Summary
Heri er protokoller til indsamling og mikroinjektion af præcellulære majsplantehoppeembryoner med det formål at ændre deres genom via CRISPR/Cas9-baseret genomredigering eller til tilføjelse af markerede transponerbare elementer gennem kimlinjetransformation.
Abstract
Majsplantehoppen, Peregrinus maidis, er et skadedyr af majs og en vektor af flere majsvirus. Tidligere publicerede metoder beskriver udløsningen af RNA-interferens (RNAi) i P. maidis gennem mikroinjektion af dobbeltstrengede RNA'er (dsRNA'er) i nymfer og voksne. På trods af kraften i RNAi er fænotyper genereret via denne teknik forbigående og mangler langsigtet Mendelsk arv. Derfor skal P. Maidis-værktøjskassen udvides til at omfatte funktionelle genomiske værktøjer, der vil muliggøre produktion af stabile mutantstammer og åbne døren for forskere til at anvende nye bekæmpelsesmetoder på dette økonomisk vigtige skadedyr. I modsætning til de dsRNA'er, der anvendes til RNAi, krydser de komponenter, der anvendes i CRISPR / Cas9-baseret genomredigering og kimlinjetransformation, imidlertid ikke let cellemembraner. Som følge heraf skal plasmid-DNA'er, RNA'er og / eller proteiner mikroinjiceres i embryoner, før embryoet cellulariseres, hvilket gør injektionstidspunktet til en kritisk faktor for succes. Til dette formål blev der udviklet en agarosebaseret æglægningsmetode, der gjorde det muligt at høste embryoner fra P. maidis-hunner med relativt korte intervaller. Heri gives detaljerede protokoller til indsamling og mikroinjektion af præcellulære P. maidis-embryoner med CRISPR-komponenter (Cas9-nuklease, der er blevet kompleksbundet med guide-RNA'er), og resultater af Cas9-baseret genknockout af et P. maidis øjenfarvegen, hvid, præsenteres. Selvom disse protokoller beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de også bruges til at producere transgene P. maidis via kimlinjetransformation ved blot at ændre sammensætningen af injektionsopløsningen.
Introduction
Majsplantehoppen, Peregrinus maidis, er et økonomisk vigtigt skadedyr af majs 1,2,3. De forårsager direkte fysisk skade på planten, både mens de fodrer med deres piercingsugende munddele, og under reproduktion, når de lægger deres embryoner direkte ind i plantevæv 2,4. På trods af de mange veje med direkte skade på afgrøder er den største indvirkning, disse insekter har på afgrødens sundhed, indirekte ved at fungere som vektor for majsmosaikvirus (MMV) og majsstribevirus 5,6. MMV er i stand til at replikere i kroppen af sin P. maidis-vektor, så virussen kan fortsætte i individuelle insekter gennem hele deres liv, så de kan fortsætte med at sprede virussen til nye værtsplanter 7,8. De mest almindelige metoder til bekæmpelse af P. maidis, og dermed de vira, det vektorer, er insekticider.
Desværre har dårlig forvaltning af disse produkter medført udvikling af resistens hos målskadegørere samt forurening af miljøet9. Derfor er der behov for nye strategier for at reducere afgrødetab fra denne kombination af insekt og virus-skadedyr. Tidligere arbejde viste, at RNA-interferens (RNAi) kunne være en effektiv kontrolmetode for P. maidis, fordi de er modtagelige for nedregulering i genekspression, selv når de indtager dobbeltstrenget RNA (dsRNA)10. Den mest effektive måde at administrere dsRNA i marken ville dog være gennem de planter, insekterne lever af; Derfor kan afgrøder stadig være modtagelige for vira, som insekterne allerede bærer. Med fremkomsten af CRISPR / Cas9-genomredigering er nye skadedyrsbekæmpelsesstrategier mulige, herunder Cas9-baseret gendrev11,12, som kan bruges til at reducere størrelsen af en skadedyrspopulation eller til at erstatte befolkningen med individer, der er resistente over for de vira, de vektor.
