Summary
硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定および比較するために、ラット骨格筋組織の4つの異なる筋肉群を均質化するための3つの異なる方法のプロトコルを提示します。さらに、異なるサンプル重量を比較して、組織のサンプルサイズが均質化の結果に影響を与えるかどうかを調査します。
Abstract
硝酸イオン(NO3-)は、かつて一酸化窒素(NO)代謝の不活性な最終生成物であると考えられていました。しかし、以前の研究では、硝酸イオンは2段階の還元メカニズムによってNOに戻すことができることが実証されました:硝酸塩は主に経口共生細菌によって亜硝酸塩(NO2-)に還元され、次に亜硝酸塩はヘムまたはモリブデン含有タンパク質を含むいくつかのメカニズムによってNOに還元されます。この還元性硝酸塩経路は、特に心血管系および筋肉運動中のNO媒介シグナル伝達経路の増強に寄与する。そのような利用前の体内の硝酸塩のレベルは、主に植物からの内因性NO酸化と食事性硝酸塩摂取の2つの異なる供給源によって決定されます。生理的環境下での複雑なNOサイクルを解明するために、NOと比較して比較的安定な代謝物である硝酸イオンと亜硝酸イオンの動態をさらに調べました。以前の研究では、骨格筋は哺乳類の硝酸イオンの主要な貯蔵器官であり、運動中のNOの直接的な供給源として特定されていました。したがって、骨格筋の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための信頼できる方法論を確立することは重要であり、他の組織サンプルへの適用を拡大するのに役立つはずです。この論文では、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のために、3つの異なる均質化方法を使用して骨格筋サンプルの調製について詳しく説明し、サンプルのサイズを含む均質化プロセスに関連する重要な問題について議論します。硝酸塩と亜硝酸塩の濃度も、4つの異なる筋肉グループで比較されています。
Introduction
小さなガス状のシグナル伝達分子である一酸化窒素(NO)は、生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします1。NOは、硝酸塩(NO 3-)およびおそらく亜硝酸塩(NO2-)への急速な酸化を受ける前に、一酸化窒素シンターゼ(NOS)ファミリーの内因性酵素によってL-アルギニンから生成することができます血液および組織2,3。最近、これらのアニオンは哺乳類系においてNOに還元されることが示されている4。硝酸塩は、主に唾液腺から分泌され、直接摂取されたイオンに作用する口腔内の共生細菌硝酸レダクターゼ5、およびある程度はキサンチンオキシドレダクターゼ6,7などの哺乳類の酵素によって亜硝酸塩に変換されます。亜硝酸塩は、デオキシヘモグロビン8、デオキシミオグロビン9、モリブデン含有酵素10、およびプロトン11,12の存在下での非酵素的還元を含むいくつかのメカニズムによってさらにNOに還元することができる。
この硝酸塩-亜硝酸塩-NO経路は、NOSがNO生成4のために酸素を必要とするため、NOS活性が低下する低酸素条件下で増強される。最近の多くの研究では、血圧調節と運動パフォーマンスに対する食事性硝酸塩の有益な効果が報告されており、硝酸塩還元経路がNOシグナル伝達の増強に寄与することが示唆されています13,14,15。以前の研究では、いくつかの骨格筋が体内の主要な硝酸塩貯蔵場所である可能性が高いことが示されています16。血液や肝臓などの他の内臓と比較して、骨格筋(大殿筋)は有意に高いレベルの硝酸塩を含み、哺乳類の体内にかなりの質量を持っています。トレッドミル運動は、ラットモデル7において、亜硝酸塩および大臀筋中のNOへの硝酸塩還元を促進することが示された。これらの結果は、いくつかの骨格筋が生理学的状況における硝酸塩還元経路を介したNOの重要な供給源である可能性があることを示唆しています。より最近の研究では、運動中の筋肉の硝酸レベルの変化を含むこれらの発見は、人間でも発生することが示唆されています17。
現在の著者のうちの2人は、血液および他の液体サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩レベルを測定する方法を以前に確立していた18。しかし、組織ホモジネート中のこれらのアニオンのレベルが最初に分析されたとき、詳細なプロトコルは利用できませんでした。いくつかの異なる臓器における硝酸塩-亜硝酸塩-NOのダイナミクスを理解するために、私たちの目標は、骨格筋を含む哺乳類組織の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定するための正確で効率的な方法を開発することでした。以前の研究では、げっ歯類の組織を使用して信頼性の高い均質化プロセスを開発し、それらのホモジネート中の硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を分析しました7,16,19。この均質化法の使用は、ヒト骨格筋生検サンプルに拡大され、それによって値が確認され、重要なことに、血液/血漿と比較して筋肉について観察された値は、げっ歯類で観察されたものと同様の範囲および比率であった17。近年、他のグループも骨格筋ホモジネート中の硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定し始め、私たちのグループによって報告されたものと同等の値を報告しました20,21。
このプロトコルペーパーの目的は、硝酸塩と亜硝酸塩のレベルをその後測定するための3つの異なる均質化方法を使用した骨格筋ホモジネートの調製を詳細に説明することです。さらに、骨格筋サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩の値に対する均質化に使用される組織重量の影響を調べました。これらの手法は、他の種類の哺乳類組織にも容易に適用できると考えています。近年、特に運動生理学の分野では、筋肉群による硝酸塩/亜硝酸塩/NO生理機能の違いが注目されています。また、4つの異なるげっ歯類の筋肉における硝酸塩と亜硝酸塩の量を報告し、これらの異なる筋肉間で両方のイオンの不均一な分布を発見しました。さらなる研究が必要な観察。
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Protocol
動物プロトコルは、NIDDK動物管理および使用委員会(ASP K049-MMB-20)によって承認されました。動物は、AAALACのウェブサイトで無料で入手できる実験動物の世話と使用に関する現在のガイドに従って取り扱われました。
1.ラット骨格筋収集
- ラットが深い麻酔下にある間(5%イソフルラン、尾/脚のピンチに対する反応がないことによって確認)、左心室の頂点に19 Gの針を配置し、右心房に刻み目を作ることにより、ヘパリンを含む生理食塩水で灌流を開始します。.少なくとも1.5リットル/ kgが組織を流れるまで、ヘパリンを含む生理食塩水を内臓に灌流させます。.この時点で、動物は放血で死んでおり、死体はサンプル収集のために処理する準備ができています。
注:亜硝酸塩は残りのヘモグロビンによって硝酸塩に酸化されるため、特に亜硝酸塩の正確な測定には、良好な灌流を達成することが重要です。 - 標的筋肉組織を同定し、清浄な手術器具を用いて後肢22 からそれらを切除する。筋肉組織からできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除きます。
- 必要な量の筋肉を微量遠心チューブに入れ、ドライアイスの上に置きます。ティッシュを充填したチューブを-80°Cの冷凍庫に保管します。
注:ヒト生検サンプルの場合は、採取後すぐにきれいなガーゼで完全に拭き取り、余分な血液を取り除きます。
2.均質化の準備
- 亜硝酸塩保存液(ストップ液)の調製
- 890 mMのフェリシアン化カリウム(K3Fe(CN)6)と118 mM NEM(N-エチルマレイミド)を蒸留水に含む透明な黄色の溶液を調製し、結晶がないことを確認します。非イオン性界面活性剤(洗剤)を1:9の比率(v / v、 材料表)で加え、泡立ちを避けるために穏やかに混ぜます。
- 停止液を蒸留水で1:9の比率に希釈します。希釈停止液(筋肉組織と希釈停止液の比率1:5)をホモジナイズチューブに入れます。
注:20ミリグラムの組織には100μLの停止液が必要であり、200mgの組織にはチューブ内の1000μLの停止液が必要です。添加溶液中の界面活性剤の存在は、細胞膜の破壊にとって重要である。任意の非イオン性界面活性剤を使用できますが、化学発光法に干渉しないことを確認するように注意する必要があります。
- ティッシュの準備
- -80°Cの冷凍庫からティッシュを取り出し、氷中でゆっくりと解凍します。骨格筋から残りの脂肪と結合組織を取り除きます。骨格筋の断片を切り取り、ガーゼで拭いて乾かします。
- 組織の量(20、50、および200 mg)を量ります。事前に計量した骨格筋をホモジナイズチューブのストップ溶液に入れるか、事前に計量した組織を清潔な微量遠心チューブに入れて後で使用できます。
3.均質化
- ロータリーホモジナイザー(図1)
- 事前に計量された骨格筋と事前に測定された停止液を含むM型チューブを機械に入れます。各サンプルを2回ホモジナイズし(最も破壊的なホモジナイズサイクルに設定)、各ホモジナイズ直後にチューブを氷上に5分間置き、冷却します。
- 2,000 × g 、4°Cで5分間短時間遠心分離します。チューブ全体を氷上に戻し、適切な量のメタノール(≥99.9%、組織重量の10倍)を加えます。15秒間徹底的に渦巻きます。
注:20 mgの組織には、200 μLのメタノールを使用してください。メタノールは、組織ホモジネートからタンパク質を沈殿させるために使用され、化学発光法を妨げません。他のタンパク質沈殿法を使用する場合は、化学発光との適合性をテストします。 - もう一度ホモジナイズし、氷上で30分間インキュベートします。サンプルを4°Cで35分間遠心分離し、3,500 × gを遠心分離します。上清を吸引し、亜硝酸塩/硝酸塩レベルを測定するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。
- ビーズホモジナイザー(図2)
- 骨格筋組織をビーズ含有チューブ(組織:希釈停止液の比率1:5)に入れ、使用する機器で利用可能な最高速度で45秒間2回ホモジナイズします。各均質化の直後にチューブを氷上に5分間置き、冷却します。
- 小型の卓上遠心分離機(2,000 x g)を使用して5秒間短時間遠心分離します。チューブを氷上に戻し、適切な量のメタノール(純度99.9%≥、組織重量の10倍)を加えます。15秒間徹底的に渦巻きます。
注1:20 mgの組織には、200 μLのメタノールを使用してください。
注2:メタノールは、組織ホモジネートからタンパク質を沈殿させるために使用され、化学発光法を妨げません。他のタンパク質沈殿法を使用する場合は、化学発光との適合性をテストします。 - 使用する機器で利用可能な最高速度で45秒間もう一度均質化します。氷上で30分間インキュベートします。17,000 x g、4°C、30分間の遠心分離機。上清を吸引し、亜硝酸塩/硝酸塩レベルを測定するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。
- 粉砕機(図3)
- 希釈した停止液(組織重量の5倍)を含むチューブを準備し、それらを計量します。重量を記録します(チューブ+ストップ溶液)。
- 液体窒素粉砕機ツールをドライアイスの上に置き、希望の温度になるまで約30分間待ちます。
- 液体窒素で冷却したピンセットを用いて、1つのサンプル(組織重量測定済み)を粉砕機に移す。スプーン一杯の液体窒素を加えて、組織が液体窒素温度になるようにします。
- 液体窒素の95%が気化したら、破砕工具を組織の上に置き、しっかりと押します。サンプルのつぶれを感じるはずです。木槌を使用して、破砕工具を3〜5倍叩きます。
- 液体窒素で冷却したスプーンを使用して、サンプルに残りのチャンクがないか確認します。液体窒素で冷却した後、ティッシュペーパーを使用して、ティッシュに触れる前に凍結水を拭き取ります。チャンクが存在する場合は、それを中央に移動してから、木槌でさらに5〜6回叩きます。
- サンプル全体が粉砕されたら、液体窒素冷却スプーンを使用して、希釈停止液を含む事前に計量されたチューブに粉砕組織を直接移します(ステップ3.3.1)。押しつぶされた骨格筋が熱くなると、粘着性があり、移動しにくくなるため、この手順をすばやく実行してください。
- 15秒間渦。チューブを開いて、チューブの上部に組織が詰まっていないことを確認します。ある場合は、それを取り除いてから、もう一度渦を巻いてみてください。
- 小型の卓上遠心分離機を使用してサンプルを2〜3秒間遠心分離します。チューブの重量をもう一度量ります。この新しい重量から元のチューブ重量(ステップ3.3.1)を差し引いて、組織の重量を計算します。チューブを氷の上に置きます。
注:正確な重量は、正確な組織重量と粉砕中に失われた組織の量を決定するのに役立ちます。 - ステップ3.3.8までのすべてのサンプルが処理されたら、適切な量のメタノール(≥99.9%、組織重量の10倍)を追加します。15秒間徹底的にボルテックスし、氷上で30分間インキュベートします。
注:20 mgの組織には、200 μLのメタノールを使用してください。メタノールは、組織ホモジネートからタンパク質を沈殿させるために使用され、化学発光法を妨げません。他のタンパク質沈殿法を使用する場合は、化学発光との適合性をテストします。 - 17,000 × g、4°C、30分間遠心分離機上清を吸引して亜硝酸塩/硝酸塩レベルを測定するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。
4. 一酸化窒素分析装置(NOA)による亜硝酸塩/硝酸塩測定
- 上記の3つの異なる均質化方法のいずれかによってすべてのサンプルを準備し、硝酸塩および亜硝酸塩の測定のためにそれらをNOAに注入します。
注:NOAの使用に関する詳細なプロトコルは、以前に公開されています19。
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Representative Results
代表的な結果を得るために、8匹のWistarラット(雄および雌、体重250±50g)の骨格筋組織を使用した。ラット骨格筋ホモジネート(各方法で50mgの大殿筋)を3つの異なるホモジナイズツール(回転ホモジナイザー、ビーズホモジナイザー、および粉砕機)によって調製した。次に、これらのホモジネートの硝酸塩と亜硝酸塩の含有量を、一酸化窒素分析装置(NOA)を使用して測定しました(図4)。これら3つのホモジネートサンプルの硝酸塩レベル(図4A)は互いに非常に似ており、39.6〜45.2 nmol / gの範囲でした。
興味深いことに、粉砕機で調製したホモジネートサンプルの亜硝酸塩レベル(図4B)は最も高い値(0.99 ± 0.15 nmol / g)を示し、これは他の2つのサンプル値とは統計的に異なっていました。組織のサイズが均質化効率と結果として生じる硝酸塩と亜硝酸塩の値に影響を与えるかどうかをテストするために、3つの異なる骨格筋組織サイズ(20、50、および200 mgの臀筋組織)を使用してビーズホモジナイザーによる均質化を行いました(図5)。硝酸塩(図5A)も亜硝酸塩(図5B)のレベルも、筋肉のサンプルサイズ間で有意差はありませんでした。ただし、サンプルサイズを大きくすると、理由は不明ですが、複数の実験でわずかに低い硝酸塩濃度が観察されました。.
次に、異なる種類のげっ歯類脚骨格筋組織における硝酸塩および亜硝酸塩レベルを測定した(図6)。大殿筋に加えて、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、および腓腹筋(各50 mg)をラットの脚から分離し、ビーズホモジナイザーを使用してホモジナイズしました。驚いたことに、大殿筋の硝酸塩レベル(40.4 nmol / g)は、他の3つの筋肉組織の硝酸塩レベルよりも約2倍高かったが、この特定の実験では、これらの差は統計的有意性に達しなかった(図6A)。臀筋の亜硝酸塩濃度も他の3つの筋肉組織よりも高く、腓腹筋サンプルの亜硝酸塩濃度よりも有意に高かった(図6B)。
使用した3つの方法すべての変動係数を決定し、結果は添付の表にあります。比較のために、表はTroutmanら21によって決定された変動係数も示している。
図1:ロータリーホモジナイザー。 (a)ホモジナイザー;(b)組織および停止液を含むチューブ。骨格筋組織サンプルを希釈停止液と共にチューブに入れ、3回ホモジナイズする。サンプルは、各均質化ステップの後、すぐに氷上に置く必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ビーズホモジナイザー。 (a)ホモジナイザー;(b)ビーズ含有チューブ。骨格筋組織サンプルを希釈停止液を含むビーズ含有チューブ(セラミックビーズ5個)に入れ、合計3回ホモジナイズします(毎回最高速度で45秒)。サンプルは、各均質化ステップの後、すぐに氷上に置く必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:粉砕機 。 (A)粉砕機部品 (B)粉砕機本体-乳鉢と乳棒を組み立てた。(C)乳鉢と乳棒の組み立ての詳細。粉砕機部品をドライアイス上で30分間冷却する。液体窒素を乳鉢に入れ、次に事前に計量した骨格筋組織を加えます。液体窒素の90パーセントがなくなった後、上部 - 乳棒 - が洗面器に挿入されます。サンプルが粉末になるまで、乳棒を木槌で5〜6回叩きます。次に、粉末組織をストップ溶液を含むチューブに移します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:3つの異なる均質化法によって調製された大殿筋ホモジネート中の(A)硝酸塩および(B)亜硝酸塩含有量。 50ミリグラムの殿筋を3つの異なる均質化法によって均質化した。ホモジネートにメタノール(500 μL)を加えてタンパク質を沈殿させた。塩化バナジウムまたは三ヨウ化物溶液を用いた標準的な化学発光法を用いて、遠心分離後の透明な上清中の硝酸塩および亜硝酸塩レベルをそれぞれ測定した。n = 7(硝酸塩);n = 8(亜硝酸塩);データは、一元配置分散分析を使用して、SD、* p<0.05±平均値として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:(A)大殿筋の異なるサンプルサイズにおける硝酸塩および(B)亜硝酸塩含有量。 3つの異なるサイズの大殿筋ホモジネートをビーズホモジナイザーを用いて調製した。塩化バナジウムまたは三ヨウ化物溶液を用いた標準的な化学発光法を用いて、遠心分離後の透明な上清中の硝酸塩および亜硝酸塩レベルをそれぞれ測定した。n = 7(硝酸塩);n = 8(亜硝酸塩);データはSD±平均値として表示されていますが、 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:4つの異なる筋肉の(A)硝酸塩と(B)亜硝酸塩の含有量。 ビーズホモジナイザーを使用して各筋肉(50 mg)を均質化し、塩化バナジウムまたは三ヨウ化物溶液を使用した標準的な化学発光法を使用して、硝酸塩および亜硝酸塩レベルをそれぞれ測定しました。n = 4-7(硝酸塩);n = 3-8(亜硝酸塩);データは、一元配置分散分析を使用して、SD、* p<0.05±平均値として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生理学的介入の機能としてNO代謝物、硝酸塩および亜硝酸塩の変化を監視するには、代謝に重要なさまざまな臓器におけるこれらのイオンのレベルを測定することが不可欠です。血液中のヘモグロビンはNOとその代謝物と反応するため、組織サンプルからできるだけ迅速に血液を除去することも重要です。したがって、動物に生理食塩水を灌流してから骨格筋組織(臀筋、TA、EDL、腓腹筋)を収集し、標的筋肉の周囲の結合組織と脂肪を直ちに除去しました。ホモジナイズ溶液については、さまざまな組織で亜硝酸塩を保存するために、フェリシアン化物、NEM、および非イオン性界面活性剤を特別に配合した「停止溶液」19。非イオン性界面活性剤の存在は、細胞膜を完全に破壊するために重要です。本研究で用いた2台のホモジナイズ機、回転式ホモジナイザーとビーズホモジナイザーの場合、ホモジナイズに必要な停止液の量は組織重量の5倍であり、組織全体が溶液に完全に沈められ、均質に処理されました。
均質化プロセスは、計3回(メタノールを添加する前に2回、メタノールを添加してタンパク質を沈殿させた後にもう1回)実行され、毎回、機器メーカーによって決定されたプログラムされた設定を使用して行われました。ホモジナイズ中に発生する可能性のある穏やかな加熱によるサンプルの劣化を防ぐために、各ホモジナイズ直後にサンプルを氷上に置くことが重要です。粉砕法では、まず組織サンプルを液体窒素で凍結させながら粉末状に粉砕し、次にサンプルをストップ溶液(組織重量の5倍)と混合しました。3つの方法すべてにおいて、メタノール(組織重量の10倍)をサンプルに添加し、混合物を氷上で30分間インキュベートしてタンパク質を沈殿させ、組織から硝酸塩と亜硝酸塩を完全に抽出しました。化学発光を使用する場合、サンプル中にタンパク質が存在すると、チャンバー内の反応溶液が過度に発泡する可能性があるため、サンプルからタンパク質を沈殿させる必要があります。沈殿剤はいずれも使用可能ですが、化学発光法に干渉したり、これらのイオンと反応して亜硝酸塩/硝酸塩濃度の変化を起こさないことを確認する必要があります。
3つの方法で調製されたすべての殿筋サンプルの硝酸塩レベルは非常に類似しており(39.6-45.2 nmol / g、 図4A)、これら3つの均質化方法が硝酸塩分析用の筋肉サンプルの調製に等しく適用可能であることが示唆されました。亜硝酸塩レベルは、他の2つの方法と比較して粉砕によって調製されたサンプルでわずかに高かったが(図4B)、すべての測定値は限られた範囲(0.64-0.99 nmol / g)であった。骨格筋サンプルの硝酸塩と亜硝酸塩の値に対する組織サンプルサイズの影響は、研究者が非常に小さなサンプル、特に小動物や人間の筋生検からのサンプルを扱うことが多いため、調べられました。これらの実験では、硝酸塩レベルも亜硝酸塩レベルも骨格筋組織20〜200 mgの範囲で有意差はありませんでした(図5)。
ただし、統計的に有意ではありませんが、硝酸塩レベルは、より大きなサンプルで測定するとわずかに低くなる傾向があることに注意してください(図5)。私たちは、発表された研究と未発表の研究の過程でこの現象に気づきましたが、その理由はわかりません。したがって、複数の組織サンプルからホモジネートを調製する場合は、サンプル重量を考慮し、理想的には研究全体で一貫性を保つことが重要です。小さいサンプル(20 mg)を扱う場合の別の考慮事項は、処理されたサンプルの最終的な総量が~300 μLしかないため、同じサンプルを複数回測定する可能性が大幅に低下することです。ただし、特に人間の研究では、20 mgが筋生検の通常の許容サイズです。
ラットの脚の異なる筋肉が異なる硝酸塩/亜硝酸塩含有量を持つかどうかを調べるために、それらのイオンの濃度を4つの異なる脚の筋肉で比較しました(図6)。硝酸塩と亜硝酸塩の両方のレベルは、他の3つの筋肉組織と比較して大臀筋で最も高かったが、この研究ではその差は統計的有意性に達しておらず、さまざまな筋肉タイプの硝酸塩代謝が異なる方法で制御されている可能性があることを示唆している。この現象は現在、より詳細に調査されています。
他の研究グループも骨格筋の硝酸塩濃度を報告しており、これらの値の有意な変動性を明らかにしています。Cogganグループは、Sprague Dawleyラットヒラメ筋の硝酸塩レベルが筋肉の準備方法に応じて62から124 nmol / gまで変化することを示しました21。同じグループが別の研究でSDラット外側広筋(約60 nmol / g)とヒラメ筋(約215 nmol / g)の硝酸塩値を報告しました23。大竹らは、マウス腓腹筋の硝酸塩濃度を>300 nmol/gで測定した。しかしながら、筋肉ホモジネート調製のための正確な方法は記載されていなかった24。Verdijkグループは、ヒト筋生検(外側広筋)の硝酸塩含有量を報告し、参加者の年齢に応じて54〜80 nmol / gの範囲でした。同様の研究では、ワイリーらは同じ筋肉群17に対して226 nmol / gを報告しています。これらの結果は、骨格筋サンプル中の硝酸塩/亜硝酸塩の濃度が、生理学的(運動状態など)、環境(食事など)、技術的(アッセイの詳細)など、多くの要因を反映していることを示唆しており、これらすべてが測定のばらつきに寄与していると考えられます。
ここに示されている3つの方法すべての変動係数(CV)を決定しました-添付の補足ファイルを参照してください。CVが理想からかけ離れており、使用される方法によって異なる場合でも、CV値は、サンプルの処理が異なる同様の方法を使用してTroutmanらによって発表されたものと比較できます 21 。残念ながら、なぜこのような高い変動性が続くのか、明確な説明はまだありません。この論文は、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のために筋肉サンプルを処理するために私たちが知っている唯一の公開された詳細なプロトコルです。
また、硝酸塩添加筋肉サンプルからの直線性と硝酸塩回収率を測定しました(添付の補足ファイルを参照)。ホモジナイズのために3つの異なる濃度の硝酸塩を大殿筋サンプルに添加すると、ビーズとロータリーホモジナイザーの両方で硝酸塩濃度の増加において良好な線形応答が得られ、添加された硝酸塩の回収率は~80%でした。これらの結果は、両方の均質化法が、生物学的サンプル中の硝酸塩および亜硝酸塩レベルの測定に確実に使用できることを示しています。添加された硝酸塩の20%の損失は、一部のイオンが荷電タンパク質または他の細胞部分と共沈する可能性がある筋肉組織ホモジネートの除タンパクおよび遠心分離中に発生する可能性があります。
一般的に、硝酸塩と亜硝酸塩の測定のための筋肉サンプル調製の提案方法が、運動研究分野だけでなく臨床研究にも役立つことを期待しています。一酸化窒素サイクルの機能不全に関連する可能性があり、硝酸塩の供給の恩恵を受ける可能性のある大規模な集団に影響を与える神経筋および/または代謝障害があります。.しかし、最初に、NO欠乏症が実際に存在するかどうか、そしてそれが食事療法によって修正できるかどうかを確認する必要があります。ここで説明した方法により、NOサイクルの硝酸塩やその他の代謝物の運命を骨格筋やその他の臓器で監視できるようになることを願っています。
その開発のこの時点で、化学発光(窒素酸化物自体のすべての測定の中で最も定量的)を使用した硝酸塩および亜硝酸塩測定のための骨格筋調製の方法にはまだ未知の変数があり、そのうちのいくつかは上で議論されていることを認識しています。ただし、その制限があっても、記載された方法は、異なる骨格筋を含む異なる臓器の硝酸塩/亜硝酸塩レベルの合理的に正確な比較を可能にし、合理的な精度でテストできる仮説の定式化を可能にするはずです。
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Disclosures
著者は、利益相反はないと宣言しています。Alan N. Schechterは、心血管疾患の治療のための亜硝酸塩の使用について国立衛生研究所に発行されたいくつかの特許の共同発明者としてリストされています。彼は、臨床開発のためのこれらの特許のNIHライセンスに基づいてロイヤルティを受け取りますが、他の補償は受け取りません。これらの取り決めは、JoVEジャーナルポリシーの遵守には影響しません。
Acknowledgments
この作業は、学内NIH / NIDDK助成金ZIA DK 0251041-14によって、メリーランド州アランNシェクターに支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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