreklikke på figuren og gemme billedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ovenstående protokol beskriver de eksperimentelle procedurer for levende celle billeddannelse af sprede celler og et beregningsværktøj til kvantitativ analyse af cellespredning dynamik. Beregningsværktøjet kan bruges i et lav- eller højoverførselsformat til at identificere de molekylære spillere, der regulerer actin-polymeriseringsmaskineriet ved cellekanten.

Den skematiske repræsentation af forsøgsprocedurerne er vist i figur 1. Cellen sprede assay blev udført på udødeliggjort mus embryo fibroblaster stabilt udtrykke pleckstrin homologi (PH) domæne Akt protein kinase mærket med eGFP25. Cellerne blev løsrevet med trypsin-EDTA og fik lov til at komme sig i suspension i 45 minutter. Under genopretningstrinnet genopfyldte cellerne deres integrinreceptorer på plasmamembranen som angivet ved den hurtige og synkrone fastgørelse af de genvundne celler til de fibronectinbelagte coverslips (Figur 2). Uden restitutionsperioden udviste spredningscellerne en bred fordeling af cellestørrelsen, hvilket indikerede en høj variation i cellespredningens begyndelse (figur 2A og B). Dernæst blev cellerne belagt på en fiducially-mærket coverslip og deres spredning dynamik blev visualiseret ved spinning disk confocal mikroskopi (skemaer vist i figur 1A - H). Gennem hele billederhvervelsen overvejede vi synsfelter, der indeholdt celler med et signal-til-støj-forhold på 2,5 eller derover. Dette var en vigtig overvejelse, da den efterfølgende billedsegmentering er følsom over for cellernes fluorescensintensitet i forhold til baggrunden. I vores eksperimenter, vi har erhvervet billeder hvert 6 sekund i 15 minutter(skemaer vist i figur 1I-J). I overensstemmelse med tidligere rapporter16, billeddannelse på en 6 sekunders billedhastighed sikret tilstrækkelig tidsmæssig opløsning til at fange dynamikken i de enkelte fremspring og tilbagetrækning begivenheder, samtidig med at vi kan erhverve flere synsfelter parallelt. De resulterende time-lapse-billeder blev analyseret ved hjælp af den specialbyggede Python-software (Figur 3).

En objektiv kvantificering af cellespredning blev udført ved hjælp af to forskellige analysemetoder: (i) Morfodynamisk profilering af spredende celler (figur 3A, C og 4) og (ii) Kymograph-analyse af cellekantdynamik (figur 3B og 5). Analysen af cellespredning ved morfodynamisk profilering indebærer automatisk detektion af sprednings- og fiducialcellerne inden for synsfeltet (Figur 3C til venstre) efterfulgt af en frame-by-frame billedsegmentering og detektion af spredningscellegrænsen. Segmenteringen udføres ved hjælp af global intensitet, der tærsklerer for de enkelte rammer. Tærskelværdien beregnes som det lokale minimum mellem første og anden intensitetstilstand på billedets histogram26. Billeder med et unimodalt, højrespyet histogram segmenteres efter trekantens tærskelalgoritme27. Efter cellesegmentering blev de spredte cellers morfonamiske egenskaber(dvs. celleområde, højde-bredde-forhold og cellecirkulærhed) beregnet(figur 3C til højre).

I overensstemmelse med offentliggjorte resultater12,28, cellespredning var drevet af en isotropisk udvidelse af lamellipodi som angivet ved en sigmoidal form på det repræsentative celleområdeområde ( figur3C til højre, blå kurve og S1). Områdeområdet viste, at celleområdet steg med ca. 3 gange, før det nåede et plateau (Figur 4A og B). Under hele cellespredningsprocessen forblev cellerne cirkulære (cirkularitet = 0,70 ± 0,076) og viste slørlignende fremspringende cellekanter, som er tegn på lamellipodiale fremspring (Figur 4C).

For at validere cellespredningsanalysen hæmmede vi Arp2/3 med 100 μM CK-666 i 1 time og 45 minutter og vurderede effekten af denne behandling på cellespredningsdynamikken. I overensstemmelse med tidligere rapporter13resulterede undertrykkelsen af Arp2/3-aktiviteten ikke i et væsentligt fald i cellespredningshastigheden (figur 4A og B, lyserød kurve). Celleformanalysen viste imidlertid en betydelig forskel i kontrollens cirkularitet og CK-666 behandlede celler (Kontrol: 0,70 ± 0,08 vs. CK-666: 0,54 ± 0,09, p < 0, 1 x 10-3) (Figur 4C). Mens kontrolcellerne forblev cirkulære indtil plateauet, fik Arp2/3-hæmmede celler en polygonal form, som blev bevaret under hele spredningsforløbet (Figur 4A). Tilsammen viser disse eksperimentelle resultater, at den beskrevne cellespredningsanalyse afslører moderate ændringer i cellemorfodynamik forårsaget af forstyrrelser af actin polymeriseringsmaskineriet.

Mens morfonamisk profilering ofte er tilstrækkelig til at detektere grove ændringer i cellespredningsdynamik, har denne analyse begrænset evne til at identificere specifikke cytoskeletale komponenter, der regulerer fremsprings-tilbagetrækningscyklusserne i cellekanten, hvilket får os til at implementere et upartisk Kymograph Analysis-værktøj (Figur 5 venstre, stiplede linjer). Analysen af cellekanthastigheden afslørede et moderat, men betydeligt fald i den gennemsnitlige fremspringshastighed for Arp2/3-hæmmede celler sammenlignet med kontrol (Kontrol: 37,1 ± 12,87 nm/s vs. CK-666: 28,7 ± 13,4 nm/s, p = 0, 9 x 10-3) (Figur 5C). Desuden var dynamikken i cellekanten af kontrol og Arp2/3-hæmmede celler bemærkelsesværdigt forskellige (Figur 5A og D). Kontrolcellerne stak vedvarende ud med lidt eller ingen tilbagetrækninger i den hurtige ekspansionsfase, som varede omkring 200 sekunder, og udviste periodiske tilbagetrækninger i plateaufasen (Figur 5A og D). I modsætning hertil blev udvidelsen af Arp2/3-hæmmede celler grebet ind ved tilbagetrækningshændelser, betegnet med de røde prikker på graferne (Figur 5B og D). Kvantificering af tilbagetrækningsfrekvensen viste, at Arp2/3-hæmmede celler trak 26% oftere end kontrolceller (Kontrol: 0,18 ± 0,22 s-1 vs. CK-666: 0,24 ± 0,19 s-1, p = 0,03) ( Figur5D). Disse data viser kymografianalysens høje følsomhed ved påvisning af milde ændringer i lamellipodial dynamik.

Figure 1
Figur 1: Den eksperimentelle arbejdsgang for en celle, der spreder analysen. (A) En coverlip på 22 mm x 22 mm er belagt med fibronectin fortyndet i PBS til en endelig koncentration på 2,5 μg/mL. (B) En sammenløbet 10 cm skål PH-Akt-GFP-udtrykkende musefostre fibroblaster (MEF' er) vaskes med PBS og behandles med 0,05% trypsin-EDTA. De trypsinbehandlede celler opdeles derefter i et 15 mL centrifugerør og en 6 cm vævskulturskål, der begge indeholder cellekulturmedier. (C) Fra 15 mL centrifugerøret pipettes 500-1000 μL på den fibronectinbelagte coverlip. D) Skålen på 6 cm og 35 mm med overtræksslip, der indeholder de sparsomt seedede celler, anbringes i en inkubator på 37 °C natten over. Når polariseret, vil disse celler give rammen af fokus for cellespredning erhvervelse. (E) En time før billederhvervelse erstattes 6 cm-skålens medier med phenolrødt DMEM suppleret med HEPES og det stof, der er af interesse. Efter 1 time behandles cellerne med 0,05% trypsin-EDTA og overføres til et 15 mL centrifugerør (Tube A), der indeholder HEPES/lægemiddeltilskudt phenol rødfri DMEM. Cellerne i rør A fortyndes derefter yderligere i et andet 15 mL centrifugerør (Tube B), som placeres i inkubatoren i 45 minutter. (F) Efterhånden som cellerne kommer sig, fremstilles det magnetiske kammer fra bund til top: Først placeres bundpladen på en flad overflade, derefter coverlip med de polariserede celler, silikonepakningen, kammerets hoveddel og til sidst det gennemsigtige dæksel lægges ovenpå. (G) 1 mL lægemiddeltilskudt phenolrødt DMEMpiperes ind i magnetkammeret, som derefter bringes til mikroskopstadiet. En CFI Plan Apo Lambda 60X Oil mål er valgt til billederhvervelse. (H) Det gennemsigtige dæksel fjernes, og 500 μL af rør B's indholdpipetteres ind i magnetkammeret. (I) Til erhvervelse af billeder vil passende synsfelter indeholde grønne "glorier", som er suspenderede celler, der endnu ikke er fastgjort til coverlipet. (J) Cellerne afbildes i 15 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Virkningen af restitutionstiden på cellespredning. Celler, der blev opretholdt i suspension i den angivne tid (cellegendannelsestrin i protokollen), blev belagt på fibronectinbelagte coverlips i 15 minutter, fastgjort med 4% paraformaldehyd og afbildet ved fasekontrastmikroskopi. (A) Toppaneler: fasekontrastbilleder, der er erhvervet med et 20X-mål. Nederste paneler: vandskel-segmenteret celle masker med celleområderne farvekodede. (B) Kvantificering af celleareal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Grafisk brugergrænseflade (GUI) og arbejdsprincipperne for billedbehandlings- og analysesoftware. Yderligere oplysninger finder du i trin 5.3. (B) Den grafiske del af fanen "Kymograph generator &analysis". Yderligere oplysninger finder du i trin 6. (C)Softwarens billedbehandlingspipeline. Softwaren identificerer først spredning af celler (mærket med en grøn afgrænsningsramme) i hele synsfeltet. Spredningscellerne identificeres ud fra deres intensitetsværdi, cirkularitet og højde-bredde-forhold. De identificerede spredningsceller segmenteres derefter ramme for ramme ved hjælp af global intensitetstærskel. Hver binær maske behandles ved medianfiltrering og binær hulfyldning efterfulgt af morfologisk lukning for at udjævne cellekanten. Den røde kontur svarer til den segmenterede cellegrænse. Cellens område, højde-bredde-forhold og cirkularitet udtrækkes fra det binære cellekort. Grafen viser området og cirkulariteten af en repræsentativ celle over tid. Ved cellesåning begynder cellerne ikke at sprede sig med det samme, hvilket giver anledning til den forsinkelsesfase, der ses på grafen. Efter forsinkelsesfasen spredte cellerne sig hurtigt i den hurtige ekspansionsfase og nåede til sidst en plateaufase. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater af cellespredningsområdeanalyse ved Arp2/3-hæmning. (A) Repræsentative billeder af PH-Akt-GFP-udtrykkende MEF'er, der spredes på en fibronectinbelagt coverlip i løbet af 3 minutter. Den røde linje angiver den cellegrænse, der er udtrukket af cellesegmenteringsalgoritmen. Toppaneler: 0,1% DMSO-behandlede celler. Bundpaneler: 100 μM CK-666 (Arp2/3-hæmmer)behandlede celler. (B) En graf, der viser cellespredningsområdet over tid. Cellespredningsområdet blev kvantificeret, efterhånden som folden ændres i forhold til det gennemsnitlige cellespredningsområde i kontrolcellerne. Blå og lyserøde linjer repræsenterer kontrol og henholdsvis Arp2/3-hæmmede celler. De nedtonede områder angiver cellespredningsområdets øvre og nedre standardafvigelse. (C) Et søjleområde med individuelle datapunkter, der viser den gennemsnitlige cellecirkelitet af kontrol og Arp2/3-hæmmede celler. Alle fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, ns (ikke signifikant, p > 0,05) som detekteres ved parametriske studerende t-tests. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater af kymographanalyse af spredning af celler ved Arp2/3-hæmning. (A - B) Repræsentative billeder og kymografier udvundet af 0,1% DMSO-behandlede (kontrol) celler og 100 μM CK-666-behandlede (Arp2/3-hæmmer) celler. Venstre paneler: inverterede gråtonebilleder af en kontrol og Arp2/3-hæmmet celle. De stiplede linjer svarer til de foruddefinerede linjer, hvor kymographs blev udvundet. Højre paneler: kymographs udvindes langs de stiplede linjer vist på gråtonebillederne. Afbildningsgrænserne er farvekodede, så de passer til de stiplede linjer på gråtonebillederne. Den stiplede linje i hvert afbildning angiver hældningen af kurven, hvorfra den gennemsnitlige fremspringshastighed blev beregnet. For at lokalisere plateaufasen blev der monteret en logistisk vækstkurve på datapunkterne, og plateauet stammede fra parameteren c (Supplerende figur 1). De røde prikker angiver tilbagetrækningshændelserne. (C) Et søjleområde med individuelle datapunkter, der viser de gennemsnitlige fremspringshastigheder for styringen og Arp2/3-hæmmede celler. Alle fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. (D) Et søjleområde med individuelle datapunkter, der viser hyppigheden af kontrolhændelsernes og Arp2/3-hæmmede cellers tilbagetrækningshændelser. (C - D) *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, ns (ikke signifikant, p > 0,05) som detekteres ved ikke-parametriske Mann-Whitney tests. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: En repræsentativ kymograph og kurvetilpasningsresultatet. En kymograph udvundet fra en spredende celle. Den blå stiplede linje svarer til afstanden mellem cellekanten i forhold til den første ramme. Den røde faste linje svarer til den monterede kurve. For at øge tilliden til kurvetilpasningen blev de rå datapunkter først udjævnet af et Savitzky-Golay-filter. Efter kurvetilpasningen blev parameteren c fra den logistiske ligning brugt til at identificere plateaupunktet. Det rå datapunkt tættest på c er angivet som plateaupunktet. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende filer. Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den beskrevne cellespredningsanalyse giver mulighed for kontinuerlig sporing af morfologiske ændringer(f.eks. cellestørrelse og -form) og cellekantbevægelser(dvs. fremspringshastighed og tilbagetrækningsfrekvens), som er funktioner, der mangler i de fleste cellespredningsprotokoller19,24. Mens almindeligt anvendte endepunkt celle sprede assays giver mulighed for bestemmelse af cellespredning hastighed, disse assays undlader at løse den tidsmæssige dynamik celle kant bevægelser. Manglen på tidsmæssige oplysninger begrænser evnen til at opdage og kvantificere ændringer i lamellipodial fremspring-tilbagetrækning cyklusser.

