دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العدوى الفيروسية بدأت للتو لاستكشاف ويمكن تسليط الضوء على آليات جديدة للتفاعل الفيروسي المضيف. في هذا العمل، ونحن نقدم خط أنابيب للتحقيق في M6A و M5C التعديلات الحمض النووي الريبي في سياق العدوى الفيروسية.
كان دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العمليات البيولوجية محور عدد متزايد من الدراسات في السنوات القليلة الماضية ويعرف في الوقت الحاضر باسم epitranscriptomics. من بين أمور أخرى، تم وصف N6-ميثيلادينوسين (m6A) و 5-ميثيلسيتوسين (m5C) تعديلات الحمض النووي الريبي على جزيئات مرنا، وربما يكون لها دور في تحوير العمليات الخلوية. وبالتالي فإن Epitranscriptomics هو طبقة جديدة من التنظيم التي يجب النظر فيها بالإضافة إلى التحليلات النسخية ، حيث يمكن أيضا تغييرها أو تعديلها عن طريق التعرض لأي عامل كيميائي أو بيولوجي ، بما في ذلك العدوى الفيروسية.
هنا، نقدم سير عمل يسمح بتحليل المشهد الخلوي والفيروسية المشتركة epitranscriptomic من علامات M6A و m5C في وقت واحد، في الخلايا المصابة أو غير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). عند عزل الحمض النووي الريبي وتجزؤه من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وغير المصابة، استخدمنا إجراءين مختلفين: MeRIP-Seq، وهي تقنية تعتمد على المناعة الحمض النووي الريبي، لإثراء شظايا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على علامة M6A وBS-Seq، وهي تقنية تعتمد على تحويل البيسلفيت، لتحديد علامة m5C بدقة نوكليوتيد واحدة. عند التقاط الميثيل الخاصة، يتم إعداد مكتبات الحمض النووي الريبي لتسلسل الإنتاجية العالية. كما قمنا بتطوير خط أنابيب المعلوماتية الحيوية مخصص لتحديد النصوص الميثيلية التفاضلية (DM) بشكل مستقل عن ملف التعبير القاعدي الخاص بهم.
وعموما، تسمح المنهجية باستكشاف علامات epitranscriptomic متعددة في وقت واحد وتوفر أطلسا لنصوص DM عند العدوى الفيروسية أو أي اضطراب آخر في الخلايا. ويوفر هذا النهج فرصا جديدة لتحديد اللاعبين الجدد والآليات الجديدة للاستجابة للخلايا، مثل العوامل الخلوية التي تعزز أو تقيد تكرار الفيروس.
ومن المعروف منذ فترة طويلة أنه يمكن تعديل جزيئات الحمض النووي الريبي، وقد تم وصف أكثر من 150 تعديلا بعد النسخ حتى الآن1. وهي تتكون في إضافة مجموعات كيميائية، وأساسا مجموعات الميثيل، إلى أي موقف تقريبا من حلقات البيريميدين والبوريين من جزيئات الحمض النووي الريبي2. وقد ثبت بالفعل أن مثل هذه التعديلات بعد النسخ غنية للغاية في نقل الحمض النووي الريبي (tRNA) والحمض النووي الريبي الريبوسومي (rRNA) وقد وصفت مؤخرا على جزيئات مرنا كذلك.
وقد أتاح ظهور تكنولوجيات جديدة، مثل تسلسل الجيل التالي، وإنتاج أجسام مضادة محددة تعترف بتعديلات كيميائية محددة، لأول مرة، التحقيق في الموقع وتواتر التعديلات الكيميائية المحددة على مستوى النص. وقد أدت هذه التطورات إلى فهم أفضل لتعديلات الحمض النووي الريبي ورسم خرائط لعدة تعديلات على جزيئات الحمض النووي الريبي3،4.
في حين أن علم الوراثة اللاجينية يحقق في دور تعديلات الحمض النووي والهستون في تنظيم النسخ ، يركز epitranscriptomics بطريقة مماثلة على تعديلات الحمض النووي الريبي ودورها. ويتيح التحقيق في التعديلات epitranscriptomic فرصا جديدة لتسليط الضوء على آليات جديدة للتنظيم قد تصل قيمتها إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية (أي الربط بين الحمض النووي الريبي والتصدير والاستقرار والترجمة)5. وبالتالي لم يكن من المستغرب أن الدراسات الحديثة كشفت عن العديد من التعديلات epitranscriptomic على العدوى الفيروسية في كل من RNAs6 الخلوية والفيروسية. وتشمل الفيروسات التي تم التحقيق فيها حتى الآن كلا من فيروسات الحمض النووي والحمض النووي الريبي؛ وفيروسات الحمض النووي ومن بين هذه الجهات، يمكن اعتبار فيروس نقص المناعة البشرية مثالا رائدا. وإجمالا، فإن اكتشاف ميثيل الحمض النووي الريبي في سياق العدوى الفيروسية قد يسمح بالتحقيق في آليات غير موصوفة بعد للتعبير الفيروسي أو التكرار الفيروسي، مما يوفر أدوات وأهدافا جديدة للسيطرة عليها7.
وفي مجال علم الفيروس، تم على نطاق واسع إجراء تحقيقات في تعديلات النصوص الفيروسية وأظهرت أن وجود هذا التعديل كان مفيدا للنسخ الفيروسي المتماثل8,9,10,11,12,13. حتى الآن يمكن استخدام تقنيات مختلفة للكشف عن علامات epitranscriptomic على مستوى النسخ على نطاق واسع. تعتمد التقنيات الأكثر استخداما لتحديد M6A على تقنيات هطول الأمطار المناعية مثل MeRIP-Seq و miCLIP. في حين تعتمد MeRIP-Seq على تجزئة الحمض النووي الريبي لالتقاط الشظايا التي تحتوي على بقايا ميثيليتات ، يستند miCLIP على توليد طفرات توقيع محددة للأجسام المضادة α-m6A على ربط الأشعة فوق البنفسجية بالأجسام المضادة للجيش الملكي النيبالي ، مما يسمح برسم خرائط أكثر دقة.
يمكن تحقيق الكشف عن تعديل M5C إما عن طريق تقنيات تعتمد على الأجسام المضادة مماثلة للكشف عن m6A (m5C RIP) ، أو عن طريق تحويل بيسوليت أو بواسطة AZA-IP أو بواسطة miCLIP. يستخدم كل من Aza-IP و m5C miCLIP ميثيل ترانسفيراز محدد كطعم لاستهداف الحمض النووي الريبي أثناء المرور بالمثيلة الحمض النووي الريبي. في Aza-IP ، تتعرض الخلايا المستهدفة إلى 5-azacytidine ، مما يؤدي إلى إدخال عشوائي لمواقع cytidine التناظرية 5-azacytidine في الحمض النووي الريبي الوليد. في miCLIP، يتم تعديل ميثيل ترانسفيراز NSun2 وراثيا لإيواء طفرة C271A14،15.
في هذا العمل، نركز على التوصيف المزدوج لتعديلات m6A و m5C في الخلايا المصابة، باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية كنموذج. عند التحسين المنهجي ، قمنا بتطوير سير عمل يجمع بين السهد المناعي الحمض النووي الريبي الميثيلي (MeRIP) وتحويل بيسوليت الحمض النووي الريبي (BS) ، مما يسمح بالاستكشاف المتزامن للعلامات epitranscriptomic m6A و m5C على مستوى النص على مستوى واسع ، في السياقين الخلوي والفيروسية. يمكن تنفيذ سير العمل هذا على مستخلصات الحمض النووي الريبي الخلوي وكذلك على الحمض النووي الريبي المعزول عن الجسيمات الفيروسية.
إن نهج إعادة التأهيل المناعي الحمض النووي الريبي الميثيلي (MeRIP)16 الذي يسمح بالتحقيق في m6A على مستوى النسخ على مستوى النسخ راسخ ومجموعة من الأجسام المضادة الخاصة ب m6A متاحة تجاريا حتى الآن17. وتتكون هذه الطريقة من التقاط انتقائي لقطع الحمض النووي الريبي المحتوية على M6A باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب m6A. وعيبان رئيسيان لهذه التقنية هما:1) الدقة المحدودة، التي تعتمد اعتمادا كبيرا على حجم شظايا الحمض النووي الريبي، وبالتالي توفر موقعا ومنطقة تقريبيتين تحتويان على بقايا الميثيل، و’2′ الكمية الكبيرة من المواد اللازمة لإجراء التحليل. في البروتوكول الأمثل التالي، قمنا بتوحيد حجم الجزء إلى حوالي 150 nt وخفضنا كمية المواد الأولية من 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي متعدد الاختر، وهو حاليا المبلغ الموصى به من مواد البداية، إلى 1 ميكروغرام فقط من الحمض النووي الريبي متعدد الاختر. كما قمنا بتعظيم كفاءة استرداد شظايا الحمض النووي الريبي m6A المرتبطة بأجسام مضادة محددة باستخدام elution من خلال نهج المنافسة مع الببتيد m6A بدلا من طرق elution أكثر تقليدية وأقل تحديدا باستخدام تقنيات القائمة على الفينول أو البروتين K. ومع ذلك، يبقى القيد الرئيسي لهذا المقايسة المستندة إلى RIP هو الدقة دون المستوى الأمثل التي لا تسمح بتحديد النيوكليوتيدات A المعدلة بدقة.
يمكن حاليا إجراء تحليل لعلامة m5C باستخدام نهجين مختلفين: طريقة تستند إلى RIP مع أجسام مضادة خاصة ب m5C وتحويل بيسوليت الحمض النووي الريبي. وبما أن RIP لا يقدم سوى دقة محدودة بشأن تحديد بقايا الميثيل، استخدمنا تحويل البيسلفيت الذي يمكن أن يوفر دقة واحدة للنيوكليوتيدات. التعرض الحمض النووي الريبي إلى بيسلفيت (BS) يؤدي إلى إزالة السمية السيتوزين، وبالتالي تحويل بقايا السيتوزين إلى uracil. وهكذا، خلال تفاعل تحويل بيسوليت الحمض النووي الريبي، يتم إزالة السمية من كل سيتوسين غير ميثيلي وتحويله إلى أوراكيل، في حين أن وجود مجموعة الميثيل في الموضع 5 من السيتوزين له تأثير وقائي، مما يمنع التخلص من السمية الناجمة عن BS والحفاظ على بقايا السيتوستين. ويتيح النهج القائم على نظام BS الكشف عن النيوكليوتيدات المعدلة M5C بدقة قاعدة واحدة وتقييم تردد الميثيل لكل نسخة، مما يوفر رؤى حول ديناميات تعديل M5C18. ومع ذلك، يعتمد القيد الرئيسي لهذه التقنية على المعدل الإيجابي الزائف للمخلفات الميثيلية. في الواقع ، تحويل BS فعال على الحمض النووي الريبي أحادية تقطعت بهم السبل مع بقايا C يمكن الوصول إليها. ومع ذلك، فإن وجود هيكل ثانوي ضيق للجيش الملكي النيبالي يمكن أن يخفي موضع N5C ويعوق تحويل BS، مما يؤدي إلى بقايا C غير الميثيلية التي لا يتم تحويلها إلى بقايا U، وبالتالي إيجابيات كاذبة. للتحايل على هذه المشكلة وتقليل معدل إيجابي كاذبة، طبقنا 3 جولات من دورات تحويل التشبع والبيسلفيت19. كما قدمنا عنصري تحكم في العينات لتمكين تقدير كفاءة تحويل البيسلفيت: نحن نطبق ضوابط تسلسل ERCC (تسلسلات قياسية وغير مثيلة ومتاحة تجاريا)20 بالإضافة إلى RNAs متعددة الاستنفاد لتقييم معدل تحويل البيسوليت من ناحية، وللتحقق من وجود موقع ميثيليت معروف ومحفظ جيدا، C4447، على 28S الحمض النووي الريبي ريبوسومال من ناحية أخرى21.
في مجال علم الفيروسات، اقتران هاتين الطريقتين التحقيق epitranscriptomic مع تسلسل الجيل القادم وتحليل المعلوماتية الحيوية دقيقة يسمح لدراسة متعمقة من ديناميات M6A و M5C (أي، التغيرات الزمنية تعديل الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تحدث عند العدوى الفيروسية ويمكن أن تكشف عن مجموعة من الأهداف العلاجية ذات الصلة الجديدة للاستخدام السريري).
دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العدوى الفيروسية لا يزال غير معروف إلى حد كبير. ويمكن أن يسهم فهم أفضل لدور التعديلات العلاجية في سياق العدوى الفيروسية في السعي إلى تحقيق أهداف جديدة للعلاج المضاد للفيروسات.
في هذا العمل، ونحن نقدم سير العمل الكامل الذي يسمح التحقيق في epitranscriptomes M6A و M5C من الخلايا المصابة. اعتمادا على المسألة البيولوجية، ونحن ننصح باستخدام الحمض النووي الريبي متعدد-A-اختيار كمادة البداية. وعلى الرغم من أن خط الأنابيب اختياري، حيث يمكن استخدامه مع إجمالي الحمض النووي الريبي، فمن المهم أن نضع في اعتبارنا أن الحمض النووي الريبي وكذلك الحمض النووي الريبي الصغير معدلان بدرجة عالية ويحتويان على عدد مهم من المخلفات الميثيلية. وقد يؤدي ذلك إلى انخفاض نوعية وكمية بيانات التسلسل المجدية.
ومع ذلك ، إذا كان تركيز الدراسة هو الحمض النووي الريبي غير متعدد adenylated ، ينبغي تكييف خطوة استخراج الحمض النووي الريبي من أجل تجنب التخلص من الحمض النووي الريبي الصغيرة (في حالة استخراج الحمض النووي الريبي القائم على العمود) وامتياز تقنيات استنفاد الريبوسوم بدلا من اختيار البولي ألف لدخول خط الأنابيب.
من أجل ضمان جودة عالية RNA، تجزئة الصحيح ومناسبة M6A المخصب وBS تحويل جودة الحمض النووي الريبي لإعداد المكتبة ننصح بشدة لاستخدام محلل جزء أو محلل حيوي. ومع ذلك، هذه المعدات غير متوفرة دائما. كبديل، يمكن أيضا تقييم جودة الحمض النووي الريبي، ميرنا وحجم الحمض النووي الريبي المجزأة من خلال التصور على هلام الآغاروز. بدلا من ذلك، يمكن إجراء إعداد المكتبة دون تقييم سابق لكمية الحمض النووي الريبي.
استخدمنا تقنية MeRIP-Seq16 المستندة إلى الأجسام المضادة لاستكشاف المناظر الطبيعية epitranscriptomic m6A. وتستند هذه التقنية على الريبي النووي الريبي المناعية وناجحة; ومع ذلك، تحتاج بعض الخطوات التحسين دقيق ويمكن أن تكون حاسمة. على الرغم من أن ميثيل M6A قد وصف بأنه يحدث بشكل رئيسي ضمن تسلسل التوافق RRA * CH ، إلا أن هذا الشعار متكرر للغاية على طول جزيئات مرنا ولا يسمح بتحديد دقيق للموقع الميثيلي. ومن ثم، من الأهمية بمكان تحقيق تجزؤ الحمض النووي الريبي القابل للاستنساخ ومتسق، وتوليد شظايا صغيرة من الحمض النووي الريبي، لتحسين القرار القائم على RIP. في هذا البروتوكول، نوصي بإجراء محسن، يوفر نتائج قابلة للاستنساخ ومتسقة في إطارنا التجريبي؛ ومع ذلك، قد تحتاج هذه الخطوة التجزئة تحسين إضافية وفقا لميزات عينة معينة.
في الآونة الأخيرة تم وصف تقنية جديدة تسمح تسلسل مباشر M6A. وهو يستند إلى استخدام متغيرات محددة للنسخ العكسي التي تعرض توقيعات RT الفريدة كرد على مواجهة تعديل الحمض النووي الريبي M6A24. هذه التكنولوجيا ، عند التحسين الدقيق ، يمكن أن تتحايل على القيود الرئيسية التي تواجهها MeRIP-Seq (تقليل كمية المواد الأولية والسماح بدقة أعلى). لاستكشاف تعديل M5C قررنا استخدام تقنية تحويل بيسلفايت من أجل الكشف في قرار النيوكليوتيدات بقايا C المعدلة. من أجل الحد من معدل إيجابي كاذبة بسبب وجود هياكل ثانوية الجيش الملكي النيبالي، قمنا بإجراء 3 دورات من تحويل التشبع / bisulfite ومزيد من التحكم bisulfite أداء معدل التحويل بفضل استخدام ERCC ارتفاع في الضوابط. أحد القيود المرتبطة بهذه التقنية هو أن تحويل البيسلفيت قاسي للغاية وثلاث دورات من تحويل التشبع / البيسلفيت يمكن أن تتحلل بعض الحمض النووي الريبي وبالتالي تقليل الدقة. ومع ذلك، اخترنا في إطارنا أن نرضى بدقة أقل قليلا من أجل زيادة جودة مجموعة البيانات.
وبفضل هذه التحسينات والضوابط، تمكنا من توفير سير عمل موثوق وسليم يمكن استغلاله للتحقيق في المشهد epitranscriptomic وتغييره في سياق العدوى الفيروسية، والتفاعلات المضيفة الممرضة، أو أي التعرض لعلاجات محددة.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنح 31003A_166412 و314730_188877).
AccuPrime Pfx SuperMix | Invitrogen | 12344-040 | |
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 | Millipore | MABE1006 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
ERCC | Invitrogen | 4456740 | |
EZ RNA Methylation Kit | Zymo Research | EZR5001 | |
Fragment analyzer RNA Kit – HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
Fragment analyzer RNA Kit – RNA Kit | Agilent | DNF-471-0500 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
Illumina TruSeq Stranded mRNA | Illumina | 20020594 | |
Magnetic Beads A/G Blend | Merck | 16-663 | |
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) | Sigma Aldrich | M2780-10MG | |
Normal Mouse IgG | Merk | 12371 | |
Oligo(dT)25 | Life Technologies | 61005, | |
PCRapace | Stratec | 1020220300 | |
Quick RNA Viral Kit | Zymo Research | 1034 | |
RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1015 | |
RNA Fragmentation Reagent | Ambion | AM8740 | |
RNase Inhibitor | Ambion | AM2684 | |
Trizol | TRIzol Reagent | 15596026 |