Summary
Protein arginin (R) -metylering er en utbredt post-translasjonell modifikasjon som regulerer flere biologiske veier. Massespektrometri er den beste teknologien for å globalt profilere R-metyl-proteomet, når det kombineres med biokjemiske tilnærminger for modifisert peptidberikelse. Arbeidsflyten designet for identifisering av global R-metylering i humane celler med høy tillit er beskrevet her.
Abstract
Protein arginin (R) -metylering er en utbredt protein post-translasjonell modifikasjon (PTM) involvert i regulering av flere cellulære veier, inkludert RNA-behandling, signaltransduksjon, DNA-skaderespons, miRNA-biogenese og oversettelse.
I de senere år, takket være biokjemisk og analytisk utvikling, har massespektrometri (MS) -basert proteomikk dukket opp som den mest effektive strategien for å karakterisere det cellulære metylproteomet med enkeltstedsoppløsning. Imidlertid er identifisering og profilering in vivo protein R-metylering ved MS fortsatt utfordrende og feilutsatt, hovedsakelig på grunn av den substøkiometriske karakteren av denne modifikasjonen og tilstedeværelsen av forskjellige aminosyresubstitusjoner og kjemisk metylesterifisering av sure rester som er isobariske til metylering. Dermed er det nødvendig med anrikningsmetoder for å forbedre identifiseringen av R-metylpeptider og ortogonale valideringsstrategier for å redusere falske oppdagelsesrater (FDR) i metylproteomikkstudier.
Her beskrives en protokoll spesielt utviklet for høy konfidens R-metyl-peptider identifikasjon og kvantifisering fra cellulære prøver, som par metabolsk merking av celler med tung isotopkodet metionin (hmSILAC) og dobbel protease i løsningen fordøyelse av hele celleekstrakt, etterfulgt av off-line High-pH reversert fase (HpH-RP) kromatografifraksjonering og affinitetsberikelse av R-metylpeptider ved bruk av anti-pan-R-metylantistoffer. Ved høyoppløselig MS-analyse behandles rådata først med MaxQuant-programvarepakken, og resultatene analyseres deretter av hmSEEKER, en programvare designet for grundig søk av MS-topppar som tilsvarer lett og tungt metylpeptid i MaxQuant-utdatafilene.
Introduction
Arginin (R)-metylering er en posttranslasjonell modifikasjon (PTM) som dekorerer rundt 1% av pattedyrproteomet1. Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) er enzymene som katalyserer R-metyleringsreaksjon ved avsetning av en eller to metylgrupper til nitrogen (N) atomer av guanidino-gruppen i sidekjeden til R på en symmetrisk eller asymmetrisk måte. Hos pattedyr kan PRMT grupperes i tre klasser - type I, type II og type III - avhengig av deres evne til å deponere både monometylering (MMA) og asymmetrisk di-metylering (ADMA), MMA og symmetrisk di-metylering (SDMA) eller bare MMA, henholdsvis 2,3. PRMT-er retter seg hovedsakelig mot R-rester som ligger innenfor glycin- og argininrike regioner, kjent som GAR-motiver, men noen PRMT-er, som PRMT5 og CARM1, kan metylatprolin-glycin-metioninrike (PGM) motiver4. R-metylering har dukket opp som en proteinmodulator av flere biologiske prosesser, for eksempel RNA-spleising5, DNA-reparasjon6, miRNA-biogenese7 og oversettelse2, og fremmer forskningen på denne PTM.
Massespektrometri (MS) er anerkjent som den mest effektive teknologien for systematisk å studere global R-metylering ved protein-, peptid- og stedsoppløsning. Imidlertid krever denne PTM noen spesielle forholdsregler for sin identifisering av MS med høy tillit. For det første er R-metylering substøkiometrisk, med den umodifiserte formen av peptidene som er mye mer rikelig enn de modifiserte, slik at massespektrometre som opererer i DDA-modus (Data Dependent Acquisition) vil fragmentere høyintensitets umodifiserte peptider oftere enn deres metylerte kolleger med lavere intensitet8. Videre lider de fleste MS-baserte arbeidsflyter for R-metylert stedsidentifikasjon av begrensninger på bioinformatisk analysenivå. Faktisk er beregningsidentifikasjonen av metylpeptider utsatt for høye falske oppdagelsesrater (FDR), fordi denne PTM er isobarisk til forskjellige aminosyresubstitusjoner (f.eks. Glycin til alanin) og kjemisk modifikasjon, som metylesterifisering av aspartat og glutamat9. Derfor har metoder basert på isotopmerking av metylgrupper, som Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), blitt implementert som ortogonale strategier for sikker MS-identifisering av in vivo metyleringer, noe som reduserer frekvensen av falske positivemerknader betydelig.
Nylig har ulike proteom-brede protokoller for å studere R-metylerte proteiner blitt optimalisert. Utviklingen av antistoffbaserte strategier for immunaffinitetsberikelse av R-metylpeptider har ført til annotering av flere hundre R-metylerte steder i humane celler11,12. Videre rapporterte mange studier 3,13 at kobling av antistoffbasert anrikning med peptidseparasjonsteknikker som HpH-RP-kromatografifraksjonering kan øke det totale antallet identifiserte metylpeptider.
Denne artikkelen beskriver en eksperimentell strategi designet for systematisk og høy konfidensidentifikasjon av R-metylerte steder i humane celler, basert på ulike biokjemiske og analytiske trinn: proteinekstraksjon fra hmSILAC-merkede celler, parallell dobbel enzymatisk fordøyelse med Trypsin- og LysargiNase-proteaser, etterfulgt av HpH-RP kromatografisk fraksjonering av fordøyde peptider, kombinert med antistoffbasert immunaffinitetsberikelse av MMA-, SDMA-, og ADMA-holdige peptider. Alle affinitetsberikede peptider analyseres deretter ved høyoppløselig væskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-modus, og rå MS-data behandles av MaxQuant-algoritmen for identifisering av R-metylpeptider. Til slutt behandles MaxQuant-utgangsresultatene med hmSEEKER, et internt utviklet bioinformatikkverktøy for å søke par tunge og lette metylpeptider. Kort fortalt leser og filtrerer hmSEEKER metylpeptididentifikasjoner fra msms-filen, matcher deretter hvert metylpeptid til den tilsvarende MS1-toppen i allPeptides-filen, og til slutt søker toppen av den tunge / lette peptidmotparten. For hvert antatte tunge lyspar beregnes Log2 H / L-forholdet (LogRatio), Retention Time difference (dRT) og Mass Error (ME) parametere, og dubletter som ligger innenfor brukerdefinerte avskjæringer er merket som sanne positiver. Arbeidsflyten til den biokjemiske protokollen er beskrevet i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celledyrking og proteinekstraksjon (tid: 3 - 4 uker kreves)
- Dyrk HeLa-celler parallelt i medier som leveres med henholdsvis lett (L) eller tung (H) metionin (se tabell 1 for mediesammensetning). Ved minst åtte celledelinger samler du en aliquot av celler fra hver SILAC-kanal og utfører inkorporeringstesten.
MERK: For å sjekke inkorporeringseffektiviteten, test ved LC-MS / MS-analyse at prosentandelen tung metionin (Met-4) i Heavy-kanalen er så nær som mulig til 100%. Analyser en aliquot av tungt merkede celler av LC-MS / MS (for innstillinger se tabell 2), og behandle deretter MS-dataene med MaxQuant ved hjelp av parametrene angitt i tabell 3. For å se etter Met-4-innlemmelsen er et internt utviklet skript tilgjengelig på https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. - Vurder tung metioninkorporering som fullført når den når >97%. Når hver kanal når et totalt antall på ca. 60 x 106 celler (tilsvarende ca. 40 retter på 15 cm hver ved 85% sammenløp for HeLa-celler, med variasjoner avhengig av celletype), høstes dem. Tell dem forsiktig, bland i 1: 1-proporsjon og pellet ved sentrifugering ved 335 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
MERK: For å vurdere riktig 1: 1 L / H-blanding, hold en aliquot og kjør den på en skive av en gel som er kjent for å inneholde en høy overflod og tungt R-metylert protein (f.eks. Fibrillarin). Hvis merking har vært vellykket og 1: 1-blanding er oppnådd, bør det være et 1: 1-forhold mellom lette og tunge versjoner av R-metylerte peptider tilstede i prøven. Alternativt kan du holde en aliquot av blandet prøve som skal analyseres av LC-MS / MS, deretter behandle MS-dataene med MaxQuant ved hjelp av parametrene angitt i tabell 3 og plotte fordelingen av Log2 H / L-forhold som vist i figur 2C. Protokollen kan stoppes her ved å fryse pelleten og lagre den ved -80 °C. - Tilbakestill cellepelleten i fire volumer lysisbuffer (se tabell 1 for lysisbuffersammensetning) med hensyn til cellepelletvolumet. Bruk for eksempel 6 ml lysisbuffer for en pellet fra 120 x 106 Hela-celler (60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy) tilsvarende 1,5 ml volum.
MERK: Proteinekstraksjon må utføres ved romtemperatur (RT) fordi lysisbufferen inneholder det kaotropiske middelet 9 M Urea som faller ut ved istemperatur; Derfor er tilsetning av et bredt spekter av serin- og cysteinproteasehemmere viktig, så vel som fosfatashemmere, for samtidig å beskytte proteiner mot proteolytisk nedbrytning og defosforylering, cocktail av protease- og fosfatasehemmere er kommersielt tilgjengelige som små tabletter, se tabell 1 og materialtabell. - Sonikere prøven med en microtip celle disruptor sonicator i minst fem sykluser av 15 s ON og 30 s OFF, for å sikre effektiv brudd på cellemembraner og DNA-frigjøring og skjæring. Kontroller viskositeten til ekstraktet ved å pipettere løsningen opp og ned. Hvis det er for tyktflytende på grunn av ufullstendig DNA-skjæring og membranoppløseliggjøring, gjenta sonikeringssyklusene.
NOTAT: Sørg for at prøven ikke overopphetes under sonikering, fordi høy temperatur kan skade proteiner. Det er imidlertid ikke mulig å sette prøven på is mellom sonikeringssykluser, på grunn av tilstedeværelsen av 9M Urea; derfor er det tilrådelig å pause i 60 s OFF mellom forskjellige sonikeringssykluser. Videre unngå dannelsen av luftbobler under sonikering fordi de reduserer sonikeringseffekten. - Sentrifuger ekstraktet ved 3,000 x g i 10 minutter ved RT for å pelletere ruskene og overføre supernatanten i et nytt 15 ml rør.
- Mål proteininnholdet i ekstraktet med en kolorimetrisk analyse, for eksempel Bradford eller bicinchoninic acid (BCA) 14,15. En optimal startmengde proteinekstrakt for denne protokollen er mellom 20-30 mg.
MERK: Lysisbuffere som inneholder høy konsentrasjon urea er kompatible både med Bradford og BCA kvantifiseringsanalyse; Andre typer lysisbuffer, som de som inkluderer høy konsentrasjon av natriumdodecylsulfat (SDS), er ikke kompatible med Bradford.
2.Lysate fordøyelse (indikativ tid kreves 2 timer)
- Utfør reduksjon av tiolgruppe (-SH) av proteiner ved bruk av en stamløsning av dithiothreitol (DTT) oppløst i ultrarent vann ved en endelig konsentrasjon på 4,5 mM og la reaksjonen gå i 30 minutter ved 55 ° C.
MERK: Det er mulig å klargjøre 1 M lager DTT-løsning og lagre den ved -20 °C i opptil 1 måned, og tine bare aliquotene som trengs for hvert eksperiment. Alternativt kan sulfhydryl reduktant tris-(2-karboksyetyl)-fosfin (TCEP) brukes til å utføre reduksjon av -SH-grupper; spesielt for langtidslagring av proteiner er TCEP betydelig mer stabil enn DTT uten metallchelater som EGTA i bufferen, mens DTT er mer stabil hvis metallchelater er til stede16. - Utfør alkylering av tiolgruppe (-SH) av proteiner ved å tilsette iodoacetamid (IAA) i en konsentrasjon på 10 mM og inkubere i 15 minutter ved RT i mørket. Utfør inkubasjonen av ekstraherte proteiner med IAA-løsning i mørke fordi IAA er lysfølsom.
MERK: IAA-lagerløsningen på 100 mM bør tilberedes fersk før hvert eksperiment. Alternativt kan kloracetamid brukes til å utføre alkylering av -SH-grupper, spesielt hvis målet med eksperimentet er å analysere kryssprat mellom metylering og ubiquitination fordi IAA-indusert artefakt etterligner ubiquitination17. - Før du fortsetter med proteinfordøyelsestrinnet, lagre en aliquot av proteinekstrakt (1/1,000 for å starte ufordøyd lysat) for påfølgende analyse på SDS-PAGE Coomassie-farget gel og sammenligning med en tilsvarende mengde prøve ved fordøyelsen; Denne testen tjener til å verifisere proteolyseeffektiviteten (se punkt 4).
- Fortynn det gjenværende proteinekstraktet med fire volumer på 20 mM HEPES pH 8,0, for å nå en endelig ureakonsentrasjon på 2 M (som er konsentrasjonen kompatibel med proteasenes enzymatiske aktivitet). Del prøven i to deler: i den første legg til sekvenseringsgrad modifisert trypsin og i den andre legg til LysargiNase protease (se materialtabell) ved 1:100 (w / w) proporsjon i forhold til mg utgangsmateriale. La stå over natten ved 37 °C i en termomikser ved 600 o / min, for å tillate enzymatisk fordøyelse.
MERK: Trypsin, det vanligste fordøyelsesenzymet i proteomikk, klipper ved C-enden av R og Lysin (K), og genererer peptider med en ladningsfordeling som resulterer i fragmenteringsspektra dominert av y-type ioner ved kollisjonsindusert dissosiasjon (CID). LysargiNase klipper ved N-enden av R og K, og speiler derfor Trypsin-spaltningsspesifisiteten og genererer peptider som frigjør hovedsakelig b-type ioner ved CID-fragmentering. Denne kombinerte analysen fører til mye økt peptidsekvensdekning og høyere tillit til stedsspesifikk identifisering av R-metyleringer18.
3. Peptidrensing (indikativ tid kreves 1 time)
- Hold en aliquot av fordøyd peptider fra begge reaksjonene, samle de samme volumene som i punkt 2.3 for sammenligningen på SDS-PAGE Coomassie-farget gel for å vurdere protease fordøyelseseffektivitet (se punkt 4).
- Stopp fordøyelsen ved å surgjøre prøvene med tilsetning av trifluoreddiksyre (TFA) til en endelig konsentrasjon på 5%. Bland godt og mål prøvenes pH med et lakmuspapir (pH skal være rundt 3). Vortex kort og spinn ned de surgjorte prøvene før du overfører dem til nye 15 ml rør.
- Rengjør prøvene gjennom to C18 vakuumpatroner (sorbentvekt 1 g, se Materialtabell), en for prøven fordøyd med Trypsin og den andre for prøven fordøyd med LysargiNase. Klargjør løsningsmiddel A, oppløsningsvæske B og vaskebuffer (se tabell 1 for buffersammensetning).
- Bruk glasspipetter til å rehydrere hver sylinderampulle med 6 ml ACN 100 % i 3 ganger. Deretter justerer du hver patron sekvensielt med 3-9-18 ml løsningsmiddel A. Legg i prøvene (harpiksene skal bli gule). Vask igjen sekvensielt med 3-9-18 ml oppløsningsvæske A og tilsett deretter 6 ml vaskebuffer. Overfør hver kolonne til rene 15 ml rør og eluer prøvene med 7 ml løsningsmiddel B. Gjenta elueringstrinnet med 7 ml løsningsmiddel B, for et siste volum på 14 ml.
MERK: Utfør alle disse trinnene ved å la bufferne og løsningen passere gjennom kolonnene etter tyngdekraften. For å favorisere strømmen av bufferne gjennom kolonnen, skyv hver løsning sakte med en sprøyte for å etterligne vakuum. - Spar 50 μL av eluerte peptider, 50 μL gjennomstrømning (FT), 50 μL av vasken med løsningsmiddel A og 50 μL av siste vask for den påfølgende peptidvurderingen ved SDS-PAGE (se punkt 4).
4. Coomassie-farget SDS-PAGE gel (indikativ tid kreves 2 timer)
- Kjør de innsamlede aliquotene på en 17,5 % SDS-PAGE-gel og beis med Instant-Blu Coomassie-farging (se Materialtabell). Det forventede resultatet er representert i figur 2A.
5. Peptid lyofilisering (indikativ tid 2 dager)
- Dekk 15 ml rørene som inneholder de eluerte peptidene med parafinfilm, som deretter stanses med en 20 G nål for å lage 3-5 hull. Sett rørene i tørris i minst 30 minutter, til prøvene er helt frosne.
- Lyofiliser de frosne fraksjonene i 48 timer, et tidsintervall som vanligvis er tilstrekkelig til å sikre en fullstendig lyofilisering av prøvene, selv om det kan oppstå en viss variasjon på grunn av frysetørkerens ytelse.
MERK: Forsøket kan settes på pause her, og lagrer de lyofiliserte prøvene ved -80 °C.
6. Off-line HpH-RP kromatografisk fraksjonering av peptider (indikativ tid 4 dager)
- For å fraksjonere peptidene i 60 fraksjoner, bruk HpH-RP væskekromatografi ved bruk av HPLC-system utstyrt med C12-RP HPLC-kolonne (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
- Før kjøringen forbereder du fersk buffer A og buffer B (sammensetningen av bufferne er beskrevet i tabell 1).
- Filtrer all løsning med 0,22 μm filter og degas dem i et sonikerbad i minst 30 minutter.
- Oppløs de lyofiliserte peptidene i 1 ml buffer A. Filtrer peptidene gjennom et polytetrafluoretylen (PTFE) 0,45 μm filter ved hjelp av en sprøyte.
- Still fraksjoneringshastigheten til 1 ml / min strømning og samle 1 ml fraksjoner ved å bruke følgende kromatografiske gradient: 5% B til 30% B på 60 minutter; 30% B til 60% på 2 minutter; 70% B i 3 min.
- Sett HPLC slik at brøksamlingen på dette tidspunktet stoppes, og gradienten holdes på 70% buffer B i 5 minutter før en omfattende vask av kolonnen med en rask gradient opp til 100% buffer B, etterfulgt av en siste vask (100% buffer B i 10 min).
MERK: På slutten av hver kromatografiske kjøring må du alltid balansere kolonnen med 100 % buffer A i 20 minutter. - Fraksjoner begge prøvene separat fordøyd med Trypsin og LysargiNase av Off-Line HpH RP kromatografiske gradienter, som beskrevet i punkt 6.5.
- For hver kromatografiske gradient samler du alle fraksjonene i en dyp 96-brønnplate.
- Slå sammen brøkene som er samlet inn før gradienten, til én enkelt brøk kalt PRE. Sett sammen de 60 fraksjonene fra HpH-RP væskekromatografisk (LC) gradient ved å samle dem på en ikke-sammenhengende måte til 14 endelige fraksjoner. For å oppnå slik ikke-sammenhengende sammenkobling, slå sammen HpH-RP-fraksjonene i henhold til følgende skjema.
- Fraksjon 1 (siste bind 5 ml): Pulje 1-15-29-43-57
- Fraksjon 2 (siste bind 5 ml): Pulje 2-16-30-44-58
- Fraksjon 3 (siste bind 5 ml): Pulje 3-17-31-45-59
- Fraksjon 4 (siste bind 5 ml): Pulje 4-18-32-46-60
- Fraksjon 5 (siste bind 4 ml): Pulje 5-19-33-47
- Fraksjon 6 (siste bind 4 ml): Pulje 6-20-34-48
- Fraksjon 7 (siste bind 4 ml): Pulje 7-21-35-49
- Fraksjon 8 (siste bind 4 ml): Pulje 8-22-36-50
- Brøk 9 (siste bind 4 ml): Pulje 9-23-37-51
- Fraksjon 10 (siste bind 4 ml): Pulje 10-24-38-52
- Fraksjon 11 (siste bind 4 ml): Pulje 11-25-39-53
- Brøk 12 (siste bind 4 ml): Pulje 12-26-40-54
- Brøk 13 (siste bind 4 ml): Pulje 13-27-41-55
- Fraksjon 14 (siste bind 4 ml): Pulje 14-28-42-56
MERK: Den ikke-sammenhengende sammenkoblingen består i å kombinere tidlige, midtre og sene eluerende fraksjoner, noe som gjør det mulig å øke heterogeniteten i peptidsammensetningen i de samlede fraksjonene. Følgelig separeres peptidblandingen av hver samlet fraksjon effektivt, med begrenset ko-eluering, i den påfølgende nanostrømningen lav pH-RP-LC-kromatografi direkte koblet til massespektrometeret.
- Slå sammen brøkene som samles inn etter graderingen, til en unik brøkdel, kalt POST.
MERK: Ved å inkludere brøkene PRE og POST gradient, oppnås totalt 16 fraksjoner, i 15 ml rør (se figur 3A). - Dekk 15 ml rørene med parafinfilm og slå den med en 20 G nål for å generere 3-5 hull. Frys dem ved å inkubere sentrifugerørene i tørris til hver fraksjon er helt frossen.
- Lyofiliser fraksjonene i ca 48 timer. Forsikre deg om at hver prøve er helt tørket før du stopper frysetørkeren.
MERK: Forsøket kan settes på pause her, og lagrer de lyofiliserte prøvene ved -80 °C.
7. R-metylert peptid immuno-affinitet anrikning (indikativ tid 2 dager)
- Utfør sekvensiell immunaffinitetsanrikning av modifisert peptid med anti-pan-R-metyleringsantistoffer parallelt, men separat for de to prøvene fra henholdsvis Trypsin og LysargiNase fordøyelser. Immuno-Affinity Purification (IAP) Buffer er levert av selskapet som kjøper anti-pan-R-metylantistoffer for modifisert peptid affinitetsberikelse (detaljer er i Tabellmateriale og reagenser). IAP-bufferen er konsentrert 10x og bør fortynnes 10 ganger før bruk.
MERK: IAP Buffer 1x kan lagres ved -20 °C til opptil 1 år. - Sentrifuger de lyofiliserte peptidene ved 2000 x g i 5 minutter ved RT for å spinne ned peptidene til bunnen av 15 ml røret. Suspendere de lyofiliserte peptidene på nytt med 250 μL 1x IAP-buffer per 15 ml rør og overføring i et 1,5 ml lavbindingsrør. Sjekk med lakmuspapir om pH-verdien er >6.
- Hold en liten aliquot (ca. 5% av volumet) av hver brøkdel som inngang for den påfølgende MS-analysen.
- Del hver fraksjon i to aliquots, for å utføre immunberikelse av asymmetrisk-di-metylerte (ADMA) og symmetrisk-di-metylerte (SDMA) peptider parallelt.
- Bruk tre hetteglass med de valgte anti-pan-R-metylerte antistoffene konjugert til protein A-agaroseperler per 10 mg av det første proteinekstraktet.
- Forbered riktig mengde antistoff konjugert til agaroseperler ved å sentrifugere hvert hetteglass med 2000 x g i 30 s og fjerne bufferen fra perlene. Vask perlene tre ganger med 1 ml 1x PBS alltid ved å sentrifugere dem ved 2000 x g i 30 s.
- Etter siste vask, re-suspendere perlene i 40 μL 1x PBS for hvert hetteglass; samle dem og til slutt dele dem likt i 16 fraksjoner (slik at 2,5 μL antistoffperler legges til hver fraksjon).
- Tilsett 250 μL 1x IAP-buffer til hvert rør, bland ved å invertere og la det inkubere på et roterende hjul i 2 timer ved 4 °C.
MERK: Bland prøvene ved å invertere 1,5 ml rørene i stedet for å pipettere dem med mikrotips, noe som kan skade perlene eller føre til at de mistes. - Ved 2 timers inkubasjon, sentrifuger 1,5 ml rørene som inneholder peptider og pan-R-metyl-antistoffkonjugerte perler ved 2000 x g i 30 s for å pelletere perlene; overfør FT fra hver fraksjon til rene 1,5 ml lavbindingsrør.
- Tilsett perlene konjugert til antistoffer mot R-monometylering (MMA) til FTs og gjenta trinnene 7,7 til 7,9.
- Under inkubasjonen av peptidprøvene med MMA-perlene, vask to ganger fraksjonene som tidligere var immunutfelt med anti-ADMA og SDMA med 250 μL IAP-buffer (invertering og ikke pipettering), og kast supernatanten ved hver vask.
- Gjenta vasken med LC-MS grad H2O tre ganger.
- Eluere de affinitetsberikede symmetrisk og asymmetrisk R-di-metylerte peptidene fra agaroseperlene ved å tilsette 50 μL 0,15% TFA til hvert rør (sterke syreforhold, faktisk, denaturerer epitopen som fører til frigjøring av antigenene fra antistoffene). La denne løsningen ligge 10 min ved RT, og inverter rørene hvert 2.-3. minutt.
- Overfør den første eluering til rene 1,5 ml lavbindingsrør og gjenta eluering med 50 μL 0,15% TFA; Samle de 2 fraksjonene i ett rør.
- Gjenta trinnene fra 7,11 til 7,14 for R-mono-metylerte peptider som ble inkubert med anti-MMA antistoff-perler.
8. Avsalting og konsentrasjon av affinitetsberikede metylpeptider ved C18 mikrokolonner (indikativ tid kreves 30 minutter)
- Likevekt med metanol C18-RP mikrokolonner laget med 3M fastfaseekstraksjonspatroner for peptidavsalting og konsentrasjon før MS-analyse19.
- Legg prøvene (tilsvarende de separate immunoaffinitetsberikede fraksjonene og inngangsfraksjonene) på C18-mikrokolonnene i to trinn (50 μL + 50 μL på hver C18-mikrokolonne) ved sentrifugering ved 600 x g i 6 minutter.
- Vask mikrokolonnene med 55 μL Buffer A (se tabell 1 for buffersammensetning), alltid ved sentrifugering på rundt 900 x g i 5 min.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause her, slik at C18-RP mikrokolonnene ved 4 °C, hvor de kan lagres i opptil 2 uker.
9. Andre enzymatiske fordøyelse (indikativ tid kreves 3 timer)
- Vask C18-RP mikrokolonnene med 55 μL buffer A (se tabell 1 for buffersammensetning) to ganger, ved sentrifugering på rundt 850 x g i 5 minutter.
- Eluter peptidene to ganger med 20 μL buffer B (se tabell 1 for buffersammensetning) og slå sammen de to fraksjonene.
- Tørk de eluerte peptidene i en vakuumkonsentrator (se Tabellmateriale og reagenser for detaljer). I mellomtiden forbereder du fordøyelsesløsningen som består av 50 mM ammoniumbikarbonat som fortynnes fra en nylaget 1 M stamløsning (se tabell 1).
- Tilsett Trypsin eller LysargiNase i de respektive prøvene, til en endelig konsentrasjon på 25 ng/μL. Inkuber hver prøve ved 37 °C i 2 timer.
- Tilsett 1 μL 5% TFA for å stoppe fordøyelsen; vortex og spinne ned prøvene.
MERK: Enzymatisk spaltning av Trypsin kan hemmes ved C-enden av metylert R og K, noe som forårsaker tapte spaltninger som øker peptidlengden og ladningen, noe som igjen produserer komplekse og ufullstendige fragmenteringsspektra som hindrer peptididentifikasjon og stedsspesifikk attribusjon av metyleringssteder. Det har vist seg at en annen enzymatisk fordøyelse kan redusere hyppigheten av slike ubesvarte spaltninger, med forbedret sekvensdekning og stedstilskrivelse20.
10. Avsalting av peptider (indikativ tid kreves 30 minutter)
- Legg de forsurede peptidløsningene på nye C18-RP mikrokolonner som tidligere er likevektet ved å følge de samme trinnene som er beskrevet i punkt 8.
- Peptidet lastet på C18-RP mikrokolonnene kan lagres ved 4 °C til eluering for LC-MS/MS-analyse.
11. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse (indikativ tid 5 dager)
- Eluter peptidene fra C18-RP-mikrokolonnene ved å passere 10μL buffer B, sentrifugering ved 615 x g i 5 minutter ved RT. Gjenta dette trinnet to ganger og kombiner eluatene.
- Reduser volumet av eluatene i en vakuumkonsentrator til de er nesten tørre, unngå overtørking.
- Suspendere peptidene på nytt i 10 μL buffer A for LC-MS/MS-analyse.
- Analyser hver fraksjon av R-metylpeptider ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) i et høyoppløselig massespektrometer (se materialtabell), koblet til et nano-flow ultrahøyytelses væskekromatografi (UHPLC) -system. Still inn instrumentparametrene som beskrevet i tabell 2.
- Legg 2 μL av hver prøve på en nanoanalytisk kolonne (enkel sprøytekolonne 75 μm indre diameter, 25 cm lengde), pakket med C18-RP harpiks (2 μm partikkelstørrelse).
- Prøver føres gjennom C18 RP nano-kolonnen med en strømningshastighet på 300 nL / min, med følgende lineære gradient: 3% -30% B i 89 min, 30% -60% B i 5 min, 60% -95% B i 1 min og 95% B i 5 min.
- Massespektrometeret opererer i DDA-modus (Data Dependent Acquisition) for automatisk å bytte mellom full skanning MS og MS / MS oppkjøp. Sett undersøkelsen full skanning MS som skal analyseres i spektrometerdetektoren med oppløsning R = 70.000. De femten mest intense peptidionene isoleres sekvensielt til en målverdi på 3 x 106 og fragmenteres av relativ kollisjonsenergi på 28%. Sett de maksimalt tillatte ionakkumuleringstidene til 20 ms for full skanning og 50 ms for MS / MS og fest målverdien for MSMS til 1 x 106. Den dynamiske ekskluderingstiden er satt til 20 s.
12. Kjøre MaxQuant og hmSEEKER dataanalyse
- Når LC-MS / MS-kjøringene er fullført, importerer du MS-rådata til en peptidsøkemotor for å identifisere metylpeptidene ved sannsynlighetsbasert tilnærming mot referansedatabasen. I denne protokollen ble MaxQuant versjon 1.6.2.10 brukt til vår analyse. MaxQuant krever minst 2 GB RAM for å kjøre, samt nok diskplass til å lagre alle rådata og alle utdatafiler.
MERK: Se den offisielle dokumentasjonen på https://www.maxquant.org for alle detaljer om installasjonen og maskinvare- og programvarekravene. - Dupliser hver rådatafil. Gi nytt navn til originalene ved å legge til "_light" til navnet deres, og gi deretter nytt navn til kopiene ved å legge til "_heavy".
MERK: hmSEEKER, skriptet for nedstrømsanalyse, skiller mellom store og små bokstaver. - Start MaxQuant/Andromeda-søk etter peptididentifikasjon med innstillingene angitt i tabell 3. Av de mange utgangsdataene som produseres av MaxQuant, er det bare allPeptides.txt og msms.txt-filene (som ligger i undermappen kombinert / txt) som kreves for etterbehandlingstrinnet.
- Etterbehandlingen av MaxQuant-utgangsdata utføres av algoritmen hmSEEKER. Last ned hmSEEKER fra: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Skriptet er tilgjengelig som en Jupyter-notatbok skrevet i Python 3.7 og kommer med et eksempeldatasett for testformål. For nye brukere anbefales det å laste ned og installere Anaconda-plattformen (https://www.anaconda.com/products/individual). Den nyeste versjonen inkluderer som standard Python 3.8, Jupyter og alle pakkene som kreves for å kjøre hmSEEKER (f.eks. Scikit-learn 0.23.1).
- Opprett en mappe og lagre filene allPeptides.txt og msms.txt fra MaxQuant-utgang til den.
- Start Jupyter (fra kommandolinjen eller fra Anaconda-navigatoren).
- Naviger til hmSEEKER-mappen og åpne hmSEEKER.ipynb.
- I delen Inndataparametere i notatblokken angir du banene til FASTA-databasen og til mappen(e) som inneholder MaxQuant-tekstfilene.
- Kjør koden inne i hver celle ved å velge cellen og klikke på Play-knappen på toppen av Jupyter-grensesnittet.
- Skriptet produserer en kommaseparert utdatafil for hvert datasett som ble analysert, pluss en kombinert fil. Den endelige doublets-listen finner du i filen "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
(Tabell 4 inneholder en kort beskrivelse av kolonnene i utdatatabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Artikkelen beskriver en arbeidsflyt for identifisering av det globale proteinet R-metylering med høy konfidens, som er basert på kombinasjonen av den enzymatiske fordøyelsen av proteinekstraktet med to forskjellige proteaser parallelt, etterfulgt av HpH-RP væskekromatografifraksjonering av proteolytiske peptider og immunoaffinitetsberikelse av R-metylpeptider med anti-pan-R-metylantistoffer (figur 1).
Cellene ble dyrket i nærvær av metionin, enten naturlig (Light, L, Met-0) eller isotopisk merket (Heavy, H, Met-4). Ved full isotopisk merking, som ble testet ved MS-analyse på en liten aliquot av Met-4-ekstrakt, ble de tunge og lette cellene høstet og blandet 1: 1 L / H-andel, som illustrert i figur 1A. Ved 13CD 3-metionin metabolsk merking tilsettes metylgruppene til proteinbasisen fra metyldonoren S-adenosyl-metionin (SAM) og vil være til stede i enten lett eller tung isotopform21. Figur 1B beskriver argininmetyleringsreaksjonen utført av familien Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) som katalyserer overføringen av en metylgruppe fra S-adenosylmetionin (SAM) til guanidino nitrogen av arginin. Hvis en enkelt metylgruppe plasseres på et av de terminale nitrogenatomer av arginin, oppnås monometylert arginin (MMA). Hvis to metylgrupper tilsettes på samme nitrogenatom i guanidino-gruppen, genereres asymmetrisk di-metylert arginin (ADMA), mens hvis to metylgrupper plasseres på to forskjellige nitrogenatomer, produseres symmetrisk di-metylert arginin (SDMA).
Etter blanding i 1: 1-forhold lette og tunge merkede celler, ble proteiner ekstrahert og utsatt for fordøyelse av Trypsin og LysargiNase, parallelt. Som vist i figur 2, ble SDS-PAGE Coomassie-farget gel brukt til å verifisere effektiv enzymatisk fordøyelse av totale proteiner i peptider (sammenlign baner I og II). Videre ble effektiviteten av rensetrinnet utført av C18 Sep-Pak-kolonnen evaluert, noe som bekreftet fraværet av peptider i gjennomstrømningen av C18-kolonnen (figur 2, bane III) og i første og andre vask (henholdsvis figur 2 kjørefelt IV og V), med forventet tilstedeværelse i eluatet (figur 2, kjørefelt VI). Riktig Met-4-inkorporering i den tunge kanalen (figur 2B) og korrekt 1:1 H/L-blanding (figur 2C) ble evaluert.
Figur 3 viser kromatogrammet fra off-line HpH-RP væskekromatografifraksjonering av peptider og den påfølgende ikke-sammenhengende sammenkjeding av fraksjoner. Peptider ble påvist av 215 nm UV mens ufordøyd proteiner som potensielt var igjen ble evaluert av 280 nm UV. Under kromatogrammet skjematiseres fraksjonssammenkoblingsstrategien for å redusere de 70 startfraksjonene til slutt 16, inkludert PRE- og POST-gradientfraksjonene.
Anti-pan-R-metylantistoffer ble brukt til anrikning av R-metylpeptider. Disse antistoffene gjenkjenner de tre typene R-metylering (MMA, SDMA og ADMA), og de er kommersielt tilgjengelige som direkte konjugert til agaroseperler (se Tabellmateriale og reagenser for detaljer). Tabell 1 viser alle buffere og løsninger som brukes i denne protokollen.
Etter innsamling ble hver MS-rådata analysert to ganger med MaxQuant, for å identifisere lette og tunge metyleringer i forskjellige søkegrupper, med begrunnelsen at metylpeptider (tunge og lette) bare vil bli identifisert i en bestemt gruppe. Å søke tunge og lette metyleringer separat forbedrer analysen ved å redusere antall variable modifikasjoner introdusert og ved å redusere risikoen for falske positive blandede merkede peptider. Når MaxQuant har tildelt metylsteder, analyserer hmSEEKER utgangstabellen for å rekonstruere mulige par med tunge topper13.
Figur 4 og 5 illustrerer fullstendige MS-spektra av peptidene FELTGIPPAPR(me) (4) og NPPGFAFVEFEDPR(me) (5), som representerer henholdsvis en Sann Positiv og Falsk Positiv metyl-peptid-annotasjon. I figur 4 er m/z-forskjellene observert mellom de tre toppene forenlige med tilstedeværelsen av en enzymatisk metylert rest (7,0082 Th mellom umodifisert og lettmetylert; 2,0102 Th mellom de lette og tunge formene av metylpeptidet). De resulterende hmSILAC-dublettene har en ME på 0,40 ppm, en dRT på 0,00 min og en LogRatio på -0,41; disse verdiene er under standardgrensene som brukes av hmSEEKER for å skille mellom sanne og falske dubletter, som tidligere ble estimert til å være som følger: | MEG | < 2 ppm, |dRT| < 0,5 min, og | LogRatio | < 1. I det andre tilfellet illustrert i figur 5, avviker m/z-forskjellen observert mellom det lysmetylerte peptidet og dets antatte tunge motstykke fra forventningsverdien med 0,0312 Th (ME = -37,28 ppm). Videre har denne dubletten en LogRatio på 2,50, som er utenfor standard LogRatio-prediksjonsintervall (disse grenseverdiene er definert og diskutert i13). Faktisk, i MS / MS-spekteret, resulterte sekvensen av peptidet NPPGFAFVEFEDPR (me) ikke fullt dekket, og den tildelte R-metyleringen kunne også tolkes som en metylesterifisering på glutamat eller aspartat nær R.
hmSEEKER-arbeidsflyten er skjematisert i figur 6, mens tabell 4 gir en beskrivelse av utgangstabellen produsert av dette verktøyet, for å hjelpe tolkningen av resultatene: peptider som har flere modifikasjoner vises flere ganger, hver oppføring tilsvarer en annen metyleringshendelse på et gitt peptid; til slutt er peak doublets delt inn i tre klasser: Matchede dubletter er de mest selvsikre, da peptidet ble fragmentert og identifisert i både tung og lett form.
Figur 1: Skjema for eksperimentell arbeidsflyt og av enzymatiske protein-R-metyleringsreaksjoner. (A) Arbeidsflytdiagram over biokjemisk protokoll. Cellene dyrkes i lys (Met-0) og tunge (Met-4) metioninholdige medium i minst 8 doblinger, og lette og tunge kanaler blandes 1:1-proporsjon. Proteiner ekstraheres og underkastes fordøyelse med Trypsin eller LysargiNase parallelt og fraksjoneres ved off-line HpH-RP væskekromatografi ved å samle 70 fraksjoner, til slutt kombinert i 16 fraksjoner. R-metylpeptider er beriket av anti-pan-R-metylantistoffer konjugert til agaroseperler, som gjennomgikk andre enzymatisk fordøyelse (henholdsvis Trypsin eller LysargiNase), og analysert av LC-MS / MS. Rå MS-data behandles av MaxQuant-algoritmen for peptid- og PTM-identifikasjon. MaxQuant-utgangsdata sendes deretter til analyse av hmSEEKER bioinformatisk verktøy, utviklet internt for tung og lett metylpeptidforening. (B) Skjema for R-metyleringsreaksjon. Guanidino-gruppen av arginin kan modifiseres ved tilsetning av en metylgruppe, som produserer monometylert arginin (MMA) eller ved tilsetning av to metylgrupper, som produserer enten symmetrisk (SDMA) eller asymmetrisk (ADMA) di-metylert arginin. Reaksjonen katalyseres av enzymer av familien Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs), som overfører disse metylgruppene fra S-Adenosyl-Metionin (SAM). Etter metylgruppeoverføringen reduseres SAM til S-adenosylhomocystein (SAH). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kontroller av protokollkritiske trinn. (A) SDS-PAGE Coomassie-farget gel for evaluering av proteolytisk fordøyelseseffektivitet. MW: molekylvektmarkører. I) 20 μg totalt H / L-proteinekstrakt før fordøyelsen kvantifisert av BCA; II) fordøyd peptider lastet i samme forhold som i I; III) Gjennomstrømning av C18-kassett lastet i samme forhold som kjørefelt I; IV-V) første og andre vask av C18-patronen med buffer A, lastet i samme forhold som I; VI) rømmer fra C18-kassetten, lastet i samme forhold som I. (B) Met-4 inkorporeringsrateanalyse. Met-4-innlemmelsen i den tunge kanalen evalueres av internt utviklet skript (tilgjengelig på https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/); rate = 1 indikerer full inkorporering (C) Gaussisk fordeling av H/L-forhold for 1:1 blandingsvurdering. En normalfordeling av Log2 H / L-forhold er plottet med tanke på ±2σ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: HpH-fraksjonssammenkoblingsskjema og representativ R-metylerte peptider anrikningsvurdering . (A) Kromatogram med høy pH-reversert fasefraksjonering og skjema for den ikke-sammenhengende fraksjonssammenkoblingen. Kromatogrammet representerer HpH-RP-separasjonsprofilen for peptider oppdaget ved 215 nm UV (blå linje), mens tilstedeværelsen av ufordøyd proteiner ble sporet i UV-kanalen 280 nm (rød linje). Den lysegrønne linjen representerer konsentrasjonen av buffer B langs kromatografisk løp. Brøkesammenslåingsordningen rapporteres, og viser strategien for ikke-sammenhengende sammenkobling av tidlige, midtre og sene eluerende fraksjoner, fra 70 til 16, inkludert PRE- og POST-gradientfraksjoner. (B) Representativ tabell som oppsummerer anrikningen av R-metylerte peptider. Tabellen rekapitulerer det totale antall peptider og den relative prosentandelen av R-metyleringsberikelse som sammenligner hver IP på inngangen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på ekte hmSILAC doublet. Massespektrum av en ekte positiv dublett. Toppene som vises tilsvarer peptidet FELTGIPPAPR i de umodifiserte, lette monometylerte (CH3) og tunge monometylerte (13CD3) formene, med ladning 2+. M/z-forskjellene observert mellom de tre toppene er i samsvar med tilstedeværelsen av en enzymatisk metylert rest. Tabellen under massespekteret representerer hmSEEKER-utgangen og inneholder LogRatio-, ME- og dRT-parametrene til dubletten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempel på falsk hmSILAC doublet. Massespektrum av en negativ in vivo metyl-peptid-oppgave. Toppene på 811,3849 m/z og 818,3927 m/z tilsvarer de umodifiserte og lette monometylerte formene av peptid NPPGFAFVEFEDPR, med ladning 2+. Den tredje toppen kan tildeles som den tunge metyl-motparten til det lette metylerte peptidet, men det observerte m / z-skiftet skiller seg fra det forventede skiftet med 0,0312 Th, noe som utelukker denne muligheten. Tabellen under massespekteret representerer hmSEEKER-utgangen og inneholder LogRatio-, ME- og dRT-parametrene til dubletten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Skjematisk fremstilling av arbeidsflyt for dataanalyse . (A) MaxQuant oppdager MS1-topper i rådataene. (B) Topper med et tilknyttet MS2-spektrum behandles av databasens søkemotor Andromeda for å oppnå en peptididentifikasjon. (C) hmSEEKER leser MaxQuant peptididentifikasjoner og ekstrakter metylpeptider med Andromeda Score > 25, Delta Score > 12, og modifikasjoner med lokaliseringssannsynlighet > 0,75. (D) For hvert metylpeptid som passerer kvalitetsfiltreringen, finner hmSEEKER sin tilsvarende MS1-topp i MaxQuant allPeptides-tabellen og søker deretter etter motparten i samme tabell. (E) En dublett av topper er definert av forskjellen i retensjonstid (RT), intensitetsforholdet (LogRatio) og avviket mellom forventet og observert deltamasse (ME); Disse tre parameterne brukes av hmSEEKER for å skille sanne positiver fra falske positiver, som diskutert13. (F) Til slutt produserer hmSEEKER lister over overflødige og ikke-overflødige dubletter; Den første inkluderer spådommer for alle metylpeptider, mens den andre filtreres slik at når et peptid identifiseres flere ganger, rapporteres bare den beste scoringsdoblingen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer | Volum | Komposisjon |
| L-metionin (L) løsning | 10 ml | 30mg/ml Light-Methionine i ultrarent vann |
| L-metionin (H) løsning | 10 ml | 30mg/ml Heavy-Metionin i ultrarent vann |
| Medium for cellekultur | 500 ml | DMEM med stabilt glutamin og uten metionin, 10%(v/v) dialysert FBS, 1% (v/v) P/S, 1:1000 (v/v) L-metioninoppløsning |
| Lysis Buffer | 50 ml | 9M urea, 20mM HEPES pH 8,0;1% (v/v) proteasehemmer; 1 % (v/v) fosfatasehemmer i ultrarent vann |
| Ammoniumbikarbonat (AMBIC) løsning | 50 ml | 1M (NH4)2CO3 i ultrarent vann |
| DTT-løsning | 10 ml | 1,25 M DTT i ultrarent vann |
| IAA-løsning | 5 ml | 109mM i ultrarent vann |
| Løsemiddel A for Sep-Pak C18 | 50 ml | 0,1% TFA i ultrarent vann |
| Løsemiddel B for Sep-Pak C18 | 50 ml | 0,1 % TFA + 40 % ACN i ultrarent vann |
| Vaskeløsning for Sep-Pak C18 | 50 ml | 0,1 % TFA + 5 % ACN i ultrarent vann |
| Buffer A for HpH-fraksjonering | 500 ml | 25 mM NH4OH i ultrarent vann |
| Buffer B for HpH-fraksjonering | 500 ml | 25 mM NH4OH+ 90 % ACN i ultrarent vann |
| IP-bindende buffer 1x | 5 ml | Fortynning 1:10 (V/V) i ultrarent vann fra 10x kommersielt lagerløsning tilgjengelig |
| IP-elueringsbuffer | 50 ml | 0,15 % TFA i ultrarent vann |
| Buffer A for scenetips | 50 ml | 0,1% TFA i ultrarent vann |
| Buffer B for scenetips | 50 ml | 0,1 % TFA + 40 % ACN i ultrarent vann |
| Buffer C for Stage-Tips | 50 ml | 0,1 % TFA + 50 % ACN i ultrarent vann |
| MS Løsemiddel A | 250 ml | 0,1% FA i ultrarent vann |
| MS Løsemiddel B | 250 ml | 0.1% FA + 80% ACN i ultrarent vann |
| Proteasehemmere cocktail | 5 ml | cOmplete, EDTA-frie proteasehemmere (ROCHE) oppløst i ultrarent vann i henhold til fremstillingsinstruksjonene |
| Fosfatase hemmere cocktail | 5 ml | PhosSTOP tabletter (ROCHE) oppløst i ultrarent vann i henhold til fremstillingsinstruksjonen |
Tabell 1: Buffere og løsningssammensetning. Lister over buffere og løsninger som brukes i denne protokollen.
| Parametere | Verdi |
| Eksempel på lasting (uL) | 2 |
| Strømningshastighet for lasting (uL/min) | 10 |
| Gradert flythastighet (nL/min) | 300 |
| Lineær gradering | 3-30% B for 89min, 30-60% B for 5min, 60-95% B for 1min, 95% B for 5min |
| Full skanneoppløsning | 70,000 |
| Antall mest intense ioner valgt | 15 |
| Relativ kollisjonsenergi (%) (CID) | 28 |
| Dynamisk ekskludering(er) | 20.0 |
Tabell 2: LC-MS/MS-innstilling. Parametere anvendt for LC-MS / MS-analysen av R-metylpeptider på et høyoppløselig Quadrupole-Orbitrap massespektrometer, koblet til et nano-flow ultrahøyytelses væskekromatografi (UHPLC) -system.
| Innstillinger for MQ-parametere (ver 1.6.2.10) | |||
| Innstilling | Handling | ||
| Konfigurasjon | |||
| Endringer | Met4 | Legg til ny endring. Sett Komposisjon til H(-3) Hx(3) Cx C(-1), og velg M som spesifisitet. | |
| Metyl4 (KR) | Dupliser "Metyl (KR)", gi den nytt navn og endre sammensetningen til Cx H(-1) Hx(3) | ||
| Dimetyl4 (KR) | Dupliser "Dimetyl (KR)", gi den nytt navn og endre sammensetningen til H(-2) Hx(6) Cx(2) | ||
| Trimetyl4 (K) | Dupliser "Trimetyl (K)", gi den nytt navn og endre sammensetningen til Cx(3) H(-3) Hx(9) | ||
| OxMet4 | Dupliser "Oksidasjon (M)" og gi den nytt navn. | ||
| Proteaser | Lysarginase | Legg til ny protease. Velg kolonnene 'R' og 'K'. | |
| Når du oppretter en ny PTM eller protease, klikker du på "Endre tabell" for å endre MaxQuant-innstillingene og deretter "Lagre endringer" for å bekrefte endringene. Start MaxQuant på nytt, og de nye alternativene vil være synlige. | |||
| Råfiler-fanen | |||
| Parametere-gruppen | Skill råfilene i 2 grupper (0 og 1) | ||
| Gruppespesifikke parametere | |||
| Type | Type | Standard | |
| Mangfold | 1 | ||
| Fordøyelse | Enzym | Trypsin eller lysarginase | |
| Maks savnet Cleavages | Sett til 3 | ||
| Endringer | Variable modifikasjoner | Gruppe 0 | Oksidasjon (M), Metyl (KR), Dimetyl (KR), Trimetyl (K) |
| Gruppe 1 | OxMet4, Metyl4 (KR), Dimetyl4 (KR), Trimetyl4 (K) | ||
| Faste modifikasjoner | Gruppe 0 | Karabamidmetylering | |
| Gruppe 1 | Carbamidomethylation og Met4 | ||
| Globale parametere | |||
| Sekvenser | Fasta-filer | Last inn FASTA-fil | |
| Identifikasjon | PSM FDR | Sett til 0,01 | |
| Min. Score for modifiserte peptider | Sett til 1 | ||
| Minimum Delta-score for modifiserte peptider | Sett til 1 | ||
| Avansert identifikasjon | Andre peptidsøk | Kryss av | |
| Tabeller | Skriv allPeptides-tabell | Sjekk | |
| Avansert | Beregn toppegenskaper | Sjekk | |
| Hvis det ikke er angitt, forlater du standardparameteren. | |||
| Innstillinger for MQ-parametere for inkorporeringstest | |||
| Gruppespesifikke parametere | |||
| Type | Type | Standard | |
| Mangfold | 2 | ||
| Maks merket | 5 | ||
| Tung etikett | Velg Met4 | ||
| Fordøyelse | Enzym | Trypsin eller lysarginase | |
| Maks savnet Cleavages | Sett til 3 | ||
| Endringer | Variable modifikasjoner | Oksidasjon (M) | |
| Faste modifikasjoner | Karabamidmetylering | ||
| Hvis det ikke er angitt, forlater du standardparameteren. | |||
Tabell 3: MaxQuant-behandlingsparametere. Gruppespesifikke og globale parametere justert til det spesifikke eksperimentet som er beskrevet, er oppført. Alle andre parametere er angitt som standard, avhengig av hvilken programversjon som brukes.
| Kolonnenavn | Beskrivelse |
| Rawfile | Rådatafil der dubletten ble identifisert |
| H-skanning | Skann nummeret til den tunge motparten |
| L-skanning | Skann nummeret til den lette motparten |
| .CLASS | Kan ha 3 verdier: |
| Matchet = Tunge og lette peptider identifiseres med samme sekvens | |
| Mismatched = Tunge og lette peptider har samme aa-sekvens, men det er en mismatch i lokaliseringen av det metylerte stedet | |
| Reddet = Bare ett peptid i dubletten er identifisert; motparten er en uidentifisert topp. | |
| PEPTID | Peptid sekvens |
| SCORE | Peptid Andromeda Score |
| RES | Modifiserte rester |
| POS | Plassering av den modifiserte resten |
| MOD | Modifikasjon |
| BLYPROTEIN | Protein peptidet tilhører |
| GEN | Gennavn tilsvarende proteinet |
| PROBABILITY_TRUE | Sannsynligheten for at dubletten er en ekte hmSILAC-dobbel, beregnet ved den logistiske regresjonsmodellen |
| FORUTSIGELSE | 1 hvis dubletten er antatt sann, 0 hvis den er usann |
| H/L-LOGRATIO | Log2 av forholdet mellom tung og lett intensitet |
| MEG | Avvik mellom forventet og observert masseforskjell |
| DRT | Forskjell i oppbevaringstid |
Tabell 4: beskrivelse av hmSEEKER-resultater. Liste over kolonneoppføringene i hmSEEKER-utdatatabellen, med en kort beskrivelse av innholdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den høye konfidensidentifiseringen av in vivo protein / peptidmetylering ved global MS-basert proteomikk er utfordrende, på grunn av risikoen for høy FDR, med flere aminosyresubstitusjoner og metylesterifisering som oppstår under prøvepreparering som er isobarisk til metylering og kan forårsake feil oppgaver i fravær av ortogonale MS-valideringsstrategier. Den substøkiometriske naturen til denne PTM kompliserer ytterligere oppgaven med global metylproteomikk, men kan overvinnes med selektiv anrikning av modifiserte peptider10.
Her presenteres en biokjemisk og analytisk arbeidsflyt, som er designet for å øke effektiviteten og påliteligheten til global MS-analyse av R-metylpeptider gjennom anvendelse av hmSILAC-strategi koblet til HpH-RP-kromatografipeptidfraksjonering og affinitetsberikelse med anti-pan-R-metyl-peptider antistoffsett. Den tidligere strategien tillater ortogonal validering av metylpeptider og reduserer sterkt FDR for identifikasjon, mens sistnevnte protokoll øker deres detekterbarhet fra bakgrunnen av umodifiserte peptider22. En begrensning av denne protokollen er imidlertid kravet om meget stor mengde startproteinekstrakt (i området 20-40 mg) som inngang for den påfølgende peptidfraksjonering og affinitetsberikelse, noe som begrenser anvendelsen av metoden til udødelige, raskt voksende cellelinjer som kan utvides omfattende. I stedet gjelder ikke det nåværende oppsettet for pasientavledede primære celler eller vev. Fremtidige undersøkelser bør rettes mot å forbedre protokollen i denne retningen: Ytterligere strategier for biokjemisk anrikning av metylert peptid over umodifiserte kan tillate omgåelse av bruk av antistoffer, noe som muliggjør nedskalering av forsøkene. En annen interessant utvikling kan representeres av kombinasjonen av dagens metoder med kjemisk modifisering av proteolytiske peptider med isobariske eller tandemmassemerker, med to ganger potensielle fordeler: på den ene siden muligheten for å kombinere flere forhold i ett enkelt eksperiment, og dermed multipleksere den relative kvantifiseringen av metylproteomiske endringer ved forskjellige forstyrrelser; På den annen side kan sammenslåing av forskjellige prøver i en før kromatografisk fraksjonering og affinitetsberikelse tillate å redusere omfanget av individuelle eksperimenter.
Denne protokollen er avhengig av to separate fordøyelser av hele celleekstraktet parallelt med Trypsin og LysargiNase. Trypsin spalter peptidbindingen på den C-terminale siden av K- og R-rester, og genererer peptider som presenterer en positivt ladet rest ved C-terminalen, i tillegg til den N-terminale positive ladningen fra α-amin23. LysargiNase-enzymet hydrolyserer selektivt peptidyl-K- og -R-bindinger, og genererer peptider som bærer en K eller R på N-terminalstedet, som kan inkludere K-metylerte former. Bruken av begge proteasene øker den totale proteomdekningen i storskala MS-analyse, noe som fører til identifisering av peptider som til slutt ble savnet ved en enkelt tryptisk fordøyelse18. Den doble enzymatiske fordøyelsen utføres i stedet for å redusere antall mulige tapte enzymatiske spaltninger. Faktisk reduserer metylering av K og R sterkt effektiviteten av proteinspaltning av trypsin. Til tross for denne forholdsregelen er det fortsatt vanlig at metylerte peptider er lengre og inneholder tapte spaltninger, noe som fører til dårlig CID-fragmentering.
Bruken av en annen type fragmentering, for eksempel Electron Transfer Dissociation (ETD), kan løse dette problemet. Faktisk fragmenterer ETD vanligvis ikke dobbelt ladede peptidioner effektivt som CID gjør, men det gir ganske jevn spaltning av peptidforløpere for høyere ladningstilstander (≥3). Dette kan være en fordel når det gjelder R-metylering, siden det ofte forekommer i argininrike domener som inneholder flere og nærliggende R-rester. ETD har imidlertid en lavere skannehastighet enn CID, så det totale antallet peptididentifikasjoner reduseres24,25,26.
Nylig har flere protokoller som involverer anrikning av posttranslasjonelt modifiserte peptider blitt kombinert med forskjellige kromatografiseparasjonsstrategier som bidrar til å redusere kompleksiteten til peptidblandingen, og dermed øke den totale effektiviteten av modifisert peptiddeteksjon i MS. Her påføres HpH-RP kromatografisk fraksjonering kombinert med ikke-sammenhengende sammenkobling av fraksjonene. Off-line peptidfraksjonering basert på en høy pH reversert fasekromatografi viser en høy oppløsningskraftseparasjon som er ortogonal til den online lave pH RP-separasjonen utført nedstrøms under LC-MS / MS-kjøringen27. Videre har den ikke-sammenhengende sammenkoblingsstrategien to hovedfordeler: For det første øker den proteindekningen ved å samle tidlige, midtre og sene eluerende fraksjoner i individuelle sammenkjedede fraksjoner, og bevare heterogeniteten av peptidblandingen. For det andre reduserer sammenkoblingen den påfølgende MS-kjøretidsanalysen ved å anskaffe et lavere antall prøvefraksjoner28.
På grunn av den substøkiometriske naturen til R-metylering er det nødvendig med et anrikningstrinn for å lette påvisning av metylpeptider i global MS-analyse av modifikasjonsproteomer. I denne protokollen er metylpeptidene beriket ved immunoaffinitetsutfelling (IAP) ved bruk av antistoffene anti-SDMA og anti-ADMA parallelt, mens immunutfelling av monometylpeptider ved bruk av anti-MMA-antistoff utføres på FTs fra de tidligere IAP-forsøkene. Denne rekkefølgen gjenspeiler den forskjellige effektiviteten til disse antistoffene: anti-SDMA- og anti-ADMA-antistoffer har lavere bindingseffektivitet sammenlignet med anti-MMA-antistoff. Det er verdt å merke seg at denne forskjellige effektiviteten også kan forårsake skjevheter i representasjonen av de forskjellige grader av R-metyleringer i modifikasjonsproteomer eksperimentelt kommentert29.
Før den kommersielle tilgjengeligheten av anti-pan-R-metyleringsantistoffer ble andre separasjonsstrategier brukt for å øke R-metylert peptiddeteksjon ved MS, for eksempel sterk kationutveksling (SCX) og hydrofil interaksjon (HILIC) kromatografi. Til tross for at disse teknikkene kunne redusere kompleksiteten til peptidblandingen analysert i MS, forbedret de ikke signifikant identifiseringen av metylpeptider30,31,32,33.
Til tross for alle disse tekniske og analytiske løsningene som tar sikte på å øke metyl-peptidseparasjonen, deteksjonen, fragmenteringen og sekvensmerknaden, er metylproteomdekningen fortsatt begrenset og partisk mot de mer rikelige metylerte proteinene, som ribonukleoprotein, RNA-bindende helikaser, mens flere kjente modifiserte proteiner med lav overflod (f.eks. TP53BP1, CHTF8, MCM2) bare oppdages serendipitøst og ikke pålitelig over flere globale eksperimenter34 . Subcellulær fraksjonering påført før den nåværende arbeidsflyten kan forbedre deteksjonen av slike proteiner; Den nåværende eksperimentelle skalaen som kreves, gjør imidlertid ikke dette til et levedyktig alternativ.
Ved MS analyseres rådataene gjennom MaxQuant-algoritmen for peptid- og PTM-identifikasjon. Analysen av data fra hmSILAC-eksperimenter er imidlertid ikke enkel med standard søkealgoritmer. For eksempel, mens MaxQuant effektivt kan analysere standard SILAC-eksperimenter basert på metabolsk merking med isotopisk kodet K og R, virker det ikke effektivt når isotopmerkingen er kodet til en variabel PTM, som i tilfelle av tung metylmerking som fører til tung metylering. Derfor består strategien som er vedtatt her i først å analysere hmSILAC-dataene med MaxQuant uten å bruke den innebygde dobbeltsøkingsfunksjonaliteten slik at de lette og tunge peptidene kan identifiseres uavhengig; Deretter matches de med en etterbehandlingsprogramvare. Denne bioinformatiske arbeidsflyten har også sine egne fallgruver, da man må spesifisere metyleringer i både tunge og lette former i Variable Modifications-panelet til MaxQuant, og ender opp med totalt åtte variable modifikasjoner når metioninoksidasjon (tung og lett) også er inkludert. Å søke etter for mange PTM-er med en databasesøkemotor som MaxQuant/Andromeda er upraktisk, fordi det fører til en eksponentiell økning av de teoretiske peptidene algoritmen må teste: vår løsning var å analysere hver MS-rådata to ganger, med forskjellige sett med variable PTM-er (gjennom parametergruppenes funksjon av MaxQuant). Etter peptidsøk brukes det egenutviklede verktøyet hmSEEKER for å støtte tildelingen av tunge lette peptidpar fra utgangstabellene produsert av MaxQuant. Den første utgivelsen av hmSEEKER-algoritmen er nylig publisert13, hvor det ble vist at hmSEEKER kan identifisere hmSILAC-dubletter med FDR-< 1%. Falske positiver kan fortsatt oppstå fra par av topper som tilfeldigvis har en masseforskjell på 4,02 Da, men dette er svært lite sannsynlig for dublettene klassifisert som Matched eller Mismatched, i lys av følgende fakta: for at en Matched eller Mismatched doublet skal være falsk, må Andromeda feilaktig bestemme sekvensen til både den tunge og den lette motparten. Forutsatt at søkemotoren har blitt kjørt med standardparametrene, har hver identifikasjon en 1% sannsynlighet for å være feil. Dermed er sannsynligheten for at hmSILAC-motparten også er feil 0, 01%.
En fallgruve av hmSILAC er at peptider som inneholder metionin i ryggraden også genererer dubletter som ikke kan skilles fra de som genereres av metylpeptider. Likevel, fra vår erfaring, bør dette ikke representere et stort problem, først fordi peptider uten metyleringer ganske enkelt kan kastes fra MaxQuant-utgangen, og for det andre fordi hmSEEKER automatisk tar hensyn til eventuelle metioninrester i et metylpeptid ved beregning av forventet masseforskjell; Til slutt er denne risikoen også utelukket ved at de tunge og lette modifikasjonene søkes i separate parametergrupper, slik at søkemotoren ikke kan dele en tung monometylering (+18,03 Da) i en lett monometylering pluss en tung metionin (14,01 + 4,02 Da).
En mer formell og eksperimentell løsning på dette problemet ble foreslått av Oreste Acuto og hans samarbeidspartnere, som utviklet en variant av hmSILAC, kalt isometioninmetyl-SILAC (iMethyl-SILAC)22. I denne alternative metabolske merkingsprotokollen erstattes naturlig lys metionin av [13 C 4] -metionin, som har samme masse som [13CD3] -metionin (Met-4), men det produserer ikke stabile isotopisk kodede metylgrupper, på grunn av den forskjellige fordelingen av de tunge isotoper i molekylkoden. I iMethyl-SILAC-eksperimenter genererer umodifiserte metioninholdige peptider ikke dubletter. Det skal imidlertid bemerkes at når Acuto og medarbeidere sammenlignet ytelsen til iMethyl-SILAC og tradisjonell hmSILAC, viste de to metodene fortsatt svært like FDR.
En mulig begrensning av hmSEEKER er at den er designet for å fungere direkte på MaxQuant-utdatatabeller slik at kildekoden ikke er kompatibel med andre søkemotorer, hvis utdatafiler er strukturert annerledes; i denne forstand gir MethylQuant35 et godt alternativt bioinformatisk verktøy som er skreddersydd ad hoc for direkte analyse av MS-rådata fra hmSILAC-type eksperimenter og er mer fleksibel når det gjelder inngangsfilene som tilbys. En maskinlæringsmodell er under utvikling for å skille mellom sanne og falske metylpeptid-H/L-dubletter uten å stole på brukerdefinerte terskler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
MM og EM er ph.d.-studenter ved European School of Molecular Medicine (SEMM). EM er mottaker av et 3-årig FIRC-AIRC-stipend (prosjektkode: 22506). Globale analyser av R-metylproteomer i TB-gruppen støttes av AIRC IG Grant (Prosjektkode: 21834).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
