Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جيل من توبولويدات الكلى البشرية من الأنسجة والبول

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62404
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Oncode Institute

Summary

ثقافات الكلى البشرية tubuloid تمثل نموذجا قيما في المختبر لدراسة فسيولوجيا الكلى والمرض. يمكن إنشاء الأنابيب من أنسجة الكلى (صحية ومرضية) وكذلك البول ، وهذا الأخير يمثل مصدرا يسهل الحصول عليه وأقل غزوا للمواد البحثية.

Abstract

يمكن إنشاء الخلايا الجذعية للبالغين (ASC) المشتقة من الأعضاء الظهارية للكلى البشرية ، أو الدرنات ، من ظهارة الكلى السليمة والمرضى بكفاءة عالية. الأنابيب الكلى العادية تلخيص العديد من جوانب نسيج المنشأ. وهي تمثل شرائح الكلية متميزة - وأبرزها من أنبوب قريب، حلقة من هنل، الأنابيب البعيدة، وجمع القناة - ويمكن استخدامها لدراسة فسيولوجيا الكلى العادية. وعلاوة على ذلك، فإن تكنولوجيا التوبيلويد تسهل نمذجة الأمراض، على سبيل المثال،للأمراض المعدية وكذلك للسرطان. الحصول على خلايا ظهارية الكلى لتوليد التوبيلويد، ومع ذلك، يعتمد على بقايا المواد الجراحية (مثل جزئية) استئصال الكلية) أو خزعات إبرة. القدرة على زراعة الدرنات من البول من شأنه أن يوفر مصدرا بديلا، أقل الغازية من الخلايا الظهارية الكلى صحية. وقد ثبت سابقا أن الثقافات الدرنية يمكن أن تتولد بنجاح من بضع ملليلترات فقط من البول التي تم جمعها حديثا. توضح هذه المقالة بروتوكولات توليد ونشر ثقافات أنبوبية الكلى البشرية المشتقة من ASC من عينات الأنسجة والبول.

Introduction

الكلى أداء وظيفة التحكم بشكل منهجي في توازن سوائل الجسم. يمكن أن يكون سبب ضعف وظيفتها الفسيولوجية عوامل مختلفة، بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم والسمية الناجمة عن المخدرات1. لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء الكلى الطبيعية، فضلا عن تطوير أمراض الكلى, استخدام نماذج ما قبل السريرية التمثيلية أمر بالغ الأهمية. في السنوات الأخيرة، تم إنشاء العديد من نماذج الكلى في المختبر على أساس ما يسمى تكنولوجيا organoid2. الأجهزة العضوية هي هياكل ثلاثية الأبعاد ومتعددة الخلايا تشبه مورفولوجيا وفسيولوجيا الأنسجة (طبيعية أو مريضة) التي تنشأ منها. ويمكن أن تنشأ من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات أو الخلايا الجذعية البالغة، ولكل منها خصائصه وتطبيقاته الخاصة.

PSC المشتقة من أعضاء الكلى تحاكي تولدالكلية 3،4،5. ويمكن أيضا أن تنشأ من الخلايا الملتزمة المشتقة من المريض عن طريق dedifferentiation القسري (المستحث pluripotency أو iPSC). ويمكن في وقت لاحق iPSCs أن تكون متباينة في أنواع مختلفة من الخلايا من الكلية، وحدة وظيفية من الكلى، من خلال التعرض في الوقت المناسب لكوكتيلات عامل النمو محددة. في حين خلق جهاز مصغرة كاملة نوعا ما في طبق، وإنشاء لا يزال مضيعة للوقت، ونظرا لبروتوكول إعادة البرمجة، iPSCs يمكن أن تكون عرضة لعدم الاستقرار الوراثي غير مرغوب فيه6. وعلاوة على ذلك، فإن أعضاء iPSC غير قادرة على النضج الكامل في خلايا الكلى البالغة، مما يكشف عن ملف تعريف النسخ الذي يشبه كلية الجنين في مرحلة النمو المبكر7.

وقد ثبت أن أنبوبيات الكلى البشرية المشتقة من ASC تلخص تجديد ظهارة الكلى للبالغين. وهي تمثل في المقام الأول أنبوبي قريب، حلقة من هنل، الأنابيب البعيدة، وجمع القناة، كما أكد التعبير عن البروتينات الناقلمختلفة 8،9،10. يسمح بروتوكول زراعة الدرنات بالتوسع السريع في أنسجة الكلى المشتقة من المريض ، مع الاحتفاظ بجينوم مستقر. وتشمل التطبيقات البحثية دراسة فسيولوجيا الكلى الطبيعية، والسمية الكلوية، واختبار المخدرات، فضلا عن نمذجة المرض8،10،11،12. وهناك قيود محتملة على إنشاء الثقافات العضوية المشتقة من المريض، بما في ذلك الدرنات، هو توافر الأنسجة الطازجة. ومع ذلك، أظهرت العديد من التقارير أن البول يمكن أن تكون بمثابة مصدر للخلايا الظهارية الكلى، وبالتالي توفير أبسط بكثير، وأقل الغازية استراتيجية للحصول على مواد المريض لثقافات الدرنية8،13،14. في الواقع، وقد تبين مؤخرا أن الدرنات يمكن زراعتها من البول8. هذه المقالة يصف إنشاء وصيانة الثقافات الدرنية من أنسجة الكلى والبول.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على التجارب الموصوفة هنا من قبل اللجنة الأخلاقية الطبية لمركز إيراسموس الطبي (روتردام، هولندا) ومركز الأميرة ماكسيما لأورام الأطفال (أوتريخت، هولندا).

1. جيل من الأنابيب الكلى البشرية من الأنسجة

  1. المواد
    1. لوحات زراعة الأنسجة متعددة الآبار قبل الحرب (6 و 12 و 24 بئرا) بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    2. إعداد المتوسط القاعدي (AdDF +++) عن طريق إضافة 1x L-ألانين / L-الجلوتامين الملحق, 1٪ ث /v 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازين حمض إيثانسلفونيك (HEPES, 10 mM), و 1٪ البنسلين / Streptomycin المضادات الحيوية لDMEM/F12 المتقدمة.
    3. إعداد الثقافة المتوسطة بإضافة 1.5٪ ملحق B27, 10٪ R-spondin-مشروط المتوسطة, عامل نمو البشرة (50 نانوغرام/مل)، عامل نمو الخلايا الليفية-10 (100 نانوغرام/مل)، N-أسيتيلسيستين (1.25 مللي متر)، مثبط رو كيناز Y-27632 (10 ميكرومتر)، والمضادات الحيوية واسعة الطيف (0.1 ملغم/مل)، وA83-01 (5 ميكرومتر) إلى AdDF+++. دافئ إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    4. إعداد استخراج غشاء الطابق السفلي (BME) عن طريق إذابة aliquot بين عشية وضحاها في 4 °C. إبقاء BME على الجليد أثناء الإجراء.
    5. إعداد محلول الكولاجينز عن طريق تخفيف الكولاجين إلى تركيز نهائي من 1 ملغم / مل في AdDF +++، مع إضافة 10 ميكرومتر Y-27632. درجة حرارة تصل إلى 37 درجة مئوية.
    6. إعداد أطباق بيتري 10 سم، المشرط، وملاقط. تطهير الأواني عن طريق تطبيق مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة، تليها يغسل مع مطهر، ديمي المياه، و 70٪ v/v الإيثانول. الهواء الجاف الأواني.
    7. Prewarm شاكر أفقي إلى 37 درجة مئوية.
  2. إجراء
    1. جمع أنسجة الكلى في أنبوب 50 مل مليئة 30-40 مل من AdDF + + + المتوسطة. ضع قطعة الأنسجة في ~ 1 مل من المتوسط في طبق بيتري 10 سم. فرم الأنسجة إلى قطع من ~ 1 مم3 حجم باستخدام مشرط (الشكل 1A).
    2. نقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب 15 مل باستخدام ملقط ومشرط. أضف 5 مل من AdDF+++ إلى طبق بيتري، اغسل، واجمع الوسط مع ماصة معقمة سعة 10 مل. نقل كل هذه المحتويات إلى نفس الأنبوب.
    3. جهاز الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة supernatant. أضف 3-4 مل من محلول الكولاجيناز إلى أنبوب 15 مل. نقل أنبوب إلى مجموعة الأفقي شاكر في 37 درجة مئوية وسرعة 250 دورة في الدقيقة.
    4. بعد أول 15 دقيقة من الحضانة، تحقق من العينة وهز الأنبوب بقوة. كرر حتى التعليق متجانسة واختفت معظم قطع الأنسجة، مع أقصى وقت حضانة من 45-60 دقيقة. (الشكل 1B).
    5. املأ الأنبوب ب AdDF+++، واخلطه عن طريق قلب الأنبوب 5-10x. الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant. إذا كانت الكريات حمراء، فانتقل إلى الخطوة 1.2.6. وإلا، انتقل إلى الخطوة 1.2.8.
    6. إضافة 1 مل من العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر جدول المواد)على رأس بيليه الخلية. بلطف اضغط على أنبوب لإعادة إنفاق بيليه (لا resuspend مع تلميح ماصة). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    7. املأ الأنبوب ب AdDF+++. الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant. إذا كانت خلايا الدم لا تزال مرئية، كرر الإجراء مرة أخرى، بدءا من الخطوة 1.2.6. وإلا، انتقل إلى الخطوة 1.2.8.
    8. إذا كانت قطع من الأنسجة مرئية في هذه المرحلة من البروتوكول، فانتقل إلى الخطوة 1.2.8. وإلا، تابع قياس حجم الكريات في الخطوة 1.2.9. أضف 5 مل من AdDF+++ إلى الأنبوب، وأعيد الإنفاق مع ماصة معقمة سعة 10 مل. تصفية التعليق من خلال 100 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون وضعت على أنبوب 50 مل.
    9. نقل التعليق المصفى إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant. قياس حجم بيليه الخلية باستخدام ماصة p1000 تعيين إلى حجم معروف. ماصة بعناية صعودا وهبوطا لإعادة الإنفاق دون خلق فقاعات الهواء. نقل الأنبوب إلى الجليد لمدة 1 دقيقة.
    10. إضافة 70-75٪ حجم BME إلى بيليه. Resuspend باستخدام ماصة p1000 أو p200 ، ولوحة قطرات 15 ميكرولتر في لوحة ثقافة خلايا ما قبل الحرب، متعددة الويلات (6، 12، أو 24 بئرا، استنادا إلى إجمالي حجم الطلاء (<100 ميكرولتر، 24 بئرا؛ 100-200 ميكرولتر، 12 بئرا؛ >200 ميكرولتر، 6 آبار)).
    11. بدوره لوحة رأسا على عقب، والسماح للراحة لوحة في الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة في 37 درجة مئوية (الشكل 1C). إضافة ثقافة ما قبل الحرب المتوسطة، وتفقد الثقافات (الشكل 1C،D).

2. جيل من الأنابيب الكلى البشرية من البول

ملاحظة: البول هو بيئة معادية للخلايا. من المهم لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح أن تتم معالجة عينات البول في أقرب وقت ممكن ، ويفضل أن تكون ضمن 4 ساعة من الإفراز. في غضون ذلك، يجب تخزين عينات البول عند 4 درجة مئوية.

  1. المواد
    1. لوحات زراعة الأنسجة متعددة الآبار قبل الحرب (6 و 12 و 24 بئرا) بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    2. إعداد وسيلة الغسيل: AdDF +++ تكملها المضادات الحيوية واسعة الطيف (0.1 ملغم / مل) و 10 ميكرومتر Y-27632.
    3. إعداد وسيط الثقافة كما هو موضح أعلاه. الاحماء عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    4. إعداد مصفوفة BME. ابق على الثلج أثناء العملية.
  2. إجراء
    1. جمع عينة البول، وتقسيمها بالتساوي إلى أنابيب 50 مل (الشكل 2A-I). إضافة 10-20 مل من الغسيل المتوسطة إلى كل من الأنابيب. الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية (الشكل 2A-II)، وإزالة supernatant بعناية.
    2. إضافة 10 مل من المتوسطة الغسيل إلى كل من الأنابيب. إعادة إنفاق بعناية الكريات باستخدام ماصة معقمة 10 مل. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية (الشكل 2A-III)، وإزالة supernatant بعناية.
    3. Resuspend الكريات، ونقل محتويات جميع الأنابيب إلى أنبوب واحد 15 مل. ملء أنبوب مع وسيطة الغسيل. جهاز الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية (الشكل 2A-IV)، وإزالة supernatant.
    4. قياس حجم بيليه الخلية باستخدام ماصة p1000 تعيين إلى حجم معروف. ماصة بعناية صعودا وهبوطا لإعادة الإنفاق دون خلق فقاعات الهواء. نقل الأنبوب إلى الجليد لمدة 1 دقيقة.
    5. إضافة 70-75٪ حجم BME إلى بيليه. Resuspend باستخدام ماصة p1000 أو p200 ، ولوحة قطرات 15 ميكرولتر في لوحة ثقافة خلايا ما قبل الحرب، متعددة الويلات (6، 12، أو 24 بئرا، استنادا إلى إجمالي حجم الطلاء (<100 ميكرولتر، 24 بئرا؛ 100-200 ميكرولتر، 12 بئرا؛ >200 ميكرولتر، 6 آبار)).
    6. قلب اللوحات رأسا على عقب في الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة ثقافة ما قبل الحرب المتوسطة ، وتفقد الثقافات(الشكل 2B).

3. توسيع الثقافات التوبولية

ملاحظة: يمكن تمرير الثقافات Tubuloid تقريبا كل 1-2 أسابيع مع نسبة الانقسام من 1:2-1:3. ويمكن توسيعها عادة لحوالي 15 مقطعا، مع اختلافات خاصة بالخط.

  1. المواد
    1. لوحات زراعة الأنسجة متعددة الآبار قبل الحرب (6 و 12 و 24 بئرا) بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    2. إعداد المتوسط القاعدي (AdDF +++)، وإبقائه على الجليد أثناء الإجراء.
    3. إعداد وسيط الثقافة كما هو موضح سابقا. الاحماء حتى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    4. إعداد مصفوفة BME، والحفاظ على الجليد أثناء الإجراء.
    5. إعداد عامل استبدال التريبسين مع إضافة Y-27632 إلى تركيز 10 ميكرومتر. الاحماء تصل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    6. نصائح P10 غير المصفاة الأوتوكلاف.
    7. تبريد الطرد المركزي إلى 4 °C.
  2. إجراء
    1. تعطيل قطرات تحتوي على tubuloids عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة p1000 باستخدام الحاضر المتوسط في البئر. استخدام طرف لكشط الجزء السفلي من البئر، والتأكد من جمع جميع الخلايا المرفقة إلى أسفل.
    2. جمع محتويات في أنبوب 15 مل. أضف 10 مل من AdDF+++. جهاز الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant.
    3. استنادا إلى حجم بيليه, إضافة عامل استبدال التريبسين تكملها مع 10 ميكرومتر Y-27632. استخدام 1 مل من عامل استبدال تريبسين ل200 ميكرولتر من قطرات BME التي تحتوي على الدرنات. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. استخدم ماصة P1000 مع طرف، وأدخل طرف P10 غير المصفى والعقيم فوق طرف 1000 ميكرولتر. ماصة صعودا وهبوطا لمدة 20-30x لتعطيل ميكانيكيا organoids.
    5. تحقق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كان العديد من الأجهزة العضوية سليمة لا تزال موجودة في أنبوب(الشكل 3A). إذا كان أكثر من 10٪ من الأجهزة العضوية سليمة موجودة في هذه المرحلة، كرر من الحضانة 5 دقيقة في الخطوة 3.2.3 إلى الملاحظة المجهرية لالأعضاء سليمة في الخطوة 3.2.5 مرة أخرى. وإلا، انتقل إلى الخطوة 3.2.6.
    6. املأ الأنبوب ب AdDF+++. جهاز الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant. قياس حجم بيليه الخلية باستخدام ماصة p1000 تعيين إلى حجم معروف. ماصة بعناية صعودا وهبوطا لإعادة الإنفاق دون خلق فقاعات الهواء. نقل الأنبوب إلى الجليد لمدة 1 دقيقة.
    7. إضافة 70-75٪ حجم BME إلى بيليه. Resuspend باستخدام ماصة p1000 أو p200 ، ولوحة قطرات 15 ميكرولتر في لوحة ثقافة خلايا ما قبل الحرب، متعددة الويلات (6، 12، أو 24 بئرا، استنادا إلى إجمالي حجم الطلاء (<100 ميكرولتر، 24 بئرا؛ 100-200 ميكرولتر، 12 بئرا؛ >200 ميكرولتر، 6 آبار)).
    8. قلب اللوحات رأسا على عقب، والسماح للوح بقية في الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة في 37 درجة مئوية. إضافة ثقافة ما قبل الحرب المتوسطة، وتفقد الثقافات (الشكل 3B).

Representative Results

بالنسبة لأنسجة الكلى، تظهر هياكل التوبيلويد عادة في غضون 7 أيام بعد التأسيس(الشكل 1D). عدم وجود نمو واضح خلال الأيام السبعة الأولى يشير إلى نتيجة غير ناجحة للبروتوكول. عموما، تحتاج الثقافات الدرنية إلى المرور في غضون 1-2 أسابيع بعد الطلاء الأول. بالنسبة للبول ، يصبح نمو الخلايا واضحا بعد 14-21 يوما تقريبا من التأسيس ، مع ظهور هياكل أنبوبية مدمجة و / أو خلايا معتنقة في الجزء السفلي من اللوحة (الشكل 2B). مؤسسة الثقافة على الأرجح قد فشلت إذا لم يكن من الممكن الكشف عن النمو مع المجهر brightfield في غضون 4 أسابيع بعد الطلاء. بالنسبة للثقافات المشتقة من البول ، يحدث أول عملية تمرير بشكل عام بين 3 و 4 أسابيع. بينما في الممرات الأولى الثقافات أنبوبي الكلى تتكون أساسا من هياكل مدمجة، وجود الدرنات الظهارية الكيسية يزيد مع زيادة عدد المرور (الشكل 1D والشكل 2B). يمكن تقييم الجيل الناجح من ثقافات أنبوبي الكلى البشرية عن طريق إجراء تلطيخ المناعة الكيميائية للعلامات المعبر عنها في ظهارة الكلى الأنبوبية ، مثل جين الصندوق المقترن 8 بروتين (PAX8) (الشكل 4A، B).

Figure 1
الشكل 1: الأنسجة المشتقة من الثقافات أنبوبي الكلى. (أ) نظرة عامة على الإجراء لفرم أنسجة الكلى. يتم فرم الأنسجة إلى حجم ~ 1 ملم3 باستخدام المشرط. (ب)مثال على الهضم الأنزيمي الصحيح لأنسجة الكلى السليمة. يظهر النسيج قبل (يسار) وبعد (يمين) 45 دقيقة من الهضم الأنزيمي مع الكولاجين. لا تزال قطع قليلة من الأنسجة مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب ، ويجب أن يصبح المحلول غائما ، مما يشير إلى وجود خلايا في التعليق. (ج) صورة تمثيلية من لوحات زراعة الخلايا بعد الطلاء من قطرات BME التي تحتوي على أنسجة الكلى المصنعة. بعد طلاء القطرات ، يتم قلب لوحات الثقافة رأسا على عقب (يسار) ووضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. بعد 15-20 دقيقة، يتم إضافة وسيط ثقافة ما قبل الحرب إلى البئر (يمين). (د) صور مشرقة ممثلة للثقافات الدرنية المشتقة من الأنسجة. تصبح الهياكل الأنبوبية الأولى مرئية بعد 2-3 أيام من البذر الأول. مع زيادة أعداد المرور ، عادة ما تغير الدرنات مورفولوجيا إلى نمط الظاهري أكثر الكيسية. أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر. المختصرات: BME = استخراج غشاء الطابق السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: البول المستمدة من الثقافات أنبوبي الكلى. (أ) نظرة عامة على معالجة عينة البول. في أقرب وقت ممكن بعد جمع (I), وتنقسم عينات البول إلى أنابيب 50 مل ومخففة في المتوسط الغسيل (II). بعد خطوة غسل ثانية (III) ، يتم تجميع محتوى الأنابيب ويتم تنفيذ خطوة غسل ثالثة ونهائية(IV)قبل الطلاء. (ب) صور برايتفيلد ممثل من الثقافات الدرنية المشتقة من البول. يجب أن تكون الهياكل الأنبوبية الأولى والخلايا الملتصقة مرئية في غضون 21 يوما بعد الطلاء الأول. أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: Passaging من الثقافات أنبوبي الكلى. (أ) صورة تمثيلية للثقافات أنبوبي الكلى بعد الهضم الأنزيمي. بعد الانتهاء من عملية الهضم، لا ينبغي أن يبقى أكثر من 10٪ من هياكل التوبوليود سليمة. شريط مقياس = 300μm. (ب) صورة تمثيلية للثقافات أنبوبي الكلى بعد الطلاء. فحص الثقافات يؤكد أن غالبية الدرنات قد تعطلت. مقياس الشريط = 300 ميكرومتر الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف الأنسجة من الثقافات الدرنية. (أ) H &؛ E تلطيخ أنسجة الكلى السليمة و tubuloids. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (ب) الكيمياء المناعية ل PAX8 في أنسجة الكلى الطبيعية ، الأنابيب ، أنسجة MRTK ، والأعضاء MRTK. تؤكد الإيجابية PAX8 للهياكل العضوية أصلها الظهاري الكلوي. تظهر أنسجة الكلى السليمة كلا من الهياكل الإيجابية (الأنابيب) والسلبية (الكبيبات). وأدرجت أنسجة MRTK والأعضاء كسيطرة سلبية. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. PAX8 = جين مربع مقترن 8; MRTK = ورم ربدويد خبيث في الكلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تعتبر الأجهزة العضوية صورا رمزية للأنسجة التي تستمد منها. أنها تسمح للتوسع السريع للمواد المريض مع الاحتفاظ بالخصائص الجينية والفينوتينوتيبيك من نسيج المنشأ15. وقد فتحت تكنولوجيا Organoid مؤخرا الأبواب لتطوير نماذج أكثر تمثيلا قبل السريرية، والتي يمكن استخدامها كأدوات هامة لترجمة النتائج من مقاعد البدلاء إلى السرير. الدرنات الكلى واعدة في نماذج المختبر لاختبار السمية الكلوية الناجمة عن المخدرات, أحد الآثار الجانبية الشائعة للعديد من الأدوية العلاج الكيميائي2,8,12. على هذا النحو ، ثبت أن الثقافات العضوية السرطانية المشتقة من المريض تنبؤية لاستجابة المريض للعلاج16و17و18. اختبار الأدوية بطريقة عالية الإنتاجية على tubuloids وبالتالي يحتمل أن يسمح تعريف أفضل للنوافذ العلاجية ويقلل من خطر السمية الكلوية الناجمة عن المخدرات في المرضى.

وقد وصفت المضادات الحيوية المستخدمة عادة لممارسة تأثير سام على الكلى19. على الرغم من أن وجود المضادات الحيوية واسعة الطيف ضروري لنجاح إنشاء الثقافات عن طريق منع التلوث ، فمن المهم النظر في السمية الكلوية المحتملة. على الرغم من عدم ملاحظة أي آثار سلبية للمضادات الحيوية على إنشاء زراعة الدرنويد ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتقييم آثارها بدقة. يمكن استغلال التوبولويدات لدراسة ونمذجة الأمراض8. يمكن دراسة اعتلالات السيليوباثية (الخلل المرضي في الأهداب) وكذلك المتلازمات الوراثية الأخرى التي تؤثر على الكلى إما عن طريق توليد خطوط الدرنات مباشرة من الأشخاص المصابين ، أو باستخدام ثقافات صحية يمكن فيها إدخال طفرات السائق الخاصة بالأمراض عن طريق CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم20.

على الرغم من أن الدرنات هي ثقافات الكلى متعددة الخلايا ، إلا أنها تفتقر إلى العديد من أنواع الخلايا الكلوية ، بما في ذلك الخلايا البودولاتية والخلايا البطانية8. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من بعض النماذج العضوية الأخرى المشتقة من ASC، فإن الدرنات لديها إمكانات تكرارية محدودة حيث يمكن استزراعها لما يقرب من 15 مقطعا. هذا العمر المحدود يمكن ، ومع ذلك ، يمكن تمديده بشكل كبير من خلال إضافة Wnt إلى الثقافة المتوسطة21. مطلوب مزيد من التحسين من بروتوكول ثقافة الدرنات لجعلها أكثر تمثيلا للكلى، بما في ذلك أنواع الخلايا أكثر تمايزا. على الرغم من أن كفاءة إنشاء الدرنات من عينات الأنسجة عالية جدا (>95٪) ، إلا أنها يمكن أن تفشل في حالات نادرة. يمكن أن تكون هناك أسباب مختلفة بما في ذلك: 1) نوعية رديئة من المواد بدءا(على سبيل المثال،الأنسجة النخرية نتيجة للعلاج من المخدرات)، 2) الإفراط في عسر الهضم من عينة الأنسجة، أو 3) تلوث العينة الأولية.

للتأكد من أن جودة عينات الأنسجة المستلمة كافية للمضي قدما في البروتوكول ، من المهم الحفاظ على اتصال وثيق مع موظفي علم الأمراض الذين يجرون تقييم الأنسجة عند الجراحة. إذا كانت هناك مواد كافية متاحة، يجب التأكد من صلاحيتها عن طريق الفحص النسيجي(على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، لمنع تحلل الخلية أثناء الهضم الأنزيمي، من المهم أن إجراء الحضانة لا يزيد عن 1 ساعة. وأخيرا، لمنع التلوث، ينبغي إضافة المضادات الحيوية والعوامل المضادة للفطريات إلى وسائل الإعلام الغسيل والثقافة.

البول يمكن أن تحتوي على خلايا الظهارية تقشير التي لا تستمد من الكلى22, التي يمكن أن تلوث الثقافات الدرنية. وتشمل هذه, على سبيل المثال, خلايا المسالك البولية التي هي, على النقيض من الخلايا الأنبوبية الكلوية, إيجابية للبروتين الورم P63 والسلبية لP PAX88. ولذلك فمن المستحسن لاختبار الثقافات الإيجابية PAX8 لتأكيد نقاء خطوط أنبوبي الكلى المنشأة قبل الشروع في متابعة التجارب(الشكل 4B).

يمثل البول بيئة معادية للخلايا بسبب ارتفاع الضغط التناضحي وانخفاض درجة الحموضة. ولذلك فمن الأهمية بمكان لنجاح البروتوكول أن تتم معالجة العينات في أقرب وقت ممكن عند جمع البول. على هذا النحو ، يجب تخفيف البول الذي تم جمعه وغسله على نطاق واسع بمحلول عازل في أقرب وقت ممكن لضمان وجود خلايا قابلة للحياة في وقت البذر. معدل نجاح إنشاء أنبوبي سينخفض بشكل ملحوظ إذا تم تخزين البول لعدة ساعات قبل المعالجة. وأخيرا، على الرغم من العقيمة، البول لديه مخاطر عالية من التلوث المرتبطة بعملية جمع. ولذلك فمن المهم لتكملة الغسيل والنمو المتوسطة مع المضادات الحيوية والعوامل المضادة للفطريات. عند أخذ كل ما سبق في الاعتبار، يمكن تحقيق معدل نجاح يبلغ حوالي 50٪.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر جميع المرضى وأسرهم على مشاركتهم في الدراسة. نشكر الفريق السريري الذي سهل أبحاثنا. نحن ممتنون لدعم مجلس البحوث الأوروبي (ERC) منحة البدء 850571 (J.D.) ، وجمعية السرطان الهولندية (KWF) / جائزة Alpe d'HuZes Bas Mulder (رقم 10218 ، J.D.) ، معهد Oncode ، ومؤسسة الأطفال الخالية من السرطان (KiKa no. 292 ، C.C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 Tocris 2939/10 Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634010
antiPAX8 antibody LSBio LS-B13466
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044 Stock of 50x, final concentration of  1x
BME Trevigen 3533-010-02
Collagenase Sigma Aldrich  C9407 Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF Peprotech AF-100-15 Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine Gibco 35050061 Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes Gibco 15630106 Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells CELLSTAR 665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells CELLSTAR 662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells CELLSTAR 657160
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140163 Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics Invivogen ant-pm-1 Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer Roche 11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience M1817 Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent ThermoFisher Scientific 12605010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Romagnani, P., et al. Chronic kidney disease. Nature Reviews. Disease Primers. 3, 17088 (2017).
  2. Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. Organoid models of childhood kidney tumours. Nature Reviews. Urology. 17 (6), 311-313 (2020).
  3. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  4. Low, J. H., et al. Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell Stem Cell. 25 (3), 373-387 (2019).
  5. Little, M. H., Combes, A. N. Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents. Genes & Development. 33 (19-20), 1319-1345 (2019).
  6. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  7. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  8. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  9. Jun, D. Y., et al. Tubular organotypic culture model of human kidney. PLoS One. 13 (10), 0206447 (2018).
  10. Grassi, L., et al. Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases. Cell Death & Disease. 10 (3), 1-15 (2019).
  11. Yousef Yengej, F. A., Jansen, J., Rookmaaker, M. B., Verhaar, M. C., Clevers, H. Kidney organoids and tubuloids. Cells. 9 (6), 1326 (2020).
  12. Calandrini, C., et al. An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 1310 (2020).
  13. Jansen, J., et al. A morphological and functional comparison of proximal tubule cell lines established from human urine and kidney tissue. Experimental Cell Research. 323 (1), 87-99 (2014).
  14. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080 (2012).
  15. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  16. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  18. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  19. Morales-Alvarez, M. C. Nephrotoxicity of antimicrobials and antibiotics. Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (1), 31-37 (2020).
  20. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  21. Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
  22. Dörrenhaus, A., et al. Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system. Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).

Tags

علم الأحياء، العدد 170،
جيل من توبولويدات الكلى البشرية من الأنسجة والبول
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calandrini, C., Drost, J. Generation … More

Calandrini, C., Drost, J. Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine. J. Vis. Exp. (170), e62404, doi:10.3791/62404 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter