Kvantitativ analyse av cellekantdynamikk under cellespredning
Summary
I denne protokollen presenterer vi eksperimentelle prosedyrer for en cellespredningsanalyse som er basert på levende cellemikroskopi. Vi tilbyr et beregningsverktøy med åpen kildekode for objektiv segmentering av fluorescerende merkede celler og kvantitativ analyse av lamellipodiadynamikk under cellespredning.
Abstract
Celleoppslag er en dynamisk prosess der en celle som er suspendert i medier, knyttes til et underlag og flater seg ut fra en avrundet til en tynn og spredt form. Etter celle-substratet danner cellen et tynt ark med lamellipodia som kommer fra cellekroppen. I lamellipodia polymeriserer kulefikale aktin (G-aktin) monomerer til et tett filamentøst aktin (F-aktin) maskearbeid som skyver mot plasmamembranen, og gir dermed de mekaniske kreftene som kreves for at cellen skal spre seg. Spesielt er de molekylære spillerne som kontrollerer aktinpolymeriseringen i lamellipodia avgjørende for mange andre cellulære prosesser, for eksempel cellemigrasjon og endokytose.
Siden spredning av celler danner kontinuerlig lamellipodia som spenner over hele celleperiphery og vedvarende ekspanderer utover, har cellespredningsanalyser blitt et effektivt verktøy for å vurdere kinetikken til lamellipodiale fremspring. Selv om flere tekniske implementeringer av cellespredningsanalysen er utviklet, mangler det for tiden en detaljert beskrivelse av arbeidsflyten, som vil inkludere både en trinnvis protokoll og beregningsverktøy for dataanalyse. Her beskriver vi de eksperimentelle prosedyrene for cellespredningsanalysen og presenterer et åpen kildekodeverktøy for kvantitativ og objektiv analyse av cellekantdynamikk under spredning. Kombinert med farmakologiske manipulasjoner og/eller gen-silencing teknikker, er denne protokollen egnet til en storskala skjerm av molekylære spillere som regulerer lamellipodiale fremspring.
Introduction
Lamellipodiale fremspring er fremtredende cytoskeletale strukturer dannet på forsiden av en migrerende celle. I lamellipodia skaper polymerisering av aktin ved hjelp av Arp2/3-komplekset og formins et raskt voksende forgrenet aktinnettverk som skyver mot plasmamembranen1,2. Trykkkraften som genereres av aktinnettverket, driver fysisk cellen fremover1,3,4,5. Uttømming av Arp2/3-komplekset eller forstyrrelse av signalveier som er avgjørende for lamellipodiale fremspring, svekker ofte cellemigrasjon6, 7. Selv om migrasjon av lamellipodia-mangelfulle celler også har blitt rapportert8,9, er betydningen av lamellipodia i cellemigrasjon tydelig som uttømming av denne fremspringende strukturen perturberer cellens evne til å bevege seg gjennom komplekse biologiske mikromiljøet6,10.
En stor hindring for å forstå reguleringen av lamellipodia i migrerende celler er den naturlige variasjonen i lamellipodial fremspring kinetikk, størrelse og form11,12,13,14. Videre har nyere studier vist at lamellipodia viser kompleks fremspringende oppførsel, inkludert svingende, periodiske og akselererende fremspring14,15. Sammenlignet med den svært variable lamellipodia av migrerende celler6,16, er lamellipodia dannet under cellespredning mer ensartet12. Siden den fremspringende aktiviteten med å spre og migrere celler er drevet av identiske makromolekylære samlinger, som inkluderer et forgrenet aktinnettverk, sammentrekningsformede actomyosinbunter og integrinbaserte cellematriseadhesjoner17,18, har spredningsceller blitt mye brukt som modell for å undersøke reguleringen av lamellipodiadynamikk.
Cellespredning er en dynamisk mekanokjemisk prosess der en celle i suspensjon først holder seg til et substrat gjennom integrinbaserte adhesjoner17,19,20 og deretter sprer seg ved å utvide aktinbaserte fremspring21,22,23. Under spredningsfasen stikker lamellipodia ut fra cellekroppen isotropisk og vedvarende med liten eller ingen tilbaketrekning eller stalling12. De mest brukte cellespredningsprotokollene er endepunktanalyser, der spredning av celler er faste på forskjellige tidspunkter etter plating19,24. Disse analysene, selv om de er raske og enkle, er begrenset i sin diagnostiske kraft til å oppdage endringer i de dynamiske egenskapene til lamellipodia. For å bestemme de molekylære mekanismene som kontrollerer lamellipodiadynamikken, var Sheetz-gruppen en pioner innen bruk av kvantitativ analyse av levende spredningsceller og avdekket mange grunnleggende egenskaper ved cellekantprotrudering11,12,22. Disse studiene har vist at live-celle spredningsanalysen er en robust og kraftig teknikk i verktøykassen til et cellebiologisk laboratorium. Til tross for det er et detaljert protokoll- og åpen kildekode-beregningsverktøy for en live-celle spredningsanalyse for tiden utilgjengelig for cellebiologisamfunnet. For dette formål skisserer protokollen vår prosedyrene for avbildning av direkte spredningsceller og gir et automatisert bildeanalyseverktøy. For å validere denne metoden brukte vi Arp2/3-hemming som eksperimentell behandling og viste at hemming av funksjonen til Arp2/3-komplekset ikke arresterte cellespredning, men forårsaket en betydelig reduksjon i celleutstikkhastigheten, samt stabiliteten til cellekantutstikk, noe som ga opphav til hakkede cellekanter. Disse dataene viser at kombinasjonen av levende celleavbildning og automatisert bildeanalyse er et nyttig verktøy for å analysere cellekantdynamikk og identifisere molekylære komponenter som regulerer lamellipodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne cellespredningsanalysen muliggjør kontinuerlig sporing av morfologiske endringer(f.eks. cellestørrelse og -form) og cellekantbevegelser (dvs. fremspringshastighet og tilbaketrekkingsfrekvens), som mangler i de fleste cellespredningsprotokoller19,24. Mens ofte brukte sluttpunktcellespredningsanalyser tillater bestemmelse av cellespredningshastighet, klarer ikke disse analysene å løse den tidsmessige dynamikken i cellekantbevegel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskudd RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund, og University of Toronto XSeed Program.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
