Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות ושתן

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62404
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Oncode Institute

Summary

תרביות טובולואיד כליות אנושיות מייצגות מודל במבחנה רב ערך לחקר פיזיולוגיה ומחלות כליות. טובולואידים ניתן להקים מרקמת כליה (בריא וחולים) כמו גם שתן, האחרון מייצג מקור קל להשגה ופחות פולשני של חומר מחקר.

Abstract

תאי גזע בוגרים (ASC) שמקורם באורגנוידים אפיתל אנושיים, או טובולואידים, ניתן להקים אפיתל כליות בריא וחולים עם יעילות גבוהה. טובולואידים כליות רגילים לשחזר היבטים רבים של רקמת המוצא שלהם. הם מייצגים מקטעי נפרון נפרדים - בעיקר של צינור פרוקסימלי, לולאה של הנל, צינורות דיסטליים, וצינור איסוף - וניתן להשתמש בהם כדי ללמוד פיזיולוגיה כליות נורמלית. יתר על כן, טכנולוגיית טובולואיד מקלה על מידול מחלות, למשל., עבור מחלות זיהומיות, כמו גם עבור סרטן. עם זאת, קבלת תאי אפיתל כליות לייצור טובולואיד תלויה בשאריות חומר כירורגי (כגון כריתת נפרקטומיות חלקיות) או ביופסיות מחט. היכולת לגדל טובולואידים משתן תספק מקור חלופי, פחות פולשני לתאי אפיתל כליות בריאים. הוכח בעבר כי תרביות טובולואיד ניתן ליצור בהצלחה רק כמה מיליליטרים של שתן שנאסף טרי. מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים כדי ליצור ולהפיץ תרביות טובולואיד כליות אנושיות נגזר ASC מרקמות ודגימות שתן.

Introduction

הכליות מבצעות את הפונקציה של שליטה שיטתית על איזון נוזלי הגוף. הפגיעה בתפקוד הפיזיולוגי שלהם יכולה להיגרם על ידי גורמים שונים, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, ורעילות הנגרמת על ידי סמים1. להבנה טובה יותר של פיזיולוגיה תקינה של הכליות, כמו גם התפתחות מחלות כליות, השימוש במודלים פרה-אקליניים מייצגים הוא קריטי. בשנים האחרונות, מספר מודלים בכליות במבחנה נוצרו בהתבסס על מה שנקרא טכנולוגיית organoid2. אורגנואידים הם מבנים תלת מימדיים, רב-תאיים הדומים למורפולוגיה ולפיזיולוגיה של הרקמה (נורמלית או חולה) שממנה הם נובעים. הם יכולים להיווצר מתאי גזע (מחשבים אישיים) או בוגרים (ASCs), כל אחד עם המאפיינים והיישומים שלו.

אורגנוידים כליות שמקורם ב-PSC מחקים נפרוגנזה3,4,5. הם יכולים גם להיות הוקמו מתאים מחויבים נגזר המטופל על ידי דיפרנציה כפויה (pluripotency המושרה או iPSC). IPSCs ניתן לאחר מכן להיות מובחנים לתוך סוגי התאים השונים של הנפרון, היחידה התפקודית של הכליה, על ידי חשיפה בזמן קוקטיילים גורם גדילה ספציפי. תוך כדי יצירת מיני-איבר שלם למדי בצלחת, הקמתם נותרה גוזלת זמן רב, ובשל פרוטוקול התכנות מחדש, IPSCs יכול להיות רגיש לחוסר יציבות גנטית בלתי רצויה6. יתר על כן, organoids iPSC אינם מסוגלים להבשיל באופן מלא לתוך תאי כליות בוגרים, חושף פרופיל transcriptome הדומה לכליה העוברית בשלב התפתחות מוקדם7.

טובולואידים כליות אנושיים נגזר ASC הוכחו כדי לשחזר את ההתחדשות של אפיתל כליות למבוגרים. הם מייצגים בעיקר את הצינור הפרוקסימלי, לולאת ההנלה, צינורות דיסטליים וצינור איסוף, כפי שאושר על ידי הביטוי של חלבוני טרנספורטר שונים8,9,10. פרוטוקול תרבית טובולואיד מאפשר התרחבות מהירה של רקמת כליה שמקורה בחולה, תוך שמירה על גנום יציב. יישומי מחקר כוללים לימוד פיזיולוגיה תקינה של הכליות, נפרוטוקסיה, בדיקות סמים, כמו גם מידול מחלות8,10,11,12. מגבלה פוטנציאלית של הקמת תרביות organoid שמקורן בחולה, כולל טובולואידים, היא הזמינות של רקמה טרייה. עם זאת, מספר דיווחים הראו כי שתן יכול לשמש כמקור לתאי אפיתל כליות, ובכך לספק אסטרטגיה הרבה יותר פשוטה, פחות פולשנית כדי להשיג חומר המטופל עבור תרביות טובולואיד8,13,14. אכן, הוכח לאחרונה כי טובולואידים ניתן לגדל משתן8. מאמר זה מתאר את הקמת ותחזוקת תרביות טובולואיד מרקמת כליה ושתן.

Protocol

הערה: הניסויים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי ארסמוס (רוטרדם, הולנד) ומרכז הנסיכה אקסימה לאונקולוגיה ילדים (אוטרכט, הולנד).

1. דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות

  1. חומרים
    1. לוחות תרבית רקמות multiwell לפני המלחמה (6, 12 ו 24 בארות) לילה ב 37 °C (50 °F).
    2. הכן מדיום בזאלי (AdDF+++) על ידי הוספת תוספת 1x L-אלנין/L-גלוטמין, 1% w/v 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין אתנסולפוניק (HEPES, 10 מ"מ), ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין אנטיביוטיקה לאנטיביוטיקה מתקדמת מסוג DMEM/F12.
    3. הכן בינוני תרבות על ידי הוספת 1.5% תוספת B27, 10% R-spondin מותנה בינוני, גורם גדילה אפידרמלי (50 ננוגרם/מ"ל), פקטור גדילה פיברובלסט-10 (100 ננוגרם/מ"ל), N-אצטילציסטאין (1.25 מ"מ), מעכב רו-קינאז Y-27632 (10 מיקרומטר), אנטיביוטיקה רחבת טווח (0.1 מ"ג/מ"ל) ו-A83-01 (5 מיקרומטר) ל-AdDF+++. יש להתחמם עד 37 °C (70°F) לפני השימוש.
    4. הכן את תמצית קרום המרתף (BME) על ידי הפשרת aliquot לילה ב 4 °C (50 °F). שמור את BME על קרח במהלך ההליך.
    5. הכן את תמיסת הקולגנאז על ידי דילול קולגנאז לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב-AdDF+++, בתוספת של 10 מיקרומטר Y-27632. להתחמם עד 37 °C (50 °F).
    6. הכינו מנות פטרי 10 ס"מ, אזמלים ופינצטה. לחטא את כלי החיטוי על ידי החלת מנורה אולטרה סגולה במשך 20 דקות, ואחריו כביסה עם חומר חיטוי, מים דמי, ו 70% v / v אתנול. ייבשו את כלי השיט.
    7. לפני המלחמה שייקר אופקי ל 37 °C (50 °F).
  2. פרוצדורה
    1. לאסוף רקמת כליה בצינור 50 מ"ל מלא 30-40 מ"ל של AdDF +++ בינוני. מניחים את חתיכת הרקמה ~ 1 מ"ל של בינוני בצלחת פטרי 10 ס"מ. טחון את הרקמה לחתיכות בגודל ~1 מ"מ3 באמצעות אזמלים(איור 1A).
    2. מעבירים את הרקמה הטחון לצינור 15 מ"ל באמצעות מלקחיים ואזמלים. הוסיפו 5 מ"ל של AdDF+++ לצלחת פטרי, שטפו ואספו את המדיום עם פיפטה סטרילית של 10 מ"ל. העבר את כל התוכן הזה לאותו צינור.
    3. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. יש להוסיף 3-4 מ"ל של תמיסת קולגנאז לצינור 15 מ"ל. הזז את הצינור לשייקר אופקי להגדיר ב 37 °C (55 °F) ומהירות של 250 סל"ד.
    4. לאחר 15 הדקות הראשונות של הדגירה, בדוק את המדגם ולנער במרץ את הצינור. חזור על הפעולה עד שהמתלה הומוגני ורוב חלקי הרקמה נעלמו, עם זמן דגירה מרבי של 45-60 דקות. (איור 1B).
    5. מלאו את הצינור ב-AdDF+++, וערבבו על ידי היפוך הצינור 5-10x. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. אם הכדור אדום, המשך עם שלב 1.2.6. אחרת, עבור לשלב 1.2.8.
    6. הוסף 1 מ"ל של מאגר תמה של תאי דם אדומים (ראה טבלת החומרים) על גבי גלולה התא. הקש בעדינות על הצינור כדי resuspend הכדור (לא resuspend עם קצה פיפטה). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    7. מלא את הצינור עם AdDF +++. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. אם תאי הדם עדיין גלויים, חזור על ההליך פעם נוספת, החל בשלב 1.2.6. אחרת, להמשיך עם שלב 1.2.8.
    8. אם גושי רקמות נראים בשלב זה של הפרוטוקול, המשך בשלב 1.2.8. אחרת, להמשיך עם מדידת נפח הכדור בשלב 1.2.9. הוסף 5 מ"ל של AdDF +++ לצינור, ו resuspend עם פיפטה סטרילית 10 מ"ל. לסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר להציב על צינור 50 מ"ל.
    9. העבר את המתלים המסוננים לצינור חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. מדוד את עוצמת הקול של גלולה התא באמצעות פיפטה p1000 להגדיר לאמצעי אחסון ידוע. בזהירות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend מבלי ליצור בועות אוויר. מעבירים את הצינור לקרח למשך דקה אחת.
    10. הוסף 70-75% נפח של BME לכדור. Resuspend באמצעות פיפטה p1000 או p200, וצלחת 15 טיפות μL בצלחת תרבית תאים רב-ערוצית מראש (6, 12, או 24 בארות, בהתבסס על נפח ציפוי כולל (<100 μL, 24 בארות; 100-200 μL, 12 בארות; >200 μL, 6 בארות)).
    11. הפוך את הצלחת, ולתת את הצלחת לנוח באינקובטור במשך 15-20 דקות ב 37 °C(איור 1C). הוסיפו מדיום תרבותי מחמם מראש, ובחנו את התרבויות(איור 1C,D).

2. דור טובולואידים כליות אנושיים משתן

הערה: שתן הוא סביבה עוינת לתאים. חשוב לביצוע מוצלח של פרוטוקול זה כי דגימות שתן מעובדים בהקדם האפשרי, רצוי בתוך 4 שעות מן ההפרשה. בינתיים, דגימות שתן צריך להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F).

  1. חומרים
    1. לוחות תרבית רקמות multiwell לפני המלחמה (6, 12 ו 24 בארות) לילה ב 37 °C (50 °F).
    2. הכן מדיום כביסה: AdDF+++ בתוספת אנטיביוטיקה רחבת טווח (0.1 מ"ג/מ"ל) ו-10 מיקרומטר Y-27632.
    3. הכן מדיום תרבות כמתואר לעיל. יש להתחמם במהירות של 37 °C (77°F) לפני השימוש.
    4. הכן מטריצת BME. שמור על קרח במהלך ההליך.
  2. פרוצדורה
    1. אסוף דגימת שתן, וחלק אותה באופן שווה לצינורות 50 מ"ל(איור 2A-I). הוסף 10-20 מ"ל של כביסה בינונית לכל אחד הצינורות. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C(איור 2A-II),ולהסיר את supernatant בזהירות.
    2. הוסף 10 מ"ל של כביסה בינונית לכל אחד מהצינורות. בזהירות respend הכדורים באמצעות פיפטה סטרילית 10 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C(איור 2A-III),ולהסיר את supernatant בזהירות.
    3. resuspend הכדורים, ולהעביר את התוכן של כל הצינורות לתוך צינור אחד 15 מ"ל. מלאו את הצינור בשטיפה בינונית. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C(איור 2A-IV),ולהסיר את supernatant.
    4. מדוד את עוצמת הקול של גלולה התא באמצעות פיפטה p1000 להגדיר לאמצעי אחסון ידוע. בזהירות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend מבלי ליצור בועות אוויר. מעבירים את הצינור לקרח למשך דקה אחת.
    5. הוסף 70-75% נפח של BME לכדור. Resuspend באמצעות פיפטה p1000 או p200, וצלחת 15 טיפות μL בצלחת תרבית תאים רב-ערוצית מראש (6, 12, או 24 בארות, בהתבסס על נפח ציפוי כולל (<100 μL, 24 בארות; 100-200 μL, 12 בארות; >200 μL, 6 בארות)).
    6. להפוך את הצלחות באינקובטור במשך 15-20 דקות ב 37 °C (7 °F). הוסיפו מדיום תרבות עם קדם-ווארוך, ובחנו את התרבויות(איור 2B).

3. הרחבת תרביות טובולואיד

הערה: ניתן לעבור תרבויות טובולואידיות בערך כל 1-2 שבועות עם יחס פיצול של 1:2-1:3. הם יכולים להיות מורחבים בדרך כלל עבור כ 15 קטעים, עם וריאציות ספציפיות לקו.

  1. חומרים
    1. לוחות תרבית רקמות multiwell לפני המלחמה (6, 12 ו 24 בארות) לילה ב 37 °C (50 °F).
    2. הכן מדיום בזאלי (AdDF+++), ולשמור אותו על קרח במהלך ההליך.
    3. הכן מדיום תרבות כפי שתואר בעבר. יש לחמם עד 37 °C (77 °F) לפני השימוש.
    4. הכן מטריצת BME, ולשמור על קרח במהלך ההליך.
    5. הכן סוכן טריפסין חלופי עם תוספת של Y-27632 לריכוז של 10 מיקרומטר. לחמם עד 37 °C (77 °F) לפני השימוש.
    6. מנעו אוטומטית עצות p10 שאינן מסוננות.
    7. מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. פרוצדורה
    1. לשבש את הטיפות המכילות את טובולואידים על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפטה p1000 באמצעות המדיום הנוכחי בבאר. השתמש בקצה כדי לגרד את תחתית הבאר, הקפד לאסוף את כל התאים המחוברים לתחתית.
    2. לאסוף את התוכן בצינור 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של AdDF+++. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant.
    3. בהתבסס על גודל הכדור, להוסיף סוכן תחליף טריפסין בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. השתמש 1 מ"ל של סוכן תחליף טריפסין עבור 200 μL של טיפות BME המכילות טובולואידים. דגירה ב 37 °C (5 דקות).
    4. השתמשו בפיפטה p1000 עם קצה, והכניסו קצה p10 סטרילי ולא מסונן מעל קצה 1000 μL. פיפטה למעלה ולמטה עבור 20-30x כדי לשבש באופן מכני את organoids.
    5. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם איברנואידים שלמים רבים עדיין קיימים בצינור(איור 3A). אם יותר מ -10% של organoids שלם נמצאים בשלב זה, לחזור מן הדגירה 5 דקות בשלב 3.2.3 לתצפית מיקרוסקופית עבור organoids שלם בשלב 3.2.5 פעם נוספת. אחרת, להמשיך עם שלב 3.2.6.
    6. מלא את הצינור עם AdDF +++. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F), ולהסיר את supernatant. מדוד את עוצמת הקול של גלולה התא באמצעות פיפטה p1000 להגדיר לאמצעי אחסון ידוע. בזהירות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend מבלי ליצור בועות אוויר. מעבירים את הצינור לקרח למשך דקה אחת.
    7. הוסף 70-75% נפח של BME לכדור. Resuspend באמצעות פיפטה p1000 או p200, וצלחת 15 טיפות μL בצלחת תרבית תאים רב-ערוצית מראש (6, 12, או 24 בארות, בהתבסס על נפח ציפוי כולל (<100 μL, 24 בארות; 100-200 μL, 12 בארות; >200 μL, 6 בארות)).
    8. להפוך את הצלחות, ולתת את הצלחת לנוח בחממה במשך 15-20 דקות ב 37 °C (77 °F). הוסיפו מדיום תרבותי מחמם מראש, ובחנו את התרבויות(איור 3B).

Representative Results

עבור רקמת כליה, מבנים טובולואידים מופיעים בדרך כלל בתוך 7 ימים לאחר הקמתו(איור 1D). חוסר צמיחה נראית לעין ב-7 הימים הראשונים מצביע על תוצאה לא מוצלחת של הפרוטוקול. בדרך כלל, תרבויות טובולואיד צריך להיות מעבר בתוך 1-2 שבועות לאחר ציפוי הראשון. עבור שתן, צמיחת התאים מתבררת כ 14-21 ימים לאחר הקמת, עם המראה של מבנים טובולואיד קומפקטיים ו / או תאים דבקים בתחתית הצלחת (איור 2B). סביר להניח שממסד התרבות נכשל אם לא ניתן לזהות צמיחה עם מיקרוסקופ Brightfield בתוך 4 שבועות לאחר ה ציפוי. עבור תרביות נגזר שתן, המעבר הראשון מתרחשת בדרך כלל בין 3 ל 4 שבועות. בעוד שבקטעים הראשונים תרביות טובולואיד כליות מורכבות בעיקר ממבנים קומפקטיים, נוכחותם של טובולואידים אפיתל ציסטי עולה עם הגידול במספר המעבר (איור 1D ואיור 2B). ניתן להעריך את הדור המוצלח של תרביות טובולואידים בכליות אנושיות על ידי ביצוע כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סמנים המתבטאים באפיתל כליות צינורי, כגון גן קופסה מזווג 8 חלבון (PAX8) (איור 4A,B).

Figure 1
איור 1: תרביות טובולואידים שמקורן ברקמות. (A)סקירה כללית של ההליך לכריתת רקמת כליה. הרקמה טחון לגודל של ~ 1 מ"מ3 באמצעות אזמלים. (B)דוגמה לעיכול אנזימטי נכון של רקמת כליה בריאה. רקמה מוצגת לפני (משמאל) ואחרי (מימין) 45 דקות של עיכול אנזימטי עם collagenase. פיסות רקמות מעטות עדיין נראות בתחתית הצינור, והפתרון צריך להיות מעונן, המציין את נוכחות התאים במתלה. (C)תמונה מייצגת של לוחות תרבית התא לאחר ציפוי של טיפות BME המכילות את רקמת הכליה המעובדת. לאחר ציפוי הטיפות, צלחות תרבות הפוכות (משמאל) ומונחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 15-20 דקות, מדיום תרבות מחמם מראש מתווסף לבאר (מימין). (D)תמונות ברייטפילד מייצגות של תרביות טובולואיד שמקורן ברקמות. המבנים טובולואיד הראשון להיות גלוי 2-3 ימים לאחר זריעה ראשונה. עם הגדלת מספרי המעבר, טובולואידים בדרך כלל לשנות מורפולוגיה פנוטיפ ציסטי יותר. סרגלי קנה מידה = 300 מיקרומטר. קיצורים: BME = תמצית קרום המרתף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תרביות טובולואידים שמקורן בשתן. (A)סקירה כללית של עיבוד דגימת שתן. בהקדם האפשרי לאחר איסוף(אני),דגימות שתן מחולקות לצינורות 50 מ"ל מדוללים במדיום כביסה(II). לאחר שלב כביסה שני(III),תוכן הצינורות מ ומאותגד וצעד שטיפה שלישי ואחרון(IV)מבוצע לפני הטיפה. (B)תמונות ברייטפילד מייצגות של תרביות טובולואידיות שמקורן בשתן. המבנים טובולואיד הראשון ותאים דבקים צריך להיות גלוי בתוך 21 ימים לאחר ציפוי הראשון. סרגלי קנה מידה = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: העברת תרביות טובולואיד בכליות. (א)תמונה מייצגת של תרביות טובולואיד בכליות לאחר עיכול אנזימטי. לאחר השלמת העיכול, לא יותר מ 10% של מבנים טובולואיד שלם צריך להישאר. סרגל קנה מידה = 300μm. (B) תמונה מייצגת של תרביות טובולואיד כליות לאחר ציפוי. בדיקת התרבויות מאשרת כי רוב הצינורות שובשו. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אפיון היסתולוגי של תרביות טובולואיד. (A)מכתים H&E של רקמת כליה בריאה וטובולואידים. מוטות קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B)אימונוהיסטוכימיה של PAX8 ברקמת כליה רגילה, טובולואידים, רקמת MRTK ואורגנוידים MRTK. PAX8 חיוביות של המבנים organoid מאשרת את מקור אפיתל הכליות שלהם. רקמת כליה בריאה מראה הן חיובי (צינורות) והן מבנים שליליים (glomeruli). רקמת MRTK ואורגנוידים נכללו כשליטה שלילית. מוטות קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואוסין; PAX8 = גן תיבה מזווגת 8; MRTK = גידול rhabdoid ממאיר של הכליה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

Organoids נחשבים אווטרים של הרקמה שממנה הם נגזרים. הם מאפשרים התרחבות מהירה של חומר המטופל תוך שמירה על המאפיינים הגנוטיפי והפנוטיפיים של רקמת המקור15. טכנולוגיית Organoid פתחה לאחרונה את הדלתות לפיתוח מודלים פרה-קליניים מייצגים יותר, שיכולים לשמש ככלים חשובים לתרגום ממצאים מהספסל לצד המיטה. טובולואידים בכליות מבטיחים מודלים במבחנה לבדיקת nephrotoxicity הנגרמת על ידי סמים, תופעת לוואי נפוצה של תרופות כימותרפיות רבות2,8,12. ככזה, תרביות organoid הגידול נגזר המטופל הוכחו להיות חזוי לתגובת המטופל לטיפול16,17,18. בדיקת תרופות באופן תפוקה גבוהה על טובולואידים ולכן פוטנציאל מאפשר הגדרה טובה יותר של חלונות טיפוליים ומקטין את הסיכון של nephrotoxicity הנגרמת על ידי תרופות בחולים.

אנטיביוטיקה נפוצה תוארו כדי להפעיל השפעה רעילה על הכליות19. למרות נוכחות של אנטיביוטיקה רחבת טווח הכרחית להקמת מוצלח של התרבויות על ידי מניעת זיהום, חשוב לשקול את הנפרוטוקסיות הפוטנציאלית שלהם. למרות שלא נצפו השפעות שליליות של אנטיביוטיקה על הקמת תרביות טובולואיד, דרושה חקירה נוספת כדי להעריך ביסודיות את ההשפעות שלהם. טובולואידים ניתן לנצל לחקר ודוגמנות מחלות8. Ciliopathies (תפקוד פתולוגי של ריסים) כמו גם תסמונות גנטיות אחרות המשפיעות על הכליה ניתן ללמוד על ידי יצירת קווים טובולואידים ישירות מנושאים מושפעים, או באמצעות תרבויות בריאות שבהן מוטציות נהג ספציפיות למחלה ניתן להציג באמצעות עריכת גנום CRISPR / Cas920.

למרות טובולואידים הם תרביות כליות רב תאיות, הם חסרים מספר סוגי תאי כליות, כולל פופוטיטים ותאי אנדותל8. יתר על כן, בניגוד כמה מודלים organoid אחרים שמקורם ASC, טובולואידים יש פוטנציאל שכפול מוגבל כפי שהם יכולים להיות תרבותיים עבור כ 15 קטעים. עם זאת, תוחלת חיים מוגבלת זו יכולה להיות מורחבת באופן משמעותי על ידי הוספת Wnt למדיום התרבות21. אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול תרבות טובולואיד נדרש כדי להפוך אותם אפילו יותר נציג של הכליה, כולל סוגי תאים מובחנים יותר. למרות היעילות של הקמת טובולואיד מדגימות רקמה הוא גבוה מאוד (>95%), זה יכול, במקרים נדירים, להיכשל. יכולות להיות סיבות שונות כולל: 1) איכות ירודה של החומר ההתחלתי (למשל.רקמה נמקית כתוצאה מטיפול תרופתי), 2) עומס יתר של דגימת הרקמה, או 3) זיהום המדגם העיקרי.

כדי לוודא כי איכות דגימות הרקמה שהתקבלו מספיקה כדי להמשיך עם הפרוטוקול, חשוב לשמור על קשר הדוק עם צוות הפתולוגיה המבצע את הערכת הרקמה בעת הניתוח. אם חומר מספיק זמין, הכדאיות שלה חייבת להיות מאושרת על ידי בדיקה היסתולוגית (למשל. יתר על כן, כדי למנוע תמה תאית במהלך עיכול אנזימטי, חשוב כי הליך הדגירה הוא לא יותר מ 1 שעות. לבסוף, כדי למנוע זיהום, אנטיביוטיקה ותרופות נגד פטריות יש להוסיף למדיה כביסה ותרבות.

שתן יכול להכיל תאי אפיתל פילינג שאינם נגזרים מהכליה22, אשר יכול לזהם את תרביות טובולואיד. אלה כוללים, למשל, תאי urothelium כי הם, בניגוד לתאי צינוריות כליות, חיובי עבור חלבון הגידול P63 ושלילי עבור PAX88. לכן מומלץ לבחון את התרבויות עבור חיוביות PAX8 כדי לאשר את הטוהר של קווים טובולואידים כליות הוקמה לפני שתמשיך בניסויי מעקב(איור 4B).

שתן מייצג סביבה עוינת לתאים בשל לחץ אוסמוטי גבוה ו- pH נמוך. לכן חיוני להצלחת הפרוטוקול כי דגימות מעובדות בהקדם האפשרי עם איסוף שתן. ככזה, השתן שנאסף צריך להיות מדולל ושטוף נרחב עם פתרון חוצץ בהקדם האפשרי כדי להבטיח נוכחות של תאים קיימא בזמן זריעה. שיעור ההצלחה של הקמת טובולואיד יקטן באופן משמעותי אם שתן מאוחסן במשך מספר שעות לפני העיבוד. לבסוף, למרות סטרילי, שתן יש סיכון גבוה של זיהום הקשורים לתהליך האיסוף. לכן חשוב להשלים כביסה וצמיחה בינונית עם אנטיביוטיקה וסוכנים נגד פטריות. כאשר לוקחים בחשבון את כל האמור לעיל, ניתן להשיג שיעור הצלחה של כ -50%.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לכל המטופלים ובני משפחותיהם שהשתתפו במחקר. אנו מודים לצוות הקליני שסייע במחקר שלנו. אנו מודים על תמיכתה של מועצת המחקר האירופית (ERC) החל מענק 850571 (J.D.), האגודה ההולנדית לסרטן (KWF)/Alpe d'HuZes Bas Mulder פרס (מס '10218, J.D.), מכון Oncode, וקרן ילדים ללא סרטן (KiKa מס '292, C.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 Tocris 2939/10 Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634010
antiPAX8 antibody LSBio LS-B13466
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044 Stock of 50x, final concentration of  1x
BME Trevigen 3533-010-02
Collagenase Sigma Aldrich  C9407 Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF Peprotech AF-100-15 Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine Gibco 35050061 Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes Gibco 15630106 Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells CELLSTAR 665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells CELLSTAR 662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells CELLSTAR 657160
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140163 Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics Invivogen ant-pm-1 Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer Roche 11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience M1817 Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent ThermoFisher Scientific 12605010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Romagnani, P., et al. Chronic kidney disease. Nature Reviews. Disease Primers. 3, 17088 (2017).
  2. Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. Organoid models of childhood kidney tumours. Nature Reviews. Urology. 17 (6), 311-313 (2020).
  3. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  4. Low, J. H., et al. Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell Stem Cell. 25 (3), 373-387 (2019).
  5. Little, M. H., Combes, A. N. Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents. Genes & Development. 33 (19-20), 1319-1345 (2019).
  6. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  7. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  8. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  9. Jun, D. Y., et al. Tubular organotypic culture model of human kidney. PLoS One. 13 (10), 0206447 (2018).
  10. Grassi, L., et al. Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases. Cell Death & Disease. 10 (3), 1-15 (2019).
  11. Yousef Yengej, F. A., Jansen, J., Rookmaaker, M. B., Verhaar, M. C., Clevers, H. Kidney organoids and tubuloids. Cells. 9 (6), 1326 (2020).
  12. Calandrini, C., et al. An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 1310 (2020).
  13. Jansen, J., et al. A morphological and functional comparison of proximal tubule cell lines established from human urine and kidney tissue. Experimental Cell Research. 323 (1), 87-99 (2014).
  14. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080 (2012).
  15. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  16. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  18. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  19. Morales-Alvarez, M. C. Nephrotoxicity of antimicrobials and antibiotics. Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (1), 31-37 (2020).
  20. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  21. Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
  22. Dörrenhaus, A., et al. Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system. Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).

Tags

ביולוגיה גיליון 170
דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות ושתן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calandrini, C., Drost, J. Generation … More

Calandrini, C., Drost, J. Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine. J. Vis. Exp. (170), e62404, doi:10.3791/62404 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter