RNA-modifikationernes rolle i virusinfektioner er lige begyndt at blive undersøgt og kunne fremhæve nye virale interaktionsmekanismer. I dette arbejde leverer vi en pipeline til at undersøge m6A og m5C RNA ændringer i forbindelse med virusinfektioner.
RNA-modifikationernes rolle i biologiske processer har været i fokus for et stigende antal undersøgelser i de sidste par år og er i dag kendt som epitranscriptomics. Blandt andet, N6-methyladenosin (m6A) og 5-methylcytosin (m5C) RNA ændringer er blevet beskrevet på mRNA molekyler og kan have en rolle i modulerende cellulære processer. Epitranscriptomics er således et nyt reguleringslag, der skal overvejes ud over transskriptomiske analyser, da det også kan ændres eller moduleres ved eksponering for kemiske eller biologiske agenser, herunder virusinfektioner.
Her præsenterer vi en arbejdsgang, der gør det muligt at analysere det fælles cellulære og virale epitranscriptomiske landskab af m6A– og m5C-mærkerne samtidigt, i celler, der er inficeret eller ej med human immundefektvirus (HIV). Ved mRNA-isolation og fragmentering fra hiv-inficerede og ikke-inficerede celler brugte vi to forskellige procedurer: MeRIP-Seq, en RNA-immunprecipitationsbaseret teknik, til at berige for RNA-fragmenter, der indeholder m6A-mærket og BS-Seq, en bisulfitkonverteringsbaseret teknik, til at identificere m5C-mærket ved en enkelt nukleotidopløsning. Ved methyleringsspecifik fangst er RNA-biblioteker forberedt til sekventering med høj kapacitetshastighed. Vi udviklede også en dedikeret bioinformatik pipeline til at identificere differentieret methylerede (DM) udskrifter uafhængigt af deres basal udtryk profil.
Samlet set metoden tillader udforskning af flere epitranscriptomic mærker samtidigt og giver et atlas af DM udskrifter på virusinfektion eller enhver anden celleforstyrrelse. Denne tilgang giver nye muligheder for at identificere nye spillere og nye mekanismer for cellerespons, såsom cellulære faktorer, der fremmer eller begrænser viral replikation.
Det er længe kendt, at RNA molekyler kan ændres, og mere end 150 post-transskriptionelle ændringer er blevet beskrevet til dato1. De består i tilsætning af kemiske grupper, hovedsagelig methylgrupper, til stort set enhver position af pyrimidin- og purinringe af RNA-molekyler2. Sådanne post-transskriptionelle ændringer har allerede vist sig at være højt beriget i overførsel RNA (tRNA) og ribosomale RNA (rRNA) og er for nylig blevet beskrevet på mRNA molekyler samt.
Fremkomsten af nye teknologier, såsom Next Generation Sequencing (NGS), og produktionen af specifikke antistoffer, der anerkender bestemte kemiske ændringer, gjorde det for første gang muligt at undersøge placeringen og hyppigheden af specifikke kemiske modifikationer på et transskriptom-dækkende niveau. Disse fremskridt har ført til en bedre forståelse af RNA-modifikationer og til kortlægning af flere modifikationer på mRNA-molekyler3,4.
Mens epigenetik undersøger DNA’s og histonemodifikationers rolle i transskriptomregulering, fokuserer epitranscriptomics på samme måde på RNA-modifikationer og deres rolle. Undersøgelsen af epitranscriptomiske modifikationer giver nye muligheder for at fremhæve nye reguleringsmekanismer, der kan tune en række cellulære processer (dvs. RNA-splejsning, eksport, stabilitet og oversættelse)5. Det var derfor ingen stor overraskelse, at nylige undersøgelser afdækket mange epitranscriptomiske ændringer på virusinfektion i både cellulære og virale RNA’er6. De vira, der hidtil er undersøgt, omfatter både DNA- og RNA-vira; blandt dem kan hiv betragtes som et banebrydende eksempel. Alt i alt kan opdagelsen af RNA methylering i forbindelse med virusinfektioner gøre det muligt at undersøge endnu ubeskrevne mekanismer for virale udtryk eller replikation, hvilket giver nye værktøjer og mål til at kontrollere dem7.
Inden for hiv epitranscriptomics, modifikationer af virale udskrifter er blevet bredt undersøgt og har vist, at tilstedeværelsen af denne ændring var gavnligt for viral replikation8,9,10,11,12,13. Til dato forskellige teknikker kan bruges til at opdage epitranscriptomic mærker på transcriptome-dækkende niveau. De mest anvendte teknikker til m6A identifikation stole på immun nedbør teknikker såsom MeRIP-Seq og miCLIP. Mens MeRIP-Seq er afhængig af RNA fragmentering til at fange fragmenter, der indeholder methylerede rester, miCLIP er baseret på generering af α-m6A antistof specifikke signatur mutationer på RNA-antistof UV crosslinking, hvilket giver mulighed for en mere præcis kortlægning.
Påvisning af m5C-modifikation kan opnås enten ved antistofbaserede teknologier svarende til m6A-detektion (m5C RIP) eller ved bisulfitkonvertering eller ved AZA-IP eller ved miCLIP. Både Aza-IP og m5C miCLIP bruger en bestemt methyltransferase som agn til at målrette RNA, mens du går gennem RNA methylering. I Aza-IP udsættes målceller for 5-azacytidin, hvilket resulterer i tilfældig indførelse af cytidin analog 5-azacytidin steder i spirende RNA. I miCLIP er NSun2 methyltransferase genetisk modificeret til at huse C271A-mutationen14,15.
I dette arbejde fokuserer vi på den dobbelte karakterisering af m6A og m5C-modifikationer i inficerede celler ved hjælp af HIV som model. Ved metodologisk optimering har vi udviklet en arbejdsgang, der kombinerer methyleret RNA immunprecipitation (MeRIP) og RNA bisulfitkonvertering (BS), der muliggør samtidig udforskning af m6A og m5C epitranscriptomiske mærker på et transskriptom-dækkende niveau, i både cellulære og virale sammenhænge. Denne arbejdsgang kan implementeres på cellulære RNA-ekstrakter såvel som på RNA isoleret fra viruspartikler.
Methyleret RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16-tilgangen , der gør det muligt at undersøge m6A på transskriptom-dækkende niveau, er veletableret, og en række m6A-specifikke antistoffer er kommercielt tilgængelige til dato17. Denne metode består i selektiv opsamling af m6A-holdige RNA-stykker ved hjælp af et m6A-specifikt antistof. De to største ulemper ved denne teknik er (i) den begrænsede opløsning, som er meget afhængig af størrelsen af RNA-fragmenter og dermed giver en omtrentlig placering og region, der indeholder methylerede rester, og (ii) den store mængde materiale, der er nødvendigt for at udføre analysen. I den følgende optimerede protokol standardiserede vi fragmentstørrelsen til ca. 150 nt og reducerede mængden af udgangsmateriale fra 10 μg poly-A-udvalgte RNA, som i øjeblikket er den anbefalede mængde udgangsmateriale, til kun 1 μg poly-A-valgt RNA. Vi maksimerede også nyttiggørelseseffektiviteten af m6A RNA-fragmenter bundet til specifikke antistoffer ved hjælp af en elution ved en konkurrencetilgang med en m6A peptid i stedet for mere konventionelle og mindre specifikke elutionsmetoder ved hjælp af phenolbaserede teknikker eller proteinase K. Den væsentligste begrænsning af denne RIP-baserede analyse er imidlertid fortsat den suboptimale opløsning, der ikke gør det muligt at identificere den præcise modificerede A-nukleotid.
Analyse af m5C-mærket kan i øjeblikket udføres ved hjælp af to forskellige tilgange: en RIP-baseret metode med m5C-specifikke antistoffer og RNA bisulfitkonvertering. Da RIP kun tilbyder begrænset opløsning på identifikationen af methylerede rester, brugte vi bisulfitkonvertering, der kan tilbyde enkelt nukleotidopløsning. RNA-eksponering for bisulfit (BS) fører til cytosindeaminering og omdanner derved cytosinresterne til uracil. Under RNA bisulfitkonverteringsreaktionen afamineres og omdannes hver ikke-methyleret cytosin til uracil, mens tilstedeværelsen af en methylgruppe i position 5 af cytosinen har en beskyttende virkning, der forhindrer BS-induceret deaminering og bevarer cytosinresterne. Den BS-baserede tilgang giver mulighed for påvisning af et m5C modificeret nukleotid ved enkelt basisopløsning og til vurdering af methyleringsfrekvensen for hver udskrift, hvilket giver indsigt i m5C-modifikationsdynamik18. Den vigtigste begrænsning af denne teknik er imidlertid afhængig af den falske positive sats af methylerede rester. BS-konverteringen er faktisk effektiv på enkeltstrenget RNA med tilgængelige C-rester. Tilstedeværelsen af en stram RNA sekundær struktur kan imidlertid maskere N5C-positionen og hæmme BS-konverteringen, hvilket resulterer i ikke-methylerede C-rester, der ikke omdannes til U-rester og dermed falske positiver. For at omgå dette problem og minimere den falske positive sats anvendte vi 3 runder denaturerings- og bisulfitkonverteringscyklusser19. Vi har også indført 2 kontroller i prøverne for at muliggøre estimering af bisulfitkonverteringseffektivitet: Vi spike-in ERCC sekventering kontrol (ikke-methyleret standardiserede og kommercielt tilgængelige sekvenser)20 samt poly-A-udtømte RNA’er til at vurdere bisulfit konverteringsfrekvens på den ene side, og at kontrollere ved RT-PCR tilstedeværelsen af en kendt og velbevaret methyleret site, C4447, på 28S ribosomale RNA på den anden side21.
Inden for virologi giver kobling af disse to epitranscriptomiske undersøgelsesmetoder med næste generations sekventering og nøjagtig bioinformatisk analyse mulighed for en dybdegående undersøgelse af m6A– og m5C-dynamik (dvs. RNA-modifikationstidlige ændringer, der kan forekomme ved virusinfektion og kunne afdække en række nye terapeutisk relevante mål for klinisk brug).
RNA-modifikationernes rolle i virusinfektion er stadig stort set ukendt. En bedre forståelse af epitranscriptomiske modifikationers rolle i forbindelse med virusinfektion kan bidrage til at finde nye antivirale behandlingsmål.
I dette arbejde leverer vi en komplet arbejdsgang, der gør det muligt at undersøge m6A og m5C epitranscriptomes af inficerede celler. Afhængigt af det biologiske spørgsmål anbefaler vi at bruge poly-A-udvalgte RNA som udgangsmateriale. Selvom det er valgfrit, da rørledningen kan bruges med total RNA, er det vigtigt at huske på, at rRNAs samt små RNA’er er stærkt modificerede og indeholder et vigtigt antal methylerede rester. Dette kan resultere i en nedsat kvalitet og mængde meningsfulde sekventeringsdata.
Hvis undersøgelsens fokus imidlertid er ikke-poly-adenyleret RNA, bør RNA-ekstraktionstrinnet tilpasses for at undgå at kassere små RNA -tegn (i tilfælde af kolonnebaseret RNA-udvinding) og for at privilegere ribosomudtømningsteknikker i stedet for poly-A-udvælgelse for at komme ind i rørledningen.
For at sikre høj kvalitet RNA, korrekt fragmentering og egnet m6A-beriget og BS konverteret RNA kvalitet til bibliotek forberedelse vi kraftigt råde til at bruge et fragment analysator eller en bioanalyzer. Dette udstyr er dog ikke altid tilgængeligt. Som et alternativ kunne kvaliteten af RNA, mRNA og størrelsen af fragmenteret RNA også vurderes ved visualisering på agarosegel. Alternativt kan biblioteksforberedelse udføres uden forudgående vurdering af RNA-mængde.
Vi brugte den antistofbaserede MeRIP-Seq16-teknik til at udforske det m6A epitranscriptomiske landskab. Denne teknik er baseret på RNA immunprecipitation og er vellykket; Nogle trin kræver dog omhyggelig optimering og kan være kritiske. Selv om m6A methylering er blevet beskrevet til at forekomme primært inden for konsensus sekvens RRA * CH, dette motiv er meget hyppig langs mRNA molekyler og tillader ikke præcis identifikation af methyleret sted. Det er derfor afgørende at opnå en reproducerbar og konsekvent RNA-fragmentering, der genererer små RNA-fragmenter, for at forbedre den RIP-baserede opløsning. I denne protokol anbefaler vi en optimeret procedure, der giver reproducerbare og konsekvente resultater i vores eksperimentelle indstilling; Dette fragmenteringstrin kan dog kræve yderligere optimering i henhold til specifikke eksempelfunktioner.
For nylig en ny teknik, der tillader m6A direkte sekventering blev beskrevet. Den er baseret på brugen af specifikke omvendte transskriptasevarianter, der udviser unikke RT-signaturer som svar på at støde på m6A RNA-modifikation24. Denne teknologi, ved omhyggelig optimering, kunne omgå den store begrænsning står over for MeRIP-Seq (faldende mængden af indledende materiale og giver en højere opløsning). For at udforske m5C-modifikationen besluttede vi at bruge bisulfitkonverteringsteknikken til ved nukleotidopløsning at opdage de modificerede C-rester. For at reducere den falske positive sats på grund af tilstedeværelsen af RNA sekundære strukturer udførte vi 3 cyklusser af denaturering / bisulfitkonvertering og yderligere kontrol bisulfitkonverteringsfrekvens takket være brugen af ERCC spike-in kontroller. En af de begrænsninger, der er forbundet med denne teknik er, at bisulfit konvertering er meget hård og tre cyklusser af denaturering / bisulfit konvertering kunne forringe nogle RNA og dermed reducere opløsningen. Men i vores indstilling valgte vi at nøjes med en potentielt lidt lavere opløsning for at øge kvaliteten af datasættet.
Takket være disse optimeringer og kontroller var vi i stand til at levere en pålidelig og sund arbejdsgang, der kan udnyttes til at undersøge det epitranscriptomiske landskab og dets ændring i forbindelse med virusinfektioner, værtspatogeninteraktioner eller enhver eksponering for specifikke behandlinger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (tilskud 31003A_166412 og 314730_188877).
AccuPrime Pfx SuperMix | Invitrogen | 12344-040 | |
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 | Millipore | MABE1006 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
ERCC | Invitrogen | 4456740 | |
EZ RNA Methylation Kit | Zymo Research | EZR5001 | |
Fragment analyzer RNA Kit – HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
Fragment analyzer RNA Kit – RNA Kit | Agilent | DNF-471-0500 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
Illumina TruSeq Stranded mRNA | Illumina | 20020594 | |
Magnetic Beads A/G Blend | Merck | 16-663 | |
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) | Sigma Aldrich | M2780-10MG | |
Normal Mouse IgG | Merk | 12371 | |
Oligo(dT)25 | Life Technologies | 61005, | |
PCRapace | Stratec | 1020220300 | |
Quick RNA Viral Kit | Zymo Research | 1034 | |
RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1015 | |
RNA Fragmentation Reagent | Ambion | AM8740 | |
RNase Inhibitor | Ambion | AM2684 | |
Trizol | TRIzol Reagent | 15596026 |