1. הכנת תאים הערה: בהתאם לסוג התא ותוכן ה-RNA שלו, מספר התאים ההתחלתי עשוי להשתנות. יש מספיק תאים כדי להשיג בין 200-500 מיקרוגרם של RNA הכולל או 5-7 מיקרוגרם של פולי-A-נבחר RNA. לדוגמה, 50 x 106 תאי SupT1 צריך להניב סביב 500 מיקרוגרם של RNA הכולל עם החילוץ עם ריאגנטים מבוססי פנול, ולכן נדרש עבור כל מצב בודד נבדק. הכן את מספר התאים הנדרש על פי העיצוב הניסיוני, וכך על פי מספר התנאים שנבדקו (זיהום, נקודות זמן, טיפול). אם הניסוי נועד להשיג תאים שאינם נגועים ותאים נגועים ב- HIV בשעה 24 שעות לאחר ההדבקה, יש צורך בסך הכל 100 x 106 תאים, מחציתם למצב שאינו נגוע ומחצית למצב נגוע. 2. מיצוי RNA מתאים: מיצוי RNA עם פנול-כלורופורם עבור כל תנאי, לאסוף תאים (למשל,50 x 106) על ידי צנטריפוגה ולהשליך את supernatant. הוסף 5 מ”ל של ריאגנט מבוסס פנול לכל גלולה של 50 x 106 תאים וערבבו על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר תמוזה מלאה. ניתן לאחסן תאים lysed ב -80 °C (80 °F) או מעובד ישירות.הערה: במידת הצורך, תאים ניתן לחלק גם aliquots של 10 x 106 תאים לכל צינור בצינורות 1.5 מ”ל ו lysed ב 1 מ”ל של ריאגנט מבוסס פנול לאחסון נוח יותר. מוסיפים 1 מ”ל של כלורופורם ומערבבים לפי היפוך. דגירה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 2,000 x g ו 4 °C (70 °F). פיפטה את השלב מימי (שלב עליון) ולעבור לצינור חדש. לסיים את העברת השלב מימי על ידי angling את הצינור ב 45° בזהירות pipetting את הפתרון החוצה.הערה: כמות השלב מימי עשוי להשתנות בין דגימות אבל צריך להיות קרוב לכמות כלורופורם הוסיף המדגם (כלומר, 1 מ”ל). אין להעביר שכבה בין-פאזית או אורגנית! השימוש בצינורות נעילת פאזה או יוצר פאזה יכול להקל על תהליך זה. הוסף 0.5 מ”ל של איזופרופנול מולקולרי 100% מולקולרי לשלב מימי. דגירה במשך 1 שעות ב -80 °C (80 °F) כדי לאפשר משקעים RNA. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 12,000 x g ו 4 °C (5 °F) כדי גלולה RNA זירוז. השלך את supernatant ו resuspend כדורי RNA ב 1 מ”ל של 75% ביולוגיה מולקולרית כיתה אתנול. מערבולת בקצרה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 7,500 x g ו 4 °C (7 °F) להשליך את supernatant. ייבשו את הכדור במשך 15 דקות. resuspend הכדור ב 20 μL של מים ללא RNase ולהעביר צינור חדש. לשטוף את הצינור הריק עם 20 μL נוסף של מים כדי למקסם את התאוששות RNA, ובריכה עם נפח 20 μL הראשון. לכמת את הרנ”א הכולל עם ספקטרופוטומטר ולהעריך את איכות ה- RNA באמצעות מנתח שברים. מחלקיקים ויראליים: מיצוי RNA עם ערכת חילוץ RNA ויראלית מבוססת טורהערה: מיצוי RNA מחלקיקים ויראליים עם תוצאות ריאגנט מבוסס פנול ברנ”א ויראלי באיכות נמוכה ובספריות באיכות נמוכה יותר. לכן יש להעדיף חילוץ RNA מבוסס טורים. ערכות חילוץ RNA באמצעות RNA נושא עבור elution RNA והתאוששות אינם מתאימים להליך זה ויש להימנע. מאז HIV RNA הוא poly-Adenylated, מיצוי RNA ישיר ללא בידוד mRNA נוסף מספיק כדי להיכנס צינורות MeRIP-Seq ו- BS-Seq. בדרך כלל 1-2 מ”ל של supernatant ויראלי מתאים נגועים אוניברסלית צריך לספק מספיק RNA כדי לבצע את זרימת העבודה כולה. הכן את המאגר על ידי הוספת 150 μL של בטא-mercaptoethanol ל 30 מ”ל של מאגר תמוגה. ליישב מחדש את מאגר הכביסה הנגיפי על ידי הוספת 96 מ”ל של 100% אתנול. לאסוף וירוסים המכילים supernatants וצנטריפוגה כדי גלולה פסולת תא כדי למזער זיהום RNA הסלולר. העבר 1 מ”ל של supernatant ויראלי לצינור 15 מ”ל. הוסף 3 מ”ל של מאגר RNA ויראלי ל 1 מ”ל של מדגם ויראלי ולערבב על ידי מערבולת. העבר 700 μL של מדגם בעמודה, מוכנס בצינור אוסף. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-13,000 על גרם בטמפרטורת החדר. תזרוק את הזרימה. חזור על 3 השלבים הקודמים עד שכל המדגם עובד, ולכן כל ה- RNA נלכד בעמודת המטריצה המבוססת על סיליקה. הוסף 500 μL של מאגר כביסה ויראלי לעמודה. צנטריפוגה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. תזרוק את הזרימה. הוסף 200 μL של מאגר כביסה ויראלי לעמודה. צנטריפוגה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. תזרוק את הזרימה. מקם את העמודה בצינור איסוף ריק. צנטריפוגה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר היא להשליך עוד יותר את כל מזהם מאגר הכביסה שנותר. בזהירות להעביר את העמודה לתוך צינור 1.5 מ”ל. הוסף 20 μL של מים ללא DNase / RNase ישירות למרכז מטריצת העמוד וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר. הוסף 10 μL נוספים של מים ללא DNase / RNase ישירות למרכז מטריצת העמודה וצנטריפוגה שוב במשך 30 s. לכמת את הרנ”א הכולל עם ספקטרופוטומטר ולהעריך את איכות ה- RNA באמצעות מנתח שברים.הערה: מיצוי RNA יכול להתבצע בכל שיטה, אם האיכות של RNA שאוחזר גבוהה, עם תקינות RNA / מספר איכות > 9. ניתן לאחסן RNA כולל ב-80 °C (80 °F) עד לעיבוד נוסף. 3. בידוד mRNA על ידי בחירת פולי-A עם אוליגו(dT)25 הערה: בשל נוכחות של RNA ריבוזומלי מתילציה מאוד בתמציות הסלולר, מומלץ מאוד לבודד פולי-A RNA או על ידי דלדול rRNA או מועדף על ידי בחירה חיובית poly-A. שלב זה הוא אופציונלי ויש לבצעו עבור דגימות RNA סלולריות בלבד, כדי להשיג תוצאות רצף ברזולוציה גבוהה יותר. אם מנתחים מתילציה של RNAs ויראליים שאינם פולי-אדנילציה, העדיפו דלדול rRNA במקום בחירת פולי-A או שבסופו של דבר לבצע את הניתוח על RNA הכולל. הכנת חרוזים ללכידת פולי-A Resuspend אוליגו(dT)25 מעין חרוזים מגנטיים מלאי על ידי מערבולת עבור >30 s. העבר 200 μL של חרוזים מגנטיים לצינור 1.5 מ”ל. הכן את מספר הצינורות עם חרוזים מגנטיים על פי הכמות הכוללת של דגימות RNA לעיבוד.הערה: צינור אחד עם 200 μL של פתרון מלאי Dynabead מתאים 1 מ ג של חרוזים והוא יכול להכיל מדגם של 75 מיקרוגרם של RNA הכולל. מניחים את הצינורות על מגנט במשך 1 דקות ולהשליך את supernatant. הסר את הצינורות מהמגנט. הוסף 1 מ”ל של חוצץ כריכה (20 מ”מ טריס-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 מ”מ EDTA) ו resuspend על ידי מערבולת. מניחים את הצינורות על המגנט במשך 1 דקות ולהשליך את supernatant. הסר את הצינורות מהמגנט. חוזר. יש לתתכוד מחדש את החרוזים המגנטיים שנשטפו ב-100 מיקרו-אל של מאגר כריכה. הכנה כוללת לרנ”א לדלל את הרנ”א הכולל בריכוז סופי של 0.75 מיקרוגרם / μL עם מים ללא RNase, אשר מתאים 75 מיקרוגרם / 100 μL.הערה: אם RNA נמצא בריכוז נמוך יותר, המשך כמתואר להלן מבלי לשנות את אמצעי האחסון. Aliquot הרנ”א הכולל בצינורות מרובים על ידי חלוקת 100 μL של דגימת RNA לכל צינור. הוסף 100 μL של מאגר איגוד לכל דגימת RNA. מחממים את הרנ”א הכולל ל-65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לשבש מבנים משניים. מניחים מיד על הקרח עד שהם מוכנים להמשיך לשלב הבא.הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם למספר הדגימות שיש לעבד אך לא יעלה על 1 שעות כדי למנוע כל השפלה RNA. בחירת פולי-איי לכל צינור RNA (החל מהשלב 3.2), הוסיפו 100 מיקרו-אל של חרוזים מגנטיים שטופים (החל מהשלב 3.1). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה ומאפשרים כריכה על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. פתחו את כל הצינורות, הניחו אותם על המגנט למשך דקה אחת, והוציאו בזהירות את כל הסופר-טבעי. לשחזר את supernatant בצינור חדש ולשמור בצד לסיבוב שני של לכידת RNA (שלב 3.3.14), על מנת לשפר את ההתאוששות הסופית poly-A. הסר את הצינור מן המגנט ולהוסיף 200 μL של חוצץ כביסה (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA). מערבבים על ידי צנרת בזהירות 4 עד 5 פעמים. מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת ומשליכים את הסופר-נט. חזור על שלב הכביסה פעם אחת (חזור על שלבים 3.3.5 ו- 3.3.6). הוסף 20 μL של קר כקרח 10 mM Tris-HCl כדי לחמוק פולי-A RNA מן החרוזים. דגירה ב 80 °C (70 °F) במשך 2 דקות. הנח את הצינור על המגנט והעבר במהירות את ה- supernatant המכיל את ה- poly-A RNA לצינור חדש ללא RNase. הנח את הצינור על קרח. חזור על שלב ההעמקה (שלבים 3.3.8 עד 3.3.10) כדי להגדיל את התשואה. לשטוף את אותם חרוזים פעם אחת עם 200 μL של חוצץ כביסה. מערבבים על ידי צנרת בזהירות 4 עד 5 פעמים. מניחים על המגנט במשך דקה אחת ומשליכים את חיץ הכביסה. הוסף את הזרימה מהשלב 3.3.4 לחרוזים וחזר על ההליך מחייב לאלוטיון (שלבים 3.3.2 עד 3.3.10). שמור את eluates RNA בצינורות נפרדים לעת עתה.הערה: באופן אופציונלי, שמור שוב את המקבילה supernatant לשלב 3.3.4 בצינור חדש כפי שהוא יכול לשמש כפקד. בסוף ההליך, לטהר ולרכז את הרנ”א על ידי משקעים אתנול או עם שיטת בחירה מבוססת טור (כלומר, RNA נקי ורכז). מדגם זה מתאים לדגימת RNA מרוקנת מפולי-A וניתן להשתמש בה כפקד להמרת ביסולפיט (שלב 8.2.2). לכמת את הרנ”א הנמהר עם ספקטרופוטומטר ולשמור על aliquot 2 μL כדי להעריך עוד יותר את איכות ה- RNA עם מנתח שברים.הערה: פולי-A RNA ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) עד הצורך. 4. זרימת עבודה של RNA חלקו את דגימות ה-פולי-A RNA התאיות (mRNA) ודגימות הרנ”א הנגיפיות ל-2 עליקוטים, המוקדשים לצינור הניתוח האפיטרנכתובי המתאים:(i) 5 מיקרוגרם של mRNA סלולרי או 1 מיקרוגרם של RNA ויראלי עבור MeRIP-Seq ובקרות קלט (עבור לשלבים 5 עד 7, ושלב 9).(ii) 1 מיקרוגרם של mRNA סלולרי או 500 ננוגרם של RNA ויראלי עבור BS-Seq (עבור לשלבים 8 ו -9). 5. פיצול RNA הערה: פיצול RNA מתבצע עם ריאגנט פיצול RNA ומיועד לדגימות MeRIP-Seq ולשלוט ב- RNA. זהו צעד חשוב מאוד הדורש אופטימיזציה זהירה על מנת להשיג שברים הנעים בין 100-200 nt. חלק את הנפח הכולל של mRNA לצינורות PCR 0.2 מ”ל עם 18 μL של mRNA / צינור.הערה: עבוד במהירות. אין לעבוד עם יותר מ-8 דגימות בכל פעם כדי לקבל תוצאות ניתנות לשחזור. הגדלת עוצמת הקול לא תבטיח פיצול אחיד ושחזורי. לחמם תרמוציקלר ב 70 °C (70 °F). הוסף 2 μL של ריאגנט פיצול בקצה של כל צינור PCR. סגור את הצינור ולהסתובב למטה (כך ריאגנט מקבל במגע עם RNA באותו זמן עבור 8 צינורות). לדגור על הדגימות 15 דקות ב 70 °C (70 °F) תרמוציקלר מחומם מראש. ברגע הדגירה נגמרת, להוסיף במהירות 2 μL של פתרון עצור בכל צינור. תסתובבו ותנו לשבת על הקרח עד שיהיו מוכנים להמשיך לשלב הבא.הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם למספר הדגימות שיש לעבד אך לא יעלה על 1 שעות כדי למנוע כל השפלה RNA. חזור על ההליך עבור כל הדגימות (אם יש יותר מ 8 aliquots). איחדו את הצינורות והמשיכו לטיהור RNA עם ערכת RNA נקייה ורכזת (שלב 6) או כל ערכה מותאמת אישית המבוססת על עמודות כדי להיפטר מהמאגרים ולשחזר RNA מקוטע נקי במים. 6. טיהור RNA הערה: שלב זה יכול להתבצע על ידי משקעים אתנול או עם כל סוג של שיטת טיהור וריכוז RNA מבוססת עמודה (כלומר, RNA נקי ורכז). יש לפנות או לתתכון מחדש את הרנ”א המטוהר בנפח כולל של 50-75 מיקרול של מים נטולי DNase/RNase.הערה: אם נעשה שימוש בשיטה מבוססת עמודה, מומלץ מאוד לשני סבבי עילה כדי להבטיח שחזור מרבי. לכמת את mRNA מקוטע מטוהר עם ספקטרופוטומטר ולהעריך את איכות ה- RNA עם מנתח שברים. שמור 100 ננוגרם של mRNA מקוטע כבקרת קלט להכנת הספרייה ורצף (עבור לשלב 9). ניתן להשתמש ב- mRNA המפוצל הנותר (מינימום 2.5 מיקרוגרם) עבור MeRIP (עבור לשלב 7.2). 7. מריפ הערה: נדרש מינימום של 2.5 מיקרוגרם של mRNA מקוטע עבור כל אימונופרציפיטציה (IP), בין אם באמצעות נוגדן אנטי-m6A ספציפי (מצב בדיקה) או באמצעות נוגדן אנטי-IgG (שליטה שלילית). הכנת חרוז מגנטי לאימונופרציפיטציה עבור כל מדגם, הכן 4 מ”ל של 1x מאגר IP בצינור חרוטי חדש על ידי דילול 800 μL של מאגר MRNA IP 5x (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 750 mM NaCl, 0.5% CA-630 Igepal ומים ללא נוקלאז) עם 3.2 מ”ל של מים ללא נוקלאז.הערה: דרושות לפחות 2 תגובות (בדיקה אחת ובקרת IgG אחת). הנח את הצינור על קרח. סמן את המספר המתאים של צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל עבור מספר תגובות ה- IP הרצויות:n צינורות (בדיקה) לנוגדן נגד m6A.n צינורות (שליטה שלילית) עבור עכבר רגיל IgG. resuspend החרוזים המגנטיים (למשל, חלבון ChIP מגנה A/G ) על ידי היפוך מערבולת. אין לראות גושי חרוזים. עבור כל תגובה מתוכננת, להעביר 25 μL של חרוזים מגנטיים לצינור microcentrifuge. הוסף פי עשרה יותר 1x מאגר IP (מהשלב 7.1.1) ביחס לנפח המקורי של חרוזים בשימוש (כלומר, 250 μL של 1x מאגר IP לכל 25 μL של חרוזים מגנטיים). מערבבים את החרוזים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים לחידוש מלא. מניחים את הצינור על המפריד המגנטי למשך דקה אחת. הסר והשלך את supernatant, הקפדה לא לשאוף כל חרוזים מגנטיים. הסר את הצינור מהמגנט. חזור על שלב הכביסה (שלבים 7.1.6 עד 7.1.9). resuspend החרוזים ב 100 μL של 1x מאגר IP לכל 25 μL של נפח מקורי של חרוזים מגנטיים. הוסף 5 μL של נוגדן (1 מיקרוגרם / μL) לכל 25 μL של נפח מקורי של חרוזים מגנטיים.n צינורות (בדיקה) עם נוגדן נגד m6A (שיבוט 17-3-4-1) [1 מיקרוגרם/μL].n צינורות (שליטה שלילית) עם IgG עכבר רגיל (1 מיקרוגרם / μL). דגירה על הגלגל המסתובב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הטיות של הנוגדנים עם החרוזים המגנטיים. מניחים את הצינור על המפריד המגנטי למשך דקה אחת. זרוק את סופר-טבעי. הסר את הצינור מן המגנט ו resuspend תערובת נוגדנים-חרוזים ב 100 μL של 1x IP Buffer. RNA Immunoprecipitation (RIP) הכן 500 μL של תערובת תגובת RIP עבור כל מדגם mRNA 2.5 מיקרוגרם כדלקמן: 2.5 מיקרוגרם ב 100 μL של RNA מקוטע (בשלב 6.12); 295 μL של מים ללא נוקלאז; 5 μL של 40 מעכבי RNase U/μL; ו- 100 μL של מאגר IP 5x. הוסף 500 μL של תערובת תגובת RIP לכל תערובת נוגדנים-חרוזים (~ 100 μL מ שלב 7.1.14). מערבבים על ידי צנרת עדינה מספר פעמים כדי להצמיד מחדש את החרוזים לחלוטין. מניחים על קרח. לדגור את כל צינורות RIP על גלגל מסתובב במשך 2 שעות ב 4 °C (70 °F). צנטריפוגות תגובות MeRIP בקצרה כדי לסובב את טיפות נוזלים מן המכסה ואת צדי הצינור. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי במשך 1 דקות. העבר את supernatant בצינור צנטריפוגה חדש, נזהר לא להפריע חרוזים מגנטיים .הערה: ניתן לשמור על Flowthrough כפקד כדי לאמת את יעילות RIP (עבור לשלב 7.3.9). הסר צינורות מהמגנט. לשטוף את החרוזים על ידי הוספת 500 μL של חיץ IP 1x קר. מערבבים את החרוזים על ידי צנרת עדינה מספר פעמים כדי resuspend החרוזים לחלוטין. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי במשך 1 דקות ולהשליך supernatant. חזור על הליך הכביסה (שלבים 7.2.6-7.2.7) פעמיים עבור סך של 3 כביסות. מניחים את הצינורות על קרח ומיד ממשיכים לתהלייה. אלוטיון הכן פתרון 20 mM m6A על ידי המסת 10 מ”ג של N6-Methyladenosine, 5′-מונופוספט מלח נתרן (m6A) ב 1.3 מ”ל של מים ללא נוקלאז. הכן 150 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (50 °F). עבור כל מדגם (בדיקה ובקרות): הכן 225 μL של מאגר אלוטיון על ידי ערבוב הרכיבים הבאים: 45 μL של 5x IP Buffer, 75 μL של 20 mM m6A, 3.5 μL של מעכב RNase 40U / μL, ו 101.5 μL של מים ללא נוקלאז. הוסף 100 μL של מאגר אלוטיון (מהשלב 7.3.2) אל החרוזים (מהשלב 7.2.9). מערבבים על ידי צנרת עדינה מספר פעמים כדי resuspend חרוזים לחלוטין. לדגור את כל הצינורות במשך 1 שעות עם רעד מתמשך על רוקר ב 4 °C (50 °F). צנטריפוגות תגובות RIP בקצרה כדי לסובב טיפות נוזליות מן המכסה ואת צדי הצינור. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי במשך 1 דקות. העבר את supernatant המכיל שברי RNA אלים לצינור microcentrifuge 1.5 מ”ל חדש. היזהר לא לשאוף את החרוזים, כפי שהוא יגביר את רעשי הרקע. חזור על שלבי ההעפרה (7.3.3 עד 7.3.6) על-ידי הוספת 100 מיקרו-אל של חוצץ אילוטיון, דגירה של שעה אחת ב-4 °C (4 °F) ואיסוף האלאט לאחר ההפרדה המגנטית. שלב את כל eluates מאותה מדגם (נפח elution הכולל צריך להיות 200 μL). טהרו את ה-RNA הנמהר ואת הזרימה (אופציונלי, החל מהשלב 7.2.5) על ידי משקעים אתנול או בשיטת בחירה מבוססת טורים (כלומר, RNA נקי ורכז). להעריך את כמות ה- RNA ואת איכות הזרימה ודגימות eluted עם מנתח שברים באמצעות ערכת זיהוי רגישות גבוהה. אם איכות ה- RNA משביעת רצון, המשך להכנת הספרייה ולרצף תפוקה גבוהה (שלב 9).הערה: כמות הרנ”א שאוחזרה ב- MeRIP נמוכה מאוד, ובהכרח דורשת ערכות לזיהוי רגישות גבוהה כדי להבטיח כימות. אם אין ביואנלייזר זמין, ניתן להמשיך בעיוורון להכנת הספרייה. 8. המרת RNA ביסולפיט הכנה לבקרה וריאגנט בקרת ספייק-אין לערבב ERCC: הוסף תערובת ERCC בהתאם להוראות היצרן, הממליצות על תוספת של 0.5 μL של תערובת ERCC לא מדוללת ל- 500 ננוגרם של mRNA. פקד זה יכול לעזור להעריך את היעילות של המרת ביסולפיט. ספייק פולי-A-מרוקן RNA (מ שלב 3.3.14) ביחס 1/1000 (כלומר, 500 pg של פולי-A-מרוקן RNA עבור 500 ננוגרם של mRNA). מדגם זה מועשר ברנ”א ריבוזומלי ולכן צריך להכיל את 28S rRNA, שליטה חיובית להמרת ביסולפיט.הערה: סה”כ RNA יכול לשמש גם כשליטה חיובית במקום RNA מרוקן פולי-A. בצע המרת ביסולפיט עם ערכת מתילציה RNA (למשל, זימו EZ). חוצץ שטיפת RNA: יש להוסיף 48 מ”ל של 100% אתנול (או 52 מ”ל של 95% אתנול) ל-12 מ”ל של תרכיז מאגר שטיפת RNA לפני השימוש. המרת ביסולפיטהערה: המרת Bisulfite בוצעה עם ערכת המרה RNA bisulfite זמין מסחרית בעקבות הליך היצרן כאמור להלן. בצינורות PCR של 0.2 מ”ל, הוסף 1000 ננוגרם של mRNA (או בין 300 ל-1000 ננוגרם). הוסף פקדי ספייק-אין: 1 μL של תערובת ERCC (שלב 8.1.1) ו- 1000 pg של RNA מרוקן פולי-A (שלב 8.1.2). נפח מלא עד 20 μL עם מים ללא DNase /RNase. הוסף 130 μL של ריאגנט המרת RNA לכל דגימת RNA של 20 μL. מערבבים את הדגימה על ידי צנרת למעלה ולמטה. ספין למטה בקצרה כדי להבטיח שאין טיפות במכסה או בצדדים של הצינור. מניחים את צינורות PCR באופניים תרמיים ולבצע את השלבים הבאים: denaturation ב 70 °C (5 דקות); המרה ב 54 °C (54 °F) במשך 45 דקות; חזור על שלבי דנטורציה והמרה עבור סך של 3 מחזורים; ולאחר מכן להחזיק ב 4 °C ללא הגבלת זמן.הערה: שלושה מחזורים של denaturation והמרת bisulfite להבטיח המרה ביסולפיט מלא של המדגם. ניתן לאחסן דגימות ב- -80 °C (80 °F) או לעבד אותן ישירות. המשך עם ביטול ההסתה בעמודה. מקם עמודה בצינור אוסף ריק והוסף 250 μL של מאגר איגוד RNA לעמודה. טען את המדגם (~ 150 μL משלב 8.2.5) לעמודה המכילה את מאגר איגוד ה- RNA וערבוב על-ידי צנרת למעלה ולמטה. הוסף 400 μL של 95-100% אתנול לתערובת אגף כריכת RNA מדגם בעמודה. סגור את המכסה ומיד מערבבים על-ידי היפוך העמודה מספר פעמים. צנטריפוגה במלוא המהירות (≥ 10,000 x g) עבור 30 s. תזרוק את הזרימה. הוסף 200 μL של מאגר שטיפת RNA לעמודה וצנטריפוגה במהירות מלאה עבור 30 s. הוסף 200 μL של מאגר Desulphonation RNA לעמודה ודגר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה במלוא המהירות במשך 30 s. תזרוק את הזרימה. הוסף 400 μL של מאגר שטיפת RNA לעמודה וצנטריפוגה במהירות מלאה עבור 30 s. חזור על שלב הכביסה עם 400 μL נוסף של מאגר שטיפת RNA. תזרוק את הזרימה. צנטריפוגה העמוד בצינור האוסף המרוקן במלוא המהירות במשך 2 דקות. העבר את העמודה לצינור ללא RNase. הוסיפו ≥ 10 מיקרו-אל של מים נטולי DNase/RNase ישירות למטריצת העמודות, ודגרו במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה במלוא המהירות ל-30 שנה.הערה: אנחנו בדרך כלל לברוח בנפח של 20 μL. RNA eluted ניתן להשתמש באופן מיידי או מאוחסן ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים. לאחסון לטווח ארוך, יש לשמור על -80 °C (80 °F). להוציא 2.5 μL להערכת מנתח קטעים של איכות RNA וכמות ולהמשיך להכנת הספרייה ורצף תפוקה גבוהה (שלב 9). קח 4 μL של RNA מומר לשליטת המרה bisulfite של יעילות (שלב 8.3). בקרת המרה ביסולפיט על ידי RT-PCRהערה: שלב זה מבטיח כי המרת bisulfite הצליחה לפני שתמשיך לרצף . RNA ריבוזומלי 28S מהומו ספיינס ישמש כבקרה חיובית לניתוח מתילציה של RNA, שכן שאריות C בעמדה 4447 (גישה של GenBank # NR_003287) תוארה כ- 100% מתילציה.רצפי פריימר:H 28SF primer: 5′-GGGGTTTTAYGATTTTTGATTTTTTGG-3’H 28SR פריימר: 5′-CCAACTCACRTTCTATTAAATAAAAAC-3′ הכן תמלול הפוך (RT) תערובת תגובה באמצעות ערכת תמלול הפוך cDNA בקיבולת גבוהה. להפשיר את רכיבי הערכה על קרח ולהכין את תערובת מאסטר RT על קרח כדלקמן:4 μL של RNA מומר ביסולפיט (החל בשלב 8.2.14):2 מיקרו-אל של מאגר 10xRT0.8 μL של 25x dNTP מיקס [100 מ”מ]2 מיקרו-אל של פריימרים אקראיים RT 10×1 μL של תמלול הפוך של ריבוי סופרים1 μL של מעכב RNase9.2 μL של H2O ללא נוקלאזהערה: כל תגובת RT צריכה להכיל נפח סופי של 20 μL בצינורות PCR של 0.2 מ”ל. שים את הצינורות ברכיב האופניים התרמי עם תוכנית RT הבאה: 25 °C (70 °F) למשך 10 דקות; 37 °C (77 °F) למשך 120 דקות; 85 °C (5 דקות; ואז ב 4 °C ללא הגבלת זמן. הכן את תגובת ה-PCR כדי להגביר במיוחד את rRNA 28S עם אנזים הגהה PCR. מפשירים את רכיבי הערכה על קרח, מערבולת בעדינות וצנטריפוגה קצרה. הכן את תערובת מאסטר PCR על קרח או על מחזיק צלחת מתכת קר כקרח כדלקמן:0.6 μL של 10 מיקרומטר H 28SF פריימר0.6 μL של 10 מיקרומטר H 28SF פריימר6.5 μL של תבנית cDNA22.5 μL של תמהיל מאסטר פולימראז DNAהערה: כל תגובת PCR צריכה להכיל נפח סופי של 20 μL בצינורות PCR של 0.2 מ”ל. שים את הצינורות ברכיב האופניים התרמי עם תוכנית PCR הבאה: denaturation הראשוני ב 95 °C במשך 5 דקות; 45 מחזורים של denaturation (95 °C (15 °C) עבור 15 s), חישול (57 °C (30 °C) והארכות (72 °C (15 °C), התארכות סופית ב 72 °C במשך 10 דקות, ולאחר מכן מחזיק ב 4 °C ללא הגבלת זמן. הפעל 10 μL של התגובה על ג’ל אגרוז 2%. גודל הרצועה הצפוי הוא 130 – 200 bp. רצף של מוצרי PCR לטהר את מוצרי PCR עם שיטה מבוססת עמודה של בחירה כדי להסיר אנזימים ושאריות dNTP ולחמוק ה- DNA המוגבר לפחות 20 μL של מים ללא DNase / RNase. לכמת את הדנ”א המטוהר עם ספקטרופוטומטר. תגובת רצף השתמש ב- 40 ננוגרם של תגובת מוצר/רצף PCR. רצף בשני הכיוונים עם פריימרים H 28SF ו- H 28SR. ישר את הרצפים עם הרצף הלא-מומר הידוע (28S ribosomal N5 (RNA28SN5). בדוק את נוכחותם של שאריות C במיקום C4447, ואת שאריות T במקום C במקום במקום אחר. 9. הכנת הספרייה ורצף תפוקה גבוהה הכן ספריות לרצף באמצעות ערכות mRNA (לדוגמה, Illumina TruSeq Stranded), הפעלת הפרוטוקול בשלב Elute-Prime-Fragment והוראות היצרן. עם זאת, עבור קלט RNA-Seq ו MeRIP-Seq דגימות, לדגור את הדגימות ב 80 °C (80 °F) במשך 2 דקות רק פריים אבל לא עוד לפצל אותם. בצע רצף באמצעות פלטפורמות Illumina. תגובות רצף יכולות להתבצע על פי העדפות ועיצוב ניסיוני, קצוות בודדים או מצמידים, עם אורך מינימלי של 100 nt. 10. ניתוחים ביואינפורמטיים עיבוד נתונים m6A הפעל FASTQC24 כדי להעריך את איכות הקריאה ב- m6A והקלט קבצי FASTQ מרצף. הפעל את Atropos25 כדי לקצץ רצפי קצה ומתאם באיכות נמוכה מהקריאות. הגדר את הפרמטרים הבאים בהפעלת Atropos. הסר את רצפי המתאם הבאים: AGATCGGAAGAG, CTCTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTTCCGATCT. השתמש בקיצוץ האיכותי הבא של Phred: 5, לגיזום קצוות באיכות נמוכה כפי שצוין על-ידי היצרן (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html). השתמש באורך הקריאה המינימלי הבא לאחר החיתוך: 25 זוגות בסיס. מזג את הגנום האנושי GRh38 ו- HIV [pNL4-3Env-GFP משולב] בפורמט FASTA. אינדקס ההפניה הממוזגת עם HISAT226. הפעל את HISAT2 בקריאות חתוכות כדי ליישר את ההפניה הכלולה באינדקס. השתמש בפרמטרים של HISAT המוגדרים כברירת מחדל. מיין וציין אינדקס של הקריאות המיושרות באמצעות SAMtools27. הפעל את הסטטיסטיקה של SAMtools ואת Qualimap 228, לבדיקת איכות לאחר היישור של הספריות המרוצפות. לחלופין, לאסוף ולסכם מדדי איכות מהשלב הקודם עם multiQC29. לגנום HIV יש רצפי 634 bp הומולוגיים ב- LTR 5 ‘ ו- LTR 3 ‘: יישר מחדש קריאות מרובות מיפויים מ- 5 ‘ LTR לאזור LTR המתאים 3 ‘ עם SAMtools. על מנת לזהות את פסגות m6A, הפעל את תוכנת הקריאה שיא MACS230 (v 2.1.2). בחר בקפידה פרמטרים פועלים MACS2, על מנת להבטיח תפקוד נכון על נתוני RNA-Seq כמו שיא שיחות יכול להיות מושפע על ידי רמת ביטוי גנים, ו exons קצר עשוי להיות misיקרא פסגות. לפיכך, יש להחסיר אות קלט מאות m6A, ללא החלקה המופעלת באופן שגרתי על-ידי MACS2 לנתונים מבוססי DNA. החל את הפרמטרים הבאים על פקודת המשנה ‘callpeak’ מ- MACS2:-keep-dup auto (שולט בהתנהגות MACS2 כלפי קריאות כפולות, ‘אוטומטי’ מאפשר ל- MACS לחשב את המספר המרבי של קריאות באותו מיקום בדיוק בהתבסס על התפלגות בינומית באמצעות 1e-5 כניתוק ערך p)-g 2.7e9 (גודל הגנום האנושי ב- bp)-q 0.01 (ניתוק מינימלי של FDR כדי לקרוא לשיאים משמעותיים)-נודל (לעקוף את בניית מודל ההזזה, המותאם לניסויי ChIP-Seq)-slocal 0-llocal 0 (הגדרת פרמטר זה ואת הפרמטר הקודם ל- 0 מאפשרת ל- MACS2 להחסיר ישירות, ללא החלקה, את קריאות הקלט מה- m6A קורא)-extsize 100 (אורך ממוצע של שברים ב- bp)-B הפעל את שיא דיפרנציאל קורא תת הפקודה של MACS2, ‘bdgdiff’ כדי להשוות דגימות נגועות לעומת לא נגועות. ‘bdgdiff’ לוקח כמו קלט קבצי bedGraph שנוצרו על ידי ‘callpeak’ בשלב הקודם. עבור כל נקודת זמן, להפעיל את ההשוואה של דגימות נגועות לעומת לא נגוע עם ‘bdgdiff’, חיסור אות הקלט המתאים מן האות m6A ומספק את הפרמטרים הנוספים: -g 60 -l 120. עיבוד נתונים m5C הפעל את Cutadapt31 כדי לחתוך רצפי מתאם מהקריאות הגולמיות, עם הפרמטרים הבאים:מתאם “AGATCGGAAGAGCACGTCTGAAC”-אורך מינימלי=25. המשלים לאחור את הקריאות הקצוצות באמצעות seqkit32, כאשר פרוטוקול הרצף מפיק קריאות מהגדיל ההפוך. הפעל FastQC כדי לבחון את איכות הקריאה. מיזוג GRh38 גנום אנושי ו- HIV [pNL4-3Env-GFP משולב] הפניה בפורמט FASTA. אינדקס ההפניה הממוזגת עם meRanGh היישום מחבילת meRanTK33. ישר עם meRanGh עם הפרמטרים הבאים:-UN מאפשר לכתוב קריאות לא ממופות לקבצי פלט-MM המאפשר כתיבת קריאות מרובות ממופות לקובץ פלט- bg לפלט במיטהגרף-mbgc 10 מסנן דיווח אזור לפי כיסוי (לפחות 10 קריאות של כיסוי) לגנום HIV יש רצפי 634 bp הומולוגיים ב- LTR 5 ‘ ו- LTR 3 ‘: יישר מחדש קריאות מרובות מיפויים מ- 5 ‘ LTR לאזור LTR המתאים 3 ‘ עם SAMtools. הפעל שיחות מתילציה באמצעות הכלי meRanCall, המסופק על ידי meRanTK, עם הפרמטרים הבאים:-rl = 126, אורך קריאה-ei = 0.1, מרווח זמן לשגיאות עבור חישוב ערך p-value של קצב מתילציה-cr = 0.99, המרה צפויה הפעל את estimateSizeFactors.pl השירות של MeRanTK להערכת גורמי הגודל של כל מדגם. גורמי הגודל ישמשו כפרמטרים בשלב הבא. הפעל MeRanCompare לניתוח מתילציה דיפרנציאלית של לא נגוע לעומת נגוע על פני נקודות זמן 12, 24, ו 36h. הפרמטרים הבאים מוחלים: ערך משמעות של .01 כסף מינימלי לדיווח וגורמי גודל מהשלב הקודם.