Summary
Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.
Abstract
Íons de nitrato (NO3-) já foram pensados para ser produtos finais inertes do metabolismo do óxido nítrico (NO). No entanto, estudos anteriores demonstraram que os íons nitrato podem ser convertidos de volta ao NO em mamíferos através de um mecanismo de redução de duas etapas: o nitrato sendo reduzido a nitrito (NO2-) principalmente por bactérias comensais orais, em seguida, o nitrito sendo reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo através de proteínas contendo heme ou molibdênio. Esta via redutora do nitrato contribui para melhorar as vias de sinalização mediadas pelo NO, particularmente no sistema cardiovascular e durante o exercício muscular. Os níveis de nitrato no organismo antes dessa utilização são determinados por duas fontes diferentes: oxidação endógena do NO e ingestão dietética de nitrato, principalmente de plantas. Para elucidar o complexo ciclo do NO em circunstâncias fisiológicas, examinamos ainda mais a dinâmica de seus metabólitos, nitrato e íons nitrito, que são relativamente estáveis em comparação com o NO. Em estudos anteriores, o músculo esquelético foi identificado como um importante órgão de armazenamento de íons nitrato em mamíferos, bem como uma fonte direta de NO durante o exercício. Portanto, estabelecer uma metodologia confiável para medir os níveis de nitrato e nitrito no músculo esquelético é importante e deve ser útil para estender sua aplicação a outras amostras de tecido. Este artigo explica em detalhes a preparação de amostras de músculo esquelético, utilizando três métodos de homogeneização diferentes, para medições de nitrato e nitrito e discute questões importantes relacionadas aos processos de homogeneização, incluindo o tamanho das amostras. As concentrações de nitrato e nitrito também foram comparadas em quatro grupos musculares diferentes.
Introduction
O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula sinalizadora gasosa, desempenha um papel crítico nos processos fisiológicos e fisiopatológicos1. O NO pode ser produzido a partir da L-arginina por enzimas endógenas da família da óxido nítrico sintase (NOS) antes de ser submetido à rápida oxidação em nitrato (NO 3-) e, possivelmente, nitrito (NO 2-) no sangue e nos tecidos 2,3. Recentemente, esses ânions demonstraram ser reduzidos de volta ao NO em sistemas de mamíferos4. O nitrato é convertido em nitrito, principalmente por nitrato redutases bacterianas comensais na cavidade oral atuando sobre íons secretados pelas glândulas salivares e ingeridos diretamente 5 e, em certa medida, por enzimas de mamíferos como a xantina oxidorredutase 6,7. O nitrito pode ser ainda reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo desoxihemoglobina8, desoximioglobina9, enzimas contendo molibdênio 10 e redução não enzimática na presença de prótons11,12.
Esta via nitrato-nitrito-NO é reforçada em condições hipóxicas, em que a atividade da NOS é diminuída porque a NOS requer oxigénio para a geração NO4. Muitos estudos recentes têm relatado efeitos benéficos do nitrato dietético na regulação da pressão arterial e no desempenho do exercício, sugerindo que as vias de redução do nitrato contribuem para o aumento da sinalização do NO13,14,15. Estudos anteriores mostraram que alguns músculos esqueléticos são provavelmente os principais locais de armazenamento de nitrato no corpo16. Em comparação com o sangue ou outros órgãos internos, como o fígado, o músculo esquelético (glúteo máximo) contém níveis significativamente mais elevados de nitrato e tem uma massa substancial no corpo dos mamíferos. O exercício em esteira foi mostrado para aumentar a redução de nitrato para nitrito e para NO em glúteos em um modelode rato 7. Esses resultados implicam que alguns músculos esqueléticos podem ser fontes importantes de NO através de vias de redução de nitrato em situações fisiológicas. Estudos mais recentes sugerem que esses achados, incluindo alterações nos níveis de nitrato muscular durante o exercício, também ocorrem em humanos17.
Dois dos autores atuais já haviam estabelecido um método para medir os níveis de nitrato e nitrito no sangue e em outras amostras líquidas18. No entanto, quando os níveis desses ânions em homogeneizados teciduais foram inicialmente analisados, protocolos detalhados não estavam disponíveis. Para entender a dinâmica nitrato-nitrito-NO em vários órgãos diferentes, nosso objetivo foi desenvolver um método preciso e eficiente para medir os níveis de nitrato e nitrito em tecidos de mamíferos, incluindo o músculo esquelético. Em estudos anteriores, tecidos de roedores foram utilizados para desenvolver processos de homogeneização confiáveis e, em seguida, analisar os teores de nitrato e nitrito nesses homogeneizados 7,16,19. O uso desse método de homogeneização foi estendido às amostras de biópsia do músculo esquelético humano, sendo confirmados os valores e, o que é mais importante, os valores observados para o músculo em comparação com o sangue/plasma estavam em faixas e proporções semelhantes às observadas em roedores17. Nos últimos anos, outros grupos também começaram a medir os níveis de nitrato e nitrito em homogeneizados musculares esqueléticos, relatando valores comparáveis aos relatados por nosso grupo20,21.
O objetivo deste trabalho de protocolo é descrever em detalhes a preparação de homogeneizados musculares esqueléticos utilizando três diferentes métodos de homogeneização para posterior medição dos níveis de nitrato e nitrito. Além disso, os efeitos do peso tecidual utilizado para homogeneização sobre os valores de nitrato e nitrito em amostras de músculo esquelético foram examinados. Acreditamos que esses métodos podem ser facilmente aplicados a outros tipos de tecidos de mamíferos. Recentemente, especialmente no campo da fisiologia do exercício, foi dada atenção às possíveis diferenças na fisiologia do nitrato/nitrito/NO de acordo com os grupos musculares. Também relatamos as quantidades de nitrato e nitrito em quatro músculos de roedores diferentes e encontramos uma distribuição não uniforme de ambos os íons entre esses diferentes músculos; uma observação que requer um estudo mais aprofundado.
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Protocol
O protocolo animal foi aprovado pelo NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Os animais foram manuseados e tratados de acordo com o atual Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, disponível gratuitamente no site da AAALAC.
1. Coleção muscular esquelética de ratos
- Enquanto um rato está sob anestesia profunda (isoflurano a 5%, confirmado pela reação ausente ao aperto da cauda / perna), inicie a perfusão com solução salina contendo heparina colocando uma agulha 19 G em um ápice do ventrículo esquerdo e fazendo um corte no átrio direito. Permita que a solução salina com heparina penetre através dos órgãos internos até que pelo menos 1,5 litro / kg tenha fluído através do tecido. Neste ponto, os animais estão mortos por exsanguinação e as carcaças estão prontas para serem processadas para coleta de amostras.
NOTA: Alcançar uma boa perfusão é fundamental, especialmente para medições precisas de nitrito, porque o nitrito é oxidado em nitrato por qualquer hemoglobina restante. - Identificar os tecidos musculares alvo e retirá-los das patas traseiras22 usando instrumentos cirúrgicos limpos. Remova o máximo de gordura e tecidos conjuntivos dos tecidos musculares quanto possível.
- Coloque a quantidade desejada de músculo em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, coloque no gelo seco. Conservar os tubos cheios de tecido no congelador a -80 °C.
NOTA: No caso de amostras de biópsia humana, apague-as completamente imediatamente após a coleta com gaze limpa para remover o excesso de sangue.
2. Preparação para homogeneização
- Preparação de solução que conserva nitritos (solução de paragem)
- Preparar uma solução amarela límpida contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K3Fe(CN)6) e 118 mM de NEM (N-etilmaleimida) em água destilada, garantindo a ausência de cristais. Adicione o tensoativo não iônico (detergente) na proporção de 1:9 (v/v, Tabela de Materiais) e misture suavemente para evitar a formação de espuma.
- Diluir a solução de paragem na proporção de 1:9 com água destilada. Colocar a solução de paragem diluída (proporção de 1:5 de tecido muscular para solução de paragem diluída) no tubo de homogeneização.
NOTA: Vinte miligramas de tecido exigirão 100 μL de solução de parada e 200 mg de tecido exigirão 1000 μL de solução de parada no tubo. A presença de detergente em solução adicionada é fundamental para a ruptura das membranas celulares. Qualquer detergente não iônico pode ser usado, mas deve-se tomar cuidado para verificar se ele não interfere com o método de quimioluminescência.
- Preparação de tecidos
- Retire o tecido do congelador a -80 °C e descongele lentamente no gelo. Remova a gordura restante e o tecido conjuntivo do músculo esquelético. Corte pedaços de músculo esquelético e borre na gaze para secar.
- Pese a quantidade de tecido (20, 50 e 200 mg). Coloque o músculo esquelético pré-pesado na solução de parada nos tubos de homogeneização ou coloque o tecido pré-pesado em um tubo de microcentrífuga limpo para uso posterior.
3. Homogeneização
- Homogeneizador rotativo (Figura 1)
- Coloque na máquina o tubo do tipo M que contém o músculo esquelético pré-pesado e a solução de paragem pré-medida. Homogeneizar cada amostra duas vezes (colocando no ciclo de homogeneização mais destrutivo) e colocar o tubo no gelo imediatamente após cada homogeneização por 5 minutos para esfriar.
- Centrifugar brevemente a 2.000 × g e 4 °C durante 5 min. Coloque o tubo cheio de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol (≥ 99,9%, 10x do peso do tecido). Vórtice completamente por 15 s.
NOTA: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência. - Homogeneize mais uma vez e incube no gelo por 30 min. Centrifugar as amostras durante 35 minutos a 4 °C e 3 500 × g. Aspirar o sobrenadante e medir os níveis de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.
- Homogeneizador de esferas (Figura 2)
- Colocar o tecido muscular esquelético num tubo contendo grânulos (proporção de 1:5 para tecido:solução de paragem diluída) e homogeneizar duas vezes durante 45 s à velocidade mais elevada disponível no instrumento utilizado. Coloque o tubo no gelo imediatamente após cada homogeneização por 5 minutos para esfriar.
- Centrífuga brevemente usando uma pequena centrífuga de desktop (2.000 x g) por 5 seg. Coloque o tubo de volta no gelo e adicione um volume apropriado de metanol (pureza ≥ 99,9%, 10x do peso do tecido). Vórtice completamente por 15 s.
NOTA 1: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol.
NOTA 2: O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência. - Homogeneizar mais uma vez por 45 s na velocidade mais alta disponível no instrumento utilizado. Incubar no gelo por 30 min. Centrífuga a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirar o sobrenadante e medir os níveis de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.
- Pulverizador (Figura 3)
- Preparar tubos contendo solução de parada diluída (5x do peso do tecido) e pesá-los. Registar o peso (tubo + solução de paragem).
- Coloque a ferramenta pulverizadora de nitrogênio líquido no gelo seco e aguarde aproximadamente 30 minutos para que ela atinja a temperatura desejada.
- Usando pinças resfriadas em nitrogênio líquido, transfira uma amostra (peso do tecido já medido) para o pulverizador. Adicione uma pequena colher de nitrogênio líquido para garantir que o tecido esteja à temperatura do nitrogênio líquido.
- Depois que 95% do nitrogênio líquido tiver vaporizado, coloque a ferramenta de esmagamento em cima do tecido e pressione firmemente. Você deve sentir o esmagamento da amostra. Usando o martelo, bata na ferramenta de esmagamento 3-5x.
- Verifique a amostra para quaisquer pedaços restantes usando uma colher resfriada em nitrogênio líquido. Depois de resfriar em nitrogênio líquido, use um pedaço de papel de seda para limpar qualquer água congelada antes de tocar no tecido. Se um pedaço estiver presente, mova-o para o centro e, em seguida, ataque mais 5-6 vezes com o martelo.
- Quando toda a amostra tiver sido pulverizada, utilizar a colher de azoto líquido refrigerada para transferir directamente o tecido triturado para o tubo pré-pesado que contém a solução de paragem diluída (passo 3.3.1). Certifique-se de realizar esta etapa rapidamente, pois quando o músculo esquelético esmagado aquece, fica pegajoso e difícil de transferir.
- Vórtice por 15 s. Verifique se nenhum tecido está preso na parte superior do tubo, abrindo o tubo. Se houver, tente desalojá-lo e, em seguida, vórtice novamente.
- Centrifugar a amostra por 2-3 s usando uma pequena centrífuga de desktop. Pese o tubo novamente. Calcular o peso do tecido deduzindo o peso original do tubo (passo 3.3.1) deste novo peso. Coloque o tubo no gelo.
NOTA: Os pesos exatos ajudarão a determinar o peso exato do tecido e quanto tecido foi perdido durante a pulverização. - Uma vez que todas as amostras tenham sido processadas até ao passo 3.3.8, adicionar um volume adequado de metanol (≥ 99,9 %, 10x do peso tecidual). Vórtice completamente por 15 s e incube no gelo por 30 min.
NOTA: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência. - Centrífuga a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirar o sobrenadante e medir os teores de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.
4. Medição de nitrito/nitrato com analisador de óxido nítrico (NOA)
- Preparar todas as amostras por um dos três métodos de homogeneização diferentes descritos acima e injetá-las em um NOA para medição de nitrato e nitrito.
NOTA: Protocolos detalhados para uso da NOA foram publicados anteriormente19.
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Representative Results
Para a obtenção de resultados representativos, foram utilizados tecidos musculares esqueléticos de 8 ratos Wistar (machos e fêmeas, peso 250 ± 50 g). Homogeneizados do músculo esquelético de ratos (50 mg de músculo glúteo máximo para cada método) foram preparados por três diferentes ferramentas de homogeneização (homogeneizador rotativo, homogeneizador de esferas e pulverizador). Os teores de nitrato e nitrito desses homogeneizados foram então determinados por meio de um analisador de óxido nítrico (NOA) (Figura 4). Os níveis de nitrato (Figura 4A) nessas três amostras homogeneizadas foram muito semelhantes, variando de 39,6 a 45,2 nmol/g.
Curiosamente, os níveis de nitrito (Figura 4B) em uma amostra homogeneizada preparada por um pulverizador apresentaram o maior valor (0,99 ± 0,15 nmol/g), sendo este estatisticamente diferente dos outros dois valores amostrais. Para testar se o tamanho dos tecidos afetaria a eficiência de homogeneização e os valores resultantes de nitrato e nitrito, três diferentes tamanhos de tecido muscular esquelético (tecido muscular glúteo de 20, 50 e 200 mg) foram utilizados para homogeneização por um homogeneizador de esferas (Figura 5). Nem os níveis de nitrato (Figura 5A) nem de nitrito (Figura 5B) foram significativamente diferentes entre os tamanhos das amostras musculares. No entanto, concentrações ligeiramente mais baixas de nitrato foram observadas quando o tamanho da amostra foi aumentado, em vários experimentos por razões que não são claras.
Em seguida, foram medidos os níveis de nitrato e nitrito em diferentes tipos de tecidos musculares esqueléticos da perna de roedores (Figura 6). Além do músculo glúteo máximo, os músculos tibial anterior (AT), extensor longo dos dedos (EDL) e gastrocnêmio (50 mg cada) foram isolados de patas de ratos e homogeneizados com homogeneizador de contas. Surpreendentemente, os níveis de nitrato do músculo glúteo (40,4 nmol/g) foram aproximadamente duas vezes maiores do que os dos outros três tecidos musculares, embora neste experimento em particular essas diferenças não tenham atingido significância estatística (Figura 6A). A concentração de nitrito no músculo glúteo também foi maior que a dos outros três tecidos musculares e significativamente maior do que na amostra de gastrocnêmio (Figura 6B).
Determinamos o coeficiente de variação para os três métodos utilizados e os resultados estão na tabela anexa. Para comparação, a tabela também mostra os coeficientes de variação determinados por Troutman ecols.21.
Figura 1: Homogeneizador rotativo. (A) Homogeneizador; (B) tubo contendo tecido e solução de parada. Amostras de tecido muscular esquelético são colocadas em um tubo com solução de parada diluída e homogeneizadas três vezes. As amostras devem ser imediatamente colocadas no gelo após cada etapa de homogeneização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Homogeneizador de grânulos. (A) Homogeneizador; (B) grânulos contendo tubo. As amostras de tecido muscular esquelético são colocadas em um tubo contendo contas (5 grânulos cerâmicos) com solução de parada diluída e homogeneizadas três vezes no total (45 s na velocidade mais alta para cada vez). As amostras devem ser imediatamente colocadas no gelo após cada etapa de homogeneização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pulverizador . (A) partes do pulverizador (B) corpo do pulverizador - argamassa e pilão montados. (C) detalhe da argamassa e do conjunto do pilão. As peças do pulverizador são resfriadas em gelo seco por 30 minutos. O nitrogênio líquido é colocado na argamassa e, em seguida, o tecido muscular esquelético pré-pesado é adicionado. Depois que 90% do nitrogênio líquido desaparece, a porção superior - o pilão - é inserida na bacia. O pilão é batido com um martelo 5-6 vezes até que a amostra esteja em pó. O tecido em pó é então transferido para um tubo com solução de parada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: (A) Teor de nitrato e (B) nitrito em homogeneizados musculares glúteos preparados por três métodos de homogeneização diferentes. Cinquenta miligramas de músculo glúteo foram homogeneizados por três diferentes métodos de homogeneização. Metanol (500 μL) foi adicionado aos homogeneizados para precipitar proteínas. Um método padrão de quimioluminescência com cloreto de vanádio ou solução de triiodeto foi utilizado para medir os teores de nitrato e nitrito, respectivamente, no sobrenadante claro após centrifugação; n=7 (nitrato); n=8 (nitrito); os dados são apresentados como médias ± DP, * p < 0,05 usando ANOVA one-way. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: (A) Teor de nitrato e (B) nitrito em diferentes tamanhos de amostra de músculo glúteo. Três tamanhos diferentes de homogeneizados do músculo glúteo foram preparados usando um homogeneizador de contas. Um método padrão de quimioluminescência com cloreto de vanádio ou solução de triiodeto foi utilizado para medir os teores de nitrato e nitrito, respectivamente, no sobrenadante claro após centrifugação; n=7 (nitrato); n=8 (nitrito); os dados são apresentados como médias ± SD, Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: (A) Teor de nitrato e (B) nitrito em quatro músculos diferentes. Cada músculo (50 mg) foi homogeneizado por meio de um homogeneizador de contas, e um método padrão de quimioluminescência com cloreto de vanádio ou solução de triiodeto foi utilizado para medir os níveis de nitrato e nitrito, respectivamente; n=4-7 (nitrato); n=3-8 (nitrito); os dados são apresentados como médias ± DP, * p < 0,05 usando ANOVA one-way. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para monitorar as mudanças nos metabólitos do NO, nitrato e nitrito, em função de intervenções fisiológicas, é imperativo medir os níveis desses íons nos diferentes órgãos que são críticos em seu metabolismo. Como a hemoglobina no sangue reagirá com o NO e seus metabólitos, também é importante remover o sangue rapidamente das amostras de tecido, tanto quanto possível. Assim, os animais foram perfundidos com solução salina antes de coletar tecidos musculares esqueléticos (glúteos, TA, EDL, músculo gastrocnêmio), e o tecido conjuntivo e a gordura ao redor do músculo alvo foram imediatamente removidos. Para a solução de homogeneização, uma 'solução stop' foi especialmente formulada com ferricianeto, NEM e surfactante não iônico para preservar nitrito em vários tecidos19. A presença de detergente não iônico é fundamental para a ruptura total das membranas celulares. No caso das duas máquinas de homogeneização utilizadas neste estudo, o homogeneizador rotativo e o homogeneizador de contas, o volume de solução de parada necessário para a homogeneização foi de 5x o peso tecidual, de modo que todo o tecido foi totalmente submerso na solução e processado homogeneamente.
O processo de homogeneização foi realizado três vezes no total (duas vezes antes da adição de metanol e mais uma vez após a adição de metanol às proteínas precipitadas), cada vez utilizando uma configuração programada determinada pelos fabricantes do instrumento. É importante colocar as amostras no gelo imediatamente após cada homogeneização para evitar a deterioração da amostra pelo aquecimento suave, que pode ser gerado durante a homogeneização. Para o método de pulverização, as amostras de tecido foram inicialmente trituradas em pó, mantendo-as congeladas usando nitrogênio líquido, em seguida, as amostras foram misturadas com solução de parada (5x peso tecidual). Nos três métodos, metanol (10x peso tecidual) foi adicionado às amostras, e a mistura foi incubada em gelo por 30 min para precipitar proteínas e extrair totalmente nitrato e nitrito dos tecidos. A presença de proteínas na amostra pode causar formação excessiva de espuma da solução de reação na câmara ao usar quimioluminescência, por isso é necessário precipitar proteínas das amostras. Qualquer agente de precipitação pode ser usado, mas é necessário confirmar que tais agentes não interferirão com o método de quimioluminescência ou causarão quaisquer alterações nas concentrações de nitrito/nitrato reagindo com esses íons.
Os níveis de nitrato em todas as amostras de glúteos preparadas pelos três métodos foram muito semelhantes (39,6-45,2 nmol/g, Figura 4A), sugerindo que esses três métodos de homogeneização são igualmente aplicáveis à preparação de amostras musculares para análise de nitrato. Embora os níveis de nitrito tenham sido ligeiramente maiores nas amostras preparadas por pulverização em comparação com os outros dois métodos (Figura 4B), todos os valores medidos estavam em uma faixa limitada (0,64-0,99 nmol/g). O efeito do tamanho da amostra de tecido sobre os valores de nitrato e nitrito em amostras de músculo esquelético foi examinado porque os pesquisadores geralmente lidam com amostras muito pequenas, particularmente de pequenos animais ou biópsias musculares humanas. Nem os níveis de nitrato nem de nitrito foram significativamente diferentes na faixa de 20 a 200 mg de tecido muscular esquelético nesses experimentos (Figura 5).
No entanto, vale ressaltar que, embora não estatisticamente significativos, os teores de nitrato tendem a ser ligeiramente menores quando medidos em amostras maiores (Figura 5). Temos notado esse fenômeno ao longo de nossos estudos publicados e inéditos, mas não entendemos as razões para isso. Portanto, é provavelmente importante considerar os pesos das amostras e, idealmente, mantê-los consistentes ao longo de um estudo ao preparar homogeneizados de várias amostras de tecido. Outra consideração ao trabalhar com amostras menores (20 mg) é que o volume total final de amostra processada é de apenas ~300 μL, o que reduz significativamente a possibilidade de medir a mesma amostra várias vezes. No entanto, especialmente para estudos em humanos, 20 mg é o tamanho aceitável usual para biópsias musculares.
Para examinar se diferentes músculos em patas de ratos teriam diferentes teores de nitrato/nitrito, as concentrações desses íons foram comparadas em quatro músculos diferentes das pernas (Figura 6). Ambos os níveis de nitrato e nitrito foram mais elevados no músculo glúteo em comparação com três outros tecidos musculares, embora as diferenças não tenham atingido significância estatística neste estudo, sugerindo que o metabolismo do nitrato em vários tipos musculares pode ser governado de forma diferente. Esse fenômeno está sendo investigado com mais detalhes atualmente.
Outros grupos de pesquisa também relataram concentrações de nitrato muscular esquelético, revelando variabilidade significativa nesses valores. O grupo de Coggan mostrou que os níveis de nitrato no músculo sóleo de rato Sprague Dawley variam de 62 a 124 nmol/g, dependendo dos métodos de preparação muscular21. O mesmo grupo relatou valores de nitrato em ratos SD vastus lateralis (aproximadamente 60 nmol/g) e sóleo (aproximadamente 215 nmol/g) em outro estudo23. Ohtake et al. mediram concentrações de nitrato no músculo gastrocnêmio de camundongo de >300 nmol/g; no entanto, métodos precisos para o preparo do homogeneizado muscular não foram descritos24. O grupo de Verdijk relatou conteúdo de nitrato em biópsias musculares humanas (vastus lateralis) variando de 54 a 80 nmol/g, dependendo da idade do participantede 20 anos; em estudo semelhante, Wylie et al. relatam 226 nmol/g para o mesmo grupo muscular17. Esses resultados sugerem que as concentrações de nitrato/nitrito em amostras de músculo esquelético refletem muitos fatores – fisiológicos (por exemplo, status de exercício), ambientais (por exemplo, dieta) e técnicos (detalhes do ensaio) – todos os quais presumivelmente contribuem para a variabilidade da medição.
Determinamos o coeficiente de variabilidade (CV) para todos os três métodos aqui apresentados - ver arquivo suplementar em anexo. Mesmo que os CV estejam longe de ser ideais, e variem entre os métodos utilizados, nossos valores de CV são comparáveis aos publicados por Troutman et al.21 utilizando métodos semelhantes com tratamento diferente das amostras. Infelizmente, ainda não há uma explicação clara para a persistência de uma variabilidade tão alta; este artigo é o único protocolo detalhado publicado que conhecemos para o processamento de amostras musculares para determinação de nitrato e nitrito.
Também medimos a linearidade e o grau de recuperação de nitrato de amostras musculares com picos de nitrato (consulte o arquivo suplementar anexo). Quando adicionamos três concentrações diferentes de nitrato em amostras de glúteos para homogeneização, obtivemos uma boa resposta linear no aumento das concentrações de nitrato com ~80% de recuperação de nitrato adicionado para homogeneizadores de contas e rotativos. Estes resultados demonstram que ambos os métodos de homogeneização podem ser utilizados para a determinação dos teores de nitrato e nitrito em amostras biológicas com boa confiança. A perda de 20% de nitrato adicionado provavelmente está acontecendo durante a desproteinização e centrifugação do tecido muscular homogeneizado, quando alguns íons podem co-precipitar com proteínas carregadas ou outras partes celulares.
Em geral, esperamos que nosso método proposto de preparação de amostras musculares para medições de nitrato e nitrito seja útil não apenas no campo da pesquisa de exercícios, mas também em estudos clínicos. Existem distúrbios neuromusculares e/ou metabólicos que afetam grandes populações que podem estar relacionados ao mau funcionamento do ciclo do óxido nítrico e podem se beneficiar do suprimento de nitrato. No entanto, é preciso primeiro estabelecer se a deficiência de NO, de fato, existe e se ela pode ser corrigida pela intervenção dietética. Esperamos que o método descrito aqui permita que o destino do nitrato e outros metabólitos do ciclo do NO seja monitorado no músculo esquelético e em outros órgãos.
Estamos cientes de que, neste ponto de seu desenvolvimento, os métodos de preparação do músculo esquelético para medições de nitrato e nitrito usando quimioluminescência (a mais quantitativa de todas as determinações dos próprios óxidos de nitrogênio) ainda têm variáveis desconhecidas, algumas das quais são discutidas acima. No entanto, mesmo com suas limitações, os métodos descritos permitem uma comparação razoavelmente precisa dos níveis de nitrato/nitrito de diferentes órgãos, incluindo diferentes músculos esqueléticos, e devem permitir a formulação de hipóteses que possam ser testadas com razoável precisão.
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Disclosures
Os autores declaram não ter conflitos de interesse. Alan N. Schechter está listado como co-inventor em várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento do NIH dessas patentes para desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação. Esses arranjos não afetam sua adesão às políticas do periódico JoVE.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão intramural do NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
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