Rollen av RNA-modifieringar i virusinfektioner har precis börjat utforskas och kan lyfta fram nya interaktionsmekanismer för virus-värd. I detta arbete tillhandahåller vi en pipeline för att undersöka m6A och m5C RNA modifieringar i samband med virusinfektioner.
RNA-modifieringarnas roll i biologiska processer har varit i fokus för ett ökande antal studier under de senaste åren och är idag känd som epitranscriptomics. Bland annat har N6-metyladenosin (m6A) och 5-metylcytosin (m5C) RNA-modifieringar beskrivits på mRNA-molekyler och kan ha en roll i modulering av cellulära processer. Epitranscriptomics är således ett nytt regleringslager som måste beaktas utöver transkriptomiska analyser, eftersom det också kan ändras eller moduleras genom exponering för något kemiskt eller biologiskt medel, inklusive virusinfektioner.
Här presenterar vi ett arbetsflöde som möjliggör analys av det gemensamma cellulära och virala epitranskriptomiska landskapet av m6A– och m5C-märkena samtidigt, i celler infekterade eller inte med humant immunbristvirus (HIV). Vid mRNA isolering och fragmentering från HIV- infekterade och icke-infekterade celler, använde vi två olika förfaranden: MeRIP-Seq, en RNA immunoprecipitation-baserad teknik, för att berika för RNA fragment som innehåller m6A märket och BS-Seq, en bisulfite konvertering-baserade teknik, för att identifiera m5C-märket vid en enda nukleotidupplösning. Vid metyleringsspecifik fångst förbereds RNA-bibliotek för sekvensering med hög genomströmning. Vi utvecklade också en dedikerad bioinformatik pipeline för att identifiera differentiellt metylerade (DM) transkriptioner oberoende av deras basala uttryck profil.
Sammantaget tillåter metoden utforskning av flera epitranscriptomic märken samtidigt och ger en atlas över DM transkript vid virusinfektion eller någon annan cell perturbation. Detta tillvägagångssätt erbjuder nya möjligheter att identifiera nya spelare och nya mekanismer för cellrespons, till exempel cellulära faktorer som främjar eller begränsar virusreplikering.
Det är länge känt att RNA-molekyler kan modifieras, och mer än 150 post-transkriptionella modifieringar har beskrivits hittills1. De består i tillsats av kemiska grupper, främst metylgrupper, till praktiskt taget alla positioner av pyrimidin- och purinringar av RNA-molekyler2. Sådana post-transkriptionella modifieringar har redan visat sig vara mycket berikade i överföring RNA (tRNA) och ribosomal RNA (rRNA) och har nyligen beskrivits på mRNA-molekyler samt.
Uppkomsten av ny teknik, såsom nästa generations sekvensering (NGS), och produktionen av specifika antikroppar som erkänner bestämda kemiska modifieringar gjorde det för första gången möjligt att undersöka platsen och frekvensen av specifika kemiska modifieringar på transkriptomomfattande nivå. Dessa framsteg har lett till en bättre förståelse av RNA-modifieringar och till kartläggning av flera modifieringar på mRNA-molekyler3,4.
Medan epigenetik undersöker DNA: s roll och histonmodifieringar i transkriptomreglering, fokuserar epitranscriptomics på ett liknande sätt på RNA-modifieringar och deras roll. Undersökningen av epitranscriptomiska modifieringar ger nya möjligheter att lyfta fram nya regleringsmekanismer som kan finjustera en mängd olika cellulära processer (dvs. RNA-splitsning, export, stabilitet och översättning)5. Det var därför ingen stor överraskning att nyligen genomförda studier avslöjade många epitranscriptomiska modifieringar vid virusinfektion i både cellulära och virala RNAs6. Virus som hittills undersökts inkluderar både DNA- och RNA-virus; hiv kan betraktas som ett banbrytande exempel. Sammantaget kan upptäckten av RNA-metylering i samband med virusinfektioner tillåta undersökning av ännu obeskrivna mekanismer för virusuttryck eller replikering, vilket ger nya verktyg och mål för att kontrollera dem7.
Inom hiv-epitranscriptomics har modifieringar av virala transkriptioner undersökts i stor utsträckning och har visat att förekomsten av denna modifiering var fördelaktig för viral replikering8,9,10,11,12,13. Hittills kan olika tekniker användas för att upptäcka epitranscriptomiska märken på transkriptomnivå. De mest använda teknikerna för m6A-identifiering förlitar sig på immunutfällningstekniker som MeRIP-Seq och miCLIP. Medan MeRIP-Seq förlitar sig på RNA-fragmentering för att fånga fragment som innehåller metylerade rester, är miCLIP baserat på generering av α-m6A antikroppsspecifika signaturmutationer på RNA-antikropps UV-korslänkning, vilket möjliggör en mer exakt kartläggning.
Detektion av m5C-modifiering kan uppnås antingen genom antikroppsbaserad teknik som liknar m6A-detektion (m5C RIP) eller genom bisulfitkonvertering eller genom AZA-IP eller genom miCLIP. Både Aza-IP och m5C miCLIP använder en specifik metyltransferas som bete för att rikta in sig på RNA medan de genomgår RNA-metylering. I Aza-IP exponeras målceller för 5-azacytidin, vilket resulterar i slumpmässig introduktion av cytidinanaloga 5-azacytidin platser i gryende RNA. I miCLIP är NSun2 metyltransferas genetiskt modifierad för att hysa C271A mutationen14,15.
I detta arbete fokuserar vi på dubbel karakterisering av m6A– och m5C-modifieringar i infekterade celler, med HIV som modell. Vid metodoptimering har vi utvecklat ett arbetsflöde som kombinerar metylerad RNA immunoprecipitation (MeRIP) och RNA bisulfite conversion (BS), vilket möjliggör samtidig utforskning av m6A och m5C epitranscriptomic märken på en transkriptom-bred nivå, i både cellulära och virala sammanhang. Detta arbetsflöde kan implementeras på cellulära RNA-extrakt samt på RNA isolerat från viruspartiklar.
Metoden Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 som möjliggör undersökning av m6A på transkriptom-wide nivå är väl etablerad och en rad m6A-specifika antikroppar är kommersiellt tillgängliga hittills17. Denna metod består i selektiv avskiljning av m6A-innehållande RNA-bitar med hjälp av en m6A-specifik antikropp. De två största nackdelarna med denna teknik är i) den begränsade upplösningen, som är mycket beroende av storleken på RNA-fragment och därmed ger en ungefärlig plats och region som innehåller de metylerade resterna, och (ii) den stora mängd material som behövs för att utföra analysen. I följande optimerade protokoll standardiserade vi fragmentstorleken till ca 150 nt och minskade mängden startmaterial från 10 μg poly-A-valt RNA, som för närvarande är den rekommenderade mängden startmaterial, till endast 1 μg poly-A-valt RNA. Vi maximerade också återvinningseffektiviteten hos m6A RNA fragment bundna till specifika antikroppar med hjälp av en elution genom en konkurrensmetod med en m6A peptid i stället för mer konventionella och mindre specifika elution metoder med fenol-baserade tekniker eller proteinas K. Den huvudsakliga begränsningen av denna RIP-baserade analys är dock fortfarande den suboptimala upplösningen som inte tillåter identifiering av den exakta modifierade A-nukleotid.
Analys av m5C-märket kan för närvarande utföras med två olika metoder: en RIP-baserad metod med m5C-specifika antikroppar och RNA bisulfitkonvertering. Eftersom RIP endast erbjuder begränsad upplösning på identifiering av metylerade rester, använde vi bisulfitomvandling som kan erbjuda en enda nukleotidupplösning. RNA-exponering för bisulfit (BS) leder till cytosindeaminering och omvandlar därmed cytosinresterna till uracil. Således, under RNA bisulfite omvandlingsreaktionen, varje icke-metylerad cytosin deamineras och omvandlas till uracil, medan närvaron av en metylgrupp i position 5 av cytosin har en skyddande effekt, förhindra BS-inducerad deamination och bevara cytosin resterna. Den BS-baserade metoden möjliggör detektion av en m5C modifierad nukleotid vid en enda basupplösning och för bedömning av metyleringsfrekvensen för varje transkription, vilket ger insikter om m5C modifieringsdynamik18. Den huvudsakliga begränsningen av denna teknik förlitar sig dock på den falska positiva hastigheten av metylerade rester. BS-omvandlingen är faktiskt effektiv på enkelsträngat RNA med tillgängliga C-rester. Förekomsten av en snäv RNA sekundär struktur kan dock maskera N5C-positionen och hämma BS-omvandlingen, vilket resulterar i icke-metylerade C-rester som inte omvandlas till U-rester, och därmed falska positiva. För att kringgå det här problemet och minimera den falska positiva frekvensen tillämpade vi 3 omgångar av denaturering och bisulfitkonverteringscykler19. Vi införde också 2 kontroller i proverna för att möjliggöra uppskattning av bisulfitomvandlingseffektivitet: vi spikar in ERCC-sekvenseringskontroller (icke-metylerade standardiserade och kommersiellt tillgängliga sekvenser)20 samt poly-A-utarmade RNAs för att bedöma bisulfitomvandlingshastigheten å ena sidan och för att verifiera genom RT-PCR närvaron av ett känt och välkonserverat metylerat område, C4447, på 28S ribosomal RNA å ena sidan21.
Inom virologin möjliggör kopplingen av dessa två epitriskriptomiska undersökningsmetoder med nästa generations sekvensering och noggrann bioinformatisk analys en djupgående studie av m6A– och m5C-dynamiken (dvs. RNA-modifiering av tidsförändringar som kan uppstå vid virusinfektion och kan avslöja en rad nya terapeutiskt relevanta mål för klinisk användning).
Rollen av RNA ändringar i viral infektion är fortfarande i stort sett okänd. En bättre förståelse för rollen av epitranscriptomic modifieringar i samband med virusinfektion kan bidra till sökandet efter nya antivirala behandlingsmål.
I detta arbete tillhandahåller vi ett komplett arbetsflöde som möjliggör undersökning av m6A och m5C epitranscriptomes av infekterade celler. Beroende på den biologiska frågan rekommenderar vi att du använder poly-A-valt RNA som startmaterial. Även om det är valfritt, eftersom rörledningen kan användas med totalt RNA, är det viktigt att komma ihåg att rRNAs samt små RNAs är mycket modifierade och innehåller ett viktigt antal metylerade rester. Detta kan resultera i en minskad kvalitet och kvantitet av meningsfulla sekvenseringsdata.
Emellertid, om fokusera av studien är non-poly-adenylated RNA, bör RNA extraktion kliver anpassas för att undvika att kassera lilla RNA (i fall av kolonn-baserade RNA extraktion) och att privilegiera ribosom-utarmningtekniker i stället för poly-A val för att skriva in pipelinen.
För att säkerställa högkvalitativt RNA, korrekt fragmentering och lämplig m6A-berikad och BS-konverterad RNA-kvalitet för biblioteksberedning rekommenderar vi starkt att du använder en fragmentanalysator eller en bioanalyzer. Denna utrustning är dock inte alltid tillgänglig. Som ett alternativ kan kvaliteten på RNA, mRNA och storleken på fragmenterat RNA också bedömas genom visualisering på agarosgel. Alternativt kan biblioteksförberedelser utföras utan tidigare bedömning av RNA-kvantitet.
Vi använde den antikroppsbaserade MeRIP-Seq16-tekniken för att utforska det epitranskriptomiska landskapet m6A. Denna teknik är baserad på RNA immunoprecipitation och är framgångsrik. Vissa steg behöver dock noggrann optimering och kan vara kritiska. Även om m6A metylering har beskrivits främst inom konsensussekvensen RRA * CH, är detta motiv mycket frekvent längs mRNA-molekyler och tillåter inte exakt identifiering av det metylerade området. Det är därför viktigt att uppnå en reproducerbar och konsekvent RNA-fragmentering, som genererar små RNA-fragment, för att förbättra den RIP-baserade upplösningen. I det här protokollet rekommenderar vi en optimerad procedur som ger reproducerbara och konsekventa resultat i vår experimentella inställning; Detta fragmenteringssteg kan dock behöva ytterligare optimering enligt specifika exempelfunktioner.
Nyligen beskrevs en ny teknik som tillåter m6A direkt sekvensering. Det är baserat på användningen av specifika omvända transkriptasvarianter som uppvisar unika RT-signaturer som ett svar på att stöta på m6A RNA-modifiering24. Denna teknik, vid noggrann optimering, kan kringgå den stora begränsningen som merip-seq står inför (minska mängden initialt material och tillåta en högre upplösning). För att utforska m5C-modifieringen bestämde vi oss för att använda bisulfitkonverteringstekniken för att vid nukleotidupplösning upptäcka de modifierade C-resterna. För att minska den falska positiva hastigheten på grund av förekomsten av RNA sekundära strukturer, utförde vi 3 cykler av denaturation/bisulfite konvertering och ytterligare kontroll bisulfite konverteringsfrekvens prestanda tack vare användningen av ERCC spike-in kontroller. En av begränsningarna kopplade till denna teknik är att bisulfit omvandling är mycket hård och tre cykler av denaturation/bisulfite omvandling kan försämra vissa RNA och därmed minska upplösningen. I vår miljö valde vi dock att nöja oss med en potentiellt något lägre upplösning för att öka datauppsättningens kvalitet.
Tack vare dessa optimeringar och kontroller kunde vi tillhandahålla ett tillförlitligt och sunt arbetsflöde som kan utnyttjas för att undersöka det epitranskriptomiska landskapet och dess förändring i samband med virusinfektioner, värdpatogeninteraktioner eller exponering för specifika behandlingar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (bidrag 31003A_166412 och 314730_188877).
AccuPrime Pfx SuperMix | Invitrogen | 12344-040 | |
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 | Millipore | MABE1006 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
ERCC | Invitrogen | 4456740 | |
EZ RNA Methylation Kit | Zymo Research | EZR5001 | |
Fragment analyzer RNA Kit – HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
Fragment analyzer RNA Kit – RNA Kit | Agilent | DNF-471-0500 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
Illumina TruSeq Stranded mRNA | Illumina | 20020594 | |
Magnetic Beads A/G Blend | Merck | 16-663 | |
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) | Sigma Aldrich | M2780-10MG | |
Normal Mouse IgG | Merk | 12371 | |
Oligo(dT)25 | Life Technologies | 61005, | |
PCRapace | Stratec | 1020220300 | |
Quick RNA Viral Kit | Zymo Research | 1034 | |
RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1015 | |
RNA Fragmentation Reagent | Ambion | AM8740 | |
RNase Inhibitor | Ambion | AM2684 | |
Trizol | TRIzol Reagent | 15596026 |