Vores billedbehandlings- og analysesoftware udfører en strømlinet analyse af spredningscellerne, fra cellesegmentering til datakvantificering. Manuelle billedanalyser af cellespredning involverer normalt et partisk valg af en tærskelværdi eller anvendelse af en automatiseret segmenteringsalgoritme, som ikke er egnet til eksperimenter med høj overførselshastighed, hvor mange billeder skal analyseres. Vores software er derfor designet til at detektere og segmentere sprede celler på en automatiseret måde, ud over at kvantificere fremspringsdynamik og morfologiske deskriptorer. Sammen gør disse funktioner den beskrevne protokol modtagelig for screeninger af signaleringsveje og molekylære spillere, der regulerer lamellipodia.

For at sikre, at analysen af spredning af celler er robust og præcis, skal et par kritiske trin i protokollen udføres med ekstra forsigtighed. Det første trin i cellespredningsanalysen omfatter plating fluorescerende-mærkede celler ved en meget lav densitet på en fibronectin-coated coverslip dagen før billeddannelse (Figur 1A-D). Disse polariserede celler muliggør præcis fokusering af spredningscellernes fremspringende kanter under billederhvervelsen. Hvis tætheden af polariserede celler er for høj, har spredning af celler stor chance for at lande på eller overlappe med de polariserede celler, hvilket kan føre til en cellesegmenteringsfejl. Gendannelsesperioden efter trypsinisering er endnu et kritisk trin i denne protokol. Celler, der behandles med det stof af interesse, f.eks DMSO eller CK-666, er løsrevet fra cellekultur parabol ved trypsin-EDTA (Trin 2), efterfulgt af en restitutionsperiode på 45 minutter (Figur 1E). Dette genopretningstrin gør det muligt for celler at komme sig efter den proteolytiske kavalergang af celleoverfladeproteiner ved trypsin19,24 og synkroniserer starten af cellespredning ( Figur2). Hvis restitutionstrinnet udelades, øges celle-til-cellevariationen i cellespredningsområdet, hvilket reducerer konsistensen af den biologiske fænotype.

