Summary
Mänskliga njure tubuloid kulturer representerar en värdefull in vitro modell för att studera njure fysiologi och sjukdom. Tubuloider kan etableras från njurvävnad (frisk och sjuk) samt urin, den senare representerar en lättåtkomlig och mindre invasiv källa till forskningsmaterial.
Abstract
Vuxna stamceller (ASC)-härledda humana njure epitelorganoider, eller tubuloider, kan fastställas från friska och sjuka njure epitel med hög effektivitet. Normala njure tubuloider rekapitulera många aspekter av deras ursprungsvävnad. De representerar distinkta nephronsegment - särskilt av den proximala tubuleen, slingan av Henle, distala tubules och samlande kanal - och kan användas för att studera normal njurfysiologi. Dessutom underlättar tubuloidteknik sjukdomsmodellering, t.ex.för infektionssjukdomar såväl som för cancer. Erhållande njure epitelceller för tubuloid generation är dock beroende av överblivna kirurgiska material (såsom partiella) nephrectomies) eller nål tarmbiopsier. Förmågan att odla tubuloider från urin skulle ge en alternativ, mindre invasiv källa till friska njure epitelceller. Det har tidigare visat sig att tubuloidkulturer framgångsrikt kan genereras från endast några milliliter nyuppsamlad urin. Denna artikel beskriver protokollen för att generera och föröka ASC-härledda mänskliga njure tubuloid kulturer från vävnad och urin prover.
Introduction
Njurar utför funktionen att systemiskt kontrollera balansen i kroppsvätskor. Försämringen av deras fysiologiska funktion kan orsakas av olika faktorer, inklusive diabetes, högt blodtryck och läkemedelsinducerad toxicitet1. För en bättre förståelse av normal njurfysiologi samt utveckling av njursjukdomar är användningen av representativa prekliniska modeller avgörande. Under de senaste åren har flera in vitro njurmodeller genererats baserat på den så kallade organoidtekniken2. Organoider är tredimensionella, multicellulära strukturer som liknar vävnadens morfologi och fysiologi (normal eller sjuk) från vilken de härstammar. De kan genereras från pluripotenta (PSC) eller vuxna stamceller (ASCs), var och en med sina egna egenskaper och applikationer.
PSC-härledda njurorganoider efterliknar nefropgenes3,4,5. De kan också fastställas från patient-härledda engagerade celler genom påtvingad dedifferentiering (inducerad pluripotens eller iPSC). iPSCs kan därefter differentieras till de olika celltyperna av nephron, den funktionella enheten i njuren, genom snabb exponering för specifika tillväxtfaktorcocktails. Samtidigt som de skapar ett ganska komplett miniorgan i en maträtt, är deras etablering fortfarande tidskrävande, och på grund av omprogrammeringsprotokollet kan iPSCs vara mottagliga för oönskad genetisk instabilitet6. Dessutom kan iPSC-organoider inte fullt mogna till vuxna njurceller, vilket avslöjar en transkriptomprofil som liknar foster njuren i ett tidigt utvecklingsstadium7.
ASC-härledda mänskliga njure tubuloider har visat sig rekapitulera förnyelsen av vuxna njure epitel. De representerar främst den proximala tubuleen, slingan av Henle, distala tubules och samlande kanal, vilket bekräftas av uttrycket av olika transportörproteiner8,9,10. Tubuloidkulturprotokollet möjliggör snabb expansion av patientledd njurvävnad, samtidigt som ett stabilt genom bibehålls. Forskningsapplikationer inkluderar studier av normal njurfysiologi, nefrotoxicitet, drogtestning, samt sjukdomsmodellering8,10,11,12. En potentiell begränsning av etableringen av patientbaserade organoidkulturer, inklusive tubuloider, är tillgången på färsk vävnad. Flera rapporter har dock visat att urin kan fungera som en källa för njure epitelceller, vilket ger en mycket enklare, mindre invasiv strategi för att få patientmaterial för tubuloidkulturer8,13,14. Det har faktiskt nyligen visat sig att tubuloider kan odlas från urin8. Denna artikel beskriver etablering och underhåll av tubuloid kulturer från njurvävnad och urin.
Protocol
OBS: De experiment som beskrivs häri godkändes av den medicinska etiska kommittén vid Erasmus Medical Center (Rotterdam, Nederländerna) och Princess Máxima Center for Pediatric Oncology (Utrecht, Nederländerna).
1. Generering av humana njure tubuloider från vävnad
- Material
- Förvärm multiwell vävnad kulturplattor (6, 12 och 24 brunnar) över natten vid 37 °C.
- Förbered basal medium (AdDF +++) genom att lägga till 1x L-alanin/L-glutamin tillägg, 1% w/v 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazin etanesulfonsyra (HEPES, 10 mM) och 1% Penicillin/Streptomycin antibiotika till Advanced DMEM/F12.
- Förbered odlingsmediet genom att lägga till 1,5% B27 tillägg, 10% R-spondin-konditionerat medium, epidermal tillväxtfaktor (50 ng/ml), fibroblasttillväxtfaktor-10 (100 ng/ml), N-acetylcystein (1,25 mM), Rhokinashämmare eller Y-27632 (10 μM), bredspektrumantibiotika (0,1 mg/ml) och A83-01 (5 μM) till AdDF+++. Värm till 37 °C före användning.
- Förbered källarmembranextraktet (BME) genom att tina upp en alikvot över natten vid 4 °C. Håll BME på is under proceduren.
- Förbered kollagenaslösning genom att späda ut kollagenas till en slutlig koncentration på 1 mg/ml i AdDF+++, med tillsats av 10 μM Y-27632. Värm upp till 37 °C.
- Förbered 10 cm petriskålar, skalpeller och pincett. Desinficera redskapen genom att applicera en ultraviolett lampa i 20 minuter, följt av tvätt med desinfektionsmedel, demivatten och 70% v/v etanol. Lufttorka redskapen.
- Förvärm en horisontell skakapparat till 37 °C.
- Procedur
- Samla njurvävnad i ett 50 ml-rör fyllt med 30-40 ml AdDF+++medium. Placera vävnadsbiten i ~1 ml medium i en 10 cm Petri-skål. Hacka vävnaden i bitar av ~1 mm3 storlek med skalpeller (Figur 1A).
- Överför den malda vävnaden till ett 15 ml-rör med tång och skalpeller. Tillsätt 5 ml AdDF+++ till Petri-skålen, tvätta och samla mediet med en 10 ml steril pipett. Överför allt detta innehåll till samma rör.
- Centrifugera vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur och ta bort supernaten. Tillsätt 3-4 ml kollagenlösning till 15 ml-röret. Flytta röret till en horisontell skakapparat inställd vid 37 °C och en hastighet av 250 varv/min.
- Efter de första 15 minuters inkubation, kontrollera provet och skaka röret kraftigt. Upprepa tills suspensionen är homogen och de flesta vävnadsbitar har försvunnit, med en maximal inkubationstid på 45-60 min. (Figur 1B).
- Fyll röret med AdDF+++, och blanda genom att invertera röret 5-10x. Centrifug vid 300 × g i 5 min vid 4 °C och ta bort supernaten. Om pelleten är röd, fortsätt med steg 1.2.6. Annars går du till steg 1.2.8.
- Tillsätt 1 ml lysbuffert för röda blodkroppar (se materialförteckningen)ovanpå cellpelleten. Knacka försiktigt på röret för att återanvända pelleten (återanvänd inte med pipettspets). Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
- Fyll röret med AdDF+++. Centrifug vid 300 × g i 5 min vid 4 °C och ta bort supernaten. Om blodkroppar fortfarande är synliga, upprepa proceduren en gång till, från steg 1.2.6. Annars fortsätter du med steg 1.2.8.
- Om bitar av vävnad är synliga vid denna punkt i protokollet, fortsätt med steg 1.2.8. I annat fall, fortsätt med mätningen av pelletsvolymen i steg 1.2.9. Tillsätt 5 ml AdDF+++ i röret och återanvänd med en 10 ml steril pipett. Filtrera fjädringen genom en 100 μm nyloncellssil placerad på ett 50 ml-rör.
- Överför den filtrerade fjädringen till ett nytt 15 ml-rör. Centrifug vid 300 × g i 5 min vid 4 °C och ta bort supernaten. Mät volymen på cellpelleten med en p1000-pipett inställd på en känd volym. Försiktigt pipett upp och ner för att återanvända utan att skapa luftbubblor. Överför röret till is i 1 minut.
- Tillsätt 70-75% volym BME till pelleten. Återanvänds med en p1000- eller p200-pipett. och platta 15 μL droppar i en förvärmd cellkulturplatta med flera brunnar (6, 12 eller 24 brunnar, baserat på total pläteringsvolym (<100 μL, 24 brunnar; 100-200 μL, 12 brunnar; >200 μL, 6 brunnar)).
- Vänd plattan upp och ner och låt plattan vila i inkubatorn i 15-20 min vid 37 °C (figur 1C). Lägg till förvärmt kulturmedium och inspektera kulturerna(figur 1C,D).
2. Generering av humana njure tubuloider från urin
OBS: Urin är en fientlig miljö för celler. Det är viktigt för ett framgångsrikt utförande av detta protokoll att urinprover bearbetas så snart som möjligt, helst inom 4 timmar från utsöndring. Under tiden ska urinprover förvaras vid 4 °C.
- Material
- Förvärm multiwell vävnad kulturplattor (6, 12 och 24 brunnar) över natten vid 37 °C.
- Förbered tvättmedel: AdDF+++ kompletterat med bredspektrumantibiotika (0,1 mg/ml) och 10 μM Y-27632.
- Förbered kulturmediet enligt beskrivningen ovan. Värm upp vid 37 °C före användning.
- Förbered BME-matrisen. Håll dig på is under proceduren.
- Procedur
- Samla ett urinprov och dela upp det lika i 50 ml rör (Figur 2A-I). Tillsätt 10-20 ml tvättmedel till vart och ett av rören. Centrifug vid 300 × g i 5 min vid 4 °C (figur 2A-II) och avlägsna supernatanten försiktigt.
- Tillsätt 10 ml tvättmedel till vart och ett av rören. Återanvänd försiktigt pelletsen med en 10 ml steril pipett. Centrifug vid 300 x g i 5 min vid 4 °C (figur 2A-III) och ta försiktigt bort supernatanten.
- Återanvänd pelletsen och överför innehållet i alla rör till ett 15 ml-rör. Fyll röret med tvättmedium. Centrifug vid 300 x g i 5 min vid 4 °C (figur 2A-IV) och ta bort supernatanten.
- Mät volymen på cellpelleten med en p1000-pipett inställd på en känd volym. Försiktigt pipett upp och ner för att återanvända utan att skapa luftbubblor. Överför röret till is i 1 minut.
- Tillsätt 70-75% volym av BME till pelleten. Återanvänds med en p1000- eller p200-pipett. och platta 15 μL droppar i en förvärmd cellkulturplatta med flera brunnar (6, 12 eller 24 brunnar, baserat på total pläteringsvolym (<100 μL, 24 brunnar; 100-200 μL, 12 brunnar; >200 μL, 6 brunnar)).
- Vänd plattorna upp och ner i inkubatorn i 15-20 min vid 37 °C. Tillsätt förvärmt kulturmedium och inspektera kulturerna (Figur 2B).
3. Utvidgning av tubuloidkulturer
OBS: Tubuloidkulturer kan passeras ungefär var 1-2 veckor med ett delat förhållande på 1:2-1:3. De kan vanligtvis utökas för cirka 15 passager, med linjespecifika variationer.
- Material
- Förvärm multiwell vävnad kulturplattor (6, 12 och 24 brunnar) över natten vid 37 °C.
- Förbered basalt medium (AdDF+++) och håll det på is under proceduren.
- Förbered kulturmediet som tidigare beskrivits. Värm upp till 37 °C före användning.
- Förbered BME-matrisen och håll på is under proceduren.
- Förbered trypsinersättningsmedel med tillsats av Y-27632 till en koncentration av 10 μM. Värm upp till 37 °C före användning.
- Autoklav icke-filtrerade p10-spetsar.
- Kyl centrifugen till 4 °C.
- Procedur
- Stör dropparna som innehåller tubuloiderna genom att pipettera upp och ner med en p1000 pipett med hjälp av mediet som finns i brunnen. Använd spetsen för att skrapa botten av brunnen och se till att samla alla celler som är fästa på botten.
- Samla innehållet i ett 15 ml-rör. Lägg till 10 ml AdDF+++. Centrifug vid 300 x g i 5 min vid 4 °C och ta bort supernaten.
- Baserat på pelletens storlek, tillsätt trypsinersättningsmedel kompletterat med 10 μM Y-27632. Använd 1 ml trypsinersättningsmedel för 200 μL BME-droppar som innehåller tubuloider. Inkubera vid 37 °C i 5 min.
- Använd en p1000-pipett med spets och sätt i en icke-filtrerad, steril p10-spets över 1000 μL-spetsen. Pipett upp och ner för 20-30x för att mekaniskt störa organoiderna.
- Kontrollera under mikroskopet om det finns många intakta organoider kvar i röret (figur 3A). Om mer än 10% av intakta organoider finns vid denna tidpunkt, upprepa från 5 min inkubation i steg 3.2.3 till mikroskopisk observation för intakta organoider i steg 3.2.5 igen. Annars fortsätter du med steg 3.2.6.
- Fyll röret med AdDF+++. Centrifug vid 300 × g i 5 min vid 4 °C och ta bort supernaten. Mät volymen på cellpelleten med en p1000-pipett inställd på en känd volym. Försiktigt pipett upp och ner för att återanvända utan att skapa luftbubblor. Överför röret till is i 1 minut.
- Tillsätt 70-75% volym BME till pelleten. Återanvänds med en p1000- eller p200-pipett. och platta 15 μL droppar i en förvärmd cellkulturplatta med flera brunnar (6, 12 eller 24 brunnar, baserat på total pläteringsvolym (<100 μL, 24 brunnar; 100-200 μL, 12 brunnar; >200 μL, 6 brunnar)).
- Vänd plattorna upp och ner och låt plattan vila i inkubatorn i 15-20 min vid 37 °C. Tillsätt förvärmt kulturmedium och inspektera kulturerna (Figur 3B).
Representative Results
För njurvävnad uppträder tubuloidstrukturer vanligtvis inom 7 dagar efter etableringen (figur 1D). Brist på uppenbar tillväxt inom de första 7 dagarna tyder på ett misslyckat resultat av protokollet. I allmänhet måste tubuloidkulturer passeras inom 1-2 veckor efter första pläteringen. För urin blir celltillväxten uppenbar cirka 14-21 dagar efter etableringen, med utseendet av kompakta tubuloidstrukturer och/eller vidhäftande celler på botten av plattan (Figur 2B). Kulturetablissemanget har sannolikt misslyckats om ingen tillväxt kan upptäckas med ett ljust mikroskop inom 4 veckor efter plätering. För urin-härledda kulturer sker den första passagingen i allmänhet mellan 3 och 4 veckor. Medan njure tubuloidkulturer i de första passagerna huvudsakligen består av kompakta strukturer, ökar närvaron av cystiska epitelial tubuloider med ökningen av passagenumret (figur 1D och figur 2B). Den framgångsrika generationen av mänskliga njure tubuloid kulturer kan bedömas genom att utföra immunohistochemical färgning för markörer uttryckt i tubular njure epitel, såsom parat box gen 8 protein (PAX8) (Figur 4A, B).
Figur 1: Vävnadsbaserade njure tubuloidkulturer. Vävnaden mals till en storlek av ~ 1 mm3 med skalpeller. B)Exempel på korrekt enzymatisk matsmältning av frisk njurvävnad. Vävnad visas före (vänster) och efter (höger) 45 min enzymatisk matsmältning med kollagenas. Få bitar av vävnad är fortfarande synliga längst ner i röret, och lösningen bör bli grumlig, vilket indikerar närvaron av celler i suspensionen. C)Representativ bild av cellkulturplattor efter plätering av BME-droppar som innehåller den bearbetade njurvävnaden. Efter plätering av dropparna vänds odlingsplattor upp och ner (vänster) och placeras i inkubatorn vid 37 °C. Efter 15-20 min tillsätts förvärmt kulturmedium till brunnen (höger). D)Representativa ljusfältsbilder av vävnadsbaserade tubuloidkulturer. De första tubuloidstrukturerna blir synliga 2-3 dagar efter första sådd. Med ökande passage nummer, tubuloider ändrar vanligtvis morfologi till en mer cystic fenotyp. Skalstänger = 300 μm. Förkortningar: BME = källarmembranextrakt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Urinbaserade njure tubuloidkulturer. Så snart som möjligt efter insamling (I) delas urinprover in i 50 ml rör och späds i tvättmedel (II). Efter ett andra tvättsteg (III) slås rörens innehåll samman och ett tredje och sista tvättsteg (IV) utförs före plätering. B)Representativa ljusfältsbilder av urinbaserade tubuloidkulturer. De första tubuloidstrukturerna och vidhäftande cellerna ska vara synliga inom 21 dagar efter första pläteringen. Skalstänger = 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:Passaging av njure tubuloid kulturer. (A) Representativ bild av njure tubuloid kulturer efter enzymatiska matsmältningen. Efter avslutad matsmältning bör inte mer än 10% av intakta tubuloidstrukturer förbli. Skala stång = 300μm. (B) Representativ bild av njure tubuloid kulturer efter plätering. Inspektion av kulturerna bekräftar att majoriteten av tubuloiderna har störts. Skalbar = 300 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologisk karakterisering av tubuloidkulturer. Skalstänger = 100 μm. (B) Immunohistokemi av PAX8 i normal njurvävnad, tubuloider, MRTK-vävnad och MRTK-organoider. PAX8 positivitet av organoid strukturer bekräftar deras njure epitelial ursprung. Hälsosam njurvävnad visar både positiva (tubules) och negativa strukturer (glomeruli). MRTK vävnad och organoider ingick som negativ kontroll. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; PAX8 = parat boxas genen 8; MRTK = maligna rhabdoid tumör i njuren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Organoider anses vara avatarer av den vävnad från vilken de härleds. De möjliggör snabb expansion av patientmaterial samtidigt som de behåller de genotypiska och fenotypiska egenskaperna hos ursprungsvävnaden15. Organoid teknik har nyligen öppnat dörrarna för utveckling av mer representativa prekliniska modeller, som kan användas som viktiga verktyg för att översätta resultaten från bänken till sängen. Njure tubuloider är lovande in vitro-modeller för testning av läkemedelsinducerad nefrotoxicitet, en vanlig biverkning av många kemoterapeutiska läkemedel2,8,12. Som sådan visades patient-härledda tumör organoid kulturer vara prediktiv för patientens svar på behandling16,17,18. Testning av läkemedel på ett höggenomströmningssätt på tubuloider möjliggör därför potentiellt bättre definition av terapeutiska fönster och minskar risken för läkemedelsinducerad nefrotoxicitet hos patienter.
Vanliga antibiotika har beskrivits för att utöva en toxisk effekt på njurarna19. Även om förekomsten av bredspektrumantibiotika är nödvändig för att framgångsrikt etablera kulturerna genom att förhindra kontaminering, är det viktigt att överväga deras potentiella nefrotoxicitet. Även om inga negativa effekter av antibiotika har observerats på upprättandet av tubuloid kulturer, ytterligare undersökning behövs för att noggrant utvärdera deras effekter. Tubuloider kan utnyttjas för studier och modellering av sjukdomar8. Ciliopathies (patologisk dysfunktion av cilia) liksom andra genetiska syndrom som påverkar njuren kan studeras genom att antingen generera tubuloidlinjer direkt från drabbade försökspersoner, eller genom att använda friska kulturer där sjukdomsspecifika förarmutationer kan introduceras via CRISPR/ Cas9 genomredigering20.
Även om tubuloider är multicellulära njurkulturer, saknar de flera njurcellstyper, inklusive podocyter och endotelceller8. Dessutom, i motsats till vissa andra ASC-härledda organoidmodeller, har tubuloider en begränsad replikativ potential eftersom de kan odlas för cirka 15 passager. Denna begränsade livslängd kan dock förlängas avsevärt genom att Wnt tillförs kulturmediet21. Ytterligare optimering av tubuloid kultur protokollet krävs för att göra dem ännu mer representativa för njuren, inklusive mer differentierade celltyper. Även om effektiviteten av tubuloid etablering från vävnad prover är mycket hög (>95%), Det kan i sällsynta fall misslyckas. Det kan finnas olika orsaker, inklusive: 1) dålig kvalitet på utgångsmaterialet(t.ex.nekrotisk vävnad till följd av läkemedelsbehandling), 2) överdedigering av vävnadsprovet eller 3) kontaminering av det primära provet.
För att säkerställa att kvaliteten på de mottagna vävnadsproverna är tillräcklig för att fortsätta med protokollet är det viktigt att upprätthålla nära kontakt med patologipersonalen som utför utvärderingen av vävnaden vid operationen. Om tillräckligt med material finns tillgängligt måste dess livskraft bekräftas genom histologisk undersökning(t.ex.hematoxylin och eosinfärgning). För att förhindra celllys under enzymatisk matsmältning är det dessutom viktigt att inkubationsförfarandet inte är längre än 1 timme. Slutligen, för att förhindra kontaminering, bör antibiotika och svampdödande medel läggas till tvätt- och kulturmedierna.
Urin kan innehålla exfolierad epitelceller som inte härrör frånnjuren 22, som kan förorena tubuloidkulturerna. Dessa inkluderar till exempel urotheliumceller som i motsats till njurslangulära celler är positiva för tumörprotein P63 och negativa för PAX88. Det rekommenderas därför att testa odlingarna för PAX8-positivitet för att bekräfta renheten hos etablerade njur tubuloidlinjer innan du fortsätter med uppföljande experiment (figur 4B).
Urin representerar en fientlig miljö för celler på grund av högt osmotiskt tryck och lågt pH. Det är därför avgörande för protokollets framgång att prover bearbetas så snart som möjligt vid urininsamling. Som sådan bör den insamlade urinen spädas och tvättas i stor utsträckning med buffrad lösning så snart som möjligt för att säkerställa förekomst av livskraftiga celler vid sådd. Framgångsgraden för tubuloidetablering kommer att minska avsevärt om urin lagras i flera timmar före bearbetning. Slutligen, även om urinen är steril, har den stor risk för kontaminering i samband med insamlingsprocessen. Det är därför viktigt att komplettera tvätt- och tillväxtmedium med antibiotika och svampdödande medel. När man tar hänsyn till allt ovanstående kan en framgångsgrad på cirka 50 procent uppnås.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar alla patienter och deras familjer för att de deltagit i studien. Vi tackar det kliniska teamet som underlättade vår forskning. Vi är tacksamma för stödet från Europeiska forskningsrådets (ERC) startbidrag 850571 (J.D.), Holländska cancerföreningen (KWF)/Alpe d'HuZes Bas Mulder Award (nr 10218, J.D.), Oncode Institute och Foundation Children Cancer Free (KiKa nr 292, C.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
| antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
| BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
| GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
| Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
| Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
| Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
| Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
| Primocin - broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
| Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
| RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
| R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
| TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Romagnani, P., et al.
- Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. Organoid models of childhood kidney tumours. Nature Reviews. Urology. 17 (6), 311-313 (2020).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Low, J. H., et al. Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell Stem Cell. 25 (3), 373-387 (2019).
- Little, M. H., Combes, A. N. Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents. Genes & Development. 33 (19-20), 1319-1345 (2019).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Jun, D. Y., et al. Tubular organotypic culture model of human kidney. PLoS One. 13 (10), 0206447 (2018).
- Grassi, L., et al. Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases. Cell Death & Disease. 10 (3), 1-15 (2019).
- Yousef Yengej, F. A., Jansen, J., Rookmaaker, M. B., Verhaar, M. C., Clevers, H.
- Calandrini, C., et al. An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 1310 (2020).
- Jansen, J., et al. A morphological and functional comparison of proximal tubule cell lines established from human urine and kidney tissue. Experimental Cell Research. 323 (1), 87-99 (2014).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080 (2012).
- Drost, J., Clevers, H.
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Morales-Alvarez, M. C.
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Dörrenhaus, A., et al. Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system. Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).
