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Biology

सेल स्प्रेडिंग के दौरान सेल एज डायनेमिक्स का मात्रात्मक विश्लेषण

doi: 10.3791/62369 Published: May 22, 2021
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम परख फैलाने वाली कोशिका की प्रायोगिक प्रक्रियाएं प्रस्तुत करते हैं जो लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है। हम फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं के निष्पक्ष विभाजन और कोशिका के प्रसार के दौरान लैमेलिपोडिया गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स कंप्यूटेशनल टूल प्रदान करते हैं।

Abstract

सेल स्प्रेडिंग एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें मीडिया में निलंबित एक सेल एक सब्सट्रेट से जुड़ता है और एक गोल से पतले और फैलाव वाले आकार तक खुद को सपाट कर देता है। सेल-सब्सट्रेट अटैचमेंट के बाद, कोशिका कोशिका शरीर से निकलने वाली लैमेलिपोडिया की एक पतली शीट बनाती है। लैमेलिपोडिया में, गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिन) मोनोमर एक घने फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) मेशवर्क में बहुल हो जाते हैं जो प्लाज्मा झिल्ली के खिलाफ धक्का देता है, जिससे कोशिका को फैलने के लिए आवश्यक यांत्रिक बल प्रदान होते हैं। विशेष रूप से, मॉलिक्यूलर प्लेयर्स जो लैमेलिपोडिया में ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन को नियंत्रित करते हैं, सेल माइग्रेशन और एंडोसाइटोसिस जैसी कई अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं।

चूंकि फैलने वाली कोशिकाएं निरंतर लैमेलिपोडिया बनाती हैं जो पूरे सेल परिधि में फैली होती हैं और लगातार जावक का विस्तार करती हैं, इसलिए कोशिका फैलने वाली परखें लैमेलिपोडियाल फलाव के काइनेटिक्स का आकलन करने के लिए एक कुशल उपकरण बन गई हैं। यद्यपि परख फैलाने वाले सेल के कई तकनीकी कार्यान्वयन विकसित किए गए हैं, लेकिन कार्यप्रवाह का विस्तृत विवरण, जिसमें डेटा विश्लेषण के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल और कम्प्यूटेशनल टूल दोनों शामिल होंगे, वर्तमान में कमी है। यहां, हम परख फैलाने वाले सेल की प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं और प्रसार के दौरान सेल एज गतिशीलता के मात्रात्मक और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स उपकरण प्रस्तुत करते हैं। जब औषधीय जोड़तोड़ और/या जीन-मुंह बंद करने की तकनीकों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल लमेलियोपियल फलाव को विनियमित करने वाले आणविक खिलाड़ियों की एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए उत्तरदायी है ।

Introduction

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लैमेलिपोडियल प्रोट्रूस माइग्रेट सेल के सामने बनने वाली प्रमुख साइटोस्केलेल संरचनाएं हैं। लैमेलिपोडिया में, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स और फॉर्मिन की सहायता से ऐक्टिन का बहुलीकरण एक तेजी से बढ़ते ब्रांच्ड ऐक्टिन मेशवर्क बनाता है जो प्लाज्मा झिल्ली1,2के खिलाफ धक्का देता है। ऐक्टिन मेशवर्क द्वारा उत्पन्न बल शारीरिक रूप से कोशिका को आगे बढ़ाता है1,3,4,5. एआरपी2/3 परिसर की कमी या लैमेलियोपियल फलाव के लिए आवश्यक सिग्नलिंग रास्तों में व्यवधान अक्सर सेल माइग्रेशन 6, 7को ख़राब कर देताहै । यद्यपि लमेलिपोडिया की कमी वाली कोशिकाओं के प्रवास की भी सूचना दी गई है8,9, कोशिका प्रवास में लैमेलिपोडिया का महत्व स्पष्ट है क्योंकि इस फलावरोधी संरचना की कमी से कोशिका की जटिल जैविक माइक्रोएनवायरमेंट्स6,10के माध्यम से स्थानांतरित करने की क्षमता में कमी आती है ।

प्रवास कोशिकाओं में लैमेलिपोडिया के नियमन को समझने में एक बड़ी बाधा लैमेलियोपियल प्रोट्रूजेशन काइनेटिक्स, आकार और आकार11, 12,13,14में प्राकृतिक परिवर्तनशीलता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि लैमेलिपोडिया जटिल फलाव व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, जिसमें उतार-चढ़ाव, आवधिक और फलाव14, 15में तेजीशामिलहै। कोशिकाओं के प्रसार के दौरान बनने वाली प्रवासी कोशिकाओं के अत्यधिक परिवर्तनीय लैमेलिपोडिया की तुलना में6,16 ,लमेलिपोडियाअधिक समानहैं। चूंकि कोशिकाओं के प्रसार और पलायन की फलती गतिविधि समान मैक्रोमॉलिक्यूलर असेंबली द्वारा संचालित होती है, जिसमें एक शाखादार ऐक्टिन नेटवर्क, अनुबंधित एक्टोमायोसिन बंडल, और इंटीग्रिन-आधारित सेल-मैट्रिक्स आसंजन17,18शामिल हैं, इसलिए फैलने वाली कोशिकाओं को लमेलिपोडिया गतिशीलता के नियमन की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।

सेलस्प्रेडिंग एक गतिशील मशीनोकेमिकल प्रक्रिया है जहां निलंबन में एक कोशिका पहले एकीकृत-आधारित आसंजन17, 19,20 के माध्यम से एक सब्सट्रेट का पालन करती है और फिर ऐक्टिन आधारित फलाव21, 22,23का विस्तार करके फैलती है। प्रसार चरण के दौरान, कोशिका शरीर से निकलने वाले लैमेलिपोडिया इसोट्रॉपिक रूप से और लगातार थोड़ा-थोड़ा करके कोई रिऐक्शन या12को ठप नहीं करते हैं। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले सेल प्रसार प्रोटोकॉल एंडपॉइंट्स परखते हैं, जहां19,24चढ़ाना के बाद विभिन्न समयों पर फैलने वाली कोशिकाओं को तय किया जाता है। ये परख, हालांकि त्वरित और सरल, लैमेलिपोडिया की गतिशील विशेषताओं में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उनकी नैदानिक शक्ति में सीमित हैं। लमेलिपोडिया गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों को निर्धारित करने के लिए, शीट्ज़ समूह ने लाइव स्प्रेडिंग कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के उपयोग का बीड़ा उठाया औरसेल एज प्रोट्रूस11, 12,22के कई मौलिक गुणों का पर्दाफाश किया। इन अध्ययनों से पता चला है कि परख फैलाने वाली लाइव-सेल एक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला के टूलबॉक्स में एक मजबूत और शक्तिशाली तकनीक है। इसके बावजूद, एक लाइव-सेल प्रसार परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और ओपन-सोर्स कंप्यूटेशनल टूल वर्तमान में सेल जीव विज्ञान समुदाय के लिए अनुपलब्ध हैं। इस उद्देश्य के लिए, हमारा प्रोटोकॉल इमेजिंग लाइव स्प्रेडिंग कोशिकाओं की प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है और एक स्वचालित छवि विश्लेषण उपकरण प्रदान करता है। इस विधि को मान्य करने के लिए, हमने एक प्रयोगात्मक उपचार के रूप में Arp2/3 निषेध का उपयोग किया और दिखाया कि Arp2/3 परिसर के कार्य को बाधित करने से कोशिका के प्रसार को गिरफ्तार नहीं किया गया, बल्कि सेल प्रोट्रूशन गति में उल्लेखनीय कमी आई, साथ ही सेल किनारे के फलाव की स्थिरता, दांतेदार सेल किनारों को जन्म दे रही है। ये डेटा प्रदर्शित करता है कि लाइव-सेल इमेजिंग और स्वचालित छवि विश्लेषण का संयोजन सेल एज गतिशीलता का विश्लेषण करने और आणविक घटकों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है जो लैमेलिपोडिया को विनियमित करता है।

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Protocol

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1. सेल सीडिंग

नोट: वर्णित सेल स्प्रेडिंग प्रोटोकॉल माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) का उपयोग करके किया गया था, जिसमें पीएच-एकेटी-जीएफपी (पीआईपी 3/पीआई (3,4) पी2के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर) व्यक्त किया गया था। इस सेल लाइन को CRISPR-मध्यस्थता जीन संपादन द्वारा पीएच-एक्ट-जीएफपी (ऐडजीन #21218) के लिए एक अभिव्यक्ति निर्माण को जनमानस द्वारा उत्पन्न किया गया था। हालांकि, अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर जो जीनोम में क्षणिक रूप से व्यक्त किए जाते हैं या एकीकृत होते हैं, उनका उपयोग इस परख में भी किया जा सकता है। इष्टतम छवि विभाजन के लिए, हम फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो साइटोप्लाज्म में समान रूप से वितरित किए जाते हैं, उदाहरण के लिए, साइटोसोलिक जीएफपी।

  1. संस्कृति 90% संकुचन के लिए कोशिकाओं की एक 10 सेमी पकवान।
  2. एक बार कोशिकाओं को उचित सम्म्धता प्राप्त हो जाने के बाद, 35 मिमी सेल कल्चर डिश में 22 मिमी x 22 मिमी कवरलिप (#1.5; 0.17 मिमी मोटाई) रखें। 2.5 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में पतला किया गया है कि फाइब्रोनेक्टिन के 400 माइक्रोनिल के साथ कवरस्लिप कोट।
    नोट: परख के लिए आवश्यक कवरस्लिप की संख्या प्रायोगिक स्थितियों और तकनीकी प्रतिकृति की संख्या से निर्धारित होती है।
  3. 35 एमएम डिश को फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड कवरलिप के साथ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर को1 घंटे के लिए रखें।
  4. इनक्यूबेटर से कवरलिप के साथ डिश निकालें। फाइब्रोनेक्टिन को एस्पिरेट करें और दो से तीन बार कवरस्लिप के चारों ओर धीरे-धीरे पाइपिंग करके पीबीएस के साथ कवरस्लिप को धोएं।
  5. कोशिकाओं के 10 सेमी पकवान से सेल संस्कृति मीडिया आकांक्षी और PBS के साथ पकवान धोने।
  6. कोशिकाओं के 90% कन्फ्लूंट डिश में 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 650 माइक्रोन जोड़ें, एंजाइम को समान रूप से वितरित करने के लिए पकवान को झुकाएं। 1 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में ट्रिप्पसिन के साथ पकवान रखें।
  7. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ पकवान निकालें। सेल कल्चर मीडिया के 10 एमएल को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में जोड़ें। ट्रिपसिन को बुझाने के लिए जल्दी से डिश में मीडिया का एक और 10 एमएल जोड़ें।
  8. कोशिकाओं को पतला करने के लिए ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में पिपेट 1 एमसीएन। मीडिया के भीतर कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब की सामग्री को ऊपर और नीचे पिपेट करें। उच्च एकत्रीकरण प्रवृत्ति वाले सेल प्रकारों के लिए, सेल छीरण (100 माइक्रोन जाल आकार) के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है ताकि सेल झुरमुट की घटना को कम किया जा सके।
  9. ट्यूब से, 35 मिमी डिश में पतला कोशिकाओं के पिपेट 500 - 1000 माइक्रोन कवरस्लिप युक्त होते हैं।
  10. धीरे से कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने के लिए पकवान हिला। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप ~ 10% संकुचन (~ 50,000 कोशिकाओं/एमएल) पर है और आवश्यकतानुसार पतला कोशिकाओं की मात्रा को समायोजित करें।
    नोट: इस तरह के कम उदारता पर कोशिकाओं होने का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि देखने के प्रत्येक क्षेत्र में 1-2 ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं जिनका उपयोग अधिग्रहण के प्रसार वाले सेल में उद्देश्य को केंद्रित करने के लिए किया जाएगा।
  11. उपचार की स्थिति के अनुसार एक 6 सेमी पकवान में 10 सेमी डिश में शेष कोशिकाओं के मार्ग 1/5 । रात भर इनक्यूबेटर में कवरस्लिप के साथ पारित व्यंजन और 35 मिमी पकवान रखें।
    नोट: ये कोशिकाओं है कि गतिशीलता के प्रसार के लिए विश्लेषण किया जाएगा होगा ।

2. ड्रग इनक्यूबेशन और सेल रिकवरी

  1. दो 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में से प्रत्येक में सेल कल्चर मीडिया के 5 एमएल और दो 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में से प्रत्येक में फिनॉल रेड फ्री डीएमईएम के 20 एमएल जोड़ें।
    नोट: ट्यूब जोड़े (15 एमएल + 50 एमएल) की संख्या प्रायोगिक स्थितियों की संख्या के अनुरूप होनी चाहिए।
  2. कोशिका के प्रसार के लिए Arp2/3 के महत्व का परीक्षण करने के लिए, पिपेट या तो Arp2/3, CK-666, या नियंत्रण उपचार, जैसे DMSO के फार्माकोलॉजिकल अवरोधक, अपकेंद्रित्र ट्यूबों की प्रत्येक जोड़ी में वांछित एकाग्रता तक ।
  3. इनक्यूबेटर से 6 सेमी व्यंजन (चरण 1.11 देखें) निकालें और मीडिया को एस्पिरेट करें। गर्म पीबीएस के साथ व्यंजन धोएं।
  4. सीके-666- या डीएमएसओ-पूरक 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब की सामग्री को प्रत्येक अंश वाले व्यंजनों में जोड़ें। सही दवा उपचार के साथ प्रत्येक पकवान लेबल और एक घंटे के लिए इनक्यूबेटर में व्यंजन जगह है।
  5. इनक्यूबेटर से व्यंजन निकालें और मीडिया को एस्पिरेट करें। शेष सभी फिनोल लाल मीडिया को अच्छी तरह से हटाने के लिए गर्म पीबीएस के साथ व्यंजन धोएं।
  6. प्रत्येक 6 सेमी डिश और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं में 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 230 माइक्रोल जोड़ें।
    नोट: यदि लागू हो, तो ट्राइप्सिन को गैर-प्रोटियोलिटिक सेल आसंजन अवरोधक द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  7. इनक्यूबेटर से व्यंजन निकालें। प्रत्येक उपचार के लिए, "ट्यूब बी" के रूप में नामित 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में दवा-पूरक फिनॉल रेड फ्री डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें। ट्राइप्सिन को बुझाने के लिए संबंधित डिश में एक ही मीडिया का अतिरिक्त 5 एमएल जोड़ें। पकवान की सामग्री को "ट्यूब ए" के रूप में नामित 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. प्रत्येक उपचार के लिए ट्यूब ए से ट्यूब बी में कोशिकाओं के 1 एमएल स्थानांतरित करें।
  9. कोशिकाओं को ट्राइसाइनाइजेशन से उबरने की अनुमति देने के लिए 45 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में ट्यूब ए और बी रखें। सीओ 2 पेनेट्रेंस के लिए अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर में रखने से पहले अपकेंद्रित्र ट्यूबों की टोपी कोथोड़ा ढीला करें।
    नोट: वसूली समय की अवधि विभिन्न सेल प्रकारों के लिए भिन्न हो सकती है। हालांकि हमारे प्रयोगों में ४५ मिनट लंबी वसूली सेल व्यवहार्यता पर एक नगण्य प्रभाव पड़ा, कुछ सेल प्रकार anoikis से गुजरना जब बहुत लंबे समय के लिए निलंबन में बनाए रखा हो सकता है । इसलिए, हम अनुभवजन्य रूप से इष्टतम वसूली समय निर्धारित करने की सलाह देते हैं। इष्टतम वसूली समय तेजी से और समकालिक कोशिका नमूना में कोई मृत या apoptotic कोशिकाओं के साथ फैल सक्षम बनाता है ।

3. मैग्नेटिक चैंबर तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि 1 वेल चमलाइड सेल मैग्नेटिक चैंबर के सभी हिस्सों को उपयोग से पहले 22 मिमी x 22 मिमी वर्ग कवरस्लिप को समायोजित किया जा सकता है।
  2. इनक्यूबेटर से कवरस्लिप (चरण 1.11 देखें) के साथ 35 मिमी पकवान निकालें। सेल कल्चर मीडिया को एस्पिरेट करें और कवरस्लिप को गर्म पीबीएस से धोएं।
  3. 35 मिमी डिश से कवरस्लिप को संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके निकालें और धीरे-धीरे चुंबकीय कक्ष की निचली प्लेट पर कवरस्लिप रखें।
  4. सिलिकॉन गैसकेट को कवरस्लिप के शीर्ष पर रखें।
    नोट: एक अनुचित रूप से रखा सिलिकॉन गैसकेट एक टपका हुआ चुंबकीय कक्ष का सबसे आम कारण है । सुनिश्चित करें कि गैसकेट नीचे की प्लेट के मांगपत्र में टिकी हुई है और मांगपत्र से आगे नहीं बढ़ती है।
  5. मुख्य शरीर को नीचे की प्लेट पर संलग्न करें।
    नोट: इस हिस्से को बहुत धीरे से करें। एक अच्छा टिप मुख्य शरीर को शीर्ष पर रखते हुए एक हाथ से नीचे की प्लेट को पकड़ना है। यह सुनिश्चित करता है कि मुख्य शरीर के चुंबक नीचे की प्लेट को ऊपर नहीं उठाते हैं, जो संभावित रूप से कवरस्लिप को विस्थापित और क्रैक कर सकता है।
  6. चुंबकीय कक्ष में दवा-पूरक फिनॉल लाल मुक्त डीएमईएम के 1 मिलीएल जोड़ें। एक लिंट मुक्त ऊतक लें और किसी भी लीक की जांच करने के लिए मुख्य शरीर और नीचे की प्लेट के बीच बाड़े को ध्यान से थपका करें।
    नोट: यदि रिसाव होता है, तो जल्दी से मीडिया को एस्पिरेट करें और चरण 3.4 से फिर से आगे बढ़ें।
  7. चुंबकीय कक्ष को संलग्न करने के लिए मुख्य शरीर पर पारदर्शी कवर कम करें।
  8. पानी के साथ पहले एक प्रयोगशाला ऊतक स्प्रे और चुंबकीय कक्ष के नीचे पोंछ (कवरस्लिप, नहीं धातु हिस्सा) । बाद में, 70% इथेनॉल की थोड़ी मात्रा के साथ एक दूसरी प्रयोगशाला ऊतक स्प्रे करें और पोंछ लें, कवरस्लिप को क्रैक न करने के लिए सावधान रहें।

4. छवि अधिग्रहण

  1. स्टेज टॉप इनक्यूबेटर और ऑब्जेक्टिव हीटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें और स्टेज टॉप इनक्यूबेटर में सीओ2 लेवल को 5% तक सेट करें।
    नोट: यदि चरण शीर्ष इनक्यूबेटर सीओ2 आपूर्ति से जुड़ा नहीं है, तो सेल कल्चर मीडिया को निरंतर पीएच 7.4 बनाए रखने के लिए 25 एमएम एचईपी के साथ पूरक किया जाना चाहिए।
  2. पूर्व गर्म 60X, 1.4 एनए तेल उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल की एक पर्याप्त मात्रा में लागू करें।
    नोट: हम देखने के अपने काफी बड़े क्षेत्र और उत्कृष्ट प्रकाश संग्रह दक्षता की वजह से इस प्रोटोकॉल में एक 60X, 1.4 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें । यदि देखने के एक बड़े क्षेत्र की आवश्यकता है, तो कम आवर्धन उद्देश्य(जैसे,20x) का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक छवियों का सिग्नल-टू-शोर अनुपात 2.5 से अधिक है।
  3. कन्फोकल माइक्रोस्कोप में पूरा चुंबकीय कक्ष और ट्यूब बी (चरण 2.9) दोनों लाएं। चुंबकीय कक्ष को स्टेज टॉप इनक्यूबेटर पर रखें।
    नोट: विसर्जन तेल में बुलबुले बनाने से बचने के लिए चुंबकीय कक्ष को धीरे-धीरे मंच पर रखें।
  4. जीएफपी चैनल का उपयोग करके फ्लोरोसेंट कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें। सुनिश्चित करें कि सेल किनारे तेज और अच्छी तरह से परिभाषित है।
  5. चुंबकीय कक्ष के पारदर्शी कवर को हटा दें और ट्यूब बी से 500 माइक्रोन को चुंबकीय कक्ष में हटा दें। पारदर्शी कवर को चुंबकीय कक्ष के शीर्ष पर वापस रखें।
  6. कोशिका प्रसार विश्लेषण के लिए आदर्श कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, उन कोशिकाओं के "प्रभामंडल" की खोज करें जो अभी तक कवरस्लिप से जुड़ती हैं लेकिन अब चारों ओर नहीं लुढ़कती हैं। कवरलिप लगाव के शुरुआती चरणों में हैं कि कोशिकाओं को भी महान उंमीदवार हैं, लेकिन छवि अधिग्रहण तेजी से करने के लिए प्रसार पर कब्जा करने के लिए होना चाहिए ।
  7. ग्रीन चैनल के लिए समय-चूक छवि अधिग्रहण को 6 सेकंड के अंतराल पर चित्रित करने के लिए चार फ़ील्ड शामिल करने के लिए कॉन्फ़िगर करें।
    नोट: विभिन्न सेल प्रकारों के बीच लैमेलिपोडिया प्रोट्रूसेशन वेग की उच्च परिवर्तनशीलता के कारण, इष्टतम फ्रेम दर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। हमारे प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले 6 सेकंड का इमेजिंग अंतराल कई मेसेंचिमल और एपिथेलियल कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। हालांकि, कोशिकाएं जो बहुत जल्दी फैलतीहैं (जैसे,प्रतिरक्षा कोशिकाएं) को बहुत अधिक फ्रेम दर (छोटे इमेजिंग अंतराल) की आवश्यकता हो सकती है। सेल प्रसार वाली फिल्मों के लिए इष्टतम फ्रेम दर बाद के फ्रेमों के बीच फैला हुआ सेल एज का 2-5 पिक्सल विस्थापन सुनिश्चित करती है। कोशिका के प्रसार के पठार की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली वक्र फिटिंग की सटीकता को ध्यान में रखते हुए, इष्टतम फ्रेम दर को सेल प्रसार के तेजी से विस्तार चरण के दौरान सेल एज विस्थापन के 50-100 माप भी सुनिश्चित करना चाहिए। देखने के क्षेत्रों की संख्या जोखिम समय, अधिग्रहण अंक के बीच की दूरी, और मंच आंदोलन की गति के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए । उपयोगकर्ताओं को सलाह दी जाती है कि वे उन दृश्यों की अधिकतम संख्या निर्धारित करें जो वांछित फ्रेम दर के साथ प्राप्त कर सकते हैं।
  8. देखने के एक उपयुक्त क्षेत्र की पहचान करने के बाद, माइक्रोस्कोप चरण के एक्स और वाई निर्देशांक को बचाएं। देखने के तीन अन्य क्षेत्रों की पहचान करने के साथ आगे बढ़ें जो कवरस्लिप पर अपेक्षाकृत एक दूसरे के करीब हैं। देखने के हर वांछित क्षेत्र के लिए माइक्रोस्कोप चरण के निर्देशांक सहेजें।
    नोट: किसी भी अनावश्यक नमूना आंदोलन को कम करने के लिए देखने के क्षेत्रों के बीच चरण आंदोलन पथ को अनुकूलित करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। इस तरह के अनुकूलन या तो मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से किया जा सकता है। अत्यधिक नमूना आंदोलन अधिग्रहण को धीमा कर देता है और कोशिकाओं को देखने से बाहर रोल के रूप में वे उतरते है कारण हो सकता है ।
  9. 6 सेकंड फ्रेम दर पर 15 मिनट के लिए छवियों का अधिग्रहण करें और फ़ाइलों को सहेजें। यदि अधिक अधिग्रहण की आवश्यकता है, तो चरण 4.6 से शुरू होकर दोहराएं।

5. सेल प्रसार के दौरान सेल क्षेत्र, परिपत्रता और फलाव गतिशीलता का विश्लेषण

  1. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए छवियां तैयार करें
    नोट: सॉफ्टवेयर को .tiff प्रारूप में एक छवि और इनपुट मापदंडों के रूप में पिक्सेल आकार की आवश्यकता होती है। दोनों आवश्यकताओं को अधिग्रहण सॉफ्टवेयर या फिजी (इस प्रोटोकॉल में) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। यदि इन आवश्यकताओं को पूरा कर रहे हैं, 5.2 कदम करने के लिए आगे बढ़ें।
    1. फिजी एप्लिकेशन (https://imagej.net/Fiji/Downloads) का नवीनतम संस्करण स्थापित करें।
    2. फिजी का उपयोग करके एक समय-चूक छवि खोलें।
    3. इमेज > प्रॉपर्टीजका चयन करके इमेज के पिक्सेल साइज को कॉपी करें । पिक्सेल साइज को नोटपैड/वर्ड में कॉपी और पेस्ट करें ।
    4. सेल स्प्रेड एरिया और सर्कुलरिटी के विश्लेषण के लिए, एक झगड़ा छवि स्टैक के रूप में समय-चूक छवि को बचाएं। कस्टम-बिल्ड विश्लेषण सॉफ्टवेयर मालिकाना फ़ाइल प्रारूपों का समर्थन नहीं करता है। फ़ाइल > सेव > झगड़ा का चयन करके व्यक्तिगत सेल झगड़ा छवि ढेर सहेजें
  2. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए पायथन आईडीई (स्पाइडर) और आवश्यक पैकेज(PySimpleGUI और टिफफाइल)स्थापित करें।
    नोट: पायथन और पैकेज की स्थापना केवल प्रारंभिक सेटअप के लिए आवश्यक है।
    1. कस्टम-बिल्ड पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग करके स्पाइडर आईडीई में समय-चूक फिल्मों का विश्लेषण किया जाएगा। स्पाइडर आईडीई डाउनलोड करने के लिए, एनाकोंडा वितरक (https://www.anaconda.com/products/individual) डाउनलोड करें जिसमें स्पाइडर आईडीई और इस विश्लेषण के लिए अधिकांश आवश्यक पुस्तकालय और पैकेज शामिल हैं।
    2. एनाकोंडा स्थापित करें और एनाकोंडा नेविगेटर के माध्यम से स्पाइडर लॉन्च करें।
    3. IPython कंसोल टैब (स्पाइडर के निचले दाहिने खंड में स्थित) में, निम्नलिखित कमांड को कॉपी और पेस्ट करें: पिप PySimpleGUI स्थापित करें और एंटर कुंजी दबाएं। इस कमांड को चलाने से ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) शुरू करने के लिए आवश्यक पैकेज स्थापित होगा।
    4. एक ही कंसोल में, निम्नलिखित कमांड को कॉपी करें और पेस्ट करें: पिप टिफफाइल स्थापित करें और एंटर कुंजी दबाएं। इस आदेश को चलाने से छवियों को झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजने के लिए आवश्यक पैकेज स्थापित होगा।
    5. पूरक फ़ाइलों से सभी पायथन स्क्रिप्ट या गिटहब से सबसे अपडेटेड स्क्रिप्ट: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. सेल प्रसार के दौरान सेल क्षेत्र और सेल आकार कारकों की मात्रा निर्धारित करें
    1. स्पायडर के शीर्ष पैनल में खुली फ़ाइल विकल्प का चयन करके या शॉर्टकट सीटीआरएल + ओ का उपयोग करके मुख्य विश्लेषण स्क्रिप्ट "cell_spreading_GUI.py" खोलें।
    2. शीर्ष पैनल में "रन फाइल" का चयन करके या शॉर्टकट F5 का उपयोग करके विश्लेषण जीयूआई फैलाने वाली सेल खोलें।
    3. सेल स्प्रेड एरिया टैब(चित्रा 3A)पर क्लिक करें ।
    4. ब्राउज़ बटन का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए झगड़ा छवि का चयन करें।
      नोट: चयनित फ़ाइल एक झगड़ा फ़ाइल होना चाहिए।
    5. गंतव्य निर्देशिका को निर्दिष्ट करें जहां डेटा आउटपुट (जैसे, सेल मास्क, मान) सहेजे जाएंगे।
    6. डेटा आउटपुट सेटिंग निर्दिष्ट करें:
      1. मास्क बचाएं: विभाजन प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न सेल मास्क को बचाएं।
      2. निर्यात डेटा: एक एक्सेल स्प्रेडशीट (.xlsx) निर्यात करें जिसमें गंतव्य फ़ोल्डर के लिए सभी विश्लेषण डेटा शामिल हैं।
        डेस्टिनेशन फोल्डर में एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में सभी स्प्रेडिंग सेल्स का सेल एरिया, सर्कुलरिटी और आस्पेक्ट रेशियो बचाया जाएगा। सेल क्षेत्र की गणना के रूप में किया जाता है:
        Equation 1 
        सेल सर्कुलरिटी एक पैमाना है कि एक सेल पूरी तरह से गोल सेल के कितने करीब है। इसकी गणना इस प्रकार की जाती है:
        Equation 2 
        जहां ए और पी क्रमशः सेल क्षेत्र और सेल परिधि हैं। कोशिका का आस्पेक्ट रेशियो यह दर्शाता है कि कोशिका कितनी लम्बी है। एक स्प्रेडिंग सेल में 1 के करीब आस्पेक्ट रेशियो होना चाहिए। आस्पेक्ट रेशियो की गणना की जाती है:
        Equation 3 
      3. आकृति को सहेजें: गंतव्य फ़ोल्डर में सेल सीमा समोच्च ओवरले छवियों को सहेजें।
    7. सेगमेंटेशन सेटिंग को निर्दिष्ट करें
      1. दिखावा विभाजन: विश्लेषण प्रक्रिया के दौरान स्पाइडर कंसोल में विभाजन परिणाम दिखाएं।
      2. सबसे छोटा सेल क्षेत्र (μm2):लगाव के शुरुआती चरणों में कोशिकाओं के क्षेत्र मूल्यों सहित सेल क्षेत्र के लिए न्यूनतम मूल्य दर्ज करें। इस सीमा से छोटे क्षेत्र वाली वस्तुओं को कोशिकाओं को फैलाने के रूप में नहीं माना जाएगा। यह संख्या विभाजन प्रक्रिया को प्रभावित करेगी।
    8. छवि मापदंडों को निर्दिष्ट करें।
      1. अधिग्रहण अंतराल (एस): सेकंड में छवि अधिग्रहण की आवृत्ति दर्ज करें।
      2. पिक्सेल आकार (μm): विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करते समय रिकॉर्ड किए गए पिक्सेल आकार को दर्ज करें।
      3. छवि थोड़ी गहराई: कैमरा/डिटेक्टर की थोड़ी गहराई दर्ज करें ।
    9. रन परक्लिक करें । यदि कोई त्रुटि उत्पन्न होती है, तो स्पाइडर के कंसोल में एक त्रुटि संदेश दिखाई देगा। अन्यथा, कंसोल में छवि विश्लेषण प्रक्रिया दिखाई जाएगी।
      नोट: कंसोल/प्लॉट्स सेक्शन (स्पाइडर सेटिंग्स के आधार पर) में दिखाई देने वाली पहली छवि देखने के क्षेत्र में पहचानी गई सभी कोशिकाओं को दिखाती है । कोशिकाओं के चारों ओर रखे गए हरे बक्से कोशिकाओं को फैलाने का संकेत देते हैं जो विभाजन और विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। ग्रे बॉक्स उन कोशिकाओं को इंगित करते हैं जो विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। पहचान की गई फैलने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या भी कंसोल टैब में दिखाई देगी । सॉफ्टवेयर समय के एक समारोह के रूप में सेल क्षेत्र (नीले रंग में) और सेल परिपत्रता (लाल रंग में) भूखंडों । ये रेखांकन उपयोगकर्ताओं को सेल विभाजन की सटीकता का मूल्यांकन करने की अनुमति देते हैं। एक सफल विभाजन सेल क्षेत्र के लिए एक एक एकरसता रूप से बढ़ते वक्र की पैदावार करता है। सेल स्प्रेड क्षेत्र के प्रतिनिधि वक्र प्राप्त करने के लिए, लैग चरण को मैन्युअल रूप से ग्राफ से हटा दिया जाना चाहिए। सेल फैलने से पहले अंतराल चरण में सेल क्षेत्र के माप शामिल हैं। अंतराल चरण तेजी से उतार-चढ़ाव से इंगित किया जाता है, जैसा कि सेल क्षेत्र भूखंड(चित्रा 3C दाएं) में प्रतिनिधित्व किया गया है।

6. कामोग्राफ का उपयोग कर सेल प्रसार के दौरान सेल एज गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करें

  1. विश्लेषण चलाने से पहले, व्यक्तिगत प्रसार कोशिकाओं की समय श्रृंखला बनाने के लिए कोशिकाओं के प्रसार की कच्ची फिल्मों की फसल ।
    1. फिजी टूल बार में आयत उपकरण का उपयोग मैन्युअल रूप से ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) का चयन करने के लिए करें जो एक एकल कोशिकाको समाहित करता है। (यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरओआई पूरी तरह से फैलने वाली कोशिका को समझाता है, सभी समय बिंदुओं पर आरओआई का निरीक्षण करने के लिए स्क्रॉल फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    2. आरओआई पर सही क्लिक करें और डुप्लिकेटका चयन करें।
    3. डुप्लीकेट स्टैक की जांच करें और ओकेपर क्लिक करें ।
  2. स्पायडर के टूल बार में ओपन फाइल बटन का चयन करके या शॉर्टकट सीटीआरएल + ओ का उपयोग करके मुख्य विश्लेषण स्क्रिप्ट "cell_spreading_GUI.py" खोलें। यदि जीयूआई पहले ही खोला जा चुका है, तो सीधे चरण 6.3 पर जाएं।
  3. शीर्ष पैनल में रन फ़ाइल का चयन करके या शॉर्टकट F5 (चित्रा 3B)का उपयोग करके विश्लेषण जीयूआई फैलाने वाली सेल खोलें।
  4. Kymograph जनरेटर और विश्लेषण टैब पर क्लिक करें ।
  5. विश्लेषण के लिए झगड़ा छवि का चयन करने के लिए ब्राउज़ बटन का उपयोग करें।
    नोट: मालिकाना फ़ाइल प्रारूप, उदाहरण के लिए, nd2, lif, ज़ेन, स्क्रिप्ट द्वारा समर्थित नहीं हैं।
  6. आउटपुट डेटा (सेल मास्क और मान) को बचाने के लिए गंतव्य फ़ोल्डर निर्दिष्ट करें।
  7. आउटपुट सेटिंग्स को निर्दिष्ट करें।
    1. निर्यात डेटा: गंतव्य फ़ोल्डर में एक एक्सेल स्प्रेडशीट (.xlsx) निर्यात करें जिसमें किमोग्राफ की सापेक्ष सेल एज स्थितियां और रिऐक्शन इवेंट शामिल हैं।
  8. छवि मापदंडों को निर्दिष्ट करें:
    1. अधिग्रहण अंतराल (एस): सेकंड में छवि अधिग्रहण आवृत्ति दर्ज करें।
    2. पिक्सेल आकार (μm): चरण 5.1.3 में विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करते समय रिकॉर्ड किए गए पिक्सेल आकार को दर्ज करें।
    3. सबसे छोटा सेल क्षेत्र (μm2):लगाव के शुरुआती चरणों में कोशिकाओं के क्षेत्र मूल्यों सहित सेल क्षेत्र के लिए न्यूनतम मूल्य दर्ज करें। इस सीमा से छोटे क्षेत्र वाली वस्तुओं को कोशिकाओं को फैलाने के रूप में नहीं माना जाएगा। यह संख्या विभाजन प्रक्रिया को प्रभावित करेगी।
    4. छवि थोड़ी गहराई: कैमरा/डिटेक्टर की थोड़ी गहराई दर्ज करें ।
  9. रन परक्लिक करें । यदि कोई त्रुटि उत्पन्न होती है, तो स्पाइडर के कंसोल में एक त्रुटि संदेश दिखाई देगा। अन्यथा, कंसोल में फलाव गतिशीलता मात्रा का सारांश दिखाया जाएगा। रिऐक्शन फ्रीक्वेंसी और प्रोट्रूशन स्पीड मेजरमेंट के 4 जोड़े होंगे, जो सेल के ऊपर, नीचे, बाएं और दाएं हिस्सों से जेनरेट किए गए 4 केमोग्राफ से निकाले जाते हैं। रिऐक्शन फ्रीक्वेंसी की गणना की जाती है:
    Equation 4 
    नोट: यह संख्या दर्शाती है कि लमेलोपियम फैलने के दौरान कितनी बार वापस लेता है। औसत फलाव गति को प्रोट्रूशन की शुरुआत और कायनोग्राफ पर पठार बिंदु के बीच ढलान से मापा जाता है। सेगमेंटेशन के बाद कंसोल में सारांश कायनाग्राफ फिगर दिखाया जाएगा। सारांश आंकड़ा बचाने के लिए, सही आंकड़ा पर क्लिक करें और छवि को बचाने के लिए।

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Representative Results

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उपरोक्त प्रोटोकॉल कोशिकाओं के प्रसार के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं और कोशिका प्रसार गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक कम्प्यूटेशनल उपकरण का वर्णन करता है। कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग कम या उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में किया जा सकता है ताकि सेल लीडिंग एज पर ऐक्टिन बहुलीकरण मशीनरी को विनियमित करने वाले आणविक खिलाड़ियों की पहचान की जा सके।

प्रायोगिक प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दर्शाया गया है । परख फैलाने वाली कोशिका को अमर माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट पर किया गया था, जो ईजीएफपी25के साथ टैग किए गए अकेट प्रोटीन किनेज़ के प्लेकस्ट्रिन होमोलॉजी (पीएच) डोमेन को स्थिर रूप से व्यक्त करते थे। कोशिकाओं को ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ अलग किया गया था और ४५ मिनट के लिए निलंबन में ठीक होने की अनुमति दी गई थी । वसूली चरण के दौरान, कोशिकाओं ने प्लाज्मा झिल्ली पर अपने इंटीग्रीन रिसेप्टर्स की भरपाई की, जैसा कि बरामद कोशिकाओं के तेज और समकालिक लगाव से फाइब्रोनेक्टिन कोटेड कवरस्लिप(चित्रा 2)को संकेत दिया गया है। वसूली अवधि के बिना, फैलने वाली कोशिकाओं ने कोशिका के आकार का एक व्यापक वितरण प्रदर्शित किया जो कोशिका के प्रसार(चित्र 2 ए और बी)की शुरुआत में उच्च परिवर्तनशीलता का संकेत देता है। इसके बाद, कोशिकाओं को एक प्रत्ययी रूप से चिह्नित कवरस्लिप पर चढ़ाया गया था और उनकी फैलने वाली गतिशीलता को डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1A-H में दिखाए गए योजनाबद्ध) कताई द्वारा कल्पना की गई थी। छवि अधिग्रहण के दौरान, हमने उन क्षेत्रों पर विचार किया जो 2.5 या उससे ऊपर के सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ कोशिकाओं को चित्रित करते हैं। यह एक महत्वपूर्ण विचार था क्योंकि बाद की छवि विभाजन पृष्ठभूमि के सापेक्ष कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता के प्रति संवेदनशील है। हमारे प्रयोगों में, हमने 15 मिनट के लिए हर 6 सेकंड में छवियों का अधिग्रहण किया (चित्रा 1I-Jमें दिखाए गए योजनाबद्ध)। पिछली रिपोर्ट16के साथ समझौते में, 6 सेकंड की फ्रेम दर पर इमेजिंग ने व्यक्तिगत फलाव और रिऐक्शन घटनाओं की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त अस्थायी संकल्प सुनिश्चित किया, जबकि हमें समानांतर में देखने के कई क्षेत्रों को प्राप्त करने की अनुमति दी। कस्टम-बिल्ड पायथन सॉफ्टवेयर(चित्रा 3)का उपयोग करके परिणामी समय-चूक छवियों का विश्लेषण किया गया।

दो अलग-अलग विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का उपयोग करके कोशिका के प्रसार का एक निष्पक्ष मात्राकरण किया गया था:(i)कोशिकाओं के प्रसार की मॉर्फोडायनामिक प्रोफाइलिंग(चित्र 3ए, सी और 4)और(ii)सेल एज डायनामिक्स(चित्रा 3बी और 5)का कामोग्राफ विश्लेषण। मॉर्फोडायनामिक प्रोफाइलिंग द्वारा फैलने वाली कोशिका के विश्लेषण में देखने के क्षेत्र में फैलने वाली और प्रत्ययी कोशिकाओं का स्वचालित पता लगाना(चित्रा 3सी बाएं),इसके बाद फ्रेम-बाय-फ्रेम छवि विभाजन और प्रसार कोशिका सीमा का पता लगाना शामिल है। विभाजन व्यक्तिगत फ्रेम को थ्रेसिंग वैश्विक तीव्रता द्वारा किया जाता है। सीमा मूल्य की गणना स्थानीय न्यूनतम के रूप में की जाती है , जो चित्र हिस्टोग्राम26पर पहली और दूसरी तीव्रता मोड के बीच होती है । एक यूनिमोडल, दाएं-विषम हिस्टोग्राम वाली छवियां त्रिकोण थ्रेसिंग एल्गोरिदम27द्वारा खंडित हैं। सेल सेगमेंटेशन के बाद, फैलने वाली कोशिकाओं(यानी, सेल एरिया, आस्पेक्ट रेशियो और सेल सर्कुलरिटी) की मॉर्फोडायनामिक विशेषताओं की गणना की गई(चित्रा 3 सी राइट)।

प्रकाशित परिणामों के अनुरूप12,28, कोशिका का प्रसार लेमेलिपोडिया के आइसोट्रोपिक विस्तार से प्रेरित था जैसा कि प्रतिनिधि सेल क्षेत्र भूखंड(चित्र 3सी अधिकार, नीली वक्र और एस 1)पर एक सिग्मोइडल आकार द्वारा दर्शाया गया था क्षेत्र की साजिश से पता चला है कि सेल क्षेत्र में एक पठार(चित्रा 4A और बी)तक पहुंचने से पहले लगभग 3 गुना की वृद्धि हुई । कोशिका के प्रसार की प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाएं परिपत्र (परिपत्रता = 0.70 ± 0.076) बनी रहीं और घूंघट जैसे फैलाव वाले सेल किनारों को प्रदर्शित किया गया, जो लैमेलिपोडियल प्रोट्रूस(चित्रा 4 सी)का संकेत हैं।

परख फैलाने वाली कोशिका को मान्य करने के लिए, हमने 1 घंटे और 45 मिनट के लिए 100 माइक्रोन सीके-666 के साथ Arp2/3 को बाधित किया और गतिशीलता फैलाने वाली कोशिका पर इस उपचार के प्रभाव का आकलन किया। पिछलीरिपोर्टों 13के साथ समझौते में, Arp2/3 गतिविधि के दमन के परिणामस्वरूप सेल प्रसार गति(चित्रा 4A और बी, गुलाबी वक्र)में उल्लेखनीय कमी नहीं आई हालांकि, सेल आकार विश्लेषण नियंत्रण और CK-666 इलाज कोशिकाओं की परिपत्रता में एक महत्वपूर्ण अंतर से पता चला (नियंत्रण: 0.70 ± 0.08 बनाम सीके-666: 0.54 ± 0.09, पी < 0. 1 x10-3)(चित्रा 4C)। जबकि नियंत्रण कोशिकाएं पठार तक परिपत्र बनी रहीं, Arp2/3-बाधित कोशिकाओं ने एक बहुभुज आकार हासिल किया जिसे फैलने के दौरान बरकरार रखा गया था(चित्रा 4A)। साथ में, ये प्रायोगिक परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि वर्णित कोशिका फैलने वाली परख से ऐक्टिन बहुलकीकरण मशीनरी के क्षोभ के कारण सेल मॉर्फोडायनामिक्स में मध्यम परिवर्तन का पता चलता है।

जबकि मॉर्फोडायनामिक प्रोफाइलिंग अक्सर कोशिका प्रसार गतिशीलता में सकल परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त होता है, इस विश्लेषण में विशिष्ट साइटोस्केलेल घटकों की पहचान करने की सीमित क्षमता होती है जो कोशिका किनारे के प्रोट्रूशन-रिऐक्शन चक्रों को विनियमित करते हैं, जिससे हमें एक निष्पक्ष कामोग्राफ विश्लेषण उपकरण(चित्रा 5 बाएं, धराशायी रेखाएं)को लागू करने का संकेत देते हैं। सेल एज गति के विश्लेषण से नियंत्रण की तुलना में Arp2/3-बाधित कोशिकाओं की औसत फलाव गति में एक मध्यम लेकिन महत्वपूर्ण कमी का पता चला (नियंत्रण: ३७.१ ± १२.८७ एनएम/s बनाम । CK-666: 28.7 ± 13.4 एनएम/एस, पी = 0. 9 x 10-3)(चित्रा 5C)। इसके अलावा, नियंत्रण के सेल किनारे की गतिशीलता और Arp2/3-बाधित कोशिकाओं उल्लेखनीय अलग थे(चित्रा 5A और डी)। नियंत्रण कोशिकाओं को तेजी से विस्तार चरण है, जो लगभग २०० सेकंड तक चली के दौरान कोई पीछे हटना के साथ लगातार फैला हुआ है, और पठार चरण के दौरान आंतरायिक पीछे हटना प्रदर्शित(चित्रा 5A और डी)। इसके विपरीत, Arp2/3-बाधित कोशिकाओं के विस्तार को रिऐक्शन घटनाओं द्वारा हस्तक्षेप किया गया था, जो रेखांकन(चित्रा 5B और D)पर लाल बिंदुओं द्वारा चिह्नित किया गया था। रिऐक्शन फ्रीक्वेंसी के क्वांटिफिकेशन से पता चला कि Arp2/3-बाधित कोशिकाएं नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में 26% अधिक बार मुकर जाती हैं (नियंत्रण: 0.18 ± 0.22 एस-1 बनाम सीके-666: 0.24 ± 0.19 एस-1,पी = 0.03)(चित्रा 5)। ये आंकड़े लैमेलियोपियल गतिशीलता में हल्के परिवर्तनों का पता लगाने में काइंग्राफ विश्लेषण की उच्च संवेदनशीलता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्र 1:परख फैलाने वाली कोशिका का प्रायोगिक कार्यप्रवाह। (ए - एच)कोशिका की योजनाएं परख फैलाती हैं। (A)पीबीएस में 22 एमएम x 22 एमएम कवरलिप को फाइब्रोनेक्टिन से लेपित किया जाता है जो 2.5 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए होता है । (ख)पीएच-एक्ट-जीएफपी-व्यक्त करने वाले माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) की एक कॉन्फ्लेंट 10 सेमी डिश को पीबीएस से धोया जाता है और ०.०५% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के साथ इलाज किया जाता है । ट्राइप्सिन-उपचारित कोशिकाओं को तब 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब और 6 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में विभाजित किया जाता है, दोनों सेल कल्चर मीडिया युक्त होते हैं। (ग)15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब से, 500-1000 माइक्रोन फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड कवरस्लिप पर पिपेट किया जाता है। (घ)विरल वरीयता प्राप्त कोशिकाओं वाले कवरलिप के साथ 6 सेमी डिश और 35 एमएम डिश को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है। एक बार ध्रुवीकृत होने के बाद, ये कोशिकाएं अधिग्रहण के प्रसार वाले सेल के लिए फोकस का फ्रेम प्रदान करेंगी। (ई)छवि अधिग्रहण से एक घंटे पहले, 6 सेमी डिश के मीडिया को एचईपीईएस और ब्याज की दवा के साथ पूरक फिनोल-रेड मुक्त डीएमईएम के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। 1 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के साथ इलाज किया जाता है और 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (ट्यूब ए) में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें एचईपी/ड्रग-सप्लीमेंटेड फिनोल रेड फ्री डीएमईएम होता है। ट्यूब ए में कोशिकाओं को फिर एक और 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (ट्यूब बी) में पतला किया जाता है, जिसे इनक्यूबेटर में ४५ मिनट के लिए रखा जाता है । (एफ)कोशिकाओं के ठीक होने के रूप में, चुंबकीय कक्ष नीचे से ऊपर तक तैयार किया जाता है: पहले नीचे की प्लेट को एक सपाट सतह पर रखा जाता है, फिर ध्रुवीकृत कोशिकाओं के साथ कवरलिप, सिलिकॉन गैसकेट, कक्ष का मुख्य शरीर, और अंत में पारदर्शी कवर शीर्ष पर रखा जाता है। (जी)दवा के पूरक फिनॉल लाल मुक्त DMEM के 1 मिलीएल चुंबकीय कक्ष में पाइपेट किया जाता है, जो तब माइक्रोस्कोप चरण में लाया जाता है । एक सीएफआई योजना एपीओ लैम्ब्डा 60X तेल उद्देश्य छवि अधिग्रहण के लिए चुना जाता है। (ज)पारदर्शी कवर को हटा दिया जाता है और ट्यूब बी की सामग्री के ५०० माइक्रोन को चुंबकीय कक्ष में पिपेट किया जाता है । (I)छवि अधिग्रहण के लिए, देखने के उपयुक्त क्षेत्रों में हरे रंग के "प्रभामंडल" होंगे, जो निलंबित कोशिकाएं हैं जो अभी तक कवरस्लिप से जुड़ी नहीं हैं। (जम्मू)कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए चित्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2-कोशिका के फैलने पर वसूली के समय का प्रभाव। संकेत समय (प्रोटोकॉल में सेल रिकवरी स्टेप) के लिए निलंबन में बनाए गए कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड कवर्लिप्स पर चढ़ाया गया था, जो 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज्ड था। (A)टॉप पैनल्स: फेज कंट्रास्ट इमेजेज 20X ऑब्जेक्टिव के साथ हासिल की गईं । नीचे पैनल: सेल क्षेत्रों रंग-कोडित के साथ वाटरशेड-सेगमेंट सेल मास्क। (ख)सेल क्षेत्र का मात्राकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) और छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के काम करने वाले सिद्धांत। (A)"सेल स्प्रेड एरिया" टैब का जीयूआई। निर्देशों के लिए चरण 5.3 का उल्लेख करें। (ख)"Kymograph जनरेटर और विश्लेषण" टैब के जीयूआई । निर्देशों के लिए चरण 6 का उल्लेख करें। (ग)सॉफ्टवेयर की इमेज प्रोसेसिंग पाइपलाइन। सॉफ्टवेयर पहले देखने के पूरे क्षेत्र में फैल कोशिकाओं (एक हरे रंग की बाउंडिंग बॉक्स द्वारा लेबल) की पहचान करता है । प्रसार कोशिकाओं की पहचान उनके तीव्रता मूल्य, परिपत्रता और पहलू अनुपात के आधार पर की जाती है। इसके बाद चिन्हित प्रसार कोशिकाओं को वैश्विक तीव्रता सीमा का उपयोग करके फ्रेम-दर-फ्रेम खंडित किया जाता है । प्रत्येक बाइनरी मास्क को मीडियन फ़िल्टरिंग और बाइनरी होल फिलिंग द्वारा संसाधित किया जाता है जिसके बाद सेल एज को चिकना करने के लिए रूपात्मक बंद होता है। लाल रूपरेखा खंडित सेल सीमा से मेल खाती है। सेल का क्षेत्रफल, आस्पेक्ट रेशियो और सर्कुलरिटी बाइनरी सेल मैप से निकाली जाती है। ग्राफ समय के साथ प्रतिनिधि प्रकोष्ठ के क्षेत्र और गोलाकारता को दर्शाता है। कोशिका सीडिंग पर, कोशिकाएं तुरंत फैलना शुरू नहीं करती हैं, जिससे ग्राफ पर देखे गए अंतराल चरण को जन्म मिलता है। अंतराल चरण के बाद, कोशिकाएं तेजी से विस्तार चरण के दौरान तेजी से फैलती हैं और अंततः एक पठार चरण तक पहुंचती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:Arp2/3 निषेध पर सेल स्प्रेड एरिया एनालिसिस के प्रतिनिधि परिणाम।(ए)पीएच-एकेटी-जीएफपी की प्रतिनिधि छवियां-3 मिनट के दौरान फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड कवरस्लिप पर फैलते हुए एमईएफ व्यक्त करना । लाल रेखा सेल विभाजन एल्गोरिदम द्वारा निकाली गई सेल सीमा को इंगित करती है। शीर्ष पैनल: 0.1% DMSO-इलाज कोशिकाओं। नीचे पैनल: 100 μM CK-666 (Arp2/3 अवरोधक) -इलाज कोशिकाओं। (ख)समय के साथ सेल स्प्रेड एरिया दिखाता ग्राफ। सेल स्प्रेड एरिया को कंट्रोल सेल के एवरेज सेल स्प्रेड एरिया के सापेक्ष गुना बदलाव के रूप में निर्धारित किया गया था । नीली और गुलाबी रेखाएं क्रमशः नियंत्रण और Arp2/3-बाधित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं । छायांकित क्षेत्र कोशिका प्रसार क्षेत्र के ऊपरी और निचले मानक विचलन का संकेत देते हैं। (ग)नियंत्रण की औसत कोशिका परिपत्रता और Arp2/3-बाधित कोशिकाओं को दिखाने वाले व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं के साथ एक बार प्लॉट । सभी त्रुटि बार मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। *, पी < 0.05, **, पी < 0.01, ***, पी < 0.001, एन.एस.(महत्वपूर्ण नहीं, पी > 0.05) जैसा कि पैरामेट्रिक छात्र टी-टेस्ट द्वारा पता लगाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:Arp2/3 निषेध पर कोशिकाओं के प्रसार के kymograph विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम । (A - B) प्रतिनिधि छवियों और 0.1% DMSO-इलाज (नियंत्रण) कोशिकाओं और 100 μM CK-666-इलाज (Arp2/3 अवरोधक) कोशिकाओं से निकाले गए kymographs। बाएं पैनल: एक नियंत्रण और Arp2/3-बाधित सेल के उल्टे ग्रेस्केल छवियां । धराशायी रेखाएं पूर्व-परिभाषित रेखाओं के अनुरूप हैं जहां किमोग्राफ निकाले गए थे। सही पैनल: ग्रेस्केल छवियों पर दिखाए गए धराशायी लाइनों के साथ काइमोग्राफ निकाले जाते हैं। प्लॉट की सीमाएं ग्रेस्केल छवियों पर धराशायी लाइनों से मेल खाने के लिए रंग-कोडित हैं। प्रत्येक भूखंड में धराशायी रेखा उस वक्र की ढलान को इंगित करती है जिसमें से औसत फलाव गति की गणना की गई थी। पठार चरण को इंगित करने के लिए, डेटा बिंदुओं पर एक लॉजिस्टिक ग्रोथ कर्व लगाया गया था और पठार पैरामीटर, सी(अनुपूरक चित्रा 1)से लिया गया था। लाल बिंदु रिऐक्शन घटनाओं को निरूपित करते हैं। (ग)नियंत्रण और Arp2/3-बाधित कोशिकाओं की औसत फलाव गति दिखा व्यक्तिगत डेटा अंक के साथ एक बार साजिश । सभी त्रुटि बार मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (घ)नियंत्रण और Arp2/3-बाधित कोशिकाओं के रिऐक्शन घटनाओं की आवृत्ति दिखाने वाले व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं के साथ एक बार प्लॉट । (सी-डी)*, पी < ०.०५, **, पी < ०.०१, ***, पी < ०.००१, एन एस (महत्वपूर्ण नहीं, पी > ०.०५) के रूप में गैर-पैरामेट्रिक मान-व्हिटनी परीक्षणों द्वारा पता चला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: एक प्रतिनिधि kymograph और वक्र फिटिंग परिणाम। एक स्प्रेडिंग सेल से निकाला गया कामोग्राफ। नीली धराशायी रेखा पहले फ्रेम के सापेक्ष सेल एज की दूरी से मेल खाती है। लाल ठोस रेखा फिट वक्र से मेल खाती है। वक्र फिटिंग के आत्मविश्वास को बढ़ाने के लिए, कच्चे डेटा अंक पहले एक Savitzky-Golay फिल्टर द्वारा सुचारू थे । कर्व-फिटिंग के बाद लॉजिस्टिक समीकरण से पैरामीटर सी का इस्तेमाल पठार बिंदु की पहचान करने के लिए किया गया । सी के निकटतम कच्चे डेटा बिंदु को पठार बिंदु के रूप में नामित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइलें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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वर्णित कोशिका प्रसार परख रूपात्मक परिवर्तनों(जैसे, सेल आकार और आकार) और सेल एज आंदोलनों(यानी, फलाव गति और रिऐक्शन आवृत्ति) की निरंतर ट्रैकिंग के लिए अनुमति देती है, जो अधिकांश सेल प्रसार प्रोटोकॉल19,24में गायब हैं। जबकि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंड-पॉइंट सेल फैलने वाले परख कोशिका के प्रसार की गति के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं, ये परख सेल एज आंदोलनों की लौकिक गतिशीलता को हल करने में विफल रहते हैं। लौकिक जानकारी की कमी लैमेलियोपियल प्रोट्रूशन-रिऐक्शन चक्रों में परिवर्तनों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने की क्षमता को सीमित करती है।

हमारी छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर फैलने वाली कोशिकाओं का एक सुव्यवस्थित विश्लेषण करता है, सेल विभाजन से डेटा क्वांटिफिकेशन तक। सेल प्रसार के मैनुअल छवि विश्लेषण में आमतौर पर एक सीमा मूल्य का पक्षपातपूर्ण चयन या एक स्वचालित विभाजन एल्गोरिदम लागू करना शामिल है, जो उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं है जहां कई छवियों का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, हमारा सॉफ्टवेयर प्रोट्रूसेशन गतिशीलता और रूपात्मक वर्णनकर्ताओं की मात्रा के अलावा, स्वचालित फैशन में कोशिकाओं का पता लगाने और खंडित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। साथ में, ये विशेषताएं वर्णित प्रोटोकॉल को सिग्नलिंग पाथवे और आणविक खिलाड़ियों के बड़े-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी बनाती हैं जो लैमेलिपोडिया को विनियमित करती हैं।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं के प्रसार का विश्लेषण मजबूत और सटीक है, प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम अतिरिक्त सावधानी के साथ किया जाना चाहिए । परख फैलाने वाली कोशिका के पहले कदम में इमेजिंग(चित्रा 1A-D)से पहले दिन फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड कवरलिप पर बहुत कम घनत्व पर फ्लोरोसेंटली-लेबल कोशिकाओं को चढ़ाना शामिल है। ये ध्रुवीकृत कोशिकाएं छवि अधिग्रहण के दौरान फैलने वाली कोशिकाओं के फैलाव वाले किनारों पर सटीक ध्यान केंद्रित करने में सक्षम होती हैं। यदि ध्रुवीकृत कोशिकाओं का घनत्व बहुत अधिक है, तो फैलने वाली कोशिकाओं में ध्रुवीकृत कोशिकाओं के साथ उतरने या ओवरलैपिंग की उच्च संभावना होती है, जिससे सेल विभाजन विफलता हो सकती है। रिकवरी पीरियड पोस्ट-ट्राइपिनाइजेशन इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम है। ब्याज की दवा के साथ इलाज कोशिकाओं, उदाहरण के लिए, DMSO या CK-666, ट्रिप्पिन-EDTA (चरण 2) द्वारा सेल संस्कृति पकवान से अलग कर रहे हैं, ४५ मिनट की वसूली अवधि(चित्रा 1E)के बाद । यह वसूली कदम कोशिकाओं को ट्राइपसिन19,24 द्वारा सेल सतह प्रोटीन के प्रोटियोलिटिक क्लीवेज से उबरने की अनुमति देता है और सेल फैलने की शुरुआत(चित्रा 2)को सिंक्रोनाइज करता है। यदि वसूली कदम छोड़ दिया जाता है, तो सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता कोशिका प्रसार क्षेत्र में बढ़ जाती है, जिससे जैविक फेनोटाइप की स्थिरता कम होती है।

छवि अधिग्रहण के दौरान, किसी भी नमूना बहाव अनिवार्य रूप से गुणवत्ता और सेल प्रसार विश्लेषण, विशेष रूप से kymograph विश्लेषण की परिशुद्धता कम हो जाती है । नमूना बहाव को कम करने के लिए, कुछ उपाय किए जाने चाहिए। सबसे पहले, उपयोगकर्ता को छवि अधिग्रहण के दौरान चरण आंदोलन को अनुकूलित करना चाहिए। अनुकूलन में देखने के क्षेत्रों के बीच चरण यात्रा को कम करना और चरण आंदोलन की गति को कम करना शामिल है। दूसरा, माइक्रोस्कोप चरण पर नमूने को कसकर सुरक्षित करना आवश्यक है। यदि ये सुझाए गए उपाय नमूना बहाव को समाप्त नहीं करते हैं, तो अधिग्रहण के बाद प्रसंस्करण पर विचार किया जाना चाहिए। कई मालिकाना और खुले स्रोत कम्प्यूटेशनल उपकरणों में, हम छवि बदलावों को सही करने और कोशिकाओं को फैलाने की फिल्मों को संरेखित करने के लिए "वर्णनकर्ता-आधारित पंजीकरण" फिजी प्लगइन का उपयोग करने की सलाह देते हैं (निर्देश पाए जा सकते हैं: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_ (2d/3d))।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेल क्षेत्रों का मात्रात्मक विश्लेषण और सॉफ्टवेयर द्वारा किए गए एज डायनामिक्स सेल सेगमेंटेशन की सटीकता पर काफी निर्भर करता है। सटीक विभाजन सुनिश्चित करने के लिए, हम एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके फैलने वाली कोशिका की कल्पना करने की सलाह देते हैं, अधिमानतः एक कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप जो उच्च रिज़ॉल्यूशन, कम फोटोब्लैचिंग/फोटोटॉक्सीसिटी, और उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप फैलने वाली कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित आउट-ऑफ-फोकस फ्लोरेसेंस को कुशलतापूर्वक हटा देता है, जो अन्यथा छवि विभाजन सटीकता और सेल सीमा ट्रेसिंग को कम कर देगा। यदि छवि अधिग्रहण के लिए एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, तो अतिरिक्त अधिग्रहण के बाद प्रसंस्करण, उदाहरण के लिए, छवि deconvolution, बाहर के फोकस फ्लोरेसेंस को हटाने और सेल विभाजन की सटीकता में सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इसलिए इमेजिंग सिस्टम के चुनाव पर विचार किया जाना चाहिए।

वर्णित सॉफ्टवेयर के भीतर, दो छवि विभाजन एल्गोरिदम को लागू किया गया था और विश्वसनीय रूप से मंद से मध्यम उज्ज्वल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल की गई कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था, जैसे साइटोसोलिक ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी और आरएफपी)26,27। हालांकि, इन विभाजन एल्गोरिदम में एक सीमित गतिशील रेंज है और बेहद उज्ज्वल फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों के साथ लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। हमारे हाथों में, ये एल्गोरिदम उच्च तीव्रता वाले पिक्सेल की ओर छवि हिस्टोग्राम की विषमता के कारण बेहद उज्ज्वल कोशिकाओं को कम करते हैं। उज्ज्वल नमूनों के लिए, छवियों की तीव्रता जोखिम समय या उत्तेजन लेजर के उत्पादन शक्ति को समायोजित करके नियंत्रित किया जा सकता है।

इन बातों को ध्यान में रखते हुए, यह लाइव-सेल प्रसार प्रोटोकॉल लैमेलिपोडिया की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और शक्तिशाली उपकरण है। स्वचालित छवि विश्लेषण मंच कई जैविक जांचों के लिए अनुकूल है, उदाहरण के लिए, आणविक/सिग्नलिंग कारकों की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग जो लैमेलिपोडियल फलाव को विनियमित करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को कनॉट फंड न्यू इन्वेस्ट्रो अन्वेषक पुरस्कार द्वारा एसपी, कनाडा फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, एनएसईआरसी डिस्कवरी ग्रांट प्रोग्राम (अनुदान आरजीपिन-2015-05114 और आरजीपिन-2020-05881), मैनचेस्टर विश्वविद्यालय और यूनिवर्सिटी ऑफ टोरंटो ज्वाइंट रिसर्च फंड और यूनिवर्सिटी ऑफ टोरंटो एक्ससीड प्रोग्राम को समर्थन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

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References

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सेल स्प्रेडिंग के दौरान सेल एज डायनेमिक्स का मात्रात्मक विश्लेषण
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Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).More

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).

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