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Biology

वायरल संक्रमण पर m6A और m5C Epitranscriptomes की खोज: एचआईवी के साथ एक उदाहरण

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62426
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Microbiology, Lausanne University Hospital and University of Lausanne, 2Bioinformatics Core Facility, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Summary

वायरल संक्रमण में आरएनए संशोधनों की भूमिका का पता लगाया जाना शुरू हो रहा है और नए वायरल-होस्ट इंटरैक्शन तंत्र को उजागर कर सकता है। इस काम में, हम वायरल संक्रमण के संदर्भ में m6A और m5C RNA संशोधनों की जांच करने के लिए एक पाइपलाइन प्रदान करते हैं।

Abstract

जैविक प्रक्रियाओं में आरएनए संशोधनों की भूमिका पिछले कुछ वर्षों में अध्ययनों की बढ़ती संख्या का ध्यान केंद्रित कर रही है और आजकल इसे एपिट्रांसक्रिप्टोमिक्स के रूप में जाना जाता है। दूसरों के अलावा, N6-methyladenosine (m6A) और 5-methylcytosine (m5C) आरएनए संशोधनों को mRNA अणुओं पर वर्णित किया गया है और सेलुलर प्रक्रियाओं को संशोधित करने में उनकी भूमिका हो सकती है। इस प्रकार एपिट्रांसक्रिप्टोमिक्स विनियमन की एक नई परत है जिसे ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के अलावा माना जाना चाहिए, क्योंकि इसे वायरल संक्रमण सहित किसी भी रासायनिक या जैविक एजेंट के संपर्क में आने से भी बदला या संशोधित किया जा सकता है।

यहां, हम एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं जो एम 6 ए और एम 5 सी चिह्नों के संयुक्त सेलुलर और वायरल एपिट्रांसक्रिप्टोमिक परिदृश्य के विश्लेषण की अनुमति देता है, एक साथ संक्रमित कोशिकाओं में या मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) से संक्रमित नहीं है। एचआईवी संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं से एमआरएनए अलगाव और विखंडन पर, हमने दो अलग-अलग प्रक्रियाओं का उपयोग किया: MeRIP-Seq, एक आरएनए इम्यूनोप्रिसिपेशन-आधारित तकनीक, m6A चिह्न वाले आरएनए टुकड़ों के लिए समृद्ध करने के लिए और BS-Seq, एक bisulfite रूपांतरण-आधारित तकनीक, एक एकल न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन पर m5C चिह्न की पहचान करने के लिए। मिथाइलेशन-विशिष्ट कैप्चर पर, आरएनए पुस्तकालयों को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए तैयार किया जाता है। हमने अपने बेसल अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल से स्वतंत्र रूप से विभेदक रूप से मेथिलेटेड (डीएम) टेपों की पहचान करने के लिए एक समर्पित जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन भी विकसित की है।

कुल मिलाकर, पद्धति एक साथ कई epitranscriptomic निशान की खोज की अनुमति देता है और वायरल संक्रमण या किसी भी अन्य सेल गड़बड़ी पर डीएम टेपों का एक एटलस प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण उपन्यास खिलाड़ियों और सेल प्रतिक्रिया के उपन्यास तंत्र की पहचान करने के लिए नए अवसर प्रदान करता है, जैसे कि सेलुलर कारक वायरल प्रतिकृति को बढ़ावा देने या प्रतिबंधित करने के लिए।

Introduction

यह लंबे समय से ज्ञात है कि आरएनए अणुओं को संशोधित किया जा सकता है, और 150 से अधिक पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों को आज तक वर्णित किया गया है। वे रासायनिक समूहों के अलावा, मुख्य रूप से मिथाइल समूहों, आरएनए अणुओं के पाइरिमिडीन और प्यूरीन के छल्ले की वस्तुतः किसी भी स्थिति में शामिल हैं2। इस तरह के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों को पहले से ही स्थानांतरण आरएनए (टीआरएनए) और राइबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) में अत्यधिक समृद्ध दिखाया गया है और हाल ही में एमआरएनए अणुओं पर भी वर्णित किया गया है।

नई प्रौद्योगिकियों का उदय, जैसे कि अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस), और निश्चित रासायनिक संशोधनों को पहचानने वाले विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन ने पहली बार, स्थान की जांच और ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड स्तर पर विशिष्ट रासायनिक संशोधनों की आवृत्ति की अनुमति दी। इन प्रगतियों ने आरएनए संशोधनों की बेहतर समझ और एमआरएनए अणुओं पर कई संशोधनों के मानचित्रण के लिए नेतृत्व किया है3,4।

जबकि एपिजेनेटिक्स ट्रांसक्रिप्टोम विनियमन में डीएनए और हिस्टोन संशोधनों की भूमिका की जांच करता है, एक समान फैशन में एपिट्रांसक्रिप्टोमिक्स आरएनए संशोधनों और उनकी भूमिका पर केंद्रित है। epitranscriptomic संशोधनों की जांच विनियमन के उपन्यास तंत्र को उजागर करने के लिए नए अवसर प्रदान करती है जो विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं (यानी, आरएनए स्प्लिसिंग, निर्यात, स्थिरता और अनुवाद) को ट्यून कर सकती है। इस प्रकार यह कोई बड़ा आश्चर्य की बात नहीं थी कि हाल के अध्ययनों ने सेलुलर और वायरल आरएनए 6 दोनों में वायरल संक्रमण पर कई एपिट्रांसक्रिप्टोमिक संशोधनों को उजागर किया। अब तक जांच किए गए वायरस में डीएनए और आरएनए वायरस दोनों शामिल हैं; उनमें से, एचआईवी को एक अग्रणी उदाहरण के रूप में माना जा सकता है। कुल मिलाकर, वायरल संक्रमण के संदर्भ में आरएनए मिथाइलेशन की खोज वायरल अभिव्यक्ति या प्रतिकृति के अभी तक अवर्णित तंत्र की जांच की अनुमति दे सकती है, इस प्रकार उन्हें नियंत्रित करने के लिए नए उपकरण और लक्ष्य प्रदान कर सकती है7।

एचआईवी epitranscriptomics के क्षेत्र में, वायरल टेपों के संशोधनों की व्यापक रूप से जांच की गई है और दिखाया गया है कि इस संशोधन की उपस्थिति वायरल प्रतिकृति के लिए फायदेमंद थी8,9,10,11,12,13. आज तक विभिन्न तकनीकों का उपयोग ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड स्तर पर एपिट्रांसक्रिप्टोमिक चिह्नों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। M6A पहचान के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीकें MeRIP-Seq और miCLIP जैसी प्रतिरक्षा वर्षा तकनीकों पर निर्भर करती हैं। जबकि MeRIP-Seq मिथाइलेटेड अवशेषों वाले टुकड़ों को पकड़ने के लिए आरएनए विखंडन पर निर्भर करता है, miCLIP आरएनए-एंटीबॉडी यूवी क्रॉसलिंकिंग पर α-m6A एंटीबॉडी विशिष्ट हस्ताक्षर उत्परिवर्तन की पीढ़ी पर आधारित है, इस प्रकार एक अधिक सटीक मानचित्रण की अनुमति देता है।

M5C संशोधन का पता लगाना या तो m6A का पता लगाने (m5C RIP) के समान एंटीबॉडी-आधारित प्रौद्योगिकियों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, या bisulfite रूपांतरण द्वारा या AZA-IP द्वारा या miCLIP द्वारा। Aza-IP और m5C miCLIP दोनों आरएनए मिथाइलेशन के माध्यम से जाते समय आरएनए को लक्षित करने के लिए चारा के रूप में एक विशिष्ट मिथाइलट्रांसफरेज़ का उपयोग करते हैं। Aza-IP में, लक्ष्य कोशिकाओं को 5-azacytidine के संपर्क में लाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप नवजात आरएनए में साइटिडीन एनालॉग 5-azacytidine साइटों की यादृच्छिक शुरुआत होती है। MICLIP में, NSun2 methyltransferase को आनुवंशिक रूप से C271A उत्परिवर्तन 14,15 को हार्बर करने के लिए संशोधित किया जाता है।

इस काम में, हम एक मॉडल के रूप में एचआईवी का उपयोग करते हुए संक्रमित कोशिकाओं में m6A और m5C संशोधनों के दोहरे लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। methodological optimization पर, हमने एक वर्कफ़्लो विकसित किया है जो methylated RNA immunoprecipitation (MeRIP) और RNA bisulfite रूपांतरण (BS) को जोड़ता है, जिससे सेलुलर और वायरल संदर्भों दोनों में एक ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड स्तर पर m6A और m5C epitranscriptomic चिह्नों की एक साथ खोज की अनुमति मिलती है। इस वर्कफ़्लो को सेलुलर आरएनए अर्क के साथ-साथ वायरल कणों से अलग किए गए आरएनए पर लागू किया जा सकता है।

Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 दृष्टिकोण ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड स्तर पर m6A की जांच की अनुमति देता है, अच्छी तरह से स्थापित है और m6A-विशिष्ट एंटीबॉडी की एक सरणी व्यावसायिक रूप से दिनांक 17 के लिए उपलब्ध है। इस विधि में m6A-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके m6A-युक्त RNA टुकड़ों के चयनात्मक कैप्चर शामिल हैं। इस तकनीक की दो प्रमुख कमियां हैं (i) सीमित रिज़ॉल्यूशन, जो आरएनए टुकड़ों के आकार पर अत्यधिक निर्भर है और इस प्रकार एक अनुमानित स्थान और क्षेत्र प्रदान करता है जिसमें मेथिलेटेड अवशेष होते हैं, और (ii) विश्लेषण करने के लिए आवश्यक सामग्री की बड़ी मात्रा। निम्नलिखित अनुकूलित प्रोटोकॉल में, हमने टुकड़े के आकार को लगभग 150 nt तक मानकीकृत किया और पॉली-ए-चयनित आरएनए के 10 μg से शुरुआती सामग्री की मात्रा को कम कर दिया, जो वर्तमान में शुरुआती सामग्री की सलाह दी गई मात्रा है, केवल 1 μg पॉली-ए-चयनित आरएनए के लिए। हमने फिनोल-आधारित तकनीकों या प्रोटीनेज के का उपयोग करके अधिक पारंपरिक और कम विशिष्ट क्षालन विधियों के बजाय एक एम 6 ए पेप्टाइड के साथ एक प्रतियोगिता दृष्टिकोण द्वारा एक क्षालन का उपयोग करके विशिष्ट एंटीबॉडी से बंधे एम 6 ए आरएनए टुकड़ों की वसूली दक्षता को भी अधिकतम किया। इस आरआईपी-आधारित परख की मुख्य सीमा, हालांकि, सबऑप्टिमल रिज़ॉल्यूशन बनी हुई है जो सटीक संशोधित ए न्यूक्लियोटाइड की पहचान की अनुमति नहीं देती है।

एम 5 सी चिह्न का विश्लेषण वर्तमान में दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग करके किया जा सकता है: एम 5 सी-विशिष्ट एंटीबॉडी और आरएनए बिसल्फाइट रूपांतरण के साथ एक आरआईपी-आधारित विधि। जैसा कि आरआईपी मेथिलेटेड अवशेषों की पहचान पर केवल सीमित संकल्प प्रदान करता है, हमने बिसल्फाइट रूपांतरण का उपयोग किया जो एकल न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन की पेशकश कर सकता है। Bisulfite (BS) के लिए आरएनए एक्सपोजर साइटोसिन deamination की ओर जाता है, जिससे साइटोसिन अवशेषों को यूरासिल में परिवर्तित किया जाता है। इस प्रकार, आरएनए बिसल्फाइट रूपांतरण प्रतिक्रिया के दौरान, प्रत्येक गैर-मेथिलेटेड साइटोसिन को डीमिनेटेड किया जाता है और यूरेसिल में परिवर्तित किया जाता है, जबकि साइटोसिन की स्थिति 5 में एक मिथाइल समूह की उपस्थिति का सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है, जो बीएस-प्रेरित डिमिनेशन को रोकता है और साइटोसिन अवशेषों को संरक्षित करता है। बीएस-आधारित दृष्टिकोण एकल आधार रिज़ॉल्यूशन पर एक m5C संशोधित न्यूक्लियोटाइड का पता लगाने और प्रत्येक प्रतिलेख की मिथाइलेशन आवृत्ति के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, जो m5C संशोधन गतिशीलता 18 में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस तकनीक की मुख्य सीमा हालांकि मिथाइलेटेड अवशेषों की झूठी सकारात्मक दर पर निर्भर करती है। दरअसल, बीएस रूपांतरण सुलभ सी अवशेषों के साथ एकल-फंसे हुए आरएनए पर प्रभावी है। हालांकि, एक तंग आरएनए माध्यमिक संरचना की उपस्थिति एन 5 सी स्थिति को मुखौटा कर सकती है और बीएस रूपांतरण को बाधित कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-मेथिलेटेड सी अवशेष होते हैं जो यू अवशेषों में परिवर्तित नहीं होते हैं, और इस प्रकार झूठे सकारात्मक होते हैं। इस मुद्दे को दरकिनार करने और झूठी सकारात्मक दर को कम करने के लिए, हमने विकृतीकरण और बिसल्फाइट रूपांतरण चक्र 19 के 3 दौर लागू किए। हमने बिसल्फाइट रूपांतरण दक्षता के अनुमान को सक्षम करने के लिए नमूनों में 2 नियंत्रण भी पेश किए: हम स्पाइक-इन ईआरसीसी अनुक्रमण नियंत्रण (गैर-मेथिलेटेड मानकीकृत और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अनुक्रम) 20 के साथ-साथ पॉली-ए-समाप्त आरएनए एक तरफ बिसल्फाइट रूपांतरण दर का आकलन करने के लिए, और आरटी-पीसीआर द्वारा एक ज्ञात और अच्छी तरह से संरक्षित मेथिलेटेड साइट की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, C4447, दूसरी ओर 28S राइबोसोमल आरएनए पर 21.

विषाणु विज्ञान के क्षेत्र में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और सटीक जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ इन दो एपिट्रांसक्रिप्टोमिक जांच विधियों को युग्मन करने से एम 6 ए और एम 5 सी गतिशीलता के गहन अध्ययन की अनुमति मिलती है (यानी, आरएनए संशोधन अस्थायी परिवर्तन जो वायरल संक्रमण पर हो सकते हैं और नैदानिक उपयोग के लिए नए चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक लक्ष्यों की एक सरणी को उजागर कर सकते हैं)।

Protocol

1. सेल तैयारी

नोट:: कक्ष प्रकार और इसकी RNA सामग्री के आधार पर, कक्षों की प्रारंभिक संख्या भिन्न हो सकती है.

  1. कुल आरएनए के 200-500 μg या पॉली-ए-चयनित आरएनए के 5-7 μg के बीच प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कोशिकाएं हैं। उदाहरण के लिए, 50 x 106 SupT1 कोशिकाओं को फिनोल-आधारित अभिकर्मकों के साथ निष्कर्षण पर कुल आरएनए के लगभग 500 μg उपज चाहिए, और इस प्रकार परीक्षण किए गए प्रत्येक व्यक्तिगत स्थिति के लिए आवश्यक है।
  2. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार कोशिकाओं की आवश्यक संख्या तैयार करें, और इस प्रकार परीक्षण की गई स्थितियों की संख्या (संक्रमण, टाइमपॉइंट्स, उपचार) के अनुसार। यदि प्रयोग का उद्देश्य गैर-संक्रमित कोशिकाओं और एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं को 24 घंटे के संक्रमण के बाद प्राप्त करना है, तो कुल 100 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, आधा गैर-संक्रमित स्थिति के लिए और आधा संक्रमित स्थिति के लिए।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. कोशिकाओं से: फिनोल-क्लोरोफॉर्म के साथ आरएनए निष्कर्षण
    1. प्रत्येक स्थिति के लिए, कोशिकाओं को इकट्ठा करें (जैसे, 50 x 106) सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा और supernatant को छोड़ दें।
    2. प्रत्येक 50 x 106 सेल गोली के लिए फिनोल-आधारित अभिकर्मक के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    3. पूर्ण लाइसिस की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लाइस्ड कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या सीधे संसाधित किया जा सकता है।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रति ट्यूब 10 x 106 कोशिकाओं के एलीकोट में भी विभाजित किया जा सकता है और अधिक सुविधाजनक भंडारण के लिए फिनोल-आधारित अभिकर्मक के 1 एमएल में lysed किया जा सकता है।
    4. क्लोरोफॉर्म का 1 मिलीलीटर जोड़ें और व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें।
    5. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. 2,000 x g और 4 °C पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    7. जलीय चरण (ऊपरी चरण) को पिपेट करें और एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। 45° पर ट्यूब angling द्वारा जलीय चरण को स्थानांतरित समाप्त करें और सावधानी से समाधान बाहर pipetting.
      नोट: जलीय चरण की मात्रा नमूनों के बीच भिन्न हो सकती है, लेकिन नमूने में जोड़े गए क्लोरोफॉर्म की मात्रा के करीब होनी चाहिए (यानी, 1 एमएल)। किसी भी interphase या कार्बनिक परत हस्तांतरण मत करो! फेज-लॉक या फेज-मेकर ट्यूबों का उपयोग इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकता है।
    8. जलीय चरण में 100% आणविक ग्रेड आइसोप्रोपेनॉल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    9. आरएनए वर्षा की अनुमति देने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    10. अवक्षेपित आरएनए को गोली मारने के लिए 12,000 x g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    11. supernatant त्यागें और 75% आणविक जीव विज्ञान ग्रेड इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में आरएनए गोली resuspend. भंवर संक्षेप में।
    12. 7,500 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग.
    13. 15 मिनट के लिए गोली को हवा से सुखाएं।
    14. RNase मुक्त पानी के 20 μL में गोली resuspend और एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    15. आरएनए वसूली को अधिकतम करने के लिए अतिरिक्त 20 μL पानी के साथ खाली ट्यूब को धोएं, और पहले 20 μL मात्रा के साथ पूल करें।
    16. एक spectrophotometer के साथ कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें।
  2. वायरल कणों से: कॉलम-आधारित वायरल आरएनए निष्कर्षण किट के साथ आरएनए निष्कर्षण
    नोट: फिनोल-आधारित अभिकर्मक के साथ वायरल कणों से आरएनए निष्कर्षण कम गुणवत्ता वाले वायरल आरएनए और कम गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों में परिणाम देता है। एक स्तंभ-आधारित आरएनए निष्कर्षण इस प्रकार इष्ट होना चाहिए। आरएनए निष्कर्षण किट आरएनए क्षालन और वसूली के लिए वाहक आरएनए का उपयोग कर इस प्रक्रिया के लिए उपयुक्त नहीं हैं और इससे बचा जाना चाहिए। चूंकि एचआईवी आरएनए पॉली-एडेनिलेटेड है, इसलिए आगे एमआरएनए अलगाव के बिना प्रत्यक्ष आरएनए निष्कर्षण MeRIP-Seq और BS-Seq पाइपलाइनों में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त है। आम तौर पर सार्वभौमिक रूप से संक्रमित कोशिकाओं से वायरल supernatant के 1-2 मिलीलीटर पूरे वर्कफ़्लो को करने के लिए पर्याप्त आरएनए प्रदान करना चाहिए।
    1. lysis बफर के 30 mL करने के लिए बीटा-mercaptoethanol के 150 μL जोड़कर बफर तैयार करें। 100% इथेनॉल के 96 मिलीलीटर जोड़कर वायरल वॉश बफर का पुनर्गठन करें।
    2. सेलुलर आरएनए संदूषण को कम करने के लिए गोली सेल मलबे के लिए वायरस युक्त supernatants और centrifuge ले लीजिए।
    3. एक 15 mL ट्यूब के लिए वायरल supernatant के 1 mL स्थानांतरण.
    4. वायरल नमूने के 1 मिलीलीटर के लिए वायरल आरएनए बफर के 3 एमएल जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण।
    5. एक संग्रह ट्यूब में डाला गया, एक स्तंभ में नमूने के 700 μL स्थानांतरण।
    6. कमरे के तापमान पर 13,000 x g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    7. फ़्लोथ्रू को छोड़ दें.
    8. 3 पिछले चरणों को दोहराएं जब तक कि पूरे नमूने को संसाधित नहीं किया जाता है, और इस प्रकार सभी आरएनए को सिलिका-आधारित मैट्रिक्स कॉलम पर कब्जा कर लिया गया है।
    9. स्तंभ के लिए वायरल वॉश बफ़र के 500 μL जोड़ें।
    10. कमरे के तापमान पर 10,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें.
    11. स्तंभ के लिए वायरल वॉश बफ़र के 200 μL जोड़ें।
    12. कमरे के तापमान पर 10,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें.
    13. स्तंभ को किसी रिक्त संग्रह ट्यूब में रखें.
    14. कमरे के तापमान पर 10,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज आगे किसी भी शेष धोने बफर संदूषक को त्यागने के लिए।
    15. ध्यान से एक 1.5 mL ट्यूब में स्तंभ हस्तांतरण.
    16. DNase / RNase मुक्त पानी के 20 μL सीधे कॉलम मैट्रिक्स के केंद्र में जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    17. DNase / RNase-मुक्त पानी का एक अतिरिक्त 10 μL सीधे कॉलम मैट्रिक्स के केंद्र में जोड़ें और 30 s के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    18. एक spectrophotometer के साथ कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें।
      नोट: आरएनए निष्कर्षण किसी भी विधि के साथ किया जा सकता है, यदि पुनर्प्राप्त आरएनए की गुणवत्ता उच्च है, तो आरएनए अखंडता / गुणवत्ता संख्या 9 > के साथ। कुल आरएनए को आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. पॉली द्वारा mRNA अलगाव-Oligo (dT) 25 के साथ एक चयन

नोट: सेलुलर अर्क में अत्यधिक मेथिलेटेड राइबोसोमल आरएनए की उपस्थिति के कारण, पॉली-ए आरएनए को या तो आरआरएनए की कमी या पॉली-ए सकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिकता से अलग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। यह चरण वैकल्पिक है और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए केवल सेलुलर आरएनए नमूनों के लिए किया जाना चाहिए। यदि गैर-पॉली-एडेनिलेटेड वायरल आरएनए के मिथाइलेशन का विश्लेषण करते हैं, तो पॉली-ए चयन के बजाय आरआरएनए की कमी का पक्ष लें या अंततः कुल आरएनए पर विश्लेषण करें।

  1. पाली-ए कैप्चर के लिए मनका तैयारी
    1. oligo (dT)25 चुंबकीय मोती स्टॉक शीशी >30 s के लिए भंवर द्वारा पुन: निलंबित.
    2. चुंबकीय मोतियों के 200 μL को 1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें। संसाधित किए जाने वाले आरएनए नमूनों की कुल मात्रा के अनुसार चुंबकीय मोतियों के साथ ट्यूबों की संख्या तैयार करें।
      नोट: डायनाबीड स्टॉक समाधान के 200 μL के साथ एक ट्यूब मोती के 1 मिलीग्राम से मेल खाती है और कुल आरएनए के 75 μg के नमूने को समायोजित कर सकती है।
    3. 1 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूबों को रखें और supernatant को छोड़ दें। चुंबक से ट्यूबों को हटा दें।
    4. बाइंडिंग बफर (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA) के 1 mL जोड़ें, और भंवर द्वारा resuspend। 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों जगह और supernatant त्याग. चुंबक से ट्यूबों को हटा दें। दोहराना।
    5. बाइंडिंग बफर के 100 μL में धोए गए चुंबकीय मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  2. कुल आरएनए तैयारी
    1. RNase मुक्त पानी के साथ 0.75 μg / μL की अंतिम एकाग्रता पर कुल आरएनए को पतला करें, जो 75 μg / 100 μL से मेल खाती है।
      नोट:: यदि RNA कम सांद्रता पर है, तो वॉल्यूम को संशोधित किए बिना नीचे वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
    2. प्रति ट्यूब आरएनए नमूने के 100 μL वितरण द्वारा कई ट्यूबों में कुल आरएनए को एलीकोट करें।
    3. प्रत्येक आरएनए नमूने के लिए बाइंडिंग बफर के 100 μL जोड़ें।
    4. माध्यमिक संरचनाओं को बाधित करने के लिए कुल आरएनए को 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    5. अगले चरण पर आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर तुरंत रखें।
      नोट: इनक्यूबेशन समय संसाधित किए जाने वाले नमूनों की संख्या के अनुसार भिन्न हो सकता है, लेकिन किसी भी आरएनए गिरावट से बचने के लिए 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।
  3. पॉली-ए चयन
    1. प्रत्येक आरएनए ट्यूब (चरण 3.2 से) के लिए, धोए गए चुंबकीय मोतियों के 100 μL जोड़ें (चरण 3.1 से)।
    2. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक घूर्णन पहिया पर बाध्यकारी की अनुमति दें।
    3. सभी ट्यूबों को खोलें, उन्हें 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें, और ध्यान से सभी supernatant को हटा दें।
    4. एक नई ट्यूब में supernatant पुनर्प्राप्त करें और आरएनए कैप्चर (चरण 3.3.14) के दूसरे दौर के लिए एक तरफ रखें, ताकि पॉली-ए अंतिम वसूली में सुधार किया जा सके।
    5. चुंबक से ट्यूब निकालें और धोने बफर के 200 μL जोड़ें (10 mM Tris-HCl, पीएच 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA). 4 से 5 बार सावधानी से पिपेट करके मिलाएं।
    6. 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब रखें और supernatant त्याग.
    7. धोने के चरण को एक बार दोहराएं (चरण 3.3.5 और 3.3.6 को दोहराएं)।
    8. मोतियों से पॉली-ए आरएनए को एल्यूट करने के लिए बर्फ-ठंडे 10 mM Tris-HCl के 20 μL जोड़ें।
    9. 2 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    10. चुंबक पर ट्यूब जगह और जल्दी से एक नई RNase मुक्त ट्यूब के लिए पॉली-ए आरएनए युक्त supernatant हस्तांतरण. ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    11. उपज को बढ़ाने के लिए क्षालन चरण (चरण 3.3.8 से 3.3.10) को दोहराएँ।
    12. धोने बफर के 200 μL के साथ एक ही मोती एक बार धो लें। 4 से 5 बार सावधानी से पिपेट करके मिलाएं।
    13. 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें और वॉशिंग बफर को छोड़ दें।
    14. मोतियों के लिए चरण 3.3.4 से flowthrough जोड़ें और क्षालन के लिए बाध्यकारी से प्रक्रिया को दोहराएँ (चरण 3.3.2 से 3.3.10)। आरएनए eluates अभी के लिए अलग ट्यूबों में रखें।
      नोट:: वैकल्पिक रूप से, फिर से supernatant चरण 3.3.4 के बराबर एक नई ट्यूब में रखें क्योंकि इसे एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है। प्रक्रिया के अंत में, इथेनॉल वर्षा द्वारा या पसंद की एक स्तंभ-आधारित विधि (यानी, आरएनए स्वच्छ और सांद्रक) के साथ आरएनए को शुद्ध और केंद्रित करें। यह नमूना एक पॉली-ए-समाप्त आरएनए नमूने से मेल खाता है और इसका उपयोग बिसल्फाइट रूपांतरण (चरण 8.2.2) के लिए एक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।
    15. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ एल्यूटेड आरएनए को मापें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए 2 μL ऐलीकोट रखें।
      नोट: पॉली-ए आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर तब तक संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आवश्यकता न हो।

4. आरएनए वर्कफ़्लो

  1. सेलुलर पॉली-ए आरएनए (एमआरएनए) और वायरल आरएनए नमूनों को 2 एलीकोट में विभाजित करें, जो संबंधित एपिट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण पाइपलाइन को समर्पित है:
    (i) सेलुलर mRNA के 5 μg या MeRIP-Seq और इनपुट नियंत्रण के लिए वायरल RNA के 1 μg (चरण 5 से 7, और चरण 9 पर जाएं)।
    (ii) बीएस-सेक के लिए सेलुलर एमआरएनए का 1 μg या वायरल आरएनए का 500 एनजी (चरण 8 और 9 पर जाएं)।

5. आरएनए विखंडन

नोट: आरएनए विखंडन आरएनए विखंडन अभिकर्मक के साथ किया जाता है और MeRIP-Seq और आरएनए नमूनों को नियंत्रित करने के लिए अभिप्रेत है। यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है कि 100-200 nt के बीच रेंज के टुकड़े प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता है।

  1. mRNA के कुल आयतन को 0.2 mL PCR ट्यूबों में विभाजित करें, जिसमें mRNA/tube का 18 μL है।
    नोट: जल्दी से काम करें। पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए एक समय में 8 से अधिक नमूनों के साथ काम न करें। वॉल्यूम को स्केल करने से एक पुन: प्रस्तुत करने योग्य और समान विखंडन की गारंटी नहीं होगी।
  2. 70 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोसाइकिलर को गर्म करें।
  3. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के किनारे पर विखंडन अभिकर्मक के 2 μL जोड़ें।
  4. ट्यूब को बंद करें और नीचे स्पिन करें (ताकि अभिकर्मक 8 ट्यूबों के लिए एक ही समय में आरएनए के संपर्क में आ जाए)।
  5. पहले से गर्म thermocycler में 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट नमूनों incubate.
  6. जैसे ही इनक्यूबेशन खत्म हो जाता है, प्रत्येक ट्यूब में स्टॉप समाधान के 2 μL को जल्दी से जोड़ें।
  7. नीचे स्पिन करें और अगले चरण पर आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर बैठें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय संसाधित किए जाने वाले नमूनों की संख्या के अनुसार भिन्न हो सकता है, लेकिन किसी भी आरएनए गिरावट से बचने के लिए 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।
  8. सभी नमूनों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं (यदि 8 से अधिक एलीकोट हैं)।
  9. ट्यूबों को एक साथ पूल करें और एक आरएनए क्लीन और कंसंट्रेटर किट (चरण 6) या किसी भी अनुकूलित कॉलम-आधारित किट के साथ आरएनए शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ें ताकि बफर से छुटकारा मिल सके और पानी में साफ खंडित आरएनए को पुनर्प्राप्त किया जा सके।

6. आरएनए शुद्धिकरण

नोट: इस चरण को इथेनॉल वर्षा द्वारा या किसी भी प्रकार के कॉलम-आधारित आरएनए शुद्धिकरण और एकाग्रता विधि (यानी, आरएनए क्लीन और कंसंट्रेटर) के साथ किया जा सकता है।

  1. DNase /RNase-मुक्त पानी के 50-75 μL की कुल मात्रा में शुद्ध आरएनए को एल्यूट या फिर से निलंबित कर दिया।
    नोट:: यदि कोई स्तंभ-आधारित विधि का उपयोग किया जाता है, तो अधिकतम पुनर्प्राप्ति सुनिश्चित करने के लिए क्षालन के दो दौर दृढ़ता से अनुशंसित हैं।
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध खंडित एमआरएनए को मापें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें।
  3. पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए इनपुट नियंत्रण के रूप में खंडित mRNA के 100 ng रखें (चरण 9 पर जाएं)। शेष खंडित mRNA (न्यूनतम 2.5 μg) MeRIP के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चरण 7.2 पर जाएँ)।

7. MeRIP

नोट: प्रत्येक immunoprecipitation (आईपी) के लिए खंडित mRNA के न्यूनतम 2.5 μg की आवश्यकता होती है, या तो एक विशिष्ट एंटी-m6A एंटीबॉडी (परीक्षण की स्थिति) का उपयोग करके या एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी (नकारात्मक नियंत्रण) का उपयोग करके।

  1. चुंबकीय मनका Immunoprecipitation के लिए तैयारी
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, 3.2 मिलीलीटर न्यूक्लिएज-मुक्त पानी के साथ 3.2 मिलीलीटर के साथ mRNA IP बफर 5x (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 750 mM NaCl, 0.5% Igepal CA-630, और न्यूक्लिएज-मुक्त पानी) के 800 μL को पतला करके एक नई शंक्वाकार ट्यूब में 1x IP बफर के 4 mL तैयार करें।
      नोट: कम से कम 2 प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता है (एक परीक्षण और एक IgG नियंत्रण)।
    2. ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    3. वांछित आईपी प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की उचित संख्या को लेबल करें:
      एंटी-एम 6 ए एंटीबॉडी के लिए एन ट्यूब (परीक्षण)।
      सामान्य माउस IgG के लिए एन ट्यूब (नकारात्मक नियंत्रण).
    4. चुंबकीय मोतियों (जैसे, Magna CHIP प्रोटीन ए / जी) को उलटा और भंवर द्वारा फिर से निलंबित कर दिया। मोतियों का कोई झुरमुट दिखाई नहीं देना चाहिए।
    5. प्रत्येक प्रतिक्रिया की योजना के लिए, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चुंबकीय मोतियों के 25 μL स्थानांतरित करें।
    6. उपयोग किए गए मोतियों की मूल मात्रा के संबंध में दस गुना अधिक 1x आईपी बफर (चरण 7.1.1 से) जोड़ें (यानी, चुंबकीय मोतियों के प्रति 25 μL प्रति 25 μL 1x IP बफर के 250 μL)।
    7. पूर्ण resuspension के लिए धीरे से ऊपर और नीचे कई बार pipetting द्वारा मोतियों मिश्रण.
    8. ट्यूब को चुंबकीय विभाजक पर 1 मिनट के लिए रखें।
    9. निकालें और supernatant त्याग, सुनिश्चित करें कि किसी भी चुंबकीय मोतियों aspirate नहीं करने के लिए। चुंबक से ट्यूब निकालें।
    10. धोने के चरण को दोहराएँ (चरण 7.1.6 से 7.1.9)।
    11. चुंबकीय मोतियों की मूल मात्रा के प्रति 25 μL प्रति 1x IP बफर के 100 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    12. चुंबकीय मोतियों की मूल मात्रा के प्रति 25 μL प्रति एंटीबॉडी (1 μg / μL) के 5 μL जोड़ें।
      एंटी-एम 6 ए एंटीबॉडी (क्लोन 17-3-4-1) [1 μg / μL] के साथ एन ट्यूब (परीक्षण)।
      सामान्य माउस IgG (1 μg/ μL) के साथ n ट्यूब (ऋणात्मक नियंत्रण).
    13. चुंबकीय मोतियों के साथ एंटीबॉडी के संयुग्मन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए घूर्णन पहिया पर इनक्यूबेट करें।
    14. ट्यूब को चुंबकीय विभाजक पर 1 मिनट के लिए रखें। supernatant को छोड़ दें। चुंबक से ट्यूब निकालें और 1x आईपी बफर के 100 μL में एंटीबॉडी मनका मिश्रण resuspend.
  2. आरएनए Immunoprecipitation (RIP)
    1. प्रत्येक 2.5 μg mRNA नमूने के लिए RIP प्रतिक्रिया मिश्रण के 500 μL को निम्नानुसार तैयार करें: खंडित आरएनए के 100 μL में 2.5 μg (चरण 6.12 से); न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 295 μL; 40 U/μL RNase Inhibitor के 5 μL; और 5x आईपी बफर के 100 μL.
    2. प्रत्येक एंटीबॉडी-मनका मिश्रण में आरआईपी प्रतिक्रिया मिश्रण के 500 μL जोड़ें (~ चरण 7.1.14 से ~ 100 μL)। मोतियों को पूरी तरह से पुन: निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे कई बार पिपेटिंग करके मिलाएं। बर्फ पर रखें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर सभी आरआईपी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    4. कैप और ट्यूब पक्षों से तरल बूंदों को नीचे स्पिन करने के लिए MeRIP प्रतिक्रियाओं को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूबों को 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर रखें।
    5. एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में supernatant स्थानांतरण, सावधान चुंबकीय मोतियों को परेशान नहीं किया जा रहा है.
      नोट:: Flowthrough RIP दक्षता सत्यापित करने के लिए नियंत्रण के रूप में रखा जा सकता है (चरण 7.3.9 पर जाएँ)।
    6. चुंबक से ट्यूबों को निकालें। ठंडे 1x आईपी बफर के 500 μL जोड़कर मोतियों को धोएं। मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए कई बार धीरे-धीरे पिपेटिंग करके मोतियों को मिलाएं।
    7. 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर ट्यूबों को रखें और supernatant को छोड़ दें।
    8. धोने की प्रक्रिया को दोहराएं (चरण 7.2.6-7.2.7) कुल 3 धोने के लिए दो बार।
    9. ट्यूबों को बर्फ पर रखें और तुरंत क्षालन के लिए आगे बढ़ें।
  3. क्षालन
    1. न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 1.3 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम N6-Methyladenosine, 5'-monophosphate सोडियम नमक (m6A) को भंग करके 20 mM m6A समाधान तैयार करें। 150 μL ऐलीकोट तैयार करें और -20 °C पर स्टोर करें।
    2. प्रत्येक नमूने (परीक्षण और नियंत्रण) के लिए: निम्नलिखित घटकों को मिलाकर 225 μL क्षालन बफर तैयार करें: 5x IP बफर के 45 μL, 20 mM m6A के 75 μL, 40U / μL RNase Inhibitor के 3.5 μL, और न्यूक्लिएज-मुक्त पानी के 101.5 μL।
    3. मोतियों (चरण 7.2.9 से) के लिए (चरण 7.3.2 से) क्षालन बफर के 100 μL जोड़ें। पूरी तरह से फिर से निलंबित मोतियों के लिए कई बार धीरे-धीरे पिपेटिंग करके मिलाएं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर लगातार मिलाते हुए 1 ज के साथ सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    5. कैप और ट्यूब पक्षों से तरल बूंदों को नीचे स्पिन करने के लिए आरआईपी प्रतिक्रियाओं को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूबों को 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर रखें।
    6. एक नए 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए eluted आरएनए टुकड़े युक्त supernatant स्थानांतरण। ध्यान रखें कि मोतियों को एस्पिरेट न करें, क्योंकि यह पृष्ठभूमि शोर को बढ़ाएगा।
    7. फिर से 100 μL क्षालन बफर को जोड़कर, 4 °C पर 1 h incubating, और चुंबकीय अलगाव के बाद eluate इकट्ठा करके क्षालन चरणों (7.3.3 से 7.3.6) को दोहराएं।
    8. एक ही नमूने से सभी eluates गठबंधन (कुल क्षालन मात्रा 200 μL होना चाहिए).
    9. इथेनॉल वर्षा द्वारा या पसंद की एक स्तंभ-आधारित विधि (यानी, आरएनए क्लीन और कंसंट्रेटर) द्वारा एल्यूटेड आरएनए और फ्लोथ्रू (वैकल्पिक, चरण 7.2.5 से) को शुद्ध करें।
    10. एक उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने किट का उपयोग कर एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए मात्रा और flowthrough और eluted नमूनों की गुणवत्ता का आकलन करें। यदि आरएनए की गुणवत्ता संतोषजनक है, तो पुस्तकालय की तैयारी और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (चरण 9) पर आगे बढ़ें।
      नोट: MeRIP पर पुनर्प्राप्त आरएनए की मात्रा बहुत कम है, और अनिवार्य रूप से परिमाणीकरण सुनिश्चित करने के लिए उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने किट की आवश्यकता होती है। यदि कोई बायोएनालिजर उपलब्ध नहीं है, तो पुस्तकालय की तैयारी के लिए आंख मूंदकर आगे बढ़ना संभव है।

8. आरएनए Bisulfite रूपांतरण

  1. नियंत्रण और अभिकर्मक तैयारी
    1. ईआरसीसी मिश्रण स्पाइक-इन नियंत्रण: निर्माता के निर्देशों के बाद ईआरसीसी मिश्रण जोड़ें, जो एमआरएनए के 500 एनजी के लिए 0.5 μL अनडिल्यूटेड ईआरसीसी मिश्रण के अतिरिक्त की सिफारिश करते हैं। यह नियंत्रण बिसल्फाइट रूपांतरण की दक्षता का आकलन करने में मदद कर सकता है।
    2. स्पाइक पॉली-ए-समाप्त आरएनए (चरण 3.3.14 से) 1/1000 के अनुपात में (यानी, एमआरएनए के 500 एनजी के लिए पॉली-ए-समाप्त आरएनए के 500 पीजी)। यह नमूना राइबोसोमल आरएनए में समृद्ध है और इस प्रकार इसमें 28 एस आरआरएनए होना चाहिए, जो बिसल्फाइट रूपांतरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण है।
      नोट: कुल आरएनए का उपयोग पॉली-ए-समाप्त आरएनए के बजाय सकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी किया जा सकता है।
    3. एक आरएनए मिथाइलेशन किट (जैसे, Zymo EZ) के साथ bisulfite रूपांतरण निष्पादित करें।
    4. आरएनए वॉश बफर: उपयोग से पहले आरएनए वॉश बफर ध्यान के 12 एमएल में 100% इथेनॉल (या 95% इथेनॉल का 52 एमएल) के 48 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. Bisulfite रूपांतरण
    नोट: बिसल्फाइट रूपांतरण एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए बिसल्फाइट रूपांतरण किट के साथ किया गया था, जैसा कि नीचे बताया गया है निर्माता की प्रक्रिया का पालन किया गया था।
    1. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में, 1000 एनजी एमआरएनए (या 300 और 1000 एनजी के बीच) जोड़ें। स्पाइक-इन नियंत्रण जोड़ें: ईआरसीसी मिश्रण के 1 μL (चरण 8.1.1) और पॉली-ए-समाप्त आरएनए के 1000 पीजी (चरण 8.1.2)। DNase / RNase मुक्त पानी के साथ 20 μL तक की पूरी मात्रा।
    2. प्रत्येक 20 μL आरएनए नमूने के लिए आरएनए रूपांतरण अभिकर्मक के 130 μL जोड़ें।
    3. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूना मिश्रण.
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में नीचे स्पिन करें कि ट्यूब की टोपी या किनारों में कोई बूंदें नहीं हैं।
    5. पीसीआर ट्यूबों को एक थर्मल साइकलर में रखें और निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें: 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण; 45 मिनट के लिए 54 डिग्री सेल्सियस पर रूपांतरण; कुल 3 चक्रों के लिए विकृतीकरण और रूपांतरण चरणों को दोहराएँ; और फिर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
      नोट: विकृतीकरण और bisulfite रूपांतरण के तीन चक्र नमूने के पूर्ण bisulfite रूपांतरण सुनिश्चित करते हैं। नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या सीधे संसाधित किया जा सकता है।
    6. इन-कॉलम डीसल्फोनेशन के साथ आगे बढ़ें। एक खाली संग्रह ट्यूब में एक स्तंभ रखें और स्तंभ के लिए आरएनए बाइंडिंग बफ़र के 250 μL जोड़ें।
    7. नमूना लोड (~ 150 μL से चरण 8.2.5 से) आरएनए बाइंडिंग बफर युक्त स्तंभ में और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण.
    8. स्तंभ में नमूना-आरएनए बाइंडिंग बफर मिश्रण के लिए 95-100% इथेनॉल के 400 μL जोड़ें। कैप को बंद करें और तुरंत कॉलम को कई बार उलटकर मिलाएं।
    9. 30 s के लिए पूर्ण गति (≥ 10,000 x g) पर सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें.
    10. कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 200 μL जोड़ें और 30 s के लिए पूर्ण गति से सेंट्रीफ्यूज करें।
    11. कॉलम के लिए आरएनए Desulphonation बफर के 200 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, 30 सेकंड के लिए पूर्ण गति से सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें.
    12. कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 400 μL जोड़ें और 30 s के लिए पूर्ण गति से सेंट्रीफ्यूज करें। आरएनए वॉश बफ़र के अतिरिक्त 400 μL के साथ धोने के चरण को दोहराएँ। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें.
    13. 2 मिनट के लिए पूर्ण गति से खाली संग्रह ट्यूब में स्तंभ सेंट्रीफ्यूज. एक RNase मुक्त ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरण.
    14. कॉलम मैट्रिक्स ≥ सीधे DNase / RNase मुक्त पानी के 10 μL जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 30 s के लिए पूर्ण गति से centrifuge.
      नोट: हम आमतौर पर 20 μL की मात्रा में elute. एल्यूटेड आरएनए का तुरंत उपयोग किया जा सकता है या 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    15. आरएनए गुणवत्ता और मात्रा के टुकड़ा विश्लेषक मूल्यांकन के लिए 2.5 μL निकालें और पुस्तकालय की तैयारी और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (चरण 9) के लिए आगे बढ़ें।
    16. दक्षता के bisulfite रूपांतरण नियंत्रण के लिए परिवर्तित आरएनए के 4 μL ले लो (चरण 8.3).
  3. आरटी-पीसीआर द्वारा बिसल्फाइट रूपांतरण नियंत्रण
    नोट:: यह चरण सुनिश्चित करता है कि bisulfite रूपांतरण अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ने से पहले सफल था। होमो सेपियन्स से 28एस राइबोसोमल आरएनए का उपयोग आरएनए मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाएगा, क्योंकि स्थिति 4447 (जेनबैंक परिग्रहण # NR_003287) पर सी अवशेषों को 100% मेथिलेटेड होने के रूप में वर्णित किया गया है।
    प्राइमर अनुक्रम:
    एच 28SF प्राइमर: 5'-GGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGG-3'
    एच 28SR प्राइमर: 5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
    1. एक उच्च क्षमता cDNA रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग कर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। बर्फ पर किट घटकों को पिघलाएं और बर्फ पर आरटी मास्टर मिश्रण तैयार करें जैसा कि निम्नानुसार है:
      Bisulfite के 4 μL परिवर्तित आरएनए (चरण 8.2.14 से):
      10xRT बफर के 2 μL
      25x dNTP मिश्रण के 0.8 μL [100 mM]
      10x RT रैंडम प्राइमरों के 2 μL
      MultiScribe रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 μL
      RNase Inhibitor के 1 μL
      न्यूक्लिएज मुक्त H2O के 9.2 μL
      नोट: प्रत्येक RT प्रतिक्रिया में 0.2 mL PCR ट्यूबों में 20 μL अंतिम मात्रा होनी चाहिए।
    2. निम्नलिखित आरटी कार्यक्रम के साथ थर्मल साइकलर में ट्यूबों को रखो: 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस; 120 मिनट के लिए 37 °C; 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस; फिर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. पीसीआर प्रूफरीडिंग एंजाइम के साथ विशेष रूप से 28 एस आरआरएनए को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें। बर्फ, धीरे भंवर और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज पर किट घटकों को पिघलाएं। बर्फ पर या बर्फ-ठंडे धातु प्लेट धारक पर पीसीआर मास्टर मिश्रण को निम्नानुसार तैयार करें:
      10 μM H 28SF प्राइमर का 0.6 μL
      10 μM H 28SF प्राइमर का 0.6 μL
      टेम्पलेट cDNA के 6.5 μL
      डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण के 22.5 μL
      नोट: प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में 20 μL अंतिम मात्रा होनी चाहिए।
    4. निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम के साथ थर्मल साइकलर में ट्यूबों को रखें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; विकृतीकरण के 45 चक्र (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस), एनीलिंग (30 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस), और बढ़ाव (15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस), 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम बढ़ाव, और फिर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ना।
    5. एक 2% agarose जेल पर प्रतिक्रिया के 10 μL चलाएँ. अपेक्षित बैंड का आकार 130 - 200 बीपी है।
  4. PCR उत्पादों का अनुक्रमण
    1. एंजाइमों और dNTP अवशेषों को हटाने के लिए पसंद की एक स्तंभ आधारित विधि के साथ पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें और DNase / RNase मुक्त पानी के कम से कम 20 μL में प्रवर्धित डीएनए को बाहर निकालें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध डीएनए को मापें।
    3. अनुक्रमण प्रतिक्रिया
      1. पीसीआर उत्पाद / अनुक्रमण प्रतिक्रिया के 40 एनजी का उपयोग करें।
      2. H 28SF और H 28SR प्राइमरों के साथ दोनों दिशाओं में अनुक्रम।
      3. अनुक्रमों को ज्ञात गैर-कनवर्ट किए गए अनुक्रम (28S राइबोसोमल N5 (RNA28SN5) के साथ संरेखित करें. स्थिति C4447 पर एक सी अवशेषों की उपस्थिति के लिए जाँच करें, और कहीं और सी के बजाय टी अवशेषों के लिए।

9. पुस्तकालय की तैयारी और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण

  1. MRNA किट (जैसे, Illumina TruSeq फंसे हुए) का उपयोग करके अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार करें, Elute-Prime-Fragment चरण पर प्रोटोकॉल शुरू करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    1. हालांकि, इनपुट RNA-Seq और MeRIP-Seq नमूनों के लिए, नमूनों को 80 °C पर 2 मिनट के लिए केवल प्राइम के लिए इनक्यूबेट करें, लेकिन उन्हें आगे टुकड़ा न करें।
  2. Illumina प्लेटफार्मों का उपयोग कर अनुक्रमण बाहर ले जाएँ. अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं को वरीयताओं और प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार किया जा सकता है, या तो एकल या युग्मित छोर, न्यूनतम 100 एनटी लंबाई के साथ।

10. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

  1. m6A डेटा प्रोसेसिंग
    1. M6A में पढ़ने की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए FASTQC24 चलाएँ और अनुक्रमण से FASTQ फ़ाइलों को इनपुट करें।
    2. पढ़ने से कम गुणवत्ता वाले अंत और एडाप्टर अनुक्रमों को ट्रिम करने के लिए Atropos25 चलाएँ। एट्रोपोस चलाने में निम्न पैरामीटर सेट करें।
      1. निम्न एडाप्टर अनुक्रमों को निकालें: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT।
      2. निम्न Phred गुणवत्ता कटऑफ का उपयोग करें: 5, निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में कम गुणवत्ता वाले सिरों को ट्रिम करने के लिए (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html).
      3. ट्रिमिंग के बाद निम्न न्यूनतम पठन लंबाई का उपयोग करें: 25 आधार जोड़े।
    3. GRh38 मानव जीनोम और एचआईवी [एकीकृत रैखिक pNL4-3Env-GFP] संदर्भ को FASTA प्रारूप में मर्ज करें।
    4. HISAT226 के साथ मर्ज किए गए संदर्भ को अनुक्रमित करें.
    5. अनुक्रमित संदर्भ में संरेखित करने के लिए छंटनी की गई पठन पर HISAT2 चलाएँ। डिफ़ॉल्ट HISAT पैरामीटर का उपयोग करें।
    6. सॉर्ट करें और संरेखित अनुक्रमणिका SAMtools27 के साथ पढ़ता है.
    7. अनुक्रमित पुस्तकालयों के बाद संरेखण गुणवत्ता की जाँच के लिए SAMtools स्टेट और Qualimap 228 चलाएँ।
    8. वैकल्पिक रूप से, multiQC29 के साथ पिछले चरण से गुणवत्ता उपायों को इकट्ठा और सारांशित करें।
    9. एचआईवी जीनोम में 5 'एलटीआर और 3' एलटीआर में होमोलोगस 634 बीपी अनुक्रम हैं: रियलिग्न मल्टीमैपिंग 5 'एलटीआर से एसएएमटीओल्स के साथ संबंधित 3 'एलटीआर क्षेत्र में पढ़ता है।
    10. M6A चोटियों की पहचान करने के लिए, पीक कॉलिंग सॉफ़्टवेयर MACS230 (v 2.1.2) चलाएं। ध्यान से MACS2 चल रहे पैरामीटर का चयन करें, ताकि RNA-Seq डेटा पर सही कामकाज सुनिश्चित किया जा सके क्योंकि पीक कॉलिंग जीन अभिव्यक्ति स्तर से प्रभावित हो सकती है, और छोटे एक्सोन को चोटियों के रूप में गलत कहा जा सकता है। इसलिए, इनपुट सिग्नल को m6A सिग्नल से घटाया जाना चाहिए, बिना MACS2 द्वारा नियमित रूप से डीएनए आधारित डेटा पर लागू किए गए स्मूथिंग के बिना। MACS2 से 'callpeak' उप-आदेश के लिए निम्न पैरामीटर लागू करें:
      -keep-dup ऑटो (डुप्लिकेट पढ़ने की ओर MACS2 व्यवहार को नियंत्रित करता है, 'ऑटो' MACS को पी-वैल्यू कटऑफ के रूप में 1e-5 का उपयोग करके द्विपद वितरण के आधार पर सटीक उसी स्थान पर पढ़ने की अधिकतम संख्या की गणना करने की अनुमति देता है)
      -g 2.7e9 (बीपी में मानव जीनोम का आकार)
      -q 0.01 (महत्वपूर्ण चोटियों को कॉल करने के लिए न्यूनतम FDR कटऑफ)
      -nomodel (शिफ्टिंग मॉडल, जो CHIP-Seq प्रयोगों के लिए सिलवाया जाता है के निर्माण बाईपास करने के लिए)
      -slocal 0
      -llocal 0 (यह और 0 करने के लिए पिछले पैरामीटर की स्थापना MACS2 सीधे घटाने के लिए अनुमति देता है, चिकनाई के बिना, इनपुट m6A से पढ़ता है पढ़ता है)
      -extsize 100 (बीपी में टुकड़ों की औसत लंबाई)
      -B
    11. विभेदक चोटी MACS2 के उप-कमांड कॉल, 'bdgdiff' संक्रमित बनाम गैर संक्रमित नमूनों की तुलना करने के लिए चलाएँ। 'bdgdiff' इनपुट के रूप में पिछले चरण में 'callpeak' द्वारा उत्पन्न bedGraph फ़ाइलों के रूप में लेता है. प्रत्येक समय बिंदु के लिए, 'bdgdiff' के साथ संक्रमित बनाम गैर-संक्रमित नमूनों की तुलना चलाएं, m6A सिग्नल से संबंधित इनपुट सिग्नल को घटाएं और अतिरिक्त पैरामीटर प्रदान करें: -g 60 -l 120।
  2. m5C डेटा प्रोसेसिंग
    1. Cutadapt31 चलाएँ निम्न पैरामीटर के साथ, कच्चे पठन से एडाप्टर अनुक्रम ट्रिम करने के लिए:
      एडाप्टर "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC"
      -न्यूनतम लंबाई = 25.
    2. रिवर्स-पूरक seqkit32 का उपयोग करके छंटनी की गई पढ़ता है, क्योंकि अनुक्रमण प्रोटोकॉल रिवर्स स्ट्रैंड से पढ़ता है।
    3. पढ़ने की गुणवत्ता की जांच करने के लिए FastQC चलाएँ।
    4. GRh38 मानव जीनोम और एचआईवी [एकीकृत रैखिक pNL4-3Env-GFP] FASTA प्रारूप में संदर्भ मर्ज करें।
    5. meRanTK package33 से अनुप्रयोग meRanGh के साथ मर्ज किए गए संदर्भ को अनुक्रमित करें।
    6. निम्न पैरामीटर के साथ meRanGh के साथ संरेखित करें:
      -UN को सक्षम करने के लिए unmapped पढ़ता है आउटपुट फ़ाइलों के लिए लिखा जा करने के लिए
      -MM सक्षम बहु-मैप किया गया पढ़ता है आउटपुट फ़ाइल के लिए लिखा जा करने के लिए
      bedGraph में आउटपुट के लिए -bg
      -mbgc 10 फ़िल्टर कवरेज द्वारा क्षेत्र की सूचना दी (कवरेज के कम से कम 10 पढ़ता है)
    7. एचआईवी जीनोम में 5 'एलटीआर और 3' एलटीआर में होमोलोगस 634 बीपी अनुक्रम होते हैं: एसएएमटीओएलएस के साथ संबंधित 3 'एलटीआर क्षेत्र में 5 'एलटीआर से मल्टीमैपिंग पढ़ता है।
    8. चलाएँ मिथाइलेशन meRanCall उपकरण के माध्यम से बुला, meRanTK द्वारा प्रदान की, निम्नलिखित मापदंडों के साथ:
      -rl = 126, पढ़ने की लंबाई
      -ei = 0.1, मेथिलिकरण दर p-मान गणना के लिए त्रुटि अंतराल
      -cr = 0.99, अपेक्षित रूपांतरण
    9. प्रत्येक नमूने के आकार कारकों का अनुमान लगाने के लिए MeRanTK की उपयोगिता estimateSizeFactors.pl चलाएँ। आकार कारकों को अगले चरण में पैरामीटर के रूप में उपयोग किया जाएगा।
    10. समय बिंदु 12, 24, और 36h में गैर-संक्रमित बनाम संक्रमित बनाम के विभेदक मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए MeRanCompare चलाएँ। निम्न पैरामीटर लागू किए जाते हैं: पिछले चरण से रिपोर्टिंग और आकार कारकों के लिए न्यूनतम थ्रेशोल्ड के रूप में .01 का एक महत्व मान.

Representative Results

यह वर्कफ़्लो एचआईवी संक्रमण के संदर्भ में m6A और m5C मिथाइलेशन की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोगी साबित हुआ है। इसके लिए, हमने एक सीडी 4 + टी सेल लाइन मॉडल (SupT1) का उपयोग किया जिसे हम या तो एचआईवी से संक्रमित करते हैं या अनुपचारित छोड़ देते हैं। हमने प्रति शर्त 50 मिलियन कोशिकाओं के साथ वर्कफ़्लो शुरू किया और 10 की आरएनए गुणवत्ता संख्या (चित्रा 1ए-बी) के साथ कुल आरएनए के 500 μg का औसत प्राप्त किया। पॉली-ए चयन पर हमने प्रति स्थिति (कुल आरएनए के लगभग 2% का प्रतिनिधित्व करते हुए) (चित्रा 1 बी) के 10 और 12 μg के बीच mRNA को पुनः प्राप्त किया। इस बिंदु पर, हमने MeRIP-Seq पाइपलाइन के लिए पॉली-ए-चयनित आरएनए के 5 μg और BS-Seq पाइपलाइन के लिए 1 μg का उपयोग किया। चूंकि एचआईवी आरएनए पॉली-एडेनिलेटेड है, इसलिए आगे की कार्रवाई की आवश्यकता नहीं है और MeRIP-Seq और BS-Seq प्रक्रियाओं को सीधे लागू किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आरएनए तैयारी। A) एक साथ MeRIP-Seq और BS-Seq पाइपलाइनों के लिए RNA तैयारी और वितरण को दर्शाने वाला वर्कफ़्लो. प्रत्येक भरा हुआ हेक्सागोनल आकार एक आरएनए संशोधन प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है, जैसे कि m6A (हरा) या m5C (गुलाबी)। प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक आरएनए सामग्री की मात्रा इंगित की जाती है। बी) कुल आरएनए निष्कर्षण (ऊपरी पैनल) और पॉली-ए चयन (निचले पैनल) पर अपेक्षित आरएनए वितरण प्रोफाइल (आकार और राशि) को दर्शाने वाले प्रतिनिधि परिणाम। नमूनों को विशिष्ट MeRIP-Seq और BS-Seq प्रक्रियाओं में प्रवेश करने से पहले आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए मानक संवेदनशीलता किट के साथ टुकड़ा विश्लेषक पर लोड किया गया था। RQN: आरएनए गुणवत्ता संख्या; nt: न्यूक्लियोटाइड्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

MeRIP-Seq पाइपलाइन एक आरएनए immunoprecipitation-आधारित तकनीक है जो आरएनए अणुओं के साथ m6A संशोधन की जांच की अनुमति देती है। इसके लिए, आरएनए को पहले खंडित किया जाता है और फिर एम 6 ए-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो इम्यूनोप्रिसिपेशन और कैप्चर के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ युग्मित होता है। MeRIP-समृद्ध आरएनए टुकड़े और अछूता (इनपुट) अंश तब अनुक्रमित होते हैं और m6A-संशोधित आरएनए क्षेत्रों की पहचान करने के लिए तुलना की जाती है और इस प्रकार m6A-methylated टेप (चित्रा 2A)। तकनीक का संकल्प आरएनए विखंडन की दक्षता पर निर्भर करता है। दरअसल, छोटे टुकड़े m6A अवशेषों के अधिक सटीक स्थानीयकरण के लिए अनुमति देते हैं। यहां, सेलुलर पॉली-ए-चयनित आरएनए और वायरल आरएनए को 100-150 एनटी के आरएनए टुकड़े प्राप्त करने के लिए 20 μL अंतिम मात्रा में 15 मिनट के दौरान आरएनए विखंडन बफर के साथ आयन-आधारित विखंडन के अधीन किया गया था। एमआरएनए के 5 μg के साथ शुरू करते हुए, हमने खंडित आरएनए के 4.5 μg को पुनर्प्राप्त किया, जो 90% (चित्रा 2B) की वसूली दर के अनुरूप है। हमने इनपुट नियंत्रण के रूप में खंडित, शुद्ध आरएनए के 100 एनजी का उपयोग किया, जो सीधे पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के अधीन था। शेष आरएनए (~ 4.4 μg) को MeRIP-Seq पाइपलाइन के अनुसार संसाधित किया गया था, जो एंटी-m6A विशिष्ट एंटीबॉडी या नियंत्रण के रूप में एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी से बंधे मोतियों के साथ खंडित आरएनए के इनक्यूबेशन के साथ शुरू होता है। खंडित आरएनए के 2.5 μg के m6A-विशिष्ट RIP (MeRIP) ने m6A-समृद्ध सामग्री के लगभग 15 ng को पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दी जो पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण (चित्रा 2B) से गुजरी। एंटी-आईजीजी नियंत्रण के साथ आरआईपी, जैसा कि अपेक्षित था, आगे के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त आरएनए उत्पन्न नहीं हुआ (चित्रा 2 बी)।

Figure 2
चित्र 2: MeRIP-Seq पाइपलाइन. A) MeRIP-Seq वर्कफ़्लो और इनपुट नियंत्रण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. पॉली-ए चयन पर, नमूनों को 120-150 एनटी टुकड़ों में विभाजित किया गया था और, या तो सीधे अनुक्रमण (100 एनजी, इनपुट नियंत्रण) के अधीन किया गया था, या आरएनए इम्युनोप्रिसिपिटेशन (2.5 μg, आरआईपी) के लिए उपयोग किया जाता था, जिसमें एंटी-एम 6 ए विशिष्ट एंटीबॉडी या एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी अनुक्रमण से पहले नकारात्मक नियंत्रण के रूप में थे। बी) प्रतिनिधि परिणाम विखंडन (ऊपरी पैनल) और आरआईपी (निचले पैनलों, MeRIP: बाएं, IgG नियंत्रण: दाएं) पर अपेक्षित आरएनए वितरण प्रोफाइल (आकार और राशि) दिखा रहे हैं। पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए आगे के प्रसंस्करण से पहले आरएनए गुणवत्ता और एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए नमूने टुकड़ा विश्लेषक पर लोड किए गए थे। खंडित आरएनए विश्लेषण आरएनए मानक संवेदनशीलता किट का उपयोग करके किया गया था जबकि इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड आरएनए ने उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग किया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बीएस-सेक पाइपलाइन न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन पर एम 5 सी आरएनए संशोधन की खोज की अनुमति देती है और एम 5 सी-मिथाइलेटेड टेपों की पहचान की ओर ले जाती है। बिसल्फाइट रूपांतरण पर, गैर-मेथिलेटेड साइटोसिन को यूरेसिल में परिवर्तित कर दिया जाता है, जबकि मेथिलेटेड साइटोसिन अपरिवर्तित रहते हैं (चित्रा 3 ए)। बिसल्फाइट रूपांतरण प्रक्रिया (यानी, उच्च तापमान और कम पीएच) की कठोर स्थितियों के कारण, परिवर्तित एमआरएनए अत्यधिक अवक्रमित होते हैं (चित्रा 3 बी), हालांकि यह पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण में हस्तक्षेप नहीं करता है। Bisulfite रूपांतरण केवल एकल-फंसे हुए आरएनए पर कुशल है और इस प्रकार संभावित रूप से द्वितीयक डबल-फंसे हुए आरएनए संरचनाओं द्वारा बाधित किया जा सकता है। सी-यू रूपांतरण की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए हमने दो नियंत्रण पेश किए। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने 28S rRNA23 की स्थिति C4447 में एक अत्यधिक मेथिलेटेड साइटोसिन की पहले से वर्णित उपस्थिति का लाभ उठाया। मिथाइलेटेड साइट के आसपास के 200 बीपी टुकड़े के आरटी-पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण पर हम देख सकते हैं कि सभी साइटोसिन को सफलतापूर्वक यूरेसिल में परिवर्तित कर दिया गया था, जिससे डीएनए अनुक्रम में थाइमिडिन के रूप में दिखाई दिया, स्थिति 4447 में साइटोसिन को छोड़कर जो अपरिवर्तित रहा। Bisulfite रूपांतरण दर के लिए एक नियंत्रण के रूप में, हम वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध सिंथेटिक ERCC आरएनए अनुक्रमों का उपयोग किया। इस मिश्रण में ज्ञात, गैर-मिथाइलेटेड और पॉली-एडेनिलेटेड आरएनए अनुक्रमों का एक पूल होता है, जिसमें विभिन्न प्रकार की माध्यमिक संरचनाएं और लंबाई होती है। पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण पर, हमने रूपांतरण दर की गणना करने के लिए इन ईआरसीसी अनुक्रमों पर ध्यान केंद्रित किया, जिसे सभी ईआरसीसी अनुक्रमों में और प्रत्येक नमूने में कुल सी अवशेषों के बीच परिवर्तित सी की संख्या की गणना करके किया जा सकता है। हमने 99.5% की रूपांतरण दर प्राप्त की, जो क्षमता और बिसल्फाइट रूपांतरण प्रतिक्रिया (चित्रा 3 डी) की सफलता की पुष्टि करती है।

Figure 3
चित्रा 3: बीएस-Seq पाइपलाइन. A) BS-Seq वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. पॉली-ए चयन पर, नमूनों को बिसल्फाइट के संपर्क में लाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-मेथिलेटेड सी अवशेषों के लिए सी से यू रूपांतरण (डिमिनेशन के कारण) होता है। इसके विपरीत, मेथिलेटेड सी अवशेष (एम 5 सी) बिसल्फाइट उपचार से प्रभावित नहीं होते हैं और अपरिवर्तित रहते हैं। बी) एक मानक संवेदनशीलता किट के साथ टुकड़ा विश्लेषक पर विश्लेषण पर bisulfite परिवर्तित आरएनए वितरण प्रोफ़ाइल (आकार और राशि) के प्रतिनिधि परिणाम. C) इलेक्ट्रोफेरोग्राम 28S rRNA (नीले रंग में हाइलाइट किया गया) में स्थिति 4447 पर 100% मेथिलेटेड C के आसपास के क्षेत्र के आरटी-पीसीआर एम्प्लिकॉन के प्रतिनिधि अनुक्रमण परिणाम को दर्शाता है। इसके विपरीत, संदर्भ अनुक्रम के सी अवशेषों को बिसल्फाइट रूपांतरण सफलता के कारण एम्प्लिकॉन अनुक्रम में टी अवशेषों के रूप में पहचाना गया था। घ) एचआईवी संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं में ईआरसीसी स्पाइक-इन अनुक्रमों के विश्लेषण द्वारा सी-यू रूपांतरण दर का मूल्यांकन। औसत रूपांतरण दर 99.5% है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

M6A-समृद्ध नमूने, bisulfite परिवर्तित नमूने और इनपुट नियंत्रण आगे पुस्तकालय की तैयारी, अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण (चित्रा 4) के लिए संसाधित कर रहे हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन और जैविक प्रश्न (ओं) के अनुसार, कई जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण लागू किए जा सकते हैं। यहां सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम एक संभावित अनुप्रयोग (यानी, विभेदक मिथाइलेशन विश्लेषण) से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं, जो एचआईवी संक्रमण पर प्रेरित विभेदक रूप से मेथिलेटेड टेपों की पहचान पर केंद्रित है। संक्षेप में, हमने वायरल जीवन चक्र के दौरान आरएनए मेथिलिकरण की भूमिका को समझने के लिए, उनके जीन अभिव्यक्ति स्तर से स्वतंत्र रूप से, गैर-संक्रमित और एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं दोनों में, टेपों के एम 6 ए या एम 5 सी मिथाइलेशन स्तर की जांच की। जीन अभिव्यक्ति सामान्यीकरण पर, हमने पहचान की कि ZNF469 प्रतिलेख संक्रमण की स्थिति के अनुसार अलग-अलग m6A-methylated था, वास्तव में इस प्रतिलेख को गैर-संक्रमित कोशिकाओं में मिथाइलेटेड नहीं किया गया था, जबकि यह एचआईवी संक्रमण (चित्रा 5 ए) पर कई मेथिलेटेड चोटियों को प्रदर्शित करता था। एम 5 सी पर एक समान अंतर मिथाइलेशन विश्लेषण से पता चला है कि पीएचएलपीपी 1 ट्रांसक्रिप्ट में कई मेथिलेटेड अवशेष शामिल थे, जो एचआईवी की स्थिति (चित्रा 5 बी) में अधिक बार मेथिलेटेड होते हैं। इस संदर्भ में, दोनों विश्लेषणों से पता चलता है कि एचआईवी संक्रमण सेलुलर एपिट्रांसक्रिप्टोम को प्रभावित करता है।

Figure 4
चित्र 4: m6A और m5C डेटा के विश्लेषण के लिए जैव सूचनाप्रवाह का योजनाबद्ध निरूपण. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: संक्रमण पर विभेदक रूप से मेथिलेटेड टेपों का उदाहरण। ए) एचआईवी संक्रमित (हरे) और गैर-संक्रमित (ग्रे) कोशिकाओं में ZNF459 प्रतिलेख के m6A मिथाइलेशन को दर्शाने वाले प्रतिनिधि परिणाम। चरम तीव्रता (इनपुट अभिव्यक्ति घटाव पर) x-अक्ष के साथ गुणसूत्र में y-अक्ष और स्थिति पर दिखाया गया है। विभेदक मिथाइलेशन विश्लेषण से पता चलता है कि ZFN469 प्रतिलेख एचआईवी संक्रमण पर हाइपरमेथिलेटेड है। बी) एचआईवी संक्रमित (ऊपरी लेन) और गैर-संक्रमित (निचली लेन) कोशिकाओं में एम 5 सी मेथिलेटेड जीन का प्रतिनिधि परिणाम। प्रत्येक बार की ऊंचाई प्रति न्यूक्लियोटाइड पढ़ने की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है और कवरेज मूल्यांकन की अनुमति देती है। लाल रंग में दर्शाए गए प्रत्येक सी अवशेष, और मेथिलेटेड सी के अनुपात को नीले रंग में दर्शाया गया है। सटीक मेथिलिकरण दर (%) प्रत्येक सी अवशेष के ऊपर रिपोर्ट की जाती है। तीर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण विभेदक रूप से मिथाइलेटेड सी को उजागर करते हैं नमूने आईजीवी व्यूअर का उपयोग करके कल्पना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वायरल संक्रमण में आरएनए संशोधनों की भूमिका अभी भी काफी हद तक अज्ञात है। वायरल संक्रमण के संदर्भ में epitranscriptomic संशोधनों की भूमिका की एक बेहतर समझ नए एंटीवायरल उपचार लक्ष्यों के लिए खोज में योगदान कर सकती है।

इस काम में, हम एक पूर्ण वर्कफ़्लो प्रदान करते हैं जो संक्रमित कोशिकाओं के m6A और m5C epitranscriptomes की जांच की अनुमति देता है। जैविक प्रश्न के आधार पर, हम प्रारंभिक सामग्री के रूप में पॉली-ए-चयनित आरएनए का उपयोग करने की सलाह देते हैं। हालांकि वैकल्पिक, जैसा कि पाइपलाइन का उपयोग कुल आरएनए के साथ किया जा सकता है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आरआरएनए के साथ-साथ छोटे आरएनए अत्यधिक संशोधित होते हैं और इसमें मिथाइलेटेड अवशेषों की एक महत्वपूर्ण संख्या होती है। इसके परिणामस्वरूप सार्थक अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता और मात्रा में कमी आ सकती है।

हालांकि, यदि अध्ययन का ध्यान गैर-पॉली-एडेनिलेटेड आरएनए है, तो आरएनए निष्कर्षण चरण को छोटे आरएनए (कॉलम-आधारित आरएनए निष्कर्षण के मामले में) को त्यागने से बचने के लिए और पाइपलाइन में प्रवेश करने के लिए पॉली-ए चयन के बजाय राइबोसोम-कमी तकनीकों को विशेषाधिकार देने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए, सही विखंडन और उपयुक्त m6A-समृद्ध और बीएस परिवर्तित आरएनए गुणवत्ता को सुनिश्चित करने के लिए पुस्तकालय की तैयारी के लिए हम दृढ़ता से एक टुकड़ा विश्लेषक या बायोएनालाइज़र का उपयोग करने की सलाह देते हैं। हालांकि, यह उपकरण हमेशा उपलब्ध नहीं होता है। एक विकल्प के रूप में, आरएनए की गुणवत्ता, एमआरएनए और खंडित आरएनए के आकार का मूल्यांकन भी एगारोज़ जेल पर विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पुस्तकालय की तैयारी आरएनए मात्रा के पिछले मूल्यांकन के बिना की जा सकती है।

हमने m6A epitranscriptomic परिदृश्य का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी-आधारित MeRIP-Seq16 तकनीक का उपयोग किया। यह तकनीक आरएनए immunoprecipitation पर आधारित है और सफल है; हालांकि, कुछ चरणों को सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता होती है और महत्वपूर्ण हो सकता है। यद्यपि m6A मिथाइलेशन को मुख्य रूप से आम सहमति अनुक्रम RRA * CH के भीतर होने के लिए वर्णित किया गया है, यह आकृति mRNA अणुओं के साथ अत्यधिक बार होती है और मेथिलेटेड साइट की सटीक पहचान की अनुमति नहीं देती है। इस प्रकार आरआईपी-आधारित रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने के लिए एक पुनरुत्पादक और सुसंगत आरएनए विखंडन प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, जो छोटे आरएनए टुकड़े उत्पन्न करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित प्रक्रिया की सिफारिश करते हैं, जो हमारी प्रयोगात्मक सेटिंग में पुन: प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत परिणाम प्रदान करता है; हालांकि, इस फ़्रेग्मेंटेशन चरण को विशिष्ट नमूना सुविधाओं के अनुसार आगे ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है।

हाल ही में एम 6 ए प्रत्यक्ष अनुक्रमण की अनुमति देने वाली एक नई तकनीक का वर्णन किया गया था। यह विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज वेरिएंट के उपयोग पर आधारित है जो एम 6 ए आरएनए संशोधन 24 का सामना करने की प्रतिक्रिया के रूप में अद्वितीय आरटी-हस्ताक्षर प्रदर्शित करते हैं। यह तकनीक, सावधानीपूर्वक अनुकूलन पर, MeRIP-Seq (प्रारंभिक सामग्री की मात्रा को कम करने और एक उच्च रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देने) के साथ सामना की जाने वाली प्रमुख सीमा को दरकिनार कर सकती है। एम 5 सी संशोधन का पता लगाने के लिए हमने न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन पर संशोधित सी अवशेषों का पता लगाने के लिए बिसल्फाइट रूपांतरण तकनीक का उपयोग करने का फैसला किया। आरएनए माध्यमिक संरचनाओं की उपस्थिति के कारण झूठी सकारात्मक दर को कम करने के लिए, हमने विकृतीकरण / बिसल्फाइट रूपांतरण के 3 चक्रों का प्रदर्शन किया और ईआरसीसी स्पाइक-इन नियंत्रणों के उपयोग के लिए बिलसल्फाइट रूपांतरण दर प्रदर्शन को आगे नियंत्रित किया। इस तकनीक से जुड़ी सीमाओं में से एक यह है कि बिसल्फाइट रूपांतरण बहुत कठोर है और विकृतीकरण / बिसल्फाइट रूपांतरण के तीन चक्र कुछ आरएनए को नीचा दिखा सकते हैं और इसलिए रिज़ॉल्यूशन को कम कर सकते हैं। हालांकि, हमारी सेटिंग में, हमने डेटासेट की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए संभावित रूप से थोड़ा कम रिज़ॉल्यूशन के लिए व्यवस्थित करना चुना।

इन अनुकूलन और नियंत्रणों के लिए धन्यवाद, हम एक विश्वसनीय और ध्वनि वर्कफ़्लो प्रदान करने में सक्षम थे जिसका उपयोग एपिट्रांसक्रिप्टोमिक परिदृश्य और वायरल संक्रमण, होस्ट-रोगज़नक़ इंटरैक्शन, या विशिष्ट उपचारों के किसी भी जोखिम के संदर्भ में इसके परिवर्तन की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान 31003A_166412 और 314730_188877) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx SuperMix Invitrogen 12344-040
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 Millipore MABE1006
Chloroform Merck 67-66-3
ERCC Invitrogen 4456740
EZ RNA Methylation Kit Zymo Research EZR5001
Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit Agilent DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit Agilent DNF-471-0500
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
Illumina TruSeq Stranded mRNA Illumina 20020594
Magnetic Beads A/G Blend Merck 16-663
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) Sigma Aldrich M2780-10MG
Normal Mouse IgG Merk 12371
Oligo(dT)25 Life Technologies 61005,
PCRapace Stratec 1020220300
Quick RNA Viral Kit Zymo Research 1034
RNA Clean & Concentrator Zymo Research R1015
RNA Fragmentation Reagent Ambion AM8740
RNase Inhibitor Ambion AM2684
Trizol TRIzol Reagent 15596026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cristinelli, S., Angelino, P., Ciuffi, A. Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV. J. Vis. Exp. (181), e62426, doi:10.3791/62426 (2022).

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