Under billedopsamlingen reducerer enhver prøvedrift uundgåeligt kvaliteten og præcisionen af cellespredningsanalysen, især kymographanalysen. For at minimere prøvedriften bør der træffes nogle få foranstaltninger. For det første skal brugeren optimere scenebevægelsen under billederhvervelsen. Optimeringen omfatter minimering af scenerejser mellem synsfelter og reduktion af hastigheden af scenebevægelser. For det andet er det vigtigt at fastgøre prøven tæt på mikroskopstadiet. Hvis disse foreslåede foranstaltninger ikke eliminerer stikprøvedrift, bør forarbejdning efter overtagelse overvejes. Blandt mange proprietære og open source-beregningsværktøjer anbefaler vi at bruge fiji-pluginet "Descriptor-based registration" til at rette billedskift og justere film med spredning af celler (instruktioner kan findes på: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)).

Det skal bemærkes, at den kvantitative analyse af celleområder og kantdynamik, der udføres af softwaren, i høj grad afhænger af nøjagtigheden af cellesegmentering. For at sikre præcis segmentering anbefaler vi, at du visualiserer cellespredning ved hjælp af et konfokalt billedsystem, helst et roterende diskkonfokalt mikroskop, der giver høj opløsning, lav fotobleaching/fototoksicitet og højt signal-til-støj-forhold. Et konfokalt mikroskop fjerner effektivt fluorescens, der udsendes af spredningscellerne, hvilket ellers ville reducere billedsegmenteringsnøjagtigheden og cellegrænsesporingen. Hvis der anvendes et widefield-mikroskop til billederhvervelse, kan yderligere efterbehandling efter erhvervelse, f.eks. Derfor bør valget af billeddannelsessystemet overvejes.

Inden for den beskrevne software blev to billedsegmenteringsalgoritmer implementeret og optimeret til pålideligt at registrere celler mærket med svagt til moderat lyse fluorescerende proteiner, såsom cytosolgrønne og røde fluorescerende proteiner (GFP og RFP)26,27. Disse segmenteringsalgoritmer har imidlertid et begrænset dynamisk område og er ikke egnede til at detektere celler mærket med ekstremt lyse fluorescerende proteiner eller farvestoffer. I vores hænder har disse algoritmer en tendens til at undersegmentere ekstremt lyse celler på grund af billedets histogrammets skævhed mod højintensive pixels. For lyse prøver kan billedernes intensitet styres ved at justere eksponeringstiden eller udgangseffekten af excitationslaseren.

Med disse overvejelser i tankerne, denne live-celle spredning protokol er et robust og kraftfuldt værktøj til at studere dynamikken i lamellipodia. Den automatiserede billedanalyseplatform er velegnet til mange biologiske undersøgelser, f.eks. screening med højt indhold af molekylære/signalfaktorer, der regulerer lamellipodiale fremspring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskud RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund og University of Toronto XSeed Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, (11), 6181-6186 (1998).
  2. Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5, (11), 317 (2007).
  3. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71, (6), 3030-3045 (1996).
  4. Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84, (3), 1591-1605 (2003).
  5. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112, (4), 453-465 (2003).
  6. Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148, (5), 973-987 (2012).
  7. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  8. Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168, (4), 619-631 (2005).
  9. Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
  10. Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18, (11), 1253-1259 (2016).
  11. Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116, (3), 431-443 (2004).
  12. Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3, (11), 3735 (2008).
  13. Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197, (2), 239-251 (2012).
  14. Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9, (1), 1688 (2018).
  15. Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133, (7), 239020 (2020).
  16. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13, (4), 371-381 (2011).
  17. Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99, (1), 29-36 (1984).
  18. Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91, (10), 3907-3920 (2006).
  19. Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18, (1), 57-61 (2001).
  20. Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, (8), 2964-2974 (2007).
  21. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86, (3), 1794-1806 (2004).
  22. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (35), 14467-14472 (2011).
  23. Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107, (11), 2508-2514 (2014).
  24. Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
  25. Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100, (2), 221-228 (2000).
  26. Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90, (4), 1439-1452 (2006).
  27. Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25, (7), 741-753 (1977).
  28. Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
Kvantitativ analyse af cellekantdynamik under cellespredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).More

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter