Summary
İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.
Abstract
İnsan astrositlerinin karmaşıklığı, birincil insan dokusunda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve izolasyonları ve moleküler karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Floresan ile aktive edilen çekirdek sıralama (FANS), insan nöronal çekirdek (NeuN +) popülasyonlarını donmuş arşiv dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek ve incelemek için kullanılabilir, böylece taze dokuyla ilgili sorunlardan kaçınılır. Bununla birlikte, astroglia'yı nöronal olmayan (NeuN-) elementten benzer şekilde izole etme çabaları eksiktir. Yakın zamanda geliştirilen ve doğrulanmış bir immünoetiketleme stratejisi, zenginleştirilmiş nöronal (NeuN +), astrosit (eşleştirilmiş kutu protein 6 (PAX6) + NeuN-) ve oligodendrosit progenitör (OLIG2 + NeuN-) çekirdek popülasyonlarını hastalıksız, taze (sabitlenmemiş) dondurulmuş postmortem insan temporal neokorteks dokusundan eşzamanlı olarak izole etmek için üç transkripsiyon faktörü antikoru kullanır.
Bu tekniğin primer patolojik epilepsi neokorteksindeki hücre tipine özgü transkriptom değişikliklerinin karakterizasyonunda yararlı olduğu gösterilmiştir. Transkriptomik analizler, PAX6 + NeuN sıralanmış popülasyonların pan-astrosit belirteçleri için sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ve hem dinlenme hem de reaktif koşullarda astrositleri yakaladığını doğruladı. Bu makalede, astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının taze dondurulmuş insan korteksinden, doku ayrışmasının tek çekirdekli (sn) süspansiyona ayrıştırılması da dahil olmak üzere izolasyonu için FANS metodolojisi açıklanmaktadır; çekirdeklerin anti-NeuN ve anti-PAX6 floresan konjuge antikorlarla immünoetiketlenmesi; FANLAR, sıralama sırasında hassasiyeti ve özgüllüğü optimize etmek ve astrosit zenginleştirmesini onaylamak için geçit stratejileri ve kalite kontrol metrikleri; ve toplu veya sn çözünürlükte aşağı akış transkriptom ve kromatin erişilebilirlik sıralaması için önerilen tedarik. Bu protokol, çeşitli patolojileri olan nekrotik olmayan, taze dondurulmuş, insan kortikal örnekleri ve 24 saat içinde önerilen postmortem doku toplanması için geçerlidir.
Introduction
İnsan astrositlerinin moleküler karmaşıklığı, birincil dokuda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve hem sağlıkta hem de hastalıkta yüksek çözünürlükte izolasyonları ve karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Bozulmamış insan nöronlarının ve glia'nın nişlerinden ayrılmasının, taze beyin dokusu örneklerinin sınırlı erişimi, glial ve nöronal süreçlerin yoğun bir şekilde birbirine bağlı doğası ve işleme sırasında kaçınılmaz hücresel aktivasyon nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır; bunların hepsi bu hücre tiplerinin moleküler karakterizasyonunu ex vivo1 . Floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS), canlı hücre sıralamaya alternatif olarak ortaya çıkmış ve çekirdek popülasyonlarının donmuş dokudan ayrışmasını ve immün etiketlemesini sağlamıştır. Son on yılda, FANS, çeşitli beyin örneklerinde ve anatomik bölgelerdeinsan nöronal (NeuN +) çekirdek popülasyonlarını izole etmek ve moleküler olarak karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4.
Bununla birlikte, spesifik glial çekirdek alt popülasyonlarını insan korteksinden izole etmek için benzer yöntemler sınırlandırılmış ve hem normal hem de hastalıklı dokularda astrosit karmaşıklığının anlaşılmasında göreceli bir karmaşıklık eksikliğine yol açmıştır. Bu amaçla, FANS4 kullanarak insan nöronal popülasyonlarını izole etmek için daha önce yayınlanmış bir protokol uyarlandı ve üçlü bir antikor kombinasyonu kullanarak astrositler (ve oligodendroglial progenitörler) için zenginleştirmek için bir yöntem doğrulandı ve astrositleri hem dinlenme hem de reaktif koşullarda yakaladı5. NeuN fraksiyonundaki astrositler için spesifik olarak zenginleştirmek için, antikorlar astrosit popülasyonları arasında farklı olarak eksprese edildiği bilinen iki transkripsiyon faktöründen birine karşı kullanıldı, PAX6 veya SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9)6,7. PAX6, germinal bölgelerdeki radyal glia benzeri progenitörlerde erken fetal gelişim sırasında yüksek oranda eksprese edilir ve hem nörogenez hem de gliogenez 8,9,10,11'e ve retinal nöronal spesifikasyona katkıda bulunur 12. Yetişkinlerde, PAX6, istirahat eden insan astrositlerinde6 farklı şekilde aşırı eksprese edilir ve insan epilepsi dokusu astrositlerinde glial fibriler asidik protein (GFAP) ile protein birlikte ekspresyonu gösterir13.
Bu protokol, neokortikal nöronal ve astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının FANS tarafından eşzamanlı izolasyonunu tanımlar. Yetişkin korteksten toplanan taze (sabitlenmemiş) çıtçıtlı dondurulmuş (yani, taze-dondurulmuş) postmortem doku ilk önce mekanik ve kimyasal olarak ayrışır. Bir sakkaroz gradyanında lizis ve ultrasantrifüjlemeden sonra, çekirdekler korunurken sitoplazmik ve hücre dışı bileşenler atılır. Çekirdekler daha sonra istenen hedef soylara karşılık gelen floresan konjuge nükleer antikorlarla etiketlenir ve FANS kullanılarak sıralanır. Bu yaklaşımı takiben, astrositlerin zenginleştirilmesi, toplanan PAX6 + NeuN- popülasyonlarında, hem hedeflenen bir qPCR paneli hem de aşağı akış nükleer RNA dizilimi ile doğrulanarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki (ISMMS) İnsan Deneklerin Korunması Programı ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), araştırmanın etik olarak yürütülmesini ve federal, eyalet ve kurumsal düzenlemelere uyumu garanti eder. Bu çalışmada, kullanılan tüm ölüm sonrası örnekler kimliksizleştirilmiş, biyodepo yoluyla uygun rıza altında elde edilmiş ve ISMMS'nin IRB'si (HS # 14-01007) tarafından "insan araştırması" tanımından muaf tutulmuştur.
1. Tampon hazırlama
NOT: Aşağı akış RNA dizilimi gerçekleştiriyorsanız, mRNA bozulmasını önlemek için tüm çalışma alanlarını ve aletleri RNaz Dekontaminasyon Çözeltisi ile iyice işleyin.
- Lizis tamponu hazırlayın.
- Aşağıdakileri damıtılmış H 2 O'da50 mL'ye kadar çözün: 5,47 g sakkaroz (0,32 M final), 250 μL 1 M CaCl 2 (5 mM final), 150 μL 1 M Mg (CH 3 COO)2 (3mM final), 10 μL 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (0,1 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 50 μL Triton X-100 (%0,1 nihai) ve 17 μL 3 M ditiyotreitol (DTT, 1 mM final, taze ekleyin) (bkz.
- Sakkaroz tamponu hazırlayın
- Aşağıdakileri damıtılmış H 2 O'da50 mL'ye kadar çözün: 30,78 g sakkaroz (1,8 M final), 150 μL 1 M Mg (CH 3 COO)2 (3 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL3M DTT (1 mM final, taze ekleyin).
2. Dondurulmuş dokunun tek çekirdekli süspansiyona ayrışması
- 7 mL'lik bir cam doku sıçramacısına (öğütücü) 4 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde tutun. Yaklaşık 200-400 mg taze dondurulmuş insan yetişkin korteksi diseksiyonu, yaklaşık 50x sıçraması ve doku homojenatını 12 mL ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın.
- 5 mL'lik bir pipet kullanarak, ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mL buz gibi soğuk sakkaroz tamponu ekleyin ve sakkaroz ile doku homojenatı arasındaki tabakayı bozmamaya özen gösterin.
NOT: Ek numuneler işleniyorsa, daha hafif numuneye ilave lizis tamponu ekleyerek tüpleri ağırlığa göre dikkatlice dengeleyin. Ultra santrifüj tüplerinin hassas bir şekilde dengelenmesi, rotorun zarar görmesini önlemek ve uygun hızda dönmeyi sağlamak için çok önemlidir.
3. Ultrasantrifüjleme
- Lisatı 4 °C'de 1 saat boyunca 24.400 rpm'de (101.814 × g) ultrasantrifüj yapın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatant ve kalıntıları dikkatlice aspire edin.
NOT: 200 mg'dan az doku ile başlandığında pelet görünmeyebilir. - Çekirdek peletine 600 μL fosfat tamponlu salin (PBS) (Ca2+, Mg2+ serbest) ekleyin ve yeniden askıya almadan önce 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Buz üzerindeki çekirdek peletini yeniden askıya almak için pipeti 50 kez yukarı ve aşağı doğru çekin.
- Bozulmamış çekirdekleri mikroskop altında görselleştirmek ve bir sonraki adıma geçmeden önce ressüspansiyonun konsantrasyonunun 105 çekirdek / mL'nin üzerinde olmasını sağlamak için bir hemositometre kullanın (yeniden askıya alınan çekirdeklerin 10 μL'sini 10 μL tripan mavisi ile birleştirin).
4. Antikor inkübasyonu
- FANS için numuneyi immünoetiketlemek için, yeniden askıya alınmış numune peletinin 500 μL'sini, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ serbest), 10 μL % 10 BSA (% 0.1 nihai), AF555'e konjuge edilmiş 1 μL fare anti-NeuN antikoru (NeuN-AF555, 1:1000 son konsantrasyon) ve allofikoksiyanine konjuge edilmiş 1 μL fare anti-PAX6 antikoru (PAX6-APC, 1:1000 nihai konsantrasyon) ekleyin.
NOT: Diğer floroforlara konjuge alternatif antikorlar eklenebilir (tartışmaya bakınız). Burada, AF488'e (1:1000 konsantrasyon) konjuge edilmiş fare anti-OLIG2 olumlu sonuçlarla kullanıldı. - Gerektiğinde numunenin az bir miktarını kullanarak geçit parametrelerini ayarlamak için 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) yalnızca ve tek renkli kontroller gerçekleştirin.
- AF555 tek renk kontrolünü gerçekleştirmek için, 20 μL yeniden askıya alınmış numune peleti, 970 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg2+ içermez), 10 μL% 10 BSA (% 0.1 nihai) ve 1 μL NeuN-AF555 antikoru (1:1000 konsantrasyon) ekleyin.
- APC tek renk kontrolünü gerçekleştirmek için, 20 μL yeniden askıya alınmış numune peleti, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ içermeyen), 10 μL% 10 BSA (% 0.1 nihai) ve 1 μL PAX6-APC antikoru (1:1000 konsantrasyon) ekleyin.
- Yalnızca DAPI kontrolü gerçekleştirmek için, yeniden askıya alınan numune peletinin 20 μL'sini, 970 μL'sini 1X PBS'yi (Ca2+, Mg2+ içermeyen) ve 10 μL'sini %10 BSA'yı (%0,1 nihai) ekleyin (DAPI daha sonra eklenecektir, bkz. 4,4).
NOT: İkiden fazla antikor kullanılıyorsa, tek renkli kontrollere ek olarak floresan-eksi-bir (FMO) kontrolünün yapılması önerilir.
- Numuneleri ve kontrolleri karanlıkta 4 °C'de 1 saat boyunca dönerek inkübe edin.
- Tüm örneklere ve denetimlere 1:1000'de DAPI ekleyin ve sıralamaya devam edin.
5. Floresan ile aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS)
NOT: Akış sitometrisi/ayıklama tekniklerinde zaten yetkin olmadıkça, eğitimli personelin yardımıyla kurumsal bir akış sitometrisi tesisinin kullanılması önerilir.
- Kapı aşağıda gösterildiği gibi.
- İlk önce ve her numune için, ileri saçılma (FSC-A) ve karşı kapı yan saçılma (SSC-A), çekirdekler için uygun boyut aralığındaki parçacıkları içerecek şekilde dahil eder, böylece kırmızı kan hücrelerini ve kalıntıları hariç tutar (Şekil 1A).
NOT: Çok temiz bir çekirdek preparatı, daha küçük bir enkaz kümesi ile bir çekirdek kümesi arasında ayrım yapabilir. - Daha sonra ve her numune için, FSC-A ile FSC-W (veya FSC-A ile FSC-H) ve SSC-A ile SSC-W (veya SSC-A ile SSC-H) arasındaki kapı, yalnızca singlet çekirdekleri içerecek şekilde (Şekil 1B).
- Daha sonra ve her örnek için, DAPI tarafından kapı, enkaz (DAPI-düşük, kapılı popülasyonun solunda) ve çiftler (kapılı popülasyonun sağında) hariç olmak üzere bozulmamış çekirdek teklilerini (DAPI-yüksek kapılı popülasyon) içerecek şekilde kapıdır (Şekil 1C).
- FACS grafiklerinde görsel olarak ayrı kümeler olarak belirlenen floresan kontrollerine dayalı olarak daha fazla geçit ayarlayın.
- Antikor yokluğunda popülasyonların arka plan boyamasını belirlemek için yalnızca DAPI kontrolünü çalıştırın (Şekil 1D ve Şekil 2A).
- AF555 kanalındaki NeuN+ boyama için kesintiyi belirlemek üzere yalnızca NeuN-AF555 kontrolünü çalıştırın (Şekil 2B).
- APC kanalında PAX6+ boyama için kesiği belirlemek üzere yalnızca PAX6-APC kontrolünü çalıştırın (Şekil 2C).
- Daha fazla antikor kullanıyorsanız ek tek renkli kontroller çalıştırın (Şekil 2D, E).
NOT: İkiden fazla antikor kullanılıyorsa, popülasyonlardaki herhangi bir kaymayı görselleştirmek için bir FMO kontrolü önerilir.
- Tüm kontroller çalıştırıldıktan sonra, NeuN+ ve PAX6+ koleksiyonları için kapıları belirlenen eşiklerin üzerine çizin.
- Nöronları toplamak için NeuN + popülasyonunu kapatın (Şekil 1E ve Şekil 2F).
- Astrositleri toplamak için NeuN popülasyonundan PAX6+ popülasyonunu kapatın (Şekil 1E, F ve Şekil 2F).
- NeuN-PAX6- popülasyonundan ek glial popülasyonları (burada OLIG2 + tarafından gösterildiği gibi oligodendrosit progenitör hücreleri gibi) kapılayın ve toplayın (Şekil 1F).
NOT: Belirsiz popülasyonlar nedeniyle akış sitometrisi yazılımı ile uygun geçit kesiklerinin belirlenmesinin zor olması durumunda, görselleştirilen olayların sayısını değiştirmek yararlı olabilir (FANS grafiğindeki olay sayısını artırmak veya azaltmak).
- İlk önce ve her numune için, ileri saçılma (FSC-A) ve karşı kapı yan saçılma (SSC-A), çekirdekler için uygun boyut aralığındaki parçacıkları içerecek şekilde dahil eder, böylece kırmızı kan hücrelerini ve kalıntıları hariç tutar (Şekil 1A).
- Amaçlanan aşağı akış analizine dayalı olarak örnekleri uygun şekilde toplayın.
6. Aşağı akış moleküler analizleri için FANS popülasyonlarının toplanması
- Toplu RNA dizilimi için, PBS'de 50.000-500.000 çekirdek toplayın (ayrıca bakınız bölüm 7.1).
- 2 mL sakkaroz çözeltisi, 50 μL 1 M CaCl 2 ve 30 μL 1 M Mg (CH3COO)2 ekleyin ve 10 mL'ye kadar PBS ile doldurun.
- 15 dakika boyunca buz üzerinde ters çevirin ve inkübe edin, ardından 4 ° C'de 10-15 dakika boyunca 900 × g'de santrifüj yapın.
- Süpernatanı aspire edin, 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifinde yeniden askıya alın, girdap, kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
- Alternatif olarak, örnekleri doğrudan RNA ekstraksiyon reaktifinin 200 μL'sine toplayın. RNA ekstraksiyon reaktifini sıralamadan sonra 1 mL'ye kadar ekleyin ve reaktifin sıralanmış numuneye 1: 1 oranını koruyun. Girdap, kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
- Dizileme (ATAC-seq) kullanılarak transpozaz erişimli kromatin için toplu tahlil için,% 5 sığır serum albümini (BSA) ile kaplanmış bir mikrosantrifüj tüpünde PBS'de 50.000-75.000 çekirdek toplayın. Çekirdekleri kuru buz/-80 °C üzerinde dondurun veya hemen ATAC hazırlığı için kullanın.
- Sn RNA-seq veya ATAC-seq için, PBS'de% 0.04 BSA'da çekirdek toplayın (ayrıca bakınız bölüm 7.2).
7. Kütüphane öncesi hazırlık ipuçları
- Toplu nükleer RNA dizileme kütüphanesi hazırlığı
- RNA ekstraksiyon reaktifinde toplandıktan sonra, fenol / kloroform ekleyerek ve RNA'yı üst sulu tabakadan etanol ile çökelterek, ardından tüp üzerinde DNaz sindirimi (15 dakika) ile standart fenol / kloroform RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
- RNA temizliği yapın ve son 15 μL su hacminde konsantre olun.
NOT: Bu yöntemi kullanarak, 300 mg yetişkin korteks örneğinden temsili geri kazanım, ~ 300.000 NeuN + çekirdeği (temizleme ve konsantrasyondan sonra 15-20 ng / μL toplam RNA) ve ~ 250.000 PAX6 + çekirdeğidir (temizleme ve konsantrasyondan sonra 10-12 ng / μL toplam RNA). Bu temsili verim, numune kalitesine, geçit sıkılığına ve RNA geri kazanımına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. - Kanonik astrosit belirteçlerinin (GFAP, SOX9), 10-formiltetrahidrofolat dehidrogenaz (ALDH1L1)) ve nöronal ve diğer hücre soy belirteçlerinin tükenmesine (Şekil 1G) yüksek diferansiyel ekspresyonuna dayanan astrositlerin zenginleştirilmesini doğrulamak için dizilemeden önce kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirin.
NOT: Çift negatif popülasyonun (NeuN-PAX6-) toplanması, astrositlerin göreceli zenginleşmesi için daha doğru, çok katmanlı bir qPCR kalite kontrol analizine izin verir (Şekil 2H). - Postmortem örneklerden beklendiği gibi, düşük RNA bütünlük sayısı değerleri için önerilen bir kit kullanarak RNA-seq kütüphaneleri oluşturun.
- Tek çekirdekli dizileme kütüphanesi hazırlama
- Kurumsal bir sıralama çekirdeği aracılığıyla sn sıralama gerçekleştirin.
- Nanoakışkan bazlı işleme ve dizileme için, önerilen konsantrasyonu 1 × 106 hücre/mL en az 60 μL 1x PBS + %0,04 BSA tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) için ve sıralama (snATAC-seq) kullanılarak Transpozaz Erişilebilir Kromatin için tek çekirdekli Tahlil için en az 20 μL 1x PBS + %0,04 BSA'da 3 × 106 hücre/mL kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çekirdekler taze (sabit olmayan) çıtçıtlı dondurulmuş temporal neokorteks dokusundan toplandı ve postmortem toplama süresi 12 saat idi. Çekirdek süspansiyonuna doku ayrışmasından sonra, örnekler NeuN, PAX6 ve OLIG2'ye karşı antikorlarla inkübe edildi ve Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen kapıya göre sıralandı. Çekirdekler NeuN+, PAX6+NeuN- ve OLIG2+NeuN- sıralanmış popülasyonlardan toplandı (Şekil 1E,F ve Şekil 2F). Hedeflenen bir qPCR paneli, PAX6 + (NeuN-) popülasyonundaki pan-astrosit belirteçleri, GFAP ve ALDH1L1 için zenginleştirme ortaya koydu (Şekil 1G ve Şekil 2H). Ek olarak, OLIG2+ popülasyonu oligodendrosit progenitör hücre (OPC) belirteci PDGFRA için zenginleştirilmiştir (Şekil 1G). Toplanan popülasyonların toplu RNA dizilimi, PAX6 + (NeuN-) popülasyonunda astrosit belirteçlerinin karşılaştırmalı zenginleşmesini ve nöronal belirteçlerin tükenmesini göstermiştir (Şekil 1H). İmmünofloresan, yetişkin insan kortikal astrositlerinde PAX6'nın GFAP ile kolokalizasyonunu doğruladı (Şekil 1I).
Tek renkli kontrollerin incelenmesi, her bir işaretleyici için farklı pozitif ve negatif popülasyonları ortaya çıkarır ve bu da toplama için doğru kesimlerin ayarlanmasını sağlar (Şekil 2A-G). Ayrıca, astrosit bakımından zenginleştirilmiş FANS izolasyonu, astrosit nükleer belirteçlerine karşı SOX9 ve PAX6 olmak üzere iki farklı antikor ile karşılaştırıldı. Çekirdek olaylarının daha yüksek bir yüzdesi, astrositle zenginleştirilmiş kapı içinde SOX9 (~% 6) kullanan FAN'lardan PAX6 (~% 13.8) kullanan FANS tarafından yakalanmıştır (Şekil 2F, G). Hedeflenen bir qPCR paneli, hem SOX9 + (NeuN-) hem de PAX6 + (NeuN-) popülasyonlarında GFAP, PAX6 ve SOX9 için zenginleştirme olduğunu ortaya koydu (Şekil 2H). Birkaç numunenin ayrışması ve boyanmasının, doku toplanmasının değişen postmortem aralığı (PMI) ile retroaktif olarak karşılaştırılması, daha kısa bir PMI'nın daha fazla bozulmamış çekirdek geri kazanımı ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 3A). PMI'ı 24 saate kadar olan dondurulmuş doku,% 90'a kadar yüksek oranda bozulmamış çekirdek verdi; Bununla birlikte, saat 30 PMI'da, çok az sayıda bozulmamış çekirdek geri kazanılabilir (Şekil 3A). Standart protokole bir antikor yıkama adımı dahil etmek (tipik olarak iyileşmeyi optimize etmek için bu adımı atlar), farklı NeuN + / - veya PAX6 + / - popülasyonlarının ayrılmasında önemli değişiklikler ortaya koymamıştır (Şekil 3B).
Bazen, PAX6 + NeuN- popülasyonlarının zayıf ayrılması, yüksek oranda canlı çekirdeğe sahip örneklerde bile görülebilir (Şekil 3C), doku ayrışmasının ve FANS protokolünün tekrarlanmasını gerektirir. Tek çekirdekli RNA-seq çalışmaları, PAX6'yı , sadece neokortekste değil, aynı zamanda subventriküler bölgede (SVZ) ve bitişik striatumda da hem protoplazmik hem de fibröz yetişkin astrosit alt popülasyonlarında üst diferansiyel olarak eksprese edilen nükleer transkripsiyon faktörü olarak önceliklendirmiştir (Şekil 3D). Aynı beyin örneğinden türetilen neokorteks ve striatum arasındaki NEUN / PAX6 / OLIG2 üçlü FANLARININ karşılaştırılması, PAX6 + çekirdeklerinin ayrılmasında bölgeye özgü farklılıklar göstermiştir (Şekil 3E). Bu protokol şu anda sadece neokorteks için doğrulanmıştır.
Şekil 1: Nöron ve astrositle zenginleştirilmiş izolasyonun FANS tarafından doğrulanması. (A-F) Enkaz ve çiftleri dışlamak için sıralı FANLAR geçidinin temsili örnekleri (A-C) ve (D) zenginleştirilmiş nöronal (NeuN +), astrosit (PAX6 + NeuN-) ve OPC (OLIG2 + + NeuN-) çekirdek popülasyonlarının toplanması için yalnızca DAPI kontrolünü kullanarak arka plan boyamasını tanımlayın. (G) Toplanan popülasyonların kalite kontrolü için pan-astrosit (GFAP, ALDH1L1), nöronal (RBFOX3) ve OPC (PDGFRA) belirteçleri kullanan minimal qPCR paneli (A-G: patolojisiz temporal neokorteks otopsi örneği, 12 saat PMI, gösterilen 100.000 olay; noktalı çizgiler pozitif kapılı sıralı popülasyonları temsil eder; katı çizgiler hücre tipi zenginleştirilmiş popülasyonların nihai koleksiyonunu temsil eder). (H) PAX6+ ve NeuN+ sıralanmış popülasyonlarda kanonik astrosit ve nöronal belirteçlerin ekspresyonunu gösteren sıra normalize edilmiş toplu RNA dizileme verilerinden üretilen ısı haritası (n=3 otopsi vakaları, patolojisiz temporal neokorteks, PMI 12-21 h). (I) İnsan neokorteksindeki PAX6, GFAP ve NeuN'nin temsili immünofloresan görüntüsü. Oklar, PAX6 ve GFAP'yi birlikte ifade eden astrositleri gösterir. Kısaltmalar: FANS = floresan-aktive çekirdek sıralama; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NeuN = nöronal çekirdekler; PAX6 = eşleştirilmiş kutu protein 6; OLIG2 = oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2; OPC = oligodendrosit progenitör hücre; qPCR = kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; GFAP = glial fibriler asidik protein ; ALDH1L1 = 10-formiltetrahidrofolat dehidrogenaz; RBFOX3 = RNA bağlayıcı protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = trombosit kaynaklı büyüme faktörü alfa; PMI = ölüm sonrası aralık; SSC-A = yan dağılım alanı; FSC-A = ileri dağılım alanı; SSC-W = yan dağılım genişliği; FSC-W = ileri dağılım genişliği; NeuN-555 = AF555'e konjuge edilmiş fare anti-NeuN; PAX6-APC = allofikosiyanine konjuge fare anti-PAX6; OLIG2-488 = 488 nm lazer hattı için yeşil floresan boyaya konjuge edilmiş fare anti-OLIG2. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PAX6 veya SOX9 antikorları kullanılarak astrositle zenginleştirilmiş popülasyonların karşılaştırmalı izolasyonu. (A-E) DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 ve OLIG2 için tek renkli kontroller, ilgili floresan kanallarındaki pozitif/negatif kesikleri tanımlar. (F-G) (F) NeuN/PAX6 veya (G) NeuN/SOX9 antikorları kullanılarak astrositle zenginleştirilmiş izolasyon için karşılaştırmalı FANS yöntemi. Olayların daha büyük bir yüzdesi, astrositle zenginleştirilmiş kapı içindeki SOX9'dan daha fazla PAX6 tarafından yakalanır. (A-G: Tüm deneyler için kullanılan özdeş postmortem patolojik olmayan temporal neokorteks örneği; 12 saat PMI; gösterilen 10.000 olay). (H) Kalite kontrol qPCR analizi, astrosit belirteçlerinin zenginleşmesini ve PAX6 + (NeuN-) ve SOX9 + (NeuN-) sıralanmış popülasyonlarda astrosit belirteçlerinin tükendiğini doğrular (veriler, ACTF'ye normalleştirilir ve NeuN + popülasyonunun katlama değişimi olarak ölçülür). Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NeuN = nöronal çekirdekler; PAX6 = eşleştirilmiş kutu protein 6; OLIG2 = oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2; SOX9 = SRY-box transkripsiyon faktörü 9; qPCR = kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; GFAP = glial fibriler asidik protein ; RBFOX3 = RNA bağlayıcı protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = trombosit kaynaklı büyüme faktörü alfa; PMI = ölüm sonrası aralık; NeuN-555 = AF555'e konjuge edilmiş fare anti-NeuN; PAX6-APC = allofikosiyanine konjuge fare anti-PAX6; OLIG2-488 = 488 nm lazer hattı için yeşil floresan boyaya konjuge edilmiş fare anti-OLIG2. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Başarılı FANS deneyleri için bağımlı ve bağımsız metrikler. (A) Numune toplama PMI'ının çekirdeklerin kalitesi üzerindeki etkisi: daha düşük PMI, 24 saate kadar yeterli sonuçlarla daha fazla sayıda bozulmamış çekirdeğin geri kazanılmasını sağlar. (B) Antikor inkübasyonundan sonra bir yıkama adımının dahil edilmesi, görsel olarak FANS popülasyonlarını değiştiriyor gibi görünmemektedir. (C) Bozulmamış çekirdeklerin ve düşük arka planın (solda) varlığına rağmen (solda) belirgin PAX6 + (NeuN-) popülasyonunun (sağda) eksikliği ile başarısız bir FANS deneyi örneği (postmortem temporal neokorteks, patolojik olmayan, 7 saat PMI). (D) PAX6 ve diğer iki astrosit nükleer faktörünün, SOX9 ve LHX2'nin, hem korteks hem de SVZ'deki protoplazmik ve fibröz astrosit alt popülasyonları arasında, diğer hücre tiplerine kıyasla diferansiyel ekspresyonunu gösteren yetişkin insan sn RNA-seq verilerinin ısı haritası gösterimi (kırmızı renk gradyanı, log-normalleştirilmiş ortalama gen ekspresyon değerlerinin spektrumunu temsil eder; n = 3 farklı otopsi vakası, 43.619 toplam çekirdek. (E) Farklı beyin bölgeleri (temporal neokorteks vs. SVZ ve subjacent striatum) NeuN/PAX6/OLIG2 ayrımının farklı modellerini gösterir. Kısaltmalar: FANS = floresan-aktive çekirdek sıralama; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NeuN = nöronal çekirdekler; PAX6 = eşleştirilmiş kutu protein 6; OLIG2 = oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2; GFAP = glial fibriler asidik protein ; ALDH1L1 = 10-formiltetrahidrofolat dehidrogenaz; LXH2 = LIM homeobox 2; PMI = ölüm sonrası aralık; SSC-A = yan dağılım alanı; FSC-A = ileri dağılım alanı; NeuN-555 = AF555'e konjuge edilmiş fare anti-NeuN; PAX6-APC = allofikosiyanine konjuge fare anti-PAX6; OLIG2-488 = 488 nm lazer hattı için yeşil floresan boyaya konjuge edilmiş fare anti-OLIG2; SVZ = subventriküler zon; A(p) = protoplazmik (gri madde) astrositler; A(f) = lifli (beyaz cevher) astrositler; OL = oligodendrositler; OPC = oligodendrosit progenitör hücreleri; EN = uyarıcı nöronlar; MSN = orta dikenli nöronlar; MG = mikroglia; BVC = kan damarı hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özetlenen protokolü takip eden deneysel tasarım, çeşitli biyolojik ve teknik faktörler göz önünde bulundurularak sonuçlandırılmalıdır. Başlangıç doku örnekleri, sabitlenmeden taze dondurulur ve tercihen çekirdek iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için kısa bir postmortem toplama aralığına sahiptir. Deneyime dayanarak, 24 saate kadar bir PMI, yeterli çekirdek geri kazanımına izin verir; Bununla birlikte, bozulmamış çekirdek geri kazanımını optimize etmek için 12 saat veya daha düşük bir PMI tercih edilir. PMI dışında, vücut depolama sıcaklığı ve dokunun pH seviyeleri de dahil olmak üzere ek faktörler de çekirdek verimini etkileyebilir, ancak bu çalışmalarda hesaba katılmamıştır14. Anekdotsal deneyimlere göre, FANS geri kazanımının, hücre tipine özgü ekspresyonda depolamanın değişkenliğini değerlendirmek için kontrollü deneyler yapılmamasına rağmen, -80 ° C'de beş yıla kadar depolanan aynı doku ile karşılaştırılabilir olduğu bulunmuştur. Antikor inkübasyonundan sonra numunenin yıkanması, dikkate alınması gereken başka bir değişkendir. Genel olarak, bir yıkama adımı genel verimi azaltır, ancak farklı immüno-işaretli popülasyonların ayrılmasını iyileştirebilir. Bu çalışmalarda, bir antikor sonrası yıkama adımı dahil edildiğinde veya hariç tutulduğunda NEUN / PAX6 popülasyonlarının ayrılmasında bir fark gözlenmemiştir, ancak bu adım, özellikle ön konjuge edilmemişlerse, diğer birincil ve ikincil antikorları kullanırken yararlı olabilir.
Ayıklama ekipmanının hassasiyetindeki değişkenlik nedeniyle, her ayıklama olayında uygun kontrollerin yapılması gerekir. Bir hemositometrede görselleştirirken askıya alınan numunede aşırı hücre dışı döküntü görülürse, numune sadece çekirdekleri tutmak için 40 μm'lik bir filtreden geçirilebilir. Numune sınırlıysa, uygun florofor ile etiketlenmiş boncuklar tek renkli ve FMO kontrolleri için de kullanılabilir. Örnekler, qPCR veya sıralama sonuçları ile belirlendiği gibi, istenen astrosit popülasyonları için zenginleştirilmemiş gibi görünüyorsa, tüm NeuN- ve PAX6 + (NeuN-) popülasyonlarını daha katı bir şekilde geçmek ve pozitif ve negatif popülasyonlar için kapı kesimleri arasında daha fazla yer bırakmak yararlı olabilir.
Burada açıklanan doğrulama çalışmalarının çoğu, nöronal, astrosit ve oligodendrosit progenitör (OPC'ler) çekirdek popülasyonları için aynı anda zenginleştirmek üzere NeuN ve PAX6'ya ek olarak OLIG2 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kortikal astrositleri NeuN-fraksiyonu içinde daha etkili bir şekilde zenginleştirmek için OLIG2'nin üçüncü bir soy belirteci olarak dahil edilmesi önerilir. FITC-konjuge OLIG2'nin varlığı veya yokluğu PAX6 + popülasyonunu değiştirmiyor gibi görünmektedir; bu nedenle, varsayım, OLIG2 hariç tutulan deneylerin benzer astrosit zenginleştirmesine neden olacağıdır. Not olarak, PAX6 + popülasyonunun NeuN popülasyonundan kapılanması esastır, çünkü bazı nöronal popülasyonlar hem NeuN hem de PAX615'i ifade eder. Astrositler SOX9 ifadesine göre de sıralanabilir; Bununla birlikte, SOX9 ile boyama ve ayıklama, PAX6'ya kıyasla astrositlerin daha az sağlam zenginleşmesine yol açar. Yetişkin kortekste nöronal, astrositik ve OPC soyları arasında net bir ayrım gözlenmesine rağmen, yetişkin SVZ ve bitişik striatum içindeki PAX6 + ve OLIG2 + popülasyonları arasında benzer bir ayrım gözlenmemiştir.
SVZ'den bazı astrositlerin düşük OLIG2 seviyelerini ifade etmesi mümkün olsa da, toplanan popülasyonlar sadece qPCR ile doğrulandı (veriler gösterilmedi); Bu nedenle, aşağı akış RNA dizilimi, bu popülasyonların saflığını daha da tanımlamada yardımcı olabilir. Ek olarak, bu protokol, popülasyona özgü nükleer belirteçler kullanılarak çekirdekleri dondurulmuş fetal beyin dokusundan ve beyin tümörü dokusundan izole etmek için uyarlanabilir. Bu dokular önemli ölçüde daha hücresel olduğundan, çekirdeklerin toplanmasını en aza indirmek için daha az doku ile başlamak yararlı olabilir. Anöploid çekirdekleri neoplastik dokudan ayırırken, DAPI geçidi potansiyel olarak daha yüksek floresanı hesaba katacak şekilde ayarlanır. Mevcut protokol yalnızca neoplastik olmayan numuneler için doğrulandığından, kullanıcıların neoplastik doku üzerinde FANS gerçekleştirmeden önce dikkatli bir doğrulama yapmaları şiddetle tavsiye edilir. Genel olarak, yukarıda açıklanan protokol, nöronları zenginleştirmek için daha önce kurulmuş protokollerden uyarlanmış, zenginleştirilmiş astrosit popülasyonlarını izole etmek için doğrulanmış bir strateji ortaya koymaktadır. Bu metodoloji, astrosit çekirdeği popülasyonlarını hem normal hem de hastalıklı kortikal beyin dokularından daha ileri moleküler analizlerde kullanılmak üzere etkili bir şekilde izole etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Patoloji ve Nöroşirürji üyelerine, tanımlanmamış beyin dokusunun ve uzman tavsiyesi için ISMMS'nin Akış Sitometrisi CORE'unun tedarikinde yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Çalışma kısmen NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.'ye) ve R61DA048207 (SA'ya) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
