Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62439
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

Summary

פרוטוקול זה מתאר את איסוף המסתמים האאורטליים האנושיים המופקים במהלך הליכים כירורגיים להחלפת מסתם אבי העורקים או מרקמה קדבורית, ואת הבידוד, ההרחבה והאפיון שלאחר מכן של תאי אנדותל ותאי אינטרסטיציאליים ספציפיים למטופל. כלולים פרטים חשובים לגבי התהליכים הדרושים כדי להבטיח את הכדאיות של התא ואת הספציפיות הפנוטיפית.

Abstract

מחלת מסתם אבי העורקים (CAVD) קיימת בכמעט שליש מאוכלוסיית הקשישים. עיבוי, התקשות והסתיידות של מסתם אבי העורקים גורמים להיצרות אבי העורקים ותורמים לאי ספיקת לב ולשבץ. פתוגנזה של מחלות היא רב-גורמית, ולחצים כגון דלקת, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית, זרימה טורבולנטית ולחץ מכני ומתח תורמים להתמיינות אוסטאוגנית של תאי אנדותל ומסתם אינטרסטיציאליים. עם זאת, הגורמים היוזמים המדויקים המניעים את המעבר האוסטיאוגני של תא בריא לתא מסתנן אינם מוגדרים במלואם. יתר על כן, הטיפול הנוכחי היחיד להיצרות אבי העורקים המושרה על ידי CAVD הוא החלפת מסתם אבי העורקים, לפיה מסירים את המסתם המקורי (החלפת מסתם אבי העורקים כירורגי, SAVR) או מוחדר מסתם חלופי הניתן לכיווץ מלא באמצעות קטטר (החלפת מסתם אבי העורקים, TAVR). הליכים כירורגיים אלה באים בעלות גבוהה ועם סיכונים חמורים; לפיכך, זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות לגילוי תרופות הוא הכרחי. לשם כך, המחקר הנוכחי מפתח זרימת עבודה שבה רקמות שהוסרו בניתוח מחולים ורקמות של תורמים משמשות ליצירת קווים ראשוניים ספציפיים למטופל של תאים valvular עבור מודלים של מחלות חוץ גופיות. פרוטוקול זה מציג את השימוש בתמיסת אחסון קרה, המשמשת בדרך כלל בהשתלת איברים, כדי להפחית את הנזק הנגרם על ידי זמן הרכש הממושך לעתים קרובות בין כריתת רקמות לעיבוד במעבדה עם היתרון של ייצוב רב של התאים של הרקמה שנכרתה. תוצאות המחקר הנוכחי מראות כי תאי מסתמים מבודדים שומרים על יכולת ההתרבות שלהם ועל פנוטיפים אנדותליאליים ואינטרסטיציאליים בתרבית למעלה מכמה ימים לאחר הסרת המסתם מהתורם. השימוש בחומרים אלה מאפשר איסוף של תאי בקרה ו-CAVD, שמהם נקבעים קווי תאי בקרה וחולי.

Introduction

מחלת מסתם אבי העורקים קלציפית (CAVD) היא פתולוגיה כרונית המאופיינת בדלקת, פיברוזיס ומקרוקלציפיקציה של עלוני מסתם אבי העורקים. שיפוץ מתקדם והסתיידות של העלונים (המכונים טרשת אבי העורקים) עלולים להוביל לחסימת זרימת הדם (היצרות אבי העורקים) התורמת לשבץ מוחי ומובילה לאי ספיקת לב. כיום הטיפול היחיד ב- CAVD הוא החלפת מסתם אבי העורקים כירורגי או טרנסקטטר (SAVR ו- TAVR, בהתאמה). אין אפשרות לא ניתוחית לעצור או להפוך את התקדמות CAVD, וללא החלפת מסתם, שיעורי התמותה מתקרבים ל -50% תוך 2-3 שנים 1,2,3. הגדרת המנגנונים הבסיסיים המניעים פתולוגיה זו תזהה גישות טיפוליות חדשניות פוטנציאליות.

אצל מבוגר בריא, עלוני שסתום אבי העורקים הם בעובי של כמילימטר אחד, ותפקידם העיקרי הוא לשמור על זרימה חד כיוונית של הדם מתוך החדר השמאלי4. כל אחד משלושת העלונים מורכב משכבה של תאי אנדותל (VECs) המרפדת את פני השטח החיצוניים של העלון ומתפקדת כמחסום. VECs שומרים על הומאוסטזיס של המסתם על ידי ויסות החדירות, הידבקות תאי דלקת ואיתות פראקריני 5,6,7. תאים אינטרסטיציאליים של שסתומים (VICs) מהווים את רוב התאים בתוך עלון המסתם8. VICs מסודרים בשלוש שכבות ייחודיות בעלון. שכבות אלה ידועות בשם החדר, הספונגיוזה והפיברוזה9. החדר פונה לחדר השמאלי ומכיל סיבי קולגן ואלסטין. השכבה האמצעית, הספונגיוסה, מכילה תוכן פרוטאוגליקני גבוה המספק גמישות גזירה במהלך מחזור הלב. שכבת הפיברוסה החיצונית ממוקמת קרוב למשטח הזרימה בצד אבי העורקים והיא עשירה בקולגן פיברילרי מסוג I ו-III המספקים חוזק לשמירה על קואפטציה במהלךדיאסטולה 10,11,12. עם זאת, תאי VICs חיים במצב שקט, גורמים כגון דלקת, שיפוץ של המטריצה החוץ-תאית (ECM) ולחץ מכני עלולים לשבש את הומאוסטזיס VIC 8,9,13,14,15,16. עם אובדן הומאוסטזיס, תאי גזע וירטואליים מפעילים ורוכשים פנוטיפ דמוי מיופיברובלסט המסוגל להתרבות, התכווצות והפרשה של חלבונים המעצבים מחדש את המיליאו17 החוץ-תאי. תאי VICs מופעלים יכולים לעבור לתאי סידן המזכירים התמיינות של תא גזע מזנכימלי (MSC) לאוסטאובלסט 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

נראה כי ההסתיידות מתחילה בשכבת הפיברוסה העשירה בקולגן מתרומות של VECs ו-VICs, אך מתרחבת ופולשת לשכבות האחרות של העלון8. לפיכך, ברור כי הן VECs והן VICs מגיבים לגירויים כדי לווסת את הביטוי של גנים אוסטאוגניים, עם זאת, האירועים המדויקים המניעים את ההפעלה של גנים אוסטאוגניים, כמו גם את יחסי הגומלין המורכבים בין התאים לבין המטריצה החוץ תאית של העלון, נשארים לא מוגדרים. מודלים של מורין אינם מקור אידיאלי לחקר מניעים לא גנטיים של פתוגנזה של CAVD, מכיוון שעכברים אינם מפתחים CAVD denovo 26,27, ולכן השימוש ברקמות אנושיות ראשוניות ובקווי התאים הראשוניים שבודדו מרקמות אלה הוא הכרחי. בפרט, השגת תאים אלה במספרים גבוהים ובאיכות טובה היא הכרחית, שכן תחום תרביות התאים התלת-ממדיות והמודלים האורגנואידיים מתרחב וצפוי להפוך לחלופה מבוססת אדם ex vivo למודלים של מורין.

מטרת השיטה הנוכחית היא לשתף זרימת עבודה שקבעה את התנאים לבידוד יעיל ולגידול VECs ו- VICs המתקבלים משסתומים שהוסרו בניתוח מתורמים אנושיים. מחקרים קודמים הראו בידוד מוצלח של VECs ו- VICs משסתומי חזיר28 ומורין29, למיטב ידיעתנו זהו הראשון המתאר את הבידוד של תאים אלה ברקמות אנושיות. הפרוטוקול המתואר כאן ישים על שסתומים שנכרתו על ידי בני אדם ועוקף ומשפר מאוד את הנזק הנגרם על ידי זמן הרכש הממושך לעתים קרובות בין כריתת רקמות לעיבוד במעבדה על ידי החדרת שימוש בתמיסת אחסון קרה, תמיסת מאגר המשמשת קלינית בהשתלות איברים המייצבת מאוד את תאי הרקמה שנכרתה. הפרוטוקול המתואר כאן מראה גם כיצד לקבוע פנוטיפ של תאים ולהבטיח יעילות גבוהה של הישרדות התא עם זיהום צולב מינימלי של התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל דגימות המטופלים נאספות מאנשים שנרשמו למחקרים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פיטסבורג בהתאם להצהרת הלסינקי. רקמות קדבוריות שהושגו באמצעות המרכז להתאוששות איברים וחינוך (CORE) אושרו על ידי הוועדה לפיקוח על מחקר והכשרה קלינית של אוניברסיטת פיטסבורג המערבת נפטרים (CORID).

1. אישור ובטיחות

  1. קבל אישור של מועצת הביקורת המוסדית (IRB) או תזכיר פטור לכל אוסף של דגימות מטופלים או רקמות קדבוריות בהתאם להצהרת הלסינקי.
  2. קח הכשרה מוסדית נדרשת כדי לעבוד עם רקמות אנושיות כגון אימון פתוגנים הנישאים בדם, מחקר ביו-רפואי בנושאים אנושיים, פרטיות ואבטחת מידע, והובלה ומשלוח של חומרים ביולוגיים.

2. לוגיסטיקה והכנה

  1. דגימות כירורגיות
    1. ודאו כי מקרר זמין וממוקם בסמוך לחדר הניתוח. שמור 50 מ"ל צינורות חרוטיים מסומנים מראש עם מינוח לא מזוהה המכיל 40 מ"ל של aliquots סטרילי של תמיסת אחסון קר במקרר זה לשימוש על ידי צוות כירורגי. צינורות אלה יציבים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד תאריך התפוגה באריזה המקורית.
    2. עם החילוץ, מניחים רקמת שסתום בצינורות אלה. הניחו את הצינורות במיכל משני אטום כגון שקית ניילון חסינת דליפות או מיכל פלסטיק המסומן בתווית biohazard. רקמות נאספות ומועברות על קרח על פי פרוטוקולים מוסדיים להובלת ביו-האזרדים.
  2. דוגמאות קדבוריות
    1. לטבול איברים משוחזרים בתמיסת אחסון קרה, להניח בכלי בלימה משני אטום, ולהוביל על קרח על פי פרוטוקולים מוסדיים להובלת biohazards.

3. הכנת ריאגנטים

  1. הכינו צלחות מצופות קולגן לפחות יום קודם לכן.
    1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, יש לערבב 5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל, 8.7 מ"ל של חומצה אצטית ו-0.5 מיקרוגרם של אבקת קולגן I. הביאו עד 50 מ"ל עם מים סטריליים. מערבבים ומסננים דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
    2. מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, הוסיפו מספיק תמיסת קולגן ל-6 צלחות באר וכלים בגודל 10 ס"מ כדי לכסות את כל החלק התחתון. מכסים את הצלחת ומשהים 4-6 שעות בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה העודפת עם פיפטה סטרילית, הנח בצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל, וחסוך ב -4 מעלות צלזיוס כדי ליצור צלחות נוספות. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 4 °C במשך מספר חודשים.
    3. ייבשו את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן אחסנו אותן בשקית הניתנת לסגירה חוזרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן צלחות וכלים מצופים קולגן במשך מספר חודשים.
  2. Autoclave את הפריטים הבאים: מלקחיים רקמות, מספריים רקמות, צמר גפן רפידות גזה.
  3. מדיית גידול VEC: הכן והשתמש במדיום צמיחת תאי אנדותל בהתאם לפרוטוקולי היצרן. יש לאחסן בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. יש לחמם עד 37 מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש בתאים, אין להשאיר את המדיה באמבט החימום זמן רב מהנדרש (10-15 דקות מספיקות). יש להשתמש במדיה תוך חודש מיום ההכנה.
  4. מדיית גידול VIC: תוסף DMEM בסיס בינוני (4.5 גרם/ל' גלוקוז, תוסף L-גלוטמין, 110 מ"ג/ל' נתרן פירובט)30 עם 10% FBS מומת בחום ו-100 I.U./מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים. יש לחמם עד 37 מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש בתאים, אין להשאיר את המדיה באמבט החימום זמן רב מהנדרש (10-15 דקות מספיקות).
  5. הכינו תמיסת שטיפה סטרילית ממש לפני השימוש. תוסף PBS סטרילי עם קוטל פטריות 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין וקוטל חיידקים 5 מיקרוגרם/מ"ל.
  6. הכינו תמיסת קולגן סטרילית ממש לפני השימוש. יש להוסיף 5 מ"ג של קולגןאז II ל-5 מ"ל של מדיום בסיס DMEM סטרילי טרי. מערבבים היטב ומעקרים את התמיסה על ידי מעבר דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. יש לשמור על הקרח עד לשימוש.

4. הכנת רקמות ועיבודן

הערה: יש לקבל אישור מוסדי לשימוש ברקמות אנושיות לפני תחילת העבודה. בעת הטיפול ברקמות, יש ללבוש את ציוד המגן האישי (PPE) הבא: חלוק מעטפת מחסום נוזלי חד פעמי, או מעיל מעבדה קדמי ייעודי עם מחסום נוזלי שעוטף סינר ושרוולים חד פעמיים; מגן פנים מלא, או משקפי בטיחות עם מסכה כירורגית; כפפות כפולות; נעליים סגורות; ובגדים לכיסוי הרגליים. דיאגרמות זרימת עבודה מקיפות של הכנת הרקמה להערכת הסתיידות (סעיף 5) ובידוד תאים (סעיפים 6 ו-7) מתוארות באיור 1A,B בהתאמה.

  1. עם קבלת דגימת איברים קדבורית, מוציאים את שורש אבי העורקים ושוקעים בצינור חרוטי של 50 מ"ל של תמיסת שטיפה סטרילית. עם קבלת דגימה כירורגית, להסיר מכלי הובלה לטבול בצינור חרוטי 50 מ"ל של תמיסת שטיפה סטרילית. מניחים את הצינור המכיל את הרקמה בדלי קרח על נדנדה ומערבבים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: עיבוד רקמות קרוב ככל האפשר לזמן המיצוי יניב את התאוששות התאים הטובה ביותר, אולם ניתן לאסוף תאים בני קיימא למעלה מ-61 שעות לאחר הכריתה, והנתונים מראים כי תאי VICs חזקים יותר מ-VECs ככל שהזמן גדל. אם לא ניתן לעבד רקמות באופן מיידי, במידת האפשר, הסר רקמה, בצע את שלב 4.1, ולאחר מכן החזיר את הרקמה לתמיסת אחסון קרה סטרילית טרייה ושמור על 4 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה להמשך. שסתומים שנאספו במהלך ניתוחים בלילה או בסוף השבוע יכולים להיות מאוחסנים בתמיסת אחסון קר של 40 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ועדיין מסוגלים להניב תאים בני קיימא יותר מיומיים לאחר השאיבה.
  2. יש לרסס צינורות ב-70% אתנול ולעבור למכסה מנוע סטרילי. הסר רקמה וכרת שני עלוני שסתום (איור 2A). מניחים עלון אחד בבקבוקון קריוגני (או 2-3 בקבוקונים אם יש צורך בכמה חתיכות קטנות יותר לניתוח עתידי) ומצמידים את ההקפאה על ידי הטלת חנקן נוזלי ואז מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    1. אם השסתום הוא bicuspid, הבלו רק עלון אחד. באמצעות מספריים, לחתוך את העלון לשניים מן הגולם אל הציר. השתמש במחצית אחת של העלון להקפאת הצמדה ובחצי השני לשלב 4.3.
  3. לעבד את העלון השני להטמעת פרפין כדי להעריך את תכולת ההסתיידות על ידי חיתוך אותו לשניים מגולם לציר. מניחים את שני החלקים בקלטת השקועה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA), ואז מניחים על נדנדה ב-RT למשך שעתיים לפחות, אך לא יותר מ-4 שעות.
    הערה: זמני קיבוע ארוכים יותר יוצרים רקע רב יותר עם צביעה אימונופלואורסצנטית. לאחר ביצוע שלבים 4.2 ו- 4.3, עבור מיד לסעיף 6 וחזור לשלב 4.4 לאחר שלב 6.12.
  4. לאחר הקיבוע, לשטוף את הרקמות על ידי טבילה PBS טרי במשך 1 שעה 3-4 פעמים. לאחר שטיפות אלה, דגימות יכולות להישאר PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים במידת הצורך. המשך לשלב הבא רגע לפני ההטמעה.
  5. שנה בהדרגה מ- PBS ל- 70% אתנול. לשטוף 30-60 דקות כל שלב עם 1:4 70% אתנול: PBS; 1:1 70% אתנול:PBS, 4:1 70% אתנול:PBS; 70% אתנול.
  6. הטמע את הרקמה כך שהמקטעים יחשפו את שלוש השכבות של העלון (איור 1A) על פי פרוטוקולים קבועים31. לחלופין, ואם זמין, להביא את הרקמה לליבה פתולוגית להטמעה וחיתוך.
  7. לאחר הטיפול ברקמות, יש להשליך או לאחסן PPE לפי הצורך ולשטוף ידיים באופן מיידי. נטרל את כל הציוד, המשטחים והפסולת המוצקה והנוזלית באמצעות דילול של 1:10 של חומר חיטוי אקונומיקה או חומר ניקוי. יש להמתין 20 דקות לפירוק, ולאחר מכן לשטוף ב-70% אתנול. טפלו במכסה המנוע של תרבית התאים באמצעות תרסיס מיקופלסמה בהתאם להוראות היצרן.

5. מכתים את פון קוסה לתכולת הסידן

הערה: ניתן לעשות זאת זמן רב לאחר בידוד התא והקמת הקו, אך הקפידו לקשר את רמת ההסתיידות של הרקמה למסמכים הנוגעים לקו התא הראשוני שנקבע.

  1. חותכים פרוסות פרפין בעובי 5 או 10 מיקרומטר על מגלשות זכוכית ואופים מגלשות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה, ואז מצננים ל-RT.
  2. באמצעות פתרונות טריים, deparaffinize שקופיות על ידי טבילה כדלקמן: 100% xylene במשך 30 דקות, 2x; 100% אתנול במשך 3 דקות, 2x; 90% אתנול במשך 3 דקות; 80% אתנול במשך 3 דקות; 70% אתנול למשך 3 דקות; 50% אתנול במשך 3 דקות; מים טהורים במיוחד במשך 3 דקות; יש לשמור במים טהורים במיוחד עד לשלבים הבאים.
    הערה: הזמנים לעיל הם מינימליים, כל שלב עשוי להימשך זמן רב יותר.
  3. המשך עם צביעת פון קוסה על פי פרוטוקולי היצרן.
  4. הערך את אזור המסתם המלא באופן מיקרוסקופי והקצה רקמת בקרה (ללא סימן להסתיידות) או CAVD (כל עדות להסתיידות, איור 2B).

6. בידוד, הרחבה ואישור של תאי אנדותל מסתם (VEC)

  1. במכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, פתחו את הצינור החרוטי המכיל את עלון המסתם שנותר והניחו את העלון בצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל מלא ב-PBS קר כקרח. מכסים את הצינור והופכים בעדינות או מניחים על נדנדה למשך 2 דקות ב-RT.
  2. הסר רקמות לצלחת בקוטר 60 מ"מ מלאה ב-5-7 מ"ל של תמיסת קולגן קרה. באמצעות מלקחיים, לטבול את שני הצדדים של העלון בתמיסה 3-4 פעמים. לדגור את הרקמה במשך 5-10 דקות באינקובטור תרבית התאים ב 37 מעלות צלזיוס, נדנדה את הרקמה בעדינות כל 2 דקות 3-4 פעמים.
  3. הסר 2 מ"ל של הפתרון מן המנה ומניחים צינור סטרילי 15 מ"ל חרוטי. הניחו מלקחיים על הגולם והשתמשו במקלון צמר גפן סטרילי יבש כדי להחליק מהמלקחיים אל הציר, תוך כדי סיבוב מקלון תוך כדי העברתו לאורך העלון. בין כל החלקה, סובבו את המטוש בתמיסה בצינור החרוטי של 15 מ"ל כדי להסיר את התאים. חזרו על הפעולה כדי לטבול את פני השטח של הרקמה במלואם, ואז התהפכו וחזרו על הפעולה בצד השני.
  4. מחזיק את עלון השסתום עם מלקחיים ביד אחת, ו 1 מ"ל פיפטה ביד השנייה, לשטוף את פני השטח של העלון עם הפתרון בצלחת. לאחר השטיפה, מעבירים את כל התמיסה המכילה את ה- VECs בצלחת לאותה צינור חרוטי של 15 מ"ל עם התאים מהמטוש וממשיכים לשלב 6.5. מניחים את רקמת המסתם הנותרת בצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל עם 7 מ"ל של תמיסת קולגן סטרילית וממשיכים לשלב 7.1.
  5. צנטריפוגה הצינור המכיל את VECs ב 180 x גרם במשך 5 דקות כדי לזרוק את VECs מבודדים. שאפו את הסופר-נאטנט והשעו ב-3 מ"ל של מדיית הצמיחה של VEC. צנטריפוגה פעם נוספת ולהסיר את supernatant. יש לתלות את התאים ב-1 מ"ל של מדיית גדילה ולקבוע את מספר התאים באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול.
  6. יש להשעות את גלולת ה-VEC ב-2 מ"ל של מדיית גדילה של VEC ולצלחת את התאים בבאר מצופה קולגן מראש של צלחת 6 בארות בערך 5 x 10תאים לס "מ2. תן לתאים לגדול לפחות 3-4 ימים, ולאחר מכן להסיר מדיה לחדש עם מדיה טרייה. יש לחזור על שינוי המדיה כל 4 ימים. VECs יגדלו בכתמים בצורת אבן מרוצפת (איור 3B, לוחות שמאליים).
  7. כאשר מדבקות VEC מכסות >80% מהצלחת, יש לפצל תאים בערך ב-1.3 x10 4 תאים לס"מ 2, תלוי כמה מהר הם גדלים (אם הם מגיעים ל-80% תוך פחות משבוע אחד מפוצלים במספר מעט נמוך יותר של תאים/ס"מ 2).
  8. כדי לפצל, שטפו תאים פעמיים עם 2 מ"ל DPBS ואז הוסיפו מספיק מגיב דיסוציאציה כדי לכסות רק את פני השטח של התאים. דגירה במשך 2-3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בדיקה כדי לוודא שהתאים אינם דוגרים יתר על המידה. עצור את העיכול על ידי הוספת נפח שווה של מדיית גידול VEC והעברת נוזל לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 180 x גרם במשך 5 דקות, להסיר supernatant, ו ressuped בנפח המתאים של מדיה עבור מספר בארות / לוחות הדרושים.
    הערה: לאחר שהורחבו לצלחת 10 ס"מ VECs עשויים לפעמים לאבד את המורפולוגיה שלהם ולשנות את הפנוטיפ שלהם ככל שהם מתרבים. זה נוטה להתרחש כאשר VECs נזרעים במפגש נמוך במהלך הקמה והרחבה של קו התא.
  9. כדי להבטיח תרבות טהורה, שקול להשתמש בחרוזים סופר-פאראמגנטיים של CD31+ עם כל פיצול.
  10. עבור 1 x 10 8 תאים או פחות (צלחת אחת של 10 ס"מ או פחות ), הכינו 25 μL של חרוזים סופר-פאראמגנטיים על ידי שטיפה על פי פרוטוקולי היצרן.
    הערה: שלב 6.10 מומלץ לביצוע לפני טריפסיניזציה של VECs.
  11. נתקו תאים כמו בשלב 6.8 אך הושתקו ב-500 μL של PBS עם 0.1% BSA, pH 7.4, והניחו בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל. הוסף 500 μL של חרוזים שטופים ומחיים לצינור 2 מ"ל של תאים ודגירה על סיבוב במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. מניחים צינורות על המגנט למשך 2 דקות. בזמן שהצינור עדיין במגנט, הסר בזהירות את הסופרנטנט. הסירו את השפופרת מהמגנט, הוסיפו 1 מ"ל PBS טרי עם 0.1% BSA, פיפטה בעדינות 2-3 פעמים, ואז הניחו בחזרה על המגנט למשך 2 דקות. חזור על 2 פעמים נוספות. לאחר הסרה סופית של חיץ, יש לתלות מחדש תאים במדיית גדילה בנפח הדרוש לציפוי מחדש.
    הערה: לתאים עדיין יהיו חרוזים, אך אלה לא ישפיעו על הצמיחה ויוסרו במעברים הבאים.
  13. לאחר הרחבת התאים, בנוסף למורפולוגיה, אשרו את הפנוטיפ של VEC על-ידי צביעה חיובית עבור סמנים אימונופלואורסצנטיים כגון גורם פון וילברנד (vWF), קדהרין 5 (CDH5) או PECAM-1/CD31, והכתמה שלילית עבור סמני VIC כגון קלפונין 1 (CNN) או אקטין שריר חלק אלפא-2 (αSMA, איור 4, לוחות שמאליים).

7. בידוד, הרחבה ואחסון של תאים אינטרסטיציאליים של שסתום (VIC)

  1. כאמור בשלב 6.4, לאחר הסרת VECs מרקמת השסתום, העלון ממוקם בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם תמיסת קולגן של 7 מ"ל. דגירה במשך 12 שעות באינקובטור תרבית התאים עם המכסה פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גזים. בידוד מוצלח של VICs עדיין יכול להתרחש עם עד 18 שעות בתמיסת קולגן.
  2. לאחר הדגירה, במכסה מנוע של תרבית תאים סטרילית, מערבבים את הרקמה בעדינות על ידי פיפטינג עם פיפטה סרולוגית כדי להבטיח שחרור של VICs מרקמת העלון.
  3. הסר את תרחיף התאים ועבור דרך מסנן 0.70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
  4. הוסף 7 מ"ל של מדיום גידול VIC לצינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 180 x גרם במשך 5 דקות. לשאוף supernatant ו resuping גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיה צמיחה VIC ולקבוע את מספר התא. צלחת את ה- VICs בצלחת 60 מ"מ תרבית רקמה מטופלת ב 1.3 x 104 תאים / ס"מ2.
  5. תנו לתאים לגדול לפחות 1-2 ימים לפני החלפת המדיה. יש להסיר את חומרי ההדפסה ולשטוף פעמיים DPBS כדי להסיר שאריות לכלוך ולהחליף במדיום צמיחה טרי. יש לחדש את המלאי הבינוני כל 2-3 ימים. תרכובות אורגניות וירטואליות יגדלו בצורת פיברובלסט (איור 3B, לוחות ימניים).
  6. כאשר VICs מגיעים למפגש של >90%, יש לשטוף פעמיים עם DPBS כדי להסיר את המדיה העודפת ולנתק את התאים על ידי הוספת נפח מתאים של מגיב דיסוציאציה מחומם מראש כדי לכסות את הצלחת (כלומר, 2-3 מ"ל לכל צלחת של 10 ס"מ). דגירה של המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס. VICs יתנתקו מהמנה לאחר 2-3 דקות של דגירה. הוסף 4-6 מ"ל של מדיה מחוממת מראש.
    הערה: אם לתאים לוקח יותר מ-3 דקות להתרומם מהצלחת, ייתכן שמגיב הדיסוציאציה איבד מעוצמתו. במידת הצורך, ניתן להשתמש במגרד תאים כדי להרים את התאים בעדינות.
  7. העבר את מתלה התא לצינור וצנטריפוגה עדינה בגודל 180 x g למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש לתלות בעדינות את גלולת התא במדיית גידול VIC שחוממה מראש ולקבוע את מספר התאים בני הקיימא באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול. זרעו את התאים בני הקיימא בצפיפות של 1:2 של המנה המקורית (כלומר, ~ 1 × 106 תאים לכל צלחת של 10 ס"מ או 1.3 x 104 תאים / ס"מ2).
  8. הערך את פנוטיפ VIC על-ידי צביעה חיובית עבור סמנים אימונופלואורסצנטיים כגון αSMA, CNN או SM22α וצביעה שלילית עבור סמני VEC כגון CD31, CDH5 או vWF (איור 4, לוחות ימניים).
    הערה: תהליך העבודה של הפרוטוקול המוצג כאן בוחר ללא משוא פנים עלון אחד לבידוד VECs ו- VICs, בעוד העלונים הנותרים משמשים לצביעת פון קוסה (סעיף 5) והקפאת הצמדה.

8. אחסון תאים לטווח ארוך

  1. לאחר ההרחבה, הקפיאו את התאים לאחסון לטווח ארוך. שטפו תאים פעמיים עם DPBS של 2-5 מ"ל ולאחר מכן הוסיפו מספיק מגיב דיסוציאציה כדי לנתק תאים כמו בשלבים 6.8 ו-7.6. עצור את העיכול על-ידי הוספת נפח שווה של מדיית גידול VEC או VIC והעברת תרחיף התאים לצינור של 15 מ"ל.
  2. לקבוע את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer ו טריפן כחול.
  3. צנטריפוגה ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
  4. יש לתלות תאים במדיית גדילה מותנית מקוררת לצפיפות תאים של ~ 3 × 106 תאים למ"ל.
  5. בעדינות עם מערבולת, הוסיפו נפח שווה של מדיום קירור 2x לשימור בהקפאה. זה יביא את ריכוז התאים ל ~ 1.5 × 106 תאים / מ"ל.
  6. Aliquot 1 מ"ל לתוך בקבוקונים שימור בהקפאה. הניחו את הבקבוקונים במיכל להקפאת תאים, סגרו והפכו 5-6 פעמים כדי להבטיח שהתאים יישארו תלויים. יש להניח את המיכל בטמפרטורה של -80°C למשך 6-72 שעות או בהתאם לפרוטוקול מיכל הקפאה. הסר בקבוקונים מ -80 מעלות צלזיוס והעבר לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול הנ"ל מתאר את השלבים הדרושים לטיפול ברקמות שסתום אנושיות ולבידוד והקמת קווי תאים בני קיימא מרקמות אלה. עלונים של מסתם אבי העורקים מעובדים להטמעת פרפין, מוקפאים לאחסון לטווח ארוך לצורך ניתוח ביוכימי או גנטי ומתעכלים לבידוד של VECs ו-VICs (איור 1). בעוד שלדגימות כירורגיות תהיה ככל הנראה אבחנה קלינית של היצרות אבי העורקים והן עשויות להפגין גושים כבדים של הסתיידות שניתן לראות בעין בלתי, הסתיידות מסתם אבי העורקים קיימת במספר משמעותי של אנשים קשישים (בני >65)בני 32, ובגלל שכיחות זו כל הרקמות - כירורגיות וקדבוריות - עוברות צביעת פון קוסה או הליך דומה כדי להעריך אם קיימת הסתיידות (איור 2).

נמצא כי השימוש בתמיסת אחסון קרה ייצב מאוד את תאי רקמת השסתום שנכרתה. תמיסת אחסון קר משמשת בהשתלות איברים חיים. הוא נשטף דרך איברים לפני או אחרי ההסרה מהתורם ונשאר בכלי הדם של אותו איבר במהלך הובלה על קרח. נצפה כי קווי VEC התבססו בקלות רבה יותר מדגימות תורמים מאשר מרקמות כירורגיות, וקווי התורם נטו יותר לשמור על המורפולוגיה של תאי האנדותל שלהם למעברים רבים יותר. זה היה מבלבל, שכן רקמות התורם לעתים קרובות לא היו מגיעות למעבדה במשך 12-24 שעות לאחר המוות בעוד רקמות כירורגיות היו מתקבלות בין 2 ל 4 שעות. לאחר אריזת צינורות הדגימה הכירורגית בתמיסת אחסון קרה במקום PBS, התאוששות התאים גדלה מאוד. כפי שניתן לראות באיור 3, ניתן להשיג גם VECs וגם VICs בני קיימא במשך 61 שעות לאחר מיצוי המסתם. בעוד שאחוז מעט גבוה יותר של VICs חיים מתקבלים מאשר VECs כאשר תאים מבודדים עד יום לאחר כריתת המסתם, תאים נשארים בני קיימא לאחר 48 שעות לאחר כריתה. עד 40% מכלל התאים שהתאוששו מתאימים לתאים חיים, וראינו נתונים עקביים בין שכפולים ביולוגיים. יתר על כן, בדיקת מורפולוגיה מאשרת גם את זהות התא; בעוד ש-VECs מופיעים כתאים ארוזים, דמויי אבן ובעלי עיכובי מגע גדילה, המורפולוגיה של VIC דומה למיופיברובלסטים בעלי צורת ציר. בדיקה חיסונית של הדגימות אישרה כי 91.8% ± 1.8 (n = 3) של VECs מורחבים היו חיוביים עבור סמן האנדותל vWF ואילו 92.0% ± 5.0 (n = 3) של VICs מורחבים היו חיוביים עבור סמן התא interstitial αSMA (איור 4). נתונים אלה עולים בקנה אחד עם התוצאות שדווחו בעבר33.

Figure 1
איור 1: עיבוד רקמת שסתום ובידוד תאים מבקרה אנושית וממסתמי CAVD . (A) ייצוג סכמטי של עיבוד רקמות להערכת רמות ההסתיידות של המסתמים. (B) ייצוג סכמטי של מהלך הזמן והשלבים לבידוד ואפיון של תאי אנדותל של מסתם אנושי (VECs) ותאים אינטרסטיציאליים של מסתם (VICs) מרקמות בקרה ו-CAVD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הערכת הסתיידות . (A) תמונה מייצגת של רקמות שסתום בקרה (למעלה) וסידן (למטה) מתורמים אנושיים. שימו לב שגושי ההסתיידות של רקמת CAVD יכולים לשנות באופן חמור את המורפולוגיה ואת היכולת לכרות את העלונים בצורה נקייה. (B) הכתמה מייצגת של פון קוסה של רקמת שסתום בקרה (משמאל) ו-CAVD (מימין) לאחר קיבוע ועיבוד נוסף של רקמת המסתם האנושית. הערה הסתיידות מתגלה על ידי נוכחות של משקעים כהים ברקמת העלון. תמונות השסתום צולמו במצלמת מעבדה. שסתומים מוכתמים של פון קוסה נלכדו עם מטרה של פי 10, סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הערכת עקומות ההישרדות של תאי VECs ו-VICs (A). שלושה עלונים התקבלו מחמש דגימות שסתומים. העלון הראשון מכל שסתום עובד באופן מיידי (3-12 שעות לאחר השאיבה), העלון השני עובד כ-24 שעות מאוחר יותר (22-35 שעות), והעלון השלישי עובד כ-48 שעות לאחר קבלת הרקמה (45-61 שעות). עלוני שסתומים נשמרו בתמיסת אחסון קרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבודם. ציר ה-y מייצג את אחוז התאים החיים. (B) מורפולוגיה של תרביות בריאות של VECs (לוחות שמאליים) ו- VICs (לוחות ימניים). גרפים מראים פרופורציה ±ממוצעת של תאי SD חיים של תאים שבודדו מ-n = 5 רקמות שסתום. התמונות צולמו עם מטרה של 4x ו-10x, סרגלי קנה מידה של 200 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: צביעה אימונופלואורסצנטית מייצגת על VECs ו-VICs. VECs חיוביים עבור סמן האנדותל פון וילברנד פקטור (vWF, לוחות שמאליים) ואילו VICs חיוביים עבור הסמן הבין-תאי αSMA. שימו לב שפרוטוקול הבידוד שלנו מבטיח יעילות בידוד גבוהה; לא זוהה זיהום צולב בין VECs ו- VICs. התמונות צולמו עם סרגל מטרה של פי 10, קנה מידה של 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השגת שליטה ורקמות מחלה מבני אדם היא קריטית עבור מודלים של מחלות in vitro ו- ex vivo; עם זאת, בעוד שלעתים קרובות מדברים על האתגרים של גישור על הפער בין ספסל למיטה, הסדר ההפוך - מעבר מסוויטת הניתוחים לספסל - הוא לעתים קרובות לא פחות מרתיע. חיוני עבור מדען בסיסי כדי להשיג דגימות רקמות אנושיות ראשוניות הוא שיתוף פעולה עם מדען מנתח מושקע שיש לו צוות של אחיות, טכנאי כירורגיה, עוזרי רופא, סטודנטים לרפואה ומתמחים, ומנהלי פרוטוקולים קליניים שיכולים לרשום ולהסכים לחולים, להשתתף ולסייע בטיפול נכון ברקמות שנכרתו, ולתאם את הלוגיסטיקה הנדרשת לאיסוף רקמות. ללא מאמץ מרבי מצד כל המעורבים לקצר את הזמן מכריתה ועד לבידוד התא, חומר תאי חיוני והמידע שהוא מכיל ישתנו או יאבדו באופן בלתי הפיך.

קריטי לשמירה על הכדאיות של דגימות הרקמה הוא השימוש בתמיסת אחסון קרה. זהו אותו פתרון המשמש את צוותי השתלות האיברים ב- UPMC ובמרכזים רפואיים אחרים להשתלות. תפוקת תאים טובה יותר התקבלה מרקמות קדבוריות שנכרתו מהתורם שעות רבות לפני כן מאשר מרקמות שהושגו מהר יותר מחדר הניתוח אך נשמרו ב-PBS קר. תגלית מקרית זו הייתה חיונית לרכישת תאים מרקמות אנושיות. זמן הרכש מכריתת רקמות ועד למסירה במעבדה נע בין 1-5 שעות לרקמה כירורגית ועד 24 שעות לרקמה קדבורית. לשם השוואה, לעתים קרובות ניתן לבצע רכישה ועיבוד של רקמות בעלי חיים תוך דקות ספורות מהמתת חסד, שהיא אידיאלית לכדאיות התאים. בהיעדר תמיסת אחסון קרה, סביר להניח כי מדיום המתאים להתרבות תאים יכול גם לתפקד טוב יותר מאשר PBS, אולם מדיום זה לא נבדק כאן בשל ההצלחה של פתרון אחסון קר בהשתלת איברים חיים וקבלת רקמות cadaveric בתמיסה זו. התמיסה יציבה על המדף ואידיאלית לאחסון בחדרי ניתוח, ומרכיבים ספציפיים כגון אדנוזין ידועים כמקדמים תגובות מועילות ללחצים תאיים כגון איסכמיה/היפוקסיה21,34.

צעד חיוני נוסף להשגת תאים בני קיימא הוא שטיפת הרקמות עם קוטל פטריות, גנטמיצין וקוטל חיידקים. שטיפה קצרה זו מסייעת להבטיח שהתאים יישארו לא מזוהמים על ידי חיידקים ופטריות. קריטיים לא פחות הם השלבים לעיכול VECs מתוך רקמת השסתום, שם בטווח של דקות ספורות, ה- VECs מנותקים ולאחר מכן מתפוגגים מפני השטח של עלוני השסתום. לעיכול שלאחר מכן של ה- VICs השוכנים על המטריצה החוץ-תאית הצפופה של העלון יש הרבה יותר מקום להתנועע למשך הזמן והחוזק. הטיפול ברקמות בלתי משוחדות המתואר בפרוטוקול זה מאפשר בידוד של שתי אוכלוסיות התאים העיקריות הנמצאות בעלון המסתם, VECs ו- VICs. אף על פי שניתוח תעתיק של תא בודד שנערך לאחרונה הראה את הדו-קיום של לפחות ארבעה עשר תתי-סוגים שונים של תאים השוכנים בשסתום האנושי, כולל שישה תאים סטרומליים שאינם שסתומים ברקמת CAVD35, מגוון זה עשוי לייצג וריאציות הנובעות מהשפעות של עיבוד ועיכול רקמות מוקשחות אלה, או שהוא עשוי לנבוע ממיקרו-סביבות שונות שאליהן נחשפים תאי העלון: תרכובות אורגניות נדיפות נחשפות לשתי זרימות דם שונות, בעוד ש-VICs מוטמעים בשלוש רמות מטריצה חוץ-תאיות שונות 8,9. פרוטוקול הבידוד והניתוח בקנה מידה גדול המתוארים כאן מבטיחים כי מעל 90% מה- VECs וה- VICs תואמים לפנוטיפ העיקרי שלהם. למרות שניתן למצוא מידה מסוימת של הטרוגניות, היא אינה משפיעה על התוצאות הכלליות של המחקר של הומאוסטזיס VEC ו- VIC 8,9,13,14,15,16.

חשוב גם לציין כי החולים ורקמות המסתם שלהם, ולכן קווי התאים שנרכשו מהם, אינם זהים. גנטיקה, תחלואה משותפת, טיפול במהלך ניתוח ועיבוד, ורעננות של מרכיבי תמיסת עיכול עשויים להשפיע על קצב הגדילה ואף אולי על ההתנהגות או הפנוטיפ של התאים המבודדים. בעוד שהמחקר הנוכחי מדגים את היכולת להניב מספר מספיק של תאים בני קיימא בהליך זה, ייתכנו הבדלים מולדים או מושרים בקווי תאים אלה שעשויים להשפיע על ניסויים במורד הזרם. לעתים קרובות קשה לדעת בדיוק את הזמן מאז הרקמה הוסרה מן המטופל או התורם, ובמיוחד במקרה של האחרון, הזמן מאז מחזור הדם נעצר. יתר על כן, קיימת שונות מובנית בין הרקמות לגבי מספר תאי המסתם בני הקיימא המתקבלים, יכולת ההתרבות של התאים ושימור הפנוטיפ של התאים. קווי תאים עשויים להכיל מוטציות גנטיות - מולדות או סומטיות - שהרופא וצוות המחקר אינם מודעים להן, והשיפוץ והטיפול ברקמות לאחר מכן עשויים גם לשנות את פנוטיפ התא או אפילו את האפיגנטיקה. לפיכך, עבור כל הניסויים שבהם נעשה שימוש בתאים אנושיים ראשוניים אלה, חיוני לחלוטין להשתמש בשכפולים ביולוגיים - כלומר, קווי תאים המתקבלים מחולים שונים, למרות הזמן והעלות המשמעותיים שהם גורמים. זה עוזר להבטיח כי כל התוצאות אינן נובעות השפעות מבלבלות של רכש ועיבוד של הרקמה. ניתן להתאים את קצב ההתרבות המשתנה של קווי תאים שונים על ידי איסוף תאים בניסויים בזמנים שונים או זריעת תאים לניסויים בצפיפויות שונות; אף תשובה אחת אינה הטובה ביותר עבור כל העיצובים הניסיוניים. בעוד שהסיבוכים אינם חסרי משמעות, השימוש בבקרה אנושית ראשונית ובקווי תאים שמקורם ברקמות CAVD עבור מודלים ניסיוניים in vitro ו- ex vivo חיוני להגדרת הגורמים היוזמים ותהליכי ההפצה המניעים פתוגנזה של CAVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

דאע"ש מקבלת תמיכה מחקרית מוסדית מ-Atricure וממדטרוניק ומשמשת כיועצת עבור מדטרוניק וסקולרי. אף אחד מהקונפליקטים הללו אינו קשור לעבודה זו. לכל שאר הכותבים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לג'ייסון דובינס על דיון מעמיק וקריאה ביקורתית של כתב יד זה. ברצוננו להודות למרכז לשיקום איברים וחינוך על עזרתם ותמיכתם ולהודות לתורמי רקמות ולמשפחותיהם על שאפשרו מחקר זה. כל דגימות המטופלים נאספות מאנשים שנרשמו למחקרים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פיטסבורג בהתאם להצהרת הלסינקי. רקמות קדבוריות שהושגו באמצעות המרכז להתאוששות איברים וחינוך (CORE) אושרו על ידי הוועדה לפיקוח על מחקר והכשרה קלינית של אוניברסיטת פיטסבורג המערבת נפטרים (CORID).

כמה דמויות שנוצרו עם Biorender.com.

CSH נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם K22 HL117917 ו- R01 HL142932, איגוד הלב האמריקאי 20IPA35260111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Thermo Scientific 7211345 Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate Greiner Bio-One 664160 Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet Fisher 14955234 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips VWR 76322-154 Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips VWR 76322-132 Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339650 Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710S Tissue and cell fixative
190 proof ethanol Decon 2801 Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium Gibco 14190250 Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS Fisher BP2944100 Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips VWR 76322-134 Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol Decon 2701 Deparaffinizing tissue samples
2-propanol Fisher A416P 4 Making collagen coated plates
5 mL serological pipet Fisher 14955233 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish GenClone 25-260 VEC isolation
6-well cell culture plate Corning 3516 Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial Fisher BP2401 500 Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin Invitrogen A12379 Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution Bridge to Life BUW0011L Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g Bioworld 220700233 VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody  Abcam ab46794 Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2) Cell Signaling 3528 Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads Invitrogen 11155D VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5 Cell Signaling 2500 Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores Corning 431751 VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein Gibco A1048301 Making collagen coated plates
Collagenase II Worthington Biochemical Corporation LS004176 Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray Decon 4101 Disinfection
Countess II Automated Cell Counter Invitrogen A27977 Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips Invitrogen 2026h Automated cell counter required slide cover
Coverslips Fisher 125485E Mounting valve samples
Cryogenic vials Olympus Plastics 24-202 Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula  Clorox N/A Disinfection
DMEM Gibco 10569044 Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 Lonza Walkersville CC3129 Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit Lonza Walkersville CC4176 Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope Life Technologies Model Number: AME3300 Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope Life Technologies AMEX1000 Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select R&D Systems S11550 VIC expansion
Fine scissors Fine Science Tools 14088-10 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers Fisher 08-100-241 VIC expansion
Fungizone Gibco 15290-026 Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin Gibco 15710-064 Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides Globe Scientific Inc 1358L mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488 Invitrogen A11001 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594 Invitrogen A11005 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488 Invitrogen A11008 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594 Invitrogen A11012 Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide Invitrogen A25750 Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) Invitrogen R37606 Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells HyClone Laboratories, Inc. SR30002 Frozen cell storage
Mounting Medium Fisher Chemical Permount SP15-100 Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container Nalgene 51000001 Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray PromoCell PK-CC91-5051 Disinfection
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin Invivogen ANTMPT Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody Abcam ab14106 Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors Fine Science Tools 14001-14 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab Puritan 25806 10WC VEC isolation
Swingsette human tissue cassette Simport Scientific M515-2 Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm) Fine Science Tools 11016-17 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061 cell counting solution
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021 Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit Polysciences 246331 Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody Abcam ab68545 Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes Fisher Chemical X3S-4 Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody Abcam ab7817 Primary antibody (VIC positive stain)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 170
בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead… More

Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead III, W. J., Wong, R., Sultan, I., St. Hilaire, C. Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling. J. Vis. Exp. (170), e62439, doi:10.3791/62439 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter