Summary
인간 신장 관형 배양은 신장 생리학 및 질병을 공부하는 중요한 체외 모형을 나타냅니다. Tubuloids는 신장 조직 (건강하고 병은) 뿐만 아니라 소변에서 설치될 수 있고, 후자는 연구 자료의 쉽게 얻을 수 있고 덜 침습적인 근원을 나타내는.
Abstract
성인 줄기 세포 (ASC)유래 인간 신장 상피 오르가노이드, 또는 tubuloids, 높은 효율과 건강하고 병든 신장 상피에서 확립 될 수있다. 정상적인 신장 관형은 기원의 그들의 조직의 많은 양상을 회상합니다. 그(것)들은 명백한 신장 분단을 나타냅니다 - 근위 관의 특히, Henle의 루프, 단위 tubule 및 수집 덕트 - 및 일반적인 신장 생리학을 공부하는 데 이용될 수 있습니다. 또한, 튜블러이드 기술은 전염병뿐만 아니라 암에 대한 질병 모델링을 용이하게합니다. 튜룰로이드 생성을 위한 신장 상피 세포를 얻는 것은, 그러나, 남은 외과 물질 (부분적인) 신장 절제술) 또는 바늘 생검에 의존합니다. 소변에서 tubuloids를 성장 하는 능력 대체 제공할 것 이다, 건강 한 신장 상피 세포의 덜 침습적인 소스. 그것은 이전에 tubuloid 배양은 성공적으로 갓 수집 된 소변의 단지 몇 밀리리터에서 생성 될 수 있음을 보여 주었다. 이 문서에서는 조직 및 소변 샘플에서 ASC 유래 인간 신장 tubuloid 배양을 생성하고 전파하는 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
신장은 체액의 균형을 체계적으로 제어하는 기능을 수행합니다. 그들의 생리적 기능의 손상은 당뇨병, 고혈압 및 약물 유발 독성1을포함한 다른 요인에 의해 발생할 수 있다. 신장 질환의 발달뿐만 아니라 정상적인 신장 생리학에 대한 더 나은 이해를 위해 대표적인 전임상 모델의 사용이 중요합니다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 체외 신장 모형은 소위 오르가노이드 기술2에근거하여 생성되었습니다. 오르가노이드는 3차원, 다세포 구조는 그들이 유래하는 조직의 형태학 및 생리학 (정상 또는 병) 닮은 다세포 구조물입니다. 그들은 다능성 (PSC) 또는 성인 줄기 세포 (ASC)에서 생성 될 수 있습니다, 각각 자신의 특성과 응용 프로그램과 함께.
PSC 유래 신장 오르가노이드는 신뢰 발생3,4,5를모방한다. 그(것)들은 또한 강제적인 분화 (유도된 자성분성 또는 iPSC)에 의해 환자 유래 저지른 세포에서 설치될 수 있습니다. iPSC는 이후에 신장의 기능성 단위인 네프론의 상이한 세포 유형으로 특정 성장 인자 칵테일에 적시에 노출함으로써 분화될 수 있다. 접시에 다소 완전한 미니 오르간을 만드는 동안, 그들의 설립은 시간이 많이 소요남아, 리프로그래밍 프로토콜로 인해, iPSC는 원치 않는 유전불안정6에취약 할 수 있습니다. 더욱이, iPSC 오르가노이드는 성인 신장 세포로 완전히 성숙할 수 없으며, 초기 발달 단계7에서태아 신장과 유사한 전사성 프로파일을 드러낸다.
ASC 유래 인간 신장 관형은 성인 신장 상피의 갱신을 recapiuure 것으로 나타났습니다. 그들은 주로 상이한 수송단백질8,9,10의발현에 의해 확인된 바와 같이, 주로 근접 튜블러, 헨레의 루프, 말단 튜블러 및 수집 덕트를 나타낸다. tubuloid 배양 프로토콜은 안정적인 게놈을 유지하면서 환자 유래 신장 조직의 신속한 확장을 허용합니다. 연구 응용 분야에는 정상적인 신장 생리학, 신증후군, 약물 검사, 질병 모델링8,10,11,12를 연구하는 것이 포함됩니다. tubuloids를 포함하여 환자 유래 오르가노이드 배양의 설치의 잠재적인 한계는, 신선한 조직의 가용성입니다. 그러나, 몇몇 보고는 소변이 신장 상피 세포를 위한 근원역할을 할 수 있다는 것을 보여주었습니다, 따라서 tubuloid 배양에 대한 환자 물질을 얻기 위하여 훨씬 간단하고, 덜 침습적인 전략을 제공하는8,13,14. 실제로, 최근에는 튜블러노이드가 소변8에서재배될 수 있음을 보여주었습니다. 이 문서는 신장 조직과 소변에서 tubuloid 문화의 설립 및 유지 보수를 설명합니다.
Protocol
참고: 여기에 설명된 실험은 에라스무스 의료 센터 (로테르담, 네덜란드)와 소아 종양학을위한 공주 말시마 센터 (위트레흐트, 네덜란드)의 의료 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 조직으로부터 인간 신장 관형의 세대
- 자료
- 37°C에서 하룻밤 동안 예비다웰 조직 배양 플레이트(6, 12 및 24웰).
- 1x L-알라닌/L-글루타민 보충제, 1%w/v 4-(2-하이드록세틸)-1-피프라진 에탄에설포닉산(HEPES, 10mM), 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 고급 DMEM/FM에 추가하여 기저 배지(AdDF++++)를 준비하십시오.
- 1.5% B27 보충제, 10% R-척추 조절 배지를 첨가하여 배양 배지를 준비, 표피 성장 인자(50 ng/mL), 섬유아세포 성장 인자-10(100 ng/mL), N-아세틸시스테인(1.25mMM), 로키나제 억제제 Y-27632(10 μM), 광범위한 항생제(0.1 mg/mL), A83-01(5Μd++++A). 사용하기 전에 37 °C로 따뜻하게합니다.
- 4°C에서 밤새 알리쿼트를 해동하여 지하 멤브레인 추출물(BME)을 준비한다. 절차 중에 BME를 얼음 위에 보관하십시오.
- 콜라게나아제1mg/mL의 최종 농도인 AdDF+++로 희석하여 콜라게나아제 용액을 준비하여 10μM Y-27632를 추가합니다. 최대 37°C까지 데우실 수 있습니다.
- 페트리 요리, 메스, 핀셋 10cm를 준비합니다. 20분 동안 자외선 램프를 바르고 소독제, 데미워터, 70% v/v 에탄올로 세척하여 식기를 소독합니다. 기구를 공기 건조시.
- 수평 셰이커를 37°C로 미리 데우습니다.
- 절차
- AdDF+++ 배지의 30-40 mL로 채워진 50mL 튜브에서 신장 조직을 수집합니다. 10cm 페트리 접시에 중간 크기의 ~ 1 mL에 티슈 조각을 놓습니다. 메스를 사용하여 ~ 1mm3 사이즈의 조각으로 조직을 다진다(도1A).
- 다진 조직을 집게와 메스를 사용하여 15mL 튜브로 옮기습니다. 페트리 접시에 AdDF++++의 5mL를 추가하고, 세척하고, 10mL 멸균 파이펫으로 매체를 수집합니다. 이러한 모든 내용을 동일한 튜브로 전송합니다.
- 300 g에서 원심분리기는 실온에서 5 분 동안 ×, 상체를 제거합니다. 15mL 튜브에 콜라게나제 용액 3-4mL를 추가합니다. 튜브를 37°C로 설정된 수평 셰이커와 250rpm의 속도로 이동합니다.
- 처음 15분 동안 잠복한 후 샘플을 확인하고 튜브를 힘차게 흔들어 줍니다. 현탁액이 균일하고 대부분의 조직이 사라질 때까지 반복하며 최대 잠복 시간 45-60 분(그림 1B).
- AdDF+++로 튜브를 채우고 튜브 5-10x를 반전하여 섞습니다. 300g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 ×, 상부체를 제거한다. 펠릿이 빨간색인 경우 1.2.6단계를 진행합니다. 그렇지 않으면 1.2.8 단계로 이동하십시오.
- 세포 펠릿 위에 적혈구 리시스 버퍼 1mL(재료 표참조)를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 탭하여 펠릿을 다시 놓습니다(파이펫 팁으로 다시 중단하지 마십시오). 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- AdDF +++로 튜브를 채웁니다. 300g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 ×, 상부체를 제거한다. 혈액 세포가 아직도 보이는 경우에, 단계 1.2.6에서 시작하는 절차를 다시 한 번 반복합니다. 그렇지 않으면 1.2.8 단계를 진행하십시오.
- 조직의 덩어리가 프로토콜의이 시점에서 볼 수 있는 경우, 단계 1.2.8진행. 그렇지 않으면, 1.2.9 단계에서 펠릿 부피의 측정을 진행한다. 튜브에 AdDF++++의 5mL를 추가하고 10mL 멸균 파이펫으로 다시 일시 중지합니다. 50mL 튜브에 놓인 100 μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 필터링합니다.
- 필터링된 서스펜션을 새로운 15mL 튜브로 전송합니다. 300g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 ×, 상부체를 제거한다. 알려진 부피로 설정된 p1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정합니다. 기포를 만들지 않고 재중단하기 위해 조심스럽게 피펫 위아래로 피펫. 튜브를 얼음으로 1분 동안 옮기십시오.
- 펠릿에 70-75% 부피를 추가합니다. p1000 또는 p200 파이펫을 사용하여 재중단, 및 플레이트 15 μL 방울을 예비, 다중 웰 세포 배양 플레이트 (6, 12, 또는 24 우물, 총 도금 부피 (<100 μL, 24 우물; 100-200 μL, 12 우물; >200 μL, 6 웰).
- 플레이트를 거꾸로 뒤집어 서 플레이트를 37°C(도1C)에서15-20분 동안 인큐베이터에 놓습니다. 미리 따뜻해지는 배양 매체를 추가하고 배양을 검사합니다(도1C,D).
2. 소변에서 인간의 신장 관형의 세대
참고: 소변은 세포에 대 한 적대적인 환경. 소변 샘플이 가능한 한 빨리 처리되는이 프로토콜의 성공적인 실행을 위해 중요합니다, 바람직하게는 배설에서 4 시간 안에. 그 동안, 소변 샘플은 4 °C에 저장해야합니다.
- 자료
- 37°C에서 하룻밤 동안 예비다웰 조직 배양 플레이트(6, 12 및 24웰).
- 세탁 매체 준비: 광범위한 항생제(0.1 mg/mL) 및 10 μM Y-27632로 보충된 AdDF+++.
- 위에서 설명한 바와 같이 배양 배지를 준비한다. 사용하기 전에 37 °C에서 따뜻하게하십시오.
- BME 행렬을 준비합니다. 시술 중에 얼음을 유지하십시오.
- 절차
- 소변 샘플을 수집하고 50 mL 튜브(그림 2A-I)로균등하게 나눕니다. 각 튜브에 10-20mL의 세탁 매체를 추가합니다. 300g에서 원심분리기는 4°C(도2A-II)에서5분 동안 g로 ×, 주체를 주의 깊게 제거한다.
- 각 튜브에 10mL의 세탁 매체를 추가합니다. 10mL 멸균 파이펫을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 재보페합니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 4°C(도2A-III)에서조심스럽게 상주체를 제거합니다.
- 펠릿을 다시 중단하고 모든 튜브의 내용을 15mL 튜브로 전송합니다. 튜브를 세탁 매체로 채웁니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 4°C(도2A-IV)에서,상류체를 제거한다.
- 알려진 부피로 설정된 p1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정합니다. 기포를 만들지 않고 재중단하기 위해 조심스럽게 피펫 위아래로 피펫. 튜브를 얼음으로 1분 동안 옮기십시오.
- 펠릿에 BME의 70-75% 부피를 추가합니다. p1000 또는 p200 파이펫을 사용하여 재중단, 및 플레이트 15 μL 방울을 예비, 다중 웰 세포 배양 플레이트 (6, 12, 또는 24 우물, 총 도금 부피 (<100 μL, 24 우물; 100-200 μL, 12 우물; >200 μL, 6 웰).
- 37°C에서 15-20분 동안 인큐베이터에서 플레이트를 거꾸로 뒤집습니다. 미리 따뜻해지는 배양 매체를 추가하고 배양을 검사합니다(도2B).
3. 튜블러이드 문화의 확장
참고: 투불로이드 배양은 1:2-1:3의 분할 비율로 대략 1-2 주마다 통과될 수 있습니다. 일반적으로 약 15개의 구절에 대해 줄별 변형을 통해 확장할 수 있습니다.
- 자료
- 37°C에서 하룻밤 동안 예비다웰 조직 배양 플레이트(6, 12 및 24웰).
- 기초 매체(AdDF++++)를 준비하고 시술 중에 얼음 위에 보관하십시오.
- 이전에 설명한 대로 배양 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 최대 37 °C까지 데우습니다.
- BME 매트릭스를 준비하고 시술 중에 얼음을 유지하십시오.
- Y-27632를 10 μM의 농도로 첨가하여 트립신 교체제를 준비하십시오.
- 필터링되지 않은 p10 팁자동 clave.
- 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
- 절차
- 우물에 존재하는 매체를 사용하여 p1000 파이펫으로 위아래로 피펫을 하여 튜블러노이드를 함유한 방울을 방해합니다. 팁을 사용하여 우물 바닥을 긁어 바닥에 부착 된 모든 세포를 수집하십시오.
- 15mL 튜브에서 내용을 수집합니다. AdDF ++++의 10mL를 추가합니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 4°C에서, 상체를 제거한다.
- 펠릿의 크기에 따라 10 μM Y-27632로 보충된 트립신 교체제를 추가하십시오. 튜룰로이드를 함유한 BME 물방울 200 μL에 트립신 교체 제1mL을 사용하십시오. 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 팁이 있는 p1000 파이펫을 사용하고 1000 μL 팁 위에 필터링되지 않은 멸균 p10 팁을 삽입합니다. 파이펫은 20-30x상하로 오르가노이드를 기계적으로 방해합니다.
- 현미경아래에서 많은 온전한 오르가노이드가 여전히 튜브에 존재하는지 확인하십시오(그림3A). 이 시점에서 그대로 유기체의 10% 이상이 존재하는 경우, 3.2.3 단계에서 5분 배양에서 3.2.5 단계에서 그대로 유기체에 대한 현미경 관찰까지 다시 한 번 반복한다. 그렇지 않으면 3.2.6 단계를 진행하십시오.
- AdDF +++로 튜브를 채웁니다. 300× g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안, 상부체를 제거한다. 알려진 부피로 설정된 p1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정합니다. 기포를 만들지 않고 재중단하기 위해 조심스럽게 피펫 위아래로 피펫. 튜브를 얼음으로 1분 동안 옮기십시오.
- 펠릿에 70-75% 부피를 추가합니다. p1000 또는 p200 파이펫을 사용하여 재중단, 및 플레이트 15 μL 방울을 예비, 다중 웰 세포 배양 플레이트 (6, 12, 또는 24 우물, 총 도금 부피 (<100 μL, 24 우물; 100-200 μL, 12 우물; >200 μL, 6 웰).
- 플레이트를 거꾸로 뒤집어 서 플레이트를 37°C에서 15-20분 동안 인큐베이터에 놓습니다. 미리 따뜻해지는 배양 매체를 추가하고 배양을 검사합니다(그림3B).
Representative Results
신장 조직의 경우, 튜룰로이드 구조는 전형적으로 설립 후 7일 이내에나타난다(도 1D). 처음 7 일 이내에 명백한 성장의 부족은 프로토콜의 실패 한 결과를 나타냅니다. 일반적으로, 튜볼로이드 배양은 첫 번째 도금 후에 1-2 주 안에 통과될 필요가 있습니다. 소변의 경우, 세포 성장은 소판의 바닥에 소형 튜룰로이드 구조 및/또는 부착 세포의 출현과 함께 설립 후 약 14-21 일 후에 명백해진다(도 2B). 도금 후 4주 이내에 밝은 시야 현미경으로 성장이 감지되지 않으면 문화 시설이 대부분 실패했을 가능성이 큽시입니다. 소변 유래 배양에 대 한, 첫 번째 패세이 징은 일반적으로 사이 발생 3 그리고 4 주. 첫 번째 구절에서 신장 tubuloid 배양은 주로 소형 구조로 구성되지만, 낭포성 상피 관부 의 존재는 통로 수의 증가에 따라 증가한다(도1D 및 도 2B). 인간 신장 관형 배양의 성공적인 생성은 쌍상자 유전자 8 단백질(PAX8)(도 4A,B)와 같은 관 신장 상피로 발현된 마커에 대한 면역히스토케미컬 염색을 수행함으로써 평가될 수 있다.
도 1: 조직 유래 신장 관형 배양. (A)신장 조직을 다진 절차에 대한 개요. 조직은 메스를 사용하여 ~ 1mm3의 크기로 다진다. (B)건강한 신장 조직의 올바른 효소 소화의 예. 조직은 콜라게나아제와 효소 소화의 45 분 전에 (왼쪽) 및 후 (오른쪽) 표시됩니다. 조직의 몇몇 조각은 아직도 관의 바닥에 보입니다, 및 해결책은 정지에 있는 세포의 존재를 나타내는 흐린 되어야 합니다. (C)처리된 신장 조직을 포함하는 BME 물방울의 도금 후 세포 배양 판의 대표적인 이미지. 물방울을 도금 한 후, 배양 판은 거꾸로 (왼쪽) 37 °C에서 인큐베이터에 배치됩니다. 15-20 분 후, 미리 따뜻해진 배양 배지가 우물(오른쪽)에 추가됩니다. (D)조직 유래 튜룰로이드 배양의 대표적인 브라이트필드 이미지. 첫 번째 튜볼로이드 구조는 첫 번째 시드 후 2-3 일 눈에 띄게됩니다. 통로 수가 증가함에 따라 튜룰로이드는 일반적으로 형태를 보다 낭포성 표현형으로 변경합니다. 스케일 바 = 300 μm. 약어 : BME = 지하 막 추출물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 소변 유래 신장 관형 배양. (A)소변 샘플 처리개요. 수거 후 가능한 한 빨리(I),소변 샘플은 50 mL 튜브로 나누어 세탁 매체(II)로희석된다. 제2 세척단계(III)가끝나면 튜브의 함량이 풀로 풀이 되고 세 번째 및 최종 세척단계(IV)는도금 전에 수행됩니다. (B)소변 유래 튜룰로이드 배양의 대표적인 브라이트필드 이미지. 첫 번째 튜볼로이드 구조와 부착 세포는 첫 번째 도금 후 21 일 이내에 볼 수 있어야합니다. 스케일 바 = 300 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 신장 튜룰로이드 배양의 패시징. (A)효소 소화 후 신장 튜룰로이드 배양의 대표적인 이미지. 소화를 완료한 후, 그대로 튜룰로이드 구조의 10% 이상이 남아 있어야 합니다. 스케일 바 = 300μm.(B)도금 후 신장 관형 배양의 대표적인 이미지. 문화의 검사는 튜룰로이드의 대부분이 중단된 것을 확인합니다. 스케일 바 = 300 μm이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 튜룰로이드 배양의 조직학적 특성화. (A)건강한 신장 조직 및 튜룰로이드의 H&E 염색. 스케일 바 = 100 μm.(B)정상 신장 조직, 튜부로이드, MRTK 조직 및 MRTK 오르가노이드에서 PAX8의 면역 조직 화학. ORGANoid 구조의 PAX8 양성은 그들의 신장 상피 기원을 확인합니다. 건강한 신장 조직은 양성 (tubules) 및 부정적인 구조 (구메룰리)를 모두 보여줍니다. MRTK 조직 및 오르가노이드는 부정적인 대조군으로 포함되었다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: H&E = 헤마톡슬린 및 에신; PAX8 = 페어링된 박스 유전자 8; MRTK = 신장의 악성 횡골 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
오르가노이드는 파생된 조직의 아바타로 간주됩니다. 그들은 기원15의조직의 지색및 현상특성을 유지하면서 환자 물질의 신속한 확장을 허용한다. Organoid 기술은 최근에 벤치에서 침대 옆으로 결과를 번역하는 중요한 도구로 사용할 수있는 보다 대표적인 전임상 모델의 개발을위한 문을 열었습니다. 신장 관형은 약물 유발 신증후군을 시험하기 위한 체외 모델, 많은 화학요법 약물의 일반적인 부작용2,8,12에유망하다. 이와 같이, 환자 유래 종양오르가노이드 배양은치료(16,17,18)에대한 환자 반응을 예측하는 것으로 입증되었다. 따라서 tubuloids에 높은 처리량 방식으로 약물을 테스트하면 잠재적으로 치료 창의 더 나은 정의를 허용하고 환자에서 약물 유발 신장 독성의 위험을 감소시면 됩니다.
일반적으로 사용되는 항생제는신장(19)에독성 효과를 발휘하기 위해 기재되었다. 광범위 한 항생제의 존재는 오염을 방지 하 여 문화의 성공적인 설립에 필요한, 그들의 잠재적인 신 독성을 고려 하는 것이 중요 하다. 항생제의 부정적인 영향은 tubuloid 문화의 설립에 관찰되지 않았지만, 철저하게 자신의 효과를 평가하기 위해 추가 조사가 필요합니다. 튜블러로이드는 질병을 연구하고 모델링하기 위해 악용 될 수있다8. Ciliopathies (섬모의 병리학 적 기능 장애) 뿐만 아니라 신장에 영향을 미치는 다른 유전 증후군은 영향을받는 과목에서 직접 tubuloid 라인을 생성하거나, 질병 특정 드라이버 돌연변이가 CRISPR / Cas9 게놈 편집20을통해 도입 될 수있는 건강한 배양을 사용하여 연구 될 수있다.
관형은 다세포 신장 배양이지만, 그들은 여러 신장 세포 유형이 부족, podocytes 및 내피 세포를 포함8. 또한, 다른 ASC 유래 오르가노이드 모델과 는 달리, tubuloids는 약 15개의 통로를 위해 배양될 수 있기 때문에 제한된 복제 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 제한된 수명은 양문화배지(21)에Wnt를 첨가함으로써 크게 연장될 수 있다. 더 분화된 세포 유형을 포함하여 신장을 더욱 대표하도록 하기 위해서는 tubuloid 배양 프로토콜의 추가 최적화가 요구된다. 조직 샘플에서 tubuloid 설립의 효율이 매우 높지만 (>95%), 드문 경우, 실패 할 수 있습니다. 1) 시작 물질의 품질저하(예를 들어,약물 치료의 결과로 괴사 조직), 2) 조직 샘플의 과다 소화, 또는 3) 1차 시료의 오염을 포함하는 다른 원인이 있을 수 있다.
수신된 조직 샘플의 품질이 프로토콜을 진행하기에 충분한지 확인하기 위해 수술 시 조직의 평가를 수행하는 병리학 직원과 긴밀한 접촉을 유지하는 것이 중요합니다. 충분한 물질을 사용할 수 있는 경우, 그 생존력은 조직학적검사(예:헤마톡클린 및 에신 염색)에 의해 확인되어야 합니다. 더욱이, 효소 소화 중 세포 용해를 방지하기 위해, 인큐베이션 절차는 더 이상 1h 이상이 아니라는 것이 중요하다. 마지막으로, 오염을 방지하기 위해 항생제와 항진균제는 세척 및 배양 매체에 첨가되어야 합니다.
소변은 혈류 배양을 오염시킬 수 있는 신장22에서파생되지 않은 각질 제거된 상피 세포를 포함할 수 있습니다. 이들은, 예를 들면, 신장 관 세포와 는 대조적으로, 종양 단백질 P63를 위한 양성 및 PAX88를위한 음성인 비뇨기혈 세포를 포함한다. 따라서 후속 실험을 진행하기 전에 확립된 신장 튜룰로이드 라인의 순도를 확인하기 위해 PAX8 양성에 대한 배양을 테스트하는 것이좋습니다(도 4B).
소변은 높은 삼투압과 낮은 pH 때문에 세포에 대한 적대적인 환경을 나타냅니다. 따라서 소변 수집 시 시 시료가 가능한 한 빨리 처리되는 프로토콜의 성공을 위해 결정적입니다. 따라서, 수집된 소변은 파종 시 실행 가능한 세포의 존재를 보장하기 위해 가능한 한 빨리 완충 된 용액으로 희석하고 광범위하게 세척해야합니다. 소변을 처리하기 전에 몇 시간 동안 저장되는 경우 tubuloid 설립의 성공률은 크게 감소할 것입니다. 마지막으로, 멸균되더라도 소변은 수집 과정과 관련된 오염의 위험이 높습니다. 따라서 항생제 및 항진균제로 세척 및 성장 매체를 보충하는 것이 중요합니다. 위의 모든 것을 고려할 때 약 50 %의 성공률을 달성 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 연구에 참여한 모든 환자와 그 가족에게 감사드립니다. 우리는 우리의 연구를 촉진 임상 팀에 감사드립니다. 우리는 유럽 연구위원회 (ERC) 시작 보조금 850571 (J.D.), 네덜란드 암 학회 (KWF)/알프 d'HuZes 바스 멀더 상 (No. 10218, J.D.), 온코드 연구소 및 재단 어린이 암 무료 (KiKa No. 292, C.C)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
| antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
| BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
| GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
| Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
| Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
| Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
| Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
| Primocin - broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
| Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
| RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
| R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
| TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
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