Summary
이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.
Abstract
석회성 대동맥 판막 질환(CAVD)은 노인 인구의 거의 3분의 1에 존재합니다. 대동맥 판막의 비후, 경화 및 석회화는 대동맥 협착을 유발하고 심부전 및 뇌졸중에 기여합니다. 질환 발병기전은 염증, 세포외 기질 리모델링, 난류, 및 기계적 스트레스 및 변형과 같은 다인성 및 스트레스가 판막 내피 및 판막 간질 세포의 골형성 분화에 기여한다. 그러나 건강한 세포의 석회화 세포로의 골형성 전이를 유도하는 정확한 개시 인자는 완전히 정의되지 않았습니다. 또한, CAVD 유발 대동맥 협착증에 대한 유일한 현재 치료법은 대동맥 판막 치환술이며, 이에 따라 천연 판막을 제거하거나(외과적 대동맥 판막 치환술, SAVR) 카테터를 통해 완전히 접을 수 있는 판막을 삽입한다(경피적 대동맥 판막 치환술, TAVR). 이러한 수술 절차에는 높은 비용과 심각한 위험이 따릅니다. 따라서 약물 발견을 위한 새로운 치료 표적을 식별하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 본 연구는 환자에서 외과적으로 제거된 조직과 기증자 사체 조직을 사용하여 체외 질환 모델링을 위한 판막 세포의 환자 특이적 기본 라인을 만드는 워크플로를 개발합니다. 이 프로토콜은 장기 이식에 일반적으로 사용되는 냉장 보관 용액의 활용을 도입하여 조직 절제와 실험실 처리 사이의 종종 긴 조달 시간으로 인한 손상을 줄이고 절제된 조직의 세포를 크게 안정화시키는 이점을 제공합니다. 본 연구의 결과는 단리된 판막 세포가 공여자로부터 판막을 제거한 후 수일 이상 배양물에서 그의 증식 능력 및 내피 및 간질 표현형을 유지한다는 것을 입증한다. 이러한 물질을 사용하면 대조군 및 CAVD 세포를 수집 할 수 있으며, 이로부터 대조군 및 질병 세포주가 모두 확립됩니다.
Introduction
석회성 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 염증, 섬유증 및 대동맥 판막 전단지의 거대 석회화를 특징으로하는 만성 병리학입니다. 전단지의 점진적인 리모델링 및 석회화 (대동맥 경화증이라고 함)는 뇌졸중에 기여하고 심부전으로 이어지는 혈류 차단 (대동맥 협착증)으로 이어질 수 있습니다. 현재 CAVD에 대한 유일한 치료법은 외과적 또는 경피적 대동맥 판막 치환술(각각 SAVR 및 TAVR)입니다. CAVD 진행을 중단하거나 역전시킬 수 있는 비수술적 옵션은 없으며, 판막 교체 없이 사망률은 2-3년 내에 50%에 접근합니다 1,2,3. 이 병리를 주도하는 기본 메커니즘을 정의하면 잠재적인 새로운 치료 접근 방식을 식별할 수 있습니다.
건강한 성인의 경우 대동맥 판막 전단지의 두께는 약 1mm이며 주요 기능은 좌심실4에서 혈액의 단방향 흐름을 유지하는 것입니다. 세 개의 전단지는 각각 전단지의 외부 표면을 감싸고 장벽 역할을하는 판막 내피 세포 (VEC) 층으로 구성됩니다. VEC는 투과성, 염증 세포 부착 및 파라 크린 신호 전달 5,6,7을 조절하여 밸브 항상성을 유지합니다. 판막 간질 세포(VIC)는 판막 소엽8 내의 대부분의 세포를 구성한다. VIC는 전단지에서 세 개의 독특한 레이어로 배열됩니다. 이 층은 심실, 해면상 및 섬유증9로 알려져 있습니다. 심실은 좌심실을 향하고 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 포함합니다. 중간층인 해면체는 심장 주기 동안 전단 유연성을 제공하는 높은 프로테오글리칸 함량을 포함합니다. 외부 섬유층은 대동맥 측의 유출 표면에 가깝게 위치하며 이완기10,11,12 동안 응고를 유지하는 강도를 제공하는 유형 I 및 유형 III 원 섬유 콜라겐이 풍부합니다. VIC는 정지 상태에 있지만 염증, 세포 외 기질 (ECM)의 리모델링 및 기계적 스트레스와 같은 요인이 VIC 항상성 8,9,13,14,15,16을 방해 할 수 있습니다. 항상성의 상실과 함께, VICs는 세포외 밀리ᄅ17을 리모델링하는 단백질의 증식, 수축 및 분비가 가능한 근섬유아세포-유사 표현형을 활성화시키고 획득한다. 활성화된 VIC는 중간엽 줄기세포(MSC)가 조골세포 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25로 분화된 것을 연상시키는 석회화 세포로 전환될 수 있습니다.
석회화는 VEC와 VIC 모두의 기여로부터 콜라겐이 풍부한 섬유사 층에서 시작되는 것으로 보이지만 전단지8의 다른 층을 확장하고 침범합니다. 따라서 VEC와 VIC가 모두 골 형성 유전자의 발현을 상향 조절하는 자극에 반응한다는 것은 분명하지만, 골 형성 유전자의 활성화를 유도하는 정확한 사건과 세포와 전단지의 세포 외 기질 사이의 복잡한 상호 작용은 아직 정의되지 않은 상태로 남아 있습니다. 쥐 모델은 CAVD denovo 26,27을 개발하지 않기 때문에 CAVD 발병 기전의 비 유전 적 동인을 연구하는 이상적인 공급원이 아니므로 일차 인간 조직과 이들 조직으로부터 분리 된 1 차 세포주의 사용이 필요합니다. 특히, 3D 세포 배양 및 오가노이드 모델링 분야가 확대되고 뮤린 모델에 대한 생체 외 인간 기반 대안이 될 가능성이 높기 때문에 이러한 세포를 높은 수와 우수한 품질로 얻는 것이 필수적입니다.
본 방법의 목적은 인간 기증자로부터 외과적으로 제거된 판막으로부터 얻은 VEC 및 VIC를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 조건을 확립한 워크플로우를 공유하는 것이다. 이전 연구에서는 돼지28 및 뮤린 밸브29에서 VEC와 VIC를 성공적으로 분리하는 것으로 나타 났으며, 우리가 아는 한 이것은 인간 조직에서 이러한 세포의 분리를 설명하는 최초의 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 인간 절제 판막에 적용할 수 있으며 절제된 조직의 세포를 크게 안정화시키는 장기 이식에 임상적으로 활용되는 완충 용액인 냉장 보관 용액의 활용을 도입하여 조직 절제와 실험실 처리 사이의 종종 긴 조달 시간으로 인한 손상을 크게 우회하고 개선합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 또한 세포 표현형을 결정하고 최소한의 세포 교차 오염으로 세포 생존의 높은 효율성을 보장하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
모든 환자 샘플은 헬싱키 선언에 따라 피츠버그 대학의 기관 검토위원회가 승인 한 연구에 등록 된 개인으로부터 수집됩니다. 장기 회복 및 교육 센터 (CORE)를 통해 얻은 사체 조직은 피츠버그 대학 사망자와 관련된 연구 및 임상 교육 감독위원회 (CORID)의 승인을 받았습니다.
1. 승인 및 안전
- 헬싱키 선언에 따라 환자 샘플 또는 사체 조직 수집에 대한 기관 검토 위원회(IRB) 승인 또는 면제 메모를 얻습니다.
- 혈액 매개 병원체 교육, 생물 의학 인간 대상 연구, 개인 정보 보호 및 정보 보안, 생물학적 물질의 운송 및 배송과 같은 인간 조직과 함께 작동하는 데 필요한 기관 교육을 받으십시오.
2. 물류 및 준비
- 수술 샘플
- 냉장고를 사용할 수 있고 수술실 근처에 있는지 확인하십시오. 수술진이 사용할 수 있도록 냉장 보관 용액의 멸균 분취액 40mL가 포함된 식별되지 않은 명명법이 미리 표시된 50mL 원추형 튜브를 이 냉장고에 보관하십시오. 이 튜브는 원래 패키지의 만료일까지 4 ° C에서 안정적입니다.
- 추출 시이 튜브에 밸브 조직을 넣으십시오. 누출 방지 비닐 봉지 또는 생물학적 위험 라벨이 부착된 플라스틱 용기와 같은 밀봉된 보조 용기에 튜브를 넣습니다. 조직은 생물학적 위험을 운반하기위한 제도적 프로토콜에 따라 얼음 위에서 집어 들고 운반됩니다.
- 사체 샘플
- 회수 된 장기를 냉장 보관 용액에 담그고 밀봉 된 2 차 격납 용기에 넣고 생물학적 위험 물질 운송을위한 제도적 프로토콜에 따라 얼음 위로 운송하십시오.
3. 시약 준비
- 적어도 전날 콜라겐 코팅 플레이트를 만드십시오.
- 50mL 원뿔형 튜브에 이소프로필 알코올 5mL, 아세트산 8.7mL, 콜라겐 I 분말 0.5μg을 혼합합니다. 멸균 수로 최대 50mL를 가져옵니다. 0.45μm 필터를 통해 혼합하고 필터링합니다.
- 멸균 세포 배양 후드 아래에서 6웰 플레이트와 10cm 접시에 충분한 콜라겐 용액을 추가하여 바닥 전체를 덮습니다. 접시를 덮고 실온에서 4-6시간 동안 그대로 두십시오. 멸균 피펫으로 여분의 용액을 제거하고 새로운 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 4°C에서 보관하여 추가 플레이트를 만듭니다. 용액은 4°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 밤새 건조시킨 다음, 4°C에서 재밀봉 가능한 백에 보관한다. 콜라겐 코팅 접시와 접시는 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
- 다음 품목을 오토 클레이브하십시오 : 조직 집게, 조직 가위, 면봉 및 거즈 패드.
- VEC 성장 배지: 제조업체의 프로토콜에 따라 내피 세포 성장 배지를 준비하고 사용합니다. 4 ° C의 어두운 곳에 보관하십시오. 세포에 사용하기 직전에 37 ° C로 따뜻하게하고 미디어를 필요 이상으로 오래 온난화 욕조에 두지 마십시오 (10-15 분이면 충분합니다). 준비 후 한 달 이내에 미디어를 사용하십시오.
- VIC 성장 배지: 10% 열 비활성화 FBS 및 100 I.U./mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 기본 배지(4.5g/L 포도당, L-글루타민 보충제, 110mg/L 나트륨 피루브산)30 를 보충합니다. 4 ° C의 어두운 곳에서 최대 3 개월 동안 보관하십시오. 세포에 사용하기 직전에 37 ° C로 따뜻하게하고 미디어를 필요 이상으로 오래 온난화 욕조에 두지 마십시오 (10-15 분이면 충분합니다).
- 사용 직전에 멸균 헹굼 용액을 만드십시오. 멸균 PBS에 2.5μg/mL 살균제, 0.05mg/mL 겐타마이신 및 5μg/mL 살균제를 보충합니다.
- 사용 직전에 멸균 콜라게나제 용액을 만드십시오. 5 mL의 멸균 된 신선한 DMEM 기본 배지에 5 mg의 콜라게나제 II를 첨가한다. 잘 혼합하고 0.45 μm 필터를 통과시켜 용액을 멸균하십시오. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
4. 조직 준비 및 가공
참고: 작업을 시작하기 전에 인체 조직 사용에 대한 기관 승인을 받아야 합니다. 티슈를 취급하는 동안 다음과 같은 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다 : 일회용 액체 장벽 랩 어라운드 가운 또는 앞치마 및 일회용 슬리브 클로버에 액체 장벽 랩이있는 전용 버튼 전면 실험실 코트; 전면 안면 보호대 또는 수술 용 마스크가 달린 안전 안경; 이중 장갑; 발가락이 가까운 신발; 그리고 다리를 덮을 옷. 석회화 평가(섹션 5) 및 세포 분리(섹션 6 및 7)를 위한 조직 준비의 포괄적인 워크플로우 다이어그램이 각각 그림 1A, B 에 설명되어 있습니다.
- 사체 기관 검체를 받으면 대동맥 뿌리를 절제하고 멸균 헹굼 용액의 50mL 원추형 튜브에 담그십시오. 수술 검체를 받으면 수송 용기에서 꺼내 멸균 헹굼 용액의 50mL 원추형 튜브에 담급니다. 로커의 얼음 양동이에 티슈가 들어있는 튜브를 놓고 실온 (RT)에서 10 분 동안 혼합합니다.
참고: 추출 시간에 최대한 가깝게 조직을 처리하면 최상의 세포 회복을 얻을 수 있지만 절제 후 61시간 이상 생존 가능한 세포를 수집할 수 있으며 데이터에 따르면 시간이 증가함에 따라 VIC가 VEC보다 더 강력합니다. 조직을 즉시 처리할 수 없는 경우 가능하면 조직을 제거하고 4.1단계를 수행한 다음 조직을 새로운 멸균 냉장 보관 용액에 다시 넣고 진행할 준비가 될 때까지 4°C에서 유지합니다. 야간 또는 주말 수술 중에 수집된 판막은 4°C에서 40mL 냉장 보관 용액에 보관할 수 있으며 추출 후 2일 이상 생존 가능한 세포를 생산할 수 있습니다. - 튜브에 70 % 에탄올을 뿌리고 멸균 후드로 옮깁니다. 조직을 제거하고 두 개의 밸브 전단지를 절제합니다(그림 2A). 하나의 전단지를 극저온 바이알(또는 향후 분석을 위해 여러 개의 작은 조각이 필요한 경우 2-3개 바이알)에 넣고 액체 질소를 떨어뜨려 스냅 동결한 다음 -80°C에서 보관합니다.
- 밸브가 이첨판이면 하나의 전단지 만 소비하십시오. 가위를 사용하여 결절에서 경첩까지 전단지를 반으로 자릅니다. 스냅 냉동을 위해 전단지의 절반을 사용하고 4.3 단계에 나머지 절반을 사용하십시오.
- 파라핀 임베딩을 위한 두 번째 전단지를 처리하여 결절에서 경첩까지 반으로 절단하여 석회화 함량을 평가합니다. 두 조각을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 잠긴 카세트에 넣은 다음 RT의 로커에 최소 2시간 이상 4시간 이하로 놓습니다.
참고: 고정 시간이 길수록 면역형광 염색으로 더 많은 배경이 생성됩니다. 4.2단계와 4.3단계가 수행되면 즉시 섹션 6으로 이동하고 6.12단계 후에 4.4단계로 돌아갑니다. - 고정 후 신선한 PBS에 1 시간 3-4 회 담가 조직을 씻으십시오. 이러한 세척 후 샘플은 필요한 경우 몇 개월 동안 4 ° C의 PBS에 머무를 수 있습니다. 임베딩 직전에 다음 단계로 진행합니다.
- 점차적으로 PBS에서 70 % 에탄올로 변경하십시오. 각 단계를 30-60 분 동안 1 : 4 70 % 에탄올로 씻으십시오 : PBS; 1 : 1 70 % 에탄올 : PBS, 4 : 1 70 % 에탄올 : PBS; 70 % 에탄올.
- 확립된 프로토콜(31)에 따라 절편이 전단지의 3개의 층을 드러내도록 조직을 매립한다(도 31). 대안으로, 가능한 경우, 조직을 병리학 코어로 가져와 매립 및 절단하십시오.
- 티슈를 취급한 후에는 PPE를 적절하게 폐기하거나 보관하고 즉시 손을 씻으십시오. 표백제 또는 세제 소독제를 1:10으로 희석하여 모든 장비, 표면, 고체 및 액체 폐기물의 오염을 제거하십시오. 오염 제거를 위해 20 분을 기다린 다음 70 % 에탄올 헹굼으로 헹굽니다. 제조업체의 지침에 따라 세포 배양 후드를 마이코플라스마 스프레이로 처리하십시오.
5. 칼슘 함량에 대한 폰 코사 염색
참고: 이것은 세포 분리 및 라인 설정 후에 잘 수행될 수 있지만 조직의 석회화 수준을 확립된 1차 세포주와 관련된 문서와 연결해야 합니다.
- 5 또는 10 μm 두께의 파라핀 슬라이스를 유리 슬라이드에 자르고 슬라이드를 65 ° C에서 1 시간 동안 구운 다음 RT로 냉각시킵니다.
- 신선한 용액을 사용하여 다음과 같이 담그면 슬라이드를 탈파라핀화합니다: 30분 동안 100% 크실렌, 2x; 3 분 동안 100 % 에탄올, 2x; 3 분 동안 90 % 에탄올; 3 분 동안 80 % 에탄올; 3 분 동안 70 % 에탄올; 3 분 동안 50 % 에탄올; 3 분 동안 초순수; 다음 단계까지 초순수에 보관하십시오.
참고: 위의 시간은 최소이며 각 단계는 더 길어질 수 있습니다. - 제조업체의 프로토콜에 따라 Von Kossa 염색을 진행하십시오.
- 전체 판막 영역을 현미경으로 평가하고 대조군 조직(석회화의 징후 없음) 또는 CAVD(석회화의 모든 증거, 그림 2B)를 할당합니다.
6. 판막 내피 세포(VEC) 분리, 확장 및 확인
- 멸균 세포 배양 후드에서 나머지 밸브 리플렛이 들어 있는 원뿔형 튜브를 열고 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 리플렛을 넣습니다. 튜브를 캡핑하고 RT에서 2분 동안 부드럽게 뒤집거나 로커에 놓습니다.
- 5-7mL의 차가운 콜라게나제 용액으로 채워진 60mm 접시에 조직을 제거합니다. 집게를 사용하여 전단지의 양면을 용액에 3-4 번 담그십시오. 조직을 37°C의 세포 배양 배양기에서 5-10분 동안 배양하고, 2분 간격으로 3-4회 부드럽게 조직을 흔든다.
- 접시에서 용액 2mL를 꺼내 멸균 15mL 원추형 튜브에 넣습니다. 결절에 집게를 놓고 마른 멸균 면봉을 사용하여 집게에서 경첩으로 스 와이프하여 면봉을 돌리면서 전단지를 따라 움직입니다. 각 스와이프 사이에 15mL 원뿔형 튜브의 용액에 있는 면봉을 헹구어 세포를 제거합니다. 반복하여 조직 표면을 완전히 닦은 다음 뒤집어서 반대쪽에서도 반복합니다.
- 한 손에는 집게로 밸브 전단지를 잡고 다른 한 손에는 1mL 피펫을 들고 접시에있는 용액으로 전단지의 표면을 헹굽니다. 헹구면 접시에 VEC가 포함된 모든 용액을 면봉의 세포와 동일한 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 6.5단계로 진행합니다. 나머지 판막 조직을 멸균 콜라게나제 용액 7mL가 포함된 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 7.1단계로 진행합니다.
- VEC가 포함된 튜브를 180 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 분리된 VEC를 펠릿화합니다. 상청액을 흡인하고 3mL의 VEC 성장 배지에 재현탁합니다. 한 번 더 원심분리하고 상층액을 제거한다. 세포를 1mL의 성장 배지에 재현탁시키고 혈구계 및 트리판 블루를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
- VEC 펠릿을 2mL의 VEC 성장 배지에 재현탁하고 6웰 플레이트의 콜라겐 사전 코팅된 웰에 세포를 약 5 x 105 cells/cm2로 플레이팅합니다. 세포가 적어도 3-4 일 동안 자라게한 다음 배지를 제거하고 신선한 배지로 보충하십시오. 4일마다 미디어 교체를 반복합니다. VEC는 조약돌 모양의 패치로 성장합니다 (그림 3B, 왼쪽 패널).
- VEC 패치가 플레이트의 >80%를 덮을 때 성장 속도에 따라 약 1.3 x 104 cells/cm2에서 세포를 분할합니다(1주 이내에 80%에 도달하면 약간 더 낮은 수의 cells/cm2로 분할).
- 분할하려면 2mL DPBS로 세포를 두 번 씻은 다음 세포 표면을 덮을 만큼 충분한 해리 시약을 추가합니다. 37 ° C에서 2-3 분 동안 배양하여 세포가 과도하게 배양되지 않았는지 확인합니다. 동일한 부피의 VEC 성장 배지를 추가하여 소화를 중지하고 액체를 15mL 튜브에 옮깁니다. 180 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 필요한 웰/플레이트 수에 맞게 적절한 양의 배지에 재현탁합니다.
참고: 일단 10cm 플레이트로 확장되면 VEC는 때때로 형태를 잃고 증식함에 따라 표현형이 변할 수 있습니다. 이것은 VEC가 세포주의 확립 및 확장 동안 낮은 컨플루언스에서 시딩될 때 발생하는 경향이 있습니다. - 순수한 배양을 보장하려면 분할할 때마다 CD31+ 초상자성 비드를 활용하는 것이 좋습니다.
- 1 x 108 개 이하의 세포(10cm 접시 1개 이하)의 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 세척하여 25μL의 초상자성 비드를 준비합니다.
참고: VEC를 트립신화하기 전에 6.10단계를 수행하는 것이 좋습니다. - 단계 6.8에서와 같이 세포를 분리하되 0.1% BSA, pH 7.4로 500 μL의 PBS에 재현탁시키고, 2 mL 원심분리 튜브에 넣었다. 세척 및 재현탁 비드 500μL를 세포의 2mL 튜브에 추가하고 4°C에서 20분 동안 회전기에서 배양합니다.
- 자석에 튜브를 2분 동안 놓습니다. 튜브가 자석에 남아있는 동안 조심스럽게 상청액을 제거하십시오. 자석에서 튜브를 제거하고 0.1% BSA가 포함된 새 PBS 1mL를 넣고 부드럽게 2-3회 피펫팅한 다음 자석에 다시 2분 동안 놓습니다. 2 번 더 반복하십시오. 완충액을 최종 제거한 후, 재도금에 필요한 부피로 성장 배지에 세포를 재현탁시킨다.
참고: 세포에는 여전히 구슬이 있지만 성장에 영향을 미치지 않으며 후속 계대에서 제거됩니다. - 세포가 확장되면 형태학 외에도 폰 빌레브란트 인자(vWF), 카드헤린 5(CDH5) 또는 PECAM-1/CD31과 같은 면역형광 마커에 대한 양성 염색과 칼포닌 1(CNN) 또는 알파-2 평활근 액틴과 같은 VIC 마커에 대한 음성 염색을 통해 VEC 표현형을 확인합니다(αSMA, 그림 4, 왼쪽 패널).
7. 밸브 간질 세포(VIC) 격리, 확장 및 보관
- 단계 6.4에서 언급했듯이 밸브 조직에서 VEC를 제거한 후 전단지를 7mL 콜라게나제 용액이 있는 15mL 원추형 튜브에 넣습니다. 가스 교환을 허용하기 위해 캡을 약간 연 상태에서 세포 배양 인큐베이터에서 12시간 동안 배양합니다. VIC의 성공적인 분리는 콜라게나제 용액에서 최대 18 시간 동안 계속 발생할 수 있습니다.
- 배양 후 멸균 세포 배양 후드에서 혈청학적 피펫으로 피펫팅하여 조직을 부드럽게 혼합하여 전단지 조직에서 VIC가 방출되도록 합니다.
- 세포 현탁액을 제거하고 0.70μm 필터를 통과하여 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
- 7mL의 VIC 성장 배지를 50mL 튜브에 넣고 180 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 1mL의 VIC 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 세포 수를 결정합니다. VIC를 60mm 조직 배양 처리된 접시에 1.3 x 104 cells/cm2로 플레이팅합니다.