Udvikling og udbredelse af enhver form for gendrevsystem vil imidlertid kræve udvikling af transgene teknikker. Sådanne metoder var ikke nødvendige for at udføre RNAi-eksperimenter i P. maidis, fordi dsRNA'er og/eller siRNA'er formodes at kunne krydse cellemembraner på grund af effektiviteten af RNAi i P. maidis10,13. Dette gælder ikke for DNA og/eller proteiner, der anvendes i traditionel transgenese eller i Cas9-baseret genredigering, som begge ville være en forløber for at skabe insekter, der bærer et gendrev. For at opnå genredigering eller andre former for kimlinjetransformation mikroinjiceres disse DNA'er og proteiner ideelt i embryoner under syncytialblastoderm-stadiet, før insektembryoet cellulariseres. Timing er kritisk, fordi syncytialfasen er den tidligste del af udviklingen14,15. Da P. maidis hunner fortrinsvis lægger deres æg i plantevæv, kan ekstraktion af tilstrækkelige mængder præcellulære embryoner til mikroinjektioner være arbejdskrævende og tidskrævende. Derfor blev der udviklet nye teknikker til hurtigt at indsamle og mikroinjicere P. maidis-embryoner før cellularisering.
Protocol
1. Opdræt på koloniniveau af voksne P. maidis
- Plant mindst fire potter majs om ugen pr. opdrætsbur med 3-4 frø pr. Potte. Voks i et insektfrit miljø.
- Når planter er ~ 5 uger gamle, skal du placere inde i et bur på 30 cm x 30 cm x 60 cm.
- Få en tilstrækkelig mængde P. maidis voksne (~ 500) fra et forskningslaboratorium eller naturen, og læg det i et insektsikkert bur med 9-12 majsplanter (3-4 potter).
- Kolonien opbevares i en insektopdrætskuvøse ved 25 °C (± 1 °C) med mindst 70 % fugtighed og en lyscyklus på 14:10.
- For at generere en alderskalibreret koloni skal du fjerne alle indledende voksne efter fire dages æglægning og lade embryonerne lagt i buret klække og ældes naturligt.
- Flyt 5 uger gamle P. maidis-insekter (voksne) til friske majsplanter til ugentlig subkultur ved at samle med en aspirator (figur 1). Slip derefter de voksne i et rent bur med friske majsplanter. For at opretholde en stabil forsyning af unge voksne til eksperimentelle formål skal du forberede friske alderskalibrerede bure hver uge.
- Vand gryderne i burene to gange dagligt. Klip regelmæssigt stilke, fjern rådnende plantemateriale, og erstat med friske majspotter efter behov.
BEMÆRK: Ved korrekt vedligeholdelse kan en koloni vare ~ 5 uger (dvs. længe nok til, at embryoner lagt i buret bliver voksne).
2. Agarosebaseret æglægningskammer
- Lav ægopsamlingsskåle (ovipositionsmedium) ved at hælde 1% w/v agarose i vand i rene 100 mm x 15 mm petriskåle. Ovipositionssubstratet opbevares ved 4 °C, efter at det er størknet.
- Forbered 10% w/v saccharoseopløsning til fodring af voksne. Saccharoseopløsningen opbevares ved -20 °C i op til en måned.
- Lav et kammer til at holde de voksne ved at skære et hul i bunden af en 1 oz kop (se materialetabellen) og lime en skærm over hullet til luftudveksling (figur 2).
- Skær plastparaffinvoksfilm i firkanter på 5 cm x 5 cm; Afsæt 2 firkanter til hver kop.
- Saml ~15 1 uge gamle voksne hunner fra en alderskalibreret P. maidis-koloni. For at vælge kvinder skal du undersøge den ventrale side af maven og kigge efter ovipositoren, som typisk er mørkere end resten af maven (figur 3). Hold voksne i op til en time i et 15 ml konisk hætteglas, hvis du opretter flere æglægningskamre. Afkøl insekterne kort på is inden køn og overfør dem til den voksne beholder.
BEMÆRK: Denne undersøgelse kan udføres uden mikroskop. Voksne hunner, der har haft tid til at fodre og parre sig, har også typisk større underliv end voksne hanner og er mere føjelige; Derfor kan de lettere vælges fra en burpopulation. - Overfør hunnerne til en voksen beholder, og forsegl koppen med 1 lag plastparaffinvoksfilm ved jævnt at strække den 3-4 gange dens oprindelige størrelse (figur 4A, B).
- Påfør 400 μL 10% w/v saccharoseopløsning på toppen af plastparaffinvoksfilmforseglingen, og tilsæt et andet lag plastparaffinvoksfilm, idet plastparaffinvoksfilmen strækker nøjagtigt som ovenfor (figur 4C, D).
BEMÆRK: Sandwichen af strakt plastparaffinvoksfilm sætter saccharoseopløsningen under tryk, hvilket er meget vigtigt for voksenfodring, men forhindrer ikke hunner i at gennembore deres ovipositorer helt igennem i ovipositionsmediet. - Anbring voksenkammeret på et ægopsamlingsfad med plastparaffinvoksfilmsiden direkte på ovipositionsmediet, og pakk hele æglægningskammeret ind med plastfolie uden at dække lufthullerne, da disse er nødvendige for luftudveksling (figur 5).
- Hvert æglægningskammer inkuberes ved 25 °C med 70 % fugtighed og en lyscyklus på 14:10.
- Skift sandwich af plastparaffinvoksfilm og 10% w / v saccharoseopløsning dagligt, og fjern alt vand, der akkumuleres inde i koppen.
3. Embryoopsamling og justering i et miljø med høj luftfugtighed
- Opsæt et stereomikroskopbaseret mikroinjektionssystem i et befugtet rum eller hætte (befugtet hætte; Figur 6) for at sikre, at arbejdsmiljøet opnår mindst 70% fugtighed under hele mikroinjektionsprocessen.
- Kontroller ovipositionssubstratet for æg efter den ønskede æglægningsperiode. Gør dette i en befugtet hætte eller et andet fugtigt miljø.
BEMÆRK: Den æglægningsperiode, der typisk blev brugt, var natten over fra kl. 18 til 10 og varede ~ 16 timer. - Hvis der lægges æg i agarose, skal du bruge fine tang til forsigtigt at grave dem ud og placere dem på overfladen af agarose for at holde dem fugtige (figur 7A).
- Påfør en strimmel med 1 mm x 15 mm dobbeltklæbende tape på en 22 mm x 30 mm dæksel (figur 7B). Dækselbåndets side opad anbringes på ovipositionsmediet (figur 7C).
- Tag hvert enkelt æg op fra agaroverfladen, og flyt til dobbeltklæbende tape med en fin børste. Fjern æg, der er helt hvide eller har sort farve på dem. Sunde æg vil være halvgennemsigtige.
- Placer de bananformede æg på deres side, med den større ende fast på den dobbeltsidede tape (figur 7D).
BEMÆRK: Opbevar altid æggene i omgivelser med høj luftfugtighed, såsom en petriskål støbt med et lag 1% agar i bunden.
4. Fremstilling af CRISPR-reagenser og injektionsnåle
- Træk kvartsnåle ved hjælp af en flammende/brun mikropipetteaftrækker.
- Skrå kvartsnålene ved hjælp af en mikropipette-facetter.
- Brug dobbeltklæbende tape til at fastgøre trukne nåle i en klar beholder, såsom en petriskål, indtil den er klar til brug.
- Injektionsopløsningen fremstilles ved at kombinere 0,5 μL Cas9-protein (5 μg/μL stamopløsning) og 0,5 μL sgRNA (4 μg/μL stamopløsning; se materialetabellen) med 1 μL phenolrød buffer i et slutvolumen på 5 μL. For at udfælde partikler, der kan tilstoppe nålen, hvirvel opløsningen kort og centrifugeres i 3 minutter ved maksimal hastighed.
- Fyld kanylen tilbage, og sørg for, at injektionsblandingen forbliver nær kanylens tilspidsede ende. Fjern eventuelle bobler fra kanylespidsen.
- Anbring forsigtigt den tilbagefyldte nål i nåleholderen, og stram kraven i rustfrit stål for at holde nålen sikkert på plads under mikroinjektion.
- Frembring en pålidelig strøm af injektionsopløsning fra nålen ved forsigtigt at stryge den skrå spids med en fin, fugtig pensel, mens nålen udsættes for lufttryk med injektionssystemet.
BEMÆRK: Kanylen er klar til injektion, når injektionsblandingen kan forlade spidsen i små mængder.
5. Mikroinjektion og pleje efter injektion
- Forbered en mikroinjektionsplatform ved at fylde en ren 100 mm x 15 mm petriskål med 1% agar for at danne et plant lag agar, der flugter med toppen af skålen.
- Anbring en tidligere forberedt dækseddel med ~25 embryoner på agarplatformen (figur 8A).
BEMÆRK: Alle injektionstrin skal udføres inde i en befugtet hætte (~ 70% fugtighed). - Kontroller injektionstrykket ved at placere kanylespidsen i en dråbe vand og starte injektionscyklussen.
BEMÆRK: En lille mængde injektionsopløsning skal spredes i vandet, hvis trykindstillingen er korrekt (figur 8B). - Indsæt nålen i den større ende af embryoet, der nærmer sig fra venstre side af dæksedlen (figur 8C). Aflever injektionsopløsningen i ægget, og træk kanylen hurtigt ud.
- Når alle æg er injiceret, placeres dækslet på overfladen af en ny 1% agarskål og overføres skålen til et fugtighedskammer (figur 9).
6. Udrugning og udklækning af embryoner
- Rugekammeret anbringes i en 25 °C inkubator i 6 dage.
- Overfør eventuelle overlevende embryoner med rent vand og en fin børste til en 35 mm x 10 mm petriskål med vandfugtet filterpapir, der dækker bunden af skålen. Petrifskålen forsegles med plastparaffinvoksfilm, og den holdes ved 25 °C, så embryonerne kan klække. Begynd at kontrollere embryonerne 6 dage efter injektion for overlevelse.
BEMÆRK: De første stjernenymfer begynder at klække omkring dag 8. - Overfør nymfer ved hjælp af en fin børste til en petriskål, der indeholder bladafklip. Dæk fadet og forsegl med plastparaffinvoksfilm.
- Den lukkede skål med nyudklækkede unger inkuberes på bladstiklinger i 48 timer ved 25 °C.
- Overfør alle 2 dage gamle nymfer fra en injektionsrunde til et opdrætsbur med majsplanter ved hjælp af en fin børste. Hvis intravenøse brugere med synlig fænotype genvindes i tilstrækkeligt antal, skal du opdrætte dem separat for at maksimere genopretningen af målegenskaben i næste generation. Ellers skal du udføre masseparring af alle injicerede.
BEMÆRK: Placer hatchlings forsigtigt i hvirvlen af majsplanten for at give tilflugt og sikre korrekt fugtighed i deres umiddelbare miljø. - Bageste insekterne under de ovenfor beskrevne forhold, hvilket sikrer korrekt temperatur, fugtighed og regelmæssige overførsler til friske majsplanter.
- Skærm afkom for forventede fænotyper. Placer individer, der udviser den ønskede fænotype i deres eget bur for at etablere homozygote linjer.
Representative Results
Æglægningskammeret var specielt designet til at gøre det muligt for P. maidis hunner at fodre, mens de ovipositerede i et beskyttende medium, hvorfra deres æg let kunne genvindes. Ved hjælp af denne metode blev tilstrækkelige mængder præcellulære embryoner genfundet til mikroinjektion med DNA, RNA og / eller proteiner. Voksne P. maidis-hunner lægger normalt æg inde i majsplanternes bladvæv, hvilket gør det til en udfordring at få nok æg på kort tid, fordi det kræver meget bladdissektion. Det kunstige æglægningsmiljø giver en løsning til at overvinde disse problemer. Som vist i tabel 1 blev der indsamlet 6.483 æg fra i alt 645 hunner på 4 uger. Hunnerne begynder normalt at lægge æg efter dag 2 og giver de fleste æg fra dag 4 til dag 6. Ovipositionsaktiviteten aftog på dag 9. Hvert ægkammer blev oprettet fredag og kontrolleret for æg fra søndag til næste søndag. Efter denne tidsplan tillod de fleste æg at blive indsamlet til mikroinjektioner i løbet af arbejdsugen.
Den første praktiske anvendelse af dette æglægningssystem var at teste effekten af Cas9-medieret genknockout ved hjælp af P. maidis-ortologen af øjenfarvegenet, hvid (Pmw), som et mål. Mutationer i hvid er kendt for at resultere i betydeligt tab af øjenpigmentering hos andre insektarter, og hvid er celleautonom, hvilket gør det muligt at detektere mutationer hos injicerede individer16,17. For at øge chancen for, at selv en lille mutation kan resultere i tab af funktion, blev guide-RNA'er designet til at skære inden for området af ATP-bindingskassetten, hvilket er nødvendigt for hvid funktion16. P. maidis embryoner blev injiceret med enten 20% phenolrød (injektionsbuffer), injektionsbuffer med Cas9 i en slutkoncentration på 800 ng/μL (Cas9-kontrol) eller Cas9 i injektionsbuffer sammen med tre guide-RNA'er tilsat i en koncentration på 400 ng/μL hver. Kombinationen af tre guider inden for en injektionsblanding var beregnet til yderligere at maksimere chancerne for at generere mutanter, både ved at skabe en stor sletning og ved at kompensere for muligheden for, at en vejledning kunne være ineffektiv til skæring. Udviklingsraterne for hver behandling var sammenlignelige (tabel 2), idet 50-60 % af de injicerede personer viste tegn på udvikling. Lugehastighederne for buffer- og Cas9-kontrollerne var også sammenlignelige; Imidlertid var udklækningsraterne for personer, der modtog tre-guide-blandingen, relativt lavere. På nuværende tidspunkt er det uklart, om den reducerede overlevelse er resultatet af tab af hvid funktion eller resultatet af utilsigtede konsekvenser af tre-guide-blandingen, såsom off-target-effekter (se diskussionsafsnittet). Imidlertid klækkede ingen af individerne med fuldstændigt tab af øjenpigmentering (dvs. fuldstændig knockout), og ingen af afkom af injicerede individer havde hvide øjne. Cas9-baseret mutageneses effekt på målet blev verificeret på to måder. Først blev injicerede screenet for tab af øjenpigmentering.
Af de 71 guide-injicerede individer, der udviklede sig, viste 23 en vis grad af pigmenttab (figur 10), og 9 af disse individer klækkede, hvilket resulterede i en knockout-rate på ≥32%. Der blev ikke observeret tab af øjenpigment i nogen af kontrolbehandlingerne. For det andet blev kromosomale mutationer bekræftet via polymerasekædereaktion (PCR)18 og sekventering19. Fordi en mutant linje ikke kunne genvindes, blev genomisk DNA analyseret fra puljer af embryoner injiceret med enten tre-guideblandingen eller bufferen. Tre-guide-blandingen forventes at fjerne ~ 180 basepar fra det hvide locus. Dette kan ses i PCR-produkterne amplificeret ud fra genomisk DNA isoleret fra injicerede individer samt de tilknyttede sekvensdata genereret fra disse produkter (figur 11). Dette kombinerede bevis indikerer, at embryoner blev injiceret, før cellularisering fandt sted.
Figur 1: Aspirator. En effektiv aspirator kan samles ved at fastgøre en vakuumpumpe ved indsugningen via plastrør til et 15 ml konisk plastrør. Ca. 0,5 cm skal forsigtigt fjernes fra bunden af det koniske rør. En vatrondel skal placeres i det koniske rør over åbningen af plastslangen for at fange P. maidis voksne, når de opsamles, og holde dem ude af vakuumpumpen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konstruktion af containere til voksne. (A) De nødvendige forsyninger (med uret fra øverst til venstre): skærm, varm limpistol, barberblad, 1 oz beholder. (B) Et stort hul skal skæres i bunden af 1 oz beholderen, og en firkant skærm skæres lige stor nok til at dække dette hul. (C) Skærmen limes derefter over hullet ved hjælp af varm lim. (D) Når limen er sat, skal overskydende net fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Køn P. maidis voksne. De ventrale sider af mandlige (venstre) og kvindelige (højre) P. maidis voksne er vist. Ovipositoren, der er synlig over den kvindelige underliv, er den klareste indikator for individets køn. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Forsegling af voksne i beholdere . (A) En 5 cm x 5 cm kvadrat plastparaffinvoksfilm. (B) Filmen skal strækkes jævnt til 3-4 gange sin oprindelige størrelse. (C) Når voksne er anbragt i voksenbeholderen, skal den strakte film placeres over åbningen for at sikre de voksne. En dråbe på 400 μL 10% w/v saccharoseopløsning anbringes oven på filmen. (D) For at give de voksne tilstrækkeligt fodringstryk skal en anden 5 cm x 5 cm kvadrat plastparaffinfilm ligeledes strækkes og placeres over dråben saccharose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Opstilling af et ovipositionskammer. (A) De nødvendige forsyninger (med uret fra øverst til venstre): plastfolie, en færdig voksenbeholder (med voksne) og en petriskål med 1% agarose (ovipositionsmedium). B) Voksenbeholderen anbringes på agarosen, mens plastparaffinfilmen/10% saccharosesandwichen anbringes direkte på æglægningsmediet. C) Plastfolie anvendes til at fastgøre voksenbeholderen til ovipositionsmediet. Dette forhindrer mediet i at tørre ud for hurtigt. (D) Der skal drages omsorg for ikke at dække skærmen på voksenbeholderen, så luftudskiftningen stadig kan fortsætte. E) Diagram over ovipositionskammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Befugtet hætte. En hætte udstyret med en luftfugter er blevet oprettet omkring injektionskikkerten for at minimere lufttræk og opretholde fugtighed, mens embryonerne håndteres. Flapper kan foldes over indgangen, når arbejderen er på plads, for at hjælpe med at opretholde passende fugtighedsniveauer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Opsamling af embryoner som forberedelse til injektioner . A) Embryoner, der er deponeret i ovipositionsmediet. Et par fine tang bruges til at udtrække embryoner fra mediet og placere dem på overfladen. (B) En smal strimmel med 1 mm x 15 mm dobbeltklæbende tape på en 22 mm x 30 mm dæksel. (C) Dæksedlen kan anbringes på æglægningsmediet for at lette overførslen af embryoner fra substratets overflade til tapen på dæksedlen. (D) P. maidis-embryoner er bananformede, med den ene ende smallere end den anden (smal ende angivet med rødt pilehoved; bredere ende angivet med gult pilehoved i eksempelembryo). Den brede ende af embryoet skal placeres på båndet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Injektion . (A) Injektionsplatformen er en petriskål fyldt til randen med 1% agar. Dæksedlen med en strimmel tape, der holder embryoner, skal placeres direkte på overfladen af injektionsplatformen. (B) Injektionstrykket bør afprøves, før embryoner injiceres, ved at »injicere« en lille mængde injektionsopløsning i en dråbe vand. Denne metode kan også bruges når som helst under injektionsprocessen til at kontrollere nålen for tilstopninger. (C) Embryoner skal injiceres ved at stikke nålen ind i den større ende af embryoet. Injektionsopløsningen skal være synlig, hvis injektionen lykkedes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Pleje efter injektion . (A) Når alle embryonerne på en dækseddel er blevet injiceret, anbringes dæksedlen i en frisk petriskål, der indeholder 1% agarose. (B) Petriskålen med dæksedlen kan derefter opbevares i et fugtighedskammer (som det viste), indtil embryonerne klækkes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: PMW knockout fænotype. (A) Aldersmatchet kontrol og (B) Pmw knockout-embryoner med udviklende øjne angivet med sorte pilespidser. Embryoet i B er mosaik, da en lille stribe pigmentering kan ses. (C) Aldersmatchet kontrol og (D) Pmw knockout hatchlings, med indsatser, der viser en anden vinkel på øjnene. Den nyudklækkede i D er også mosaik. En hvid pil peger på et område i hovedbilledet, der viser tab af pigmentering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: PMW knockout sekvens. (A) To-skala model af Pmw mRNA, markeret i trin på 500 bp, med placeringer af gRNA-bindingssteder angivet: G1, blå; G2, gul; G3, lyserød. Alle frame-shift-mutationer, der genereres på dette tidspunkt, vil forstyrre størstedelen af oversættelsesproduktet. (B) Genomisk kontekst af gRNA-steder, alt sammen i en exon (fed tekst med store bogstaver). Hjælpelinjebindingssteder fremhæves i de samme farver som A, og PAM'er er understreget. Spændvidde er ~ 300 bp. In-frame oversættelsen af exon er vist ovenfor, som enkeltbogstavsforkortelser i stor tekst. To motiver, der er specifikke for øjenpigmenttransportører, er markeret. CDEPT-motivet for det funktionelle Walker B-domæne er indrammet i lilla, og IHQP-motivet for H-loop-domænet er indrammet i grønt. Begge domæner er kritiske for ATP-transportørens funktion. (C) PMW-målregionen blev forstærket ved hjælp af to runder PCR. Produktet i anden runde blev undersøgt på en gel for tegn på størrelsesforskydning på grund af vellykket fjernelse af regionen mellem guiderne. Baner: L = 100 bp stige; 1 = PCR vandkontrol; 2 = Bufferinjicerede æg; 3-4 = to separate sæt æg injiceret med tre-guide blanding. Kun embryoner, der modtog tre-guideblandingen, producerede både WT-båndet (rød pil) og båndet som følge af en fuldstændig excision (hvid pil). (D) For at bekræfte identiteten af det nedre (hvide pil) bånd blev dette DNA renset, klonet og sekventeret. Den øverste linje er vildtypesekvensen. De to andre linjer er sekvenser fra to kloner. Tre yderligere kloner matchede bundsekvensen. Blå fremhævning angiver bindingsstedet for Guide 1, mens lyserød fremhævning angiver bindingsstedet for Guide 3. I begge alleler er hele regionen mellem disse to guidesteder blevet slettet. Forkortelser: Pmw = Peregrinus maidis hvide gen; gRNA = guide RNA; PAM = protospacer tilstødende motiv; ATP = adenosintrifosfat; PCR = polymerasekædereaktion; WT = vildtype; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Sæt | # af kopper | # af kvinder i hver kop | # af æg | I alt # af æg | |||||||
| Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 | Dag 8 | Dag 9 | ||||
| 1 | 10 | 15 | 0 | 26 | 166 | 355 | 530 | 193 | 91 | 37 | 1398 |
| 2 | 15 | 15 | 22 | 238 | 489 | 699 | 520 | 379 | 203 | 58 | 2608 |
| 3 | 8 | 15 | 0 | 57 | 230 | 190 | 116 | 80 | 34 | 1 | 708 |
| 4 | 10 | 15 | 0 | 226 | 446 | 519 | 301 | 179 | 24 | 15 | 1710 |
| Total | 43 | 15 | 23 | 547 | 1331 | 1763 | 1467 | 831 | 352 | 111 | 6483 |
Tabel 1: Repræsentative ægsamlinger fra kunstigt ovipositionsmiljø. Data fra fire sæt ægopsamlingskopper vises, hvor ægtællinger starter den anden dag efter opsætning og løber gennem den niende dag.
| Injektion Behandling | Samlet injiceret | Samlet udviklet | I alt udklækket | Udviklingsrate (%) | Lugehastighed (%) |
| Buffer | 39 | 20 | 12 | 51 | 31 |
| Cas9 | 39 | 24 | 14 | 61 | 36 |
| Cas9 + Pmw gRNA'er | 121 | 71 | 28 | 59 | 28 |
Tabel 2: Overlevelses- og knockoutrater fra injektioner af 3 forskellige injektionsblandinger.
Discussion
Æglægningskvalitet og ernæring
For nylig fik forskere, der arbejder med en beslægtet art, Nilaparvata lugens, de æg, de brugte til mikroinjektioner, direkte fra bladet og holdt de injicerede æg i bladvævet, indtil de klækkede17. Mens denne bladbaserede metode gav et mere naturligt miljø for embryonal udvikling, øgede den også chancerne for infektioner og ægskader under fjernelsesprocessen. Det kunstige ovipositionssystem, der præsenteres her, giver et mere ensartet miljø og reducerer chancerne for beskadigelse af æggene fra håndtering. Ved at sætte ovipositionskopperne op om fredagen blev størstedelen af de ovipositerede æg indsamlet i løbet af en typisk arbejdsuge til gavn for dem, der udfører mikroinjektionsarbejdet. En advarsel til denne metode er imidlertid, at manglen på næringsstoffer i 10% saccharoseopløsningsdiet i sidste ende vil påvirke insekternes sundhed, og hunner i kopperne begynder normalt at dø efter kun 10 dage. Æggekvaliteten begynder også at falde efter 6 dage, hvilket fremgår af en stigning i døde eller usunde æg. Som følge heraf er det vigtigt at være selektiv med hensyn til de æg, der anvendes til mikroinjektioner, og ikke holde hunnerne efter dag 6.
Overlevelsesrate og fugtighed
To faktorer synes at være afgørende for embryonal overlevelse gennem mikroinjektionsprocessen. Det mest udfordrende aspekt ved håndtering af P. maidis-embryoner er at forhindre dem i at tørre ud efter fjernelse fra ovipositionsmediet og gennem mikroinjektion. Da æggene typisk lægges inde i plantevæv, mangler de en passende skal for at forhindre dehydrering. Selv i den befugtede hætte gik hele sæt æg tabt på grund af udtørring. Overdreven høj luftfugtighed kan dog også påvirke mikroinjektionerne, hvis der akkumuleres vand på den dobbeltklæbende tape eller på kikkerten. Desværre var ægdehydrering normalt ikke let at bemærke under mikroinjektionsprocessen, og de syntes ofte normale indtil 2 eller 3 dage senere, da de blev helt gennemsigtige og ikke viste tegn på udvikling.
Nålekvalitet ser også ud til at spille en vigtig rolle for overlevelse. Nålen skal skrånes for at minimere unødvendig skade på ægget. Når nålen er blokeret, returneres nålen typisk til en funktionel tilstand ved hjælp af clearingfunktionen på injektoren, mens nålens spids forsigtigt stryges med en fugtig pensel (se trin 4.7). Uanset hvad anbefales det kun at putte små mængder injektionsopløsning (~ 0,25 μL) i hver nål og skifte til en ny nål hvert par dias (~ 50-60 æg) for at sikre, at nålekvaliteten opretholdes under hele injektionsprocessen.
Succesfuld generering af en knockout-fænotype
For at kunne omdanne kimcellerne skal embryomikroinjektioner normalt udføres så tidligt som muligt før cellularisering. Afhængigt af insektarten varierer tidsvinduet for at gennemføre mikroinjektionerne fra kun et par timer til så længe som en hel dag14,15,20. Det er stadig uklart, hvornår P. maidis embryoner gennemgår cellularisering. Cas9-medieret knockout blev testet på embryoner så unge som 4 timer efter æglægning (pel) til så mange som 16 timer pel, og de forventede fænotyper blev observeret i alle forsøg, hvilket tyder på, at alle mikroinjektioner blev udført inden for præcelluriseringsvinduet.
P. maidis ortologen af øjenfarvegenet, hvid, blev valgt, fordi knockout-fænotypen forventedes at være let at screene hos intravenøse på grund af dens celleautonome natur. Som forventet var både mosaik og total knockouts klart identificerbare blandt embryoner, der modtog injektionsblandingen indeholdende Cas9 og guide-RNA'er. Desværre blev ingen injektiver med fuldstændig knockout udklækket, og en masseparring af overlevende injektiver undlod at generere hvidøjede afkom. Imidlertid blev en mutant linje senere med succes genereret ved at målrette mod et andet gen (Klobasa et al., I gang). Dette tyder på, at den manglende etablering af en hvid mutantlinje sandsynligvis skyldes enten off-target-effekter (dvs. Cas9, der skærer vigtige regioner andre steder i genomet), der genererer en tæt forbundet dødelig mutation, eller til en uforudset kritisk rolle for hvid i P. maidis.
Fænotypiske og molekylære data (figur 8 og figur 9) bekræfter, at der blev skabt en signifikant knockout i det hvide locus i en prøve af injicerede embryoner, hvilket ville resultere i totalt tab af genfunktion. Desuden, mens mutationer i hvid er levedygtige i nogle arter, er der præcedens for, at reduceret hvid aktivitet er skadelig21,22. Når det er sagt, kan virkninger uden for målet ikke helt udelukkes. Forudsigelse af sandsynlige off-targets kræver nøjagtige genomsekvensdata23, hvilket den nuværende tilstand af genomiske ressourcer i P. maidis gør umuligt at gøre på nuværende tidspunkt. Uanset hvad kan testning af andre målgener med disse nye metoder udføres med tillid, endda bevæge sig mod mere traditionel transgenese i et forsøg på at bringe nye genetiske værktøjer til dette skadelige skadedyr.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
North Carolina State University, Institut for Entomologi og Plantepatologi, er en del af et team, der støtter DARPAs Insect Allies Program. De synspunkter, meninger og/eller resultater, der udtrykkes, er forfatternes og bør ikke fortolkes som udtryk for forsvarsministeriets eller den amerikanske regerings officielle synspunkter eller politikker. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. MDL, DR og AEW udtænkte projektet og sørgede for finansieringserhvervelse, projektadministration og ressourcer. FC, WK, NG og MDL udtænkte og designede mikroinjektionseksperimenterne; OH udtænkte og designede æglægningsmetoden. FC og WK udførte eksperimenterne; FC og WK analyserede resultaterne; og FC, WK, NG og MDL skrev manuskriptet. Forfatterne vil gerne rette en særlig tak til Kyle Sozanski og Victoria Barnett for deres hjælp med at opretholde P. maidis-kolonier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
| Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
| Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
| Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
| Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
| Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
| Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
| Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
| Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
| Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
| Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
| Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
| General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
| Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
| Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
| Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
| Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
| Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
| Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
| Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
| Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
| Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
| pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
| Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
| Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
| Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
| Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |
References
- Namba, R., Higa, S. Y. Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).
- Singh, B. U., Seetharama, N. Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems. Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).
- Tsai, J. Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis. Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).
- Chelliah, S., Basheer, M. Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum. Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).
- Lastra, J., Esparza, J. Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus. Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).
- Nault, L. R., Ammar, E. -D. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).
- Ammar, E. -D., Tsai, C. -W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).
- Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae). Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).
- Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper. PloS One. 8 (8), 70243 (2013).
- Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 3, 03401 (2014).
- Gantz, V. M., Bier, E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector. Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).
- Kimelman, D., Martin, B. L. Anterior-posterior patterning in early development: three strategies. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).
- Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm. Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).
- Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes. Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).
- Xue, W. H., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).
- Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).
- Brent, C. S., Hull, J. J. RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).
- Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
