Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjoner begynner å bli utforsket og kan markere nye viral-vert interaksjonsmekanismer. I dette arbeidet gir vi en rørledning for å undersøke m6A– og m5C RNA-modifikasjoner i sammenheng med virusinfeksjoner.
Rollen til RNA-modifikasjoner i biologiske prosesser har vært fokus for et økende antall studier de siste årene og er i dag kjent som epitranscriptomics. Blant annet er N6-metyladenosin (m6A) og 5-metylcytosin (m5C) RNA-modifikasjoner beskrevet på mRNA-molekyler og kan ha en rolle i modulering av cellulære prosesser. Epitranscriptomics er dermed et nytt lag av regulering som må vurderes i tillegg til transkripsjonsanalyser, da det også kan endres eller moduleres ved eksponering for kjemiske eller biologiske midler, inkludert virusinfeksjoner.
Her presenterer vi en arbeidsflyt som tillater analyse av det felles cellulære og virale epitranskriptomiske landskapet på m6A– og m5C-merkene samtidig, i celler som er infisert eller ikke med det menneskelige immunsviktviruset (HIV). Ved mRNA-isolasjon og fragmentering fra HIV-infiserte og ikke-infiserte celler brukte vi to forskjellige prosedyrer: MeRIP-Seq, en RNA-immunoprecipitation-basert teknikk, for å berike for RNA-fragmenter som inneholder m6A-merket og BS-Seq, en bisulfittkonverteringsbasert teknikk, for å identifisere m5C-merket med en enkelt nukleotidoppløsning. Ved metyleringsspesifikk fangst er RNA-biblioteker forberedt for sekvensering med høy gjennomstrømning. Vi utviklet også en dedikert bioinformatikkpipeline for å identifisere differensialt metylerte (DM) transkripsjoner uavhengig av deres basale uttrykksprofil.
Totalt sett tillater metodikken utforskning av flere epitranskriptomiske merker samtidig og gir et atlas av DM-transkripsjoner ved virusinfeksjon eller annen celleperturbasjon. Denne tilnærmingen gir nye muligheter til å identifisere nye spillere og nye mekanismer for cellerespons, for eksempel cellulære faktorer som fremmer eller begrenser viral replikering.
Det er lenge kjent at RNA-molekyler kan modifiseres, og mer enn 150 posttranskripsjonelle modifikasjoner har blitt beskrevet til dags dato1. De består i tillegg av kjemiske grupper, hovedsakelig metylgrupper, til praktisk talt enhver posisjon av pyrimidin- og purinringene til RNA-molekyler2. Slike posttranskripsjonelle modifikasjoner har allerede vist seg å være svært beriket i overføring RNA (tRNA) og ribosomal RNA (rRNA) og har nylig blitt beskrevet på mRNA molekyler også.
Fremveksten av nye teknologier, som Next Generation Sequencing (NGS), og produksjon av spesifikke antistoffer som gjenkjenner bestemte kjemiske modifikasjoner tillatt, for første gang, undersøkelsen av plasseringen og frekvensen av spesifikke kjemiske modifikasjoner på et transkripsjonsnivå. Disse fremskrittene har ført til en bedre forståelse av RNA modifikasjoner og til kartlegging av flere modifikasjoner på mRNA molekyler3,4.
Mens epigenetikk undersøker rollen som DNA- og histonemodifikasjoner i transkripsjonsregulering, fokuserer epitranskriptomikk på en lignende måte på RNA-modifikasjoner og deres rolle. Undersøkelsen av epitranskriptomiske modifikasjoner gir nye muligheter til å fremheve nye reguleringsmekanismer som kan stille inn en rekke cellulære prosesser (dvs. RNA-skjøting, eksport, stabilitet og oversettelse)5. Det var derfor ingen stor overraskelse at nyere studier avdekket mange epitranskriptomiske modifikasjoner ved virusinfeksjon i både cellulære og virale RNAer6. Virus undersøkt så langt inkluderer både DNA og RNA virus; blant dem kan HIV betraktes som et banebrytende eksempel. Til sammen kan oppdagelsen av RNA-metylering i sammenheng med virusinfeksjoner tillate undersøkelse av ennå ikke-innskrevne mekanismer for viralt uttrykk eller replikering, og dermed gi nye verktøy og mål for å kontrollere dem7.
Innen HIV-epitranskriptomikk har modifikasjoner av virale transkripsjoner blitt mye undersøkt og har vist at tilstedeværelsen av denne modifikasjonen var gunstig for viral replikasjon8,9,10,11,12,13. Til dags dato kan ulike teknikker brukes til å oppdage epitranscriptomiske merker på transkripsjonsnivå. De mest brukte teknikkene for m6A-identifisering er avhengige av immunutfellingsteknikker som MeRIP-Seq og miCLIP. Mens MeRIP-Seq er avhengig av RNA-fragmentering for å fange fragmenter som inneholder metylerte rester, er miCLIP basert på genereringen av α-m6A antistoffspesifikke signaturmutasjoner ved RNA-antistoff UV-krysskobling, og tillater dermed en mer presis kartlegging.
Påvisning av m5C-modifikasjon kan oppnås enten ved antistoffbaserte teknologier som ligner på m6A-deteksjon (m5C RIP), eller ved bisulfittkonvertering eller av AZA-IP eller miCLIP. Både Aza-IP og m5C miCLIP bruker en spesifikk metyltransferase som agn for å målrette RNA mens du går gjennom RNA-metylering. I Aza-IP blir målceller eksponert for 5-azacytidin, noe som resulterer i tilfeldig innføring av cytidin analoge 5-azacytidinsteder i nascent RNA. I miCLIP er NSun2 metyltransferase genetisk modifisert for å huse C271A-mutasjonen14,15.
I dette arbeidet fokuserer vi på dobbel karakterisering av m6A– og m5C-modifikasjoner i infiserte celler, ved hjelp av HIV som modell. Ved metologisk optimalisering har vi utviklet en arbeidsflyt som kombinerer metylert RNA-immunoprecipitation (MeRIP) og RNA bisulfittkonvertering (BS), slik at samtidig utforskning av m6A og m5C epitranscriptomiske merker på et transkripsjonsmessig bredt nivå, i både cellulære og virale sammenhenger. Denne arbeidsflyten kan implementeres på cellulære RNA-ekstrakter så vel som på RNA isolert fra viruspartikler.
Metylert RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 tilnærming som tillater undersøkelse av m6A på transkripsjonsnivå er godt etablert og en rekke m6A-spesifikke antistoffer er kommersielt tilgjengelige til dags dato17. Denne metoden består i selektiv fangst av m6A-inneholdende RNA-stykker ved hjelp av et m6A-spesifikt antistoff. De to store ulempene ved denne teknikken er (i) den begrensede oppløsningen, som er svært avhengig av størrelsen på RNA-fragmenter og dermed gir en omtrentlig plassering og region som inneholder metylerte rester, og (ii) den store mengden materiale som trengs for å utføre analysen. I den følgende optimaliserte protokollen standardiserte vi fragmentstørrelsen til ca. 150 nt og reduserte mengden startmateriale fra 10 μg poly-A-valgt RNA, som for tiden er anbefalt mengde startmateriale, til bare 1 μg poly-A-valgt RNA. Vi maksimerte også utvinningseffektiviteten til m6A RNA-fragmenter bundet til spesifikke antistoffer ved hjelp av en elution ved en konkurransetilnærming med et m6A-peptid i stedet for mer konvensjonelle og mindre spesifikke elutionmetoder ved hjelp av fenolbaserte teknikker eller proteinase K. Hovedbegrensningen i denne RIP-baserte analysen forblir imidlertid den suboptimale oppløsningen som ikke tillater identifisering av det presise modifiserte A-nukleotidet.
Analyse av m5C-merket kan for tiden utføres ved hjelp av to forskjellige tilnærminger: en RIP-basert metode med m5C-spesifikke antistoffer og RNA bisulfittkonvertering. Siden RIP bare tilbyr begrenset oppløsning på identifisering av metylerte rester, brukte vi bisulfittkonvertering som kan tilby enkel nukleotidoppløsning. RNA-eksponering for bisulfitt (BS) fører til cytosindeaminering, og konverterer dermed cytosinrester til uracil. Således, under RNA bisulfitt konvertering reaksjon, hver ikke-metylert cytosin er deaminert og konvertert til uracil, mens tilstedeværelsen av en metyl gruppe i posisjon 5 av cytosin har en beskyttende effekt, forhindrer BS-indusert deaminering og bevaring av cytosinrester rester. Den BS-baserte tilnærmingen gjør det mulig å oppdage et m5C modifisert nukleotid ved enkel basisoppløsning og for vurdering av metyleringsfrekvensen for hver transkripsjon, og gir innsikt i m5C modifikasjonsdynamikk18. Hovedbegrensningen av denne teknikken er imidlertid avhengig av den falske positive frekvensen av metylerte rester. Faktisk er BS-konvertering effektiv på enkeltstrengede RNA med tilgjengelige C-rester. Tilstedeværelsen av en stram RNA sekundærstruktur kan imidlertid maskere N5C-posisjonen og hemme BS-konvertering, noe som resulterer i ikke-metylerte C-rester som ikke konverteres til U-rester, og dermed falske positiver. For å omgå dette problemet og minimere den falske positive frekvensen, brukte vi 3 runder med denaturering og bisulfittkonverteringssykluser19. Vi introduserte også 2 kontroller i prøvene for å muliggjøre estimering av bisulfittkonverteringseffektivitet: vi spike-in ERCC-sekvenseringskontroller (ikke-metylerte standardiserte og kommersielt tilgjengelige sekvenser)20 samt poly-A-utarmede RNAer for å vurdere bisulfittkonverteringsfrekvens på den ene siden, og for å verifisere av RT-PCR tilstedeværelsen av et kjent og godt bevart metylert sted, C4447, på 28S ribosomal RNA derimot21.
Innen virologi muliggjør kobling av disse to epitranskriptomiske undersøkelsesmetodene med neste generasjons sekvensering og nøyaktige bioinformatiske analyser den grundige studien av m6A– og m5C-dynamikken (dvs. RNA-modifikasjon temporale endringer som kan oppstå ved virusinfeksjon og kan avdekke en rekke nye terapeutisk relevante mål for klinisk bruk).
Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjon er fortsatt stort sett ukjent. En bedre forståelse av epitranskriptomiske modifikasjoners rolle i sammenheng med virusinfeksjon kan bidra til å søke nye antivirale behandlingsmål.
I dette arbeidet tilbyr vi en komplett arbeidsflyt som tillater undersøkelse av m6A og m5C epitranscriptomes av infiserte celler. Avhengig av det biologiske spørsmålet anbefaler vi å bruke poly-A-valgt RNA som startmateriale. Selv om det er valgfritt, da rørledningen kan brukes med total RNA, er det viktig å huske på at rRNAer så vel som små RNAer er høyt modifisert og inneholder et viktig antall metylerte rester. Dette kan føre til redusert kvalitet og mengde meningsfulle sekvenseringsdata.
Men hvis fokuset i studien er ikke-poly-adenylert RNA, bør RNA-ekstraksjonstrinnet tilpasses for å unngå å kaste bort små RNA (i tilfelle kolonnebasert RNA-ekstraksjon) og til privilegier ribosom-uttømmingsteknikker i stedet for poly-A-valg for å komme inn i rørledningen.
For å sikre høy kvalitet RNA, riktig fragmentering og egnet m6A-beriket og BS konvertert RNA kvalitet for bibliotek forberedelse anbefaler vi sterkt å bruke en fragmentanasator eller en bioanalyse. Dette utstyret er imidlertid ikke alltid tilgjengelig. Som et alternativ kan kvaliteten på RNA, mRNA og størrelsen på fragmentert RNA også vurderes ved visualisering på agarose gel. Alternativt kan bibliotekforberedelse utføres uten tidligere vurdering av RNA-mengde.
Vi brukte den antistoffbaserte MeRIP-Seq16-teknikken til å utforske det epitranskriptomiske landskapet m6A. Denne teknikken er basert på RNA immunoprecipitation og er vellykket; Noen trinn trenger imidlertid nøye optimalisering og kan være kritisk. Selv om m6A metylering har blitt beskrevet å forekomme hovedsakelig innenfor konsensussekvensen RRA * CH, er dette motivet svært hyppig langs mRNA-molekyler og tillater ikke presis identifisering av det metylerte stedet. Det er derfor viktig å oppnå en reproduserbar og konsistent RNA-fragmentering, som genererer små RNA-fragmenter, for å forbedre den RIP-baserte oppløsningen. I denne protokollen anbefaler vi en optimalisert prosedyre som gir reproduserbare og konsistente resultater i vår eksperimentelle setting; Dette fragmenteringstrinnet kan imidlertid trenge ytterligere optimalisering i henhold til bestemte eksempelfunksjoner.
Nylig ble en ny teknikk som tillater m6A direkte sekvensering beskrevet. Den er basert på bruk av spesifikke omvendte transkripsjonsvarianter som viser unike RT-signaturer som svar på å møte m6A RNA-modifikasjon24. Denne teknologien, ved nøye optimalisering, kan omgå den største begrensningen som MeRIP-Seq står overfor (redusere mengden innledende materiale og tillate en høyere oppløsning). For å utforske m5C modifikasjonen bestemte vi oss for å bruke bisulfittkonverteringsteknikken for å oppdage ved nukleotidoppløsning de modifiserte C-rester. For å redusere den falske positive frekvensen på grunn av tilstedeværelsen av RNA sekundære strukturer, utførte vi 3 sykluser med denaturering / bisulfittkonvertering og ytterligere kontroll bisulfitt konverteringsfrekvensytelse takket være bruk av ERCC-spike-in-kontroller. En av begrensningene knyttet til denne teknikken er at bisulfittkonvertering er veldig hard og tre sykluser med denaturering / bisulfittkonvertering kan forringe noe RNA og dermed redusere oppløsningen. I vår setting valgte vi imidlertid å nøye oss med en potensielt litt lavere oppløsning for å øke kvaliteten på datasettet.
Takket være disse optimaliseringene og kontrollene kunne vi tilby en pålitelig og god arbeidsflyt som kan utnyttes til å undersøke det epitranskriptomiske landskapet og dets endring i sammenheng med virusinfeksjoner, vertspatogeninteraksjoner eller eksponering for spesifikke behandlinger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd 31003A_166412 og 314730_188877).
AccuPrime Pfx SuperMix | Invitrogen | 12344-040 | |
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 | Millipore | MABE1006 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
ERCC | Invitrogen | 4456740 | |
EZ RNA Methylation Kit | Zymo Research | EZR5001 | |
Fragment analyzer RNA Kit – HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
Fragment analyzer RNA Kit – RNA Kit | Agilent | DNF-471-0500 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
Illumina TruSeq Stranded mRNA | Illumina | 20020594 | |
Magnetic Beads A/G Blend | Merck | 16-663 | |
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) | Sigma Aldrich | M2780-10MG | |
Normal Mouse IgG | Merk | 12371 | |
Oligo(dT)25 | Life Technologies | 61005, | |
PCRapace | Stratec | 1020220300 | |
Quick RNA Viral Kit | Zymo Research | 1034 | |
RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1015 | |
RNA Fragmentation Reagent | Ambion | AM8740 | |
RNase Inhibitor | Ambion | AM2684 | |
Trizol | TRIzol Reagent | 15596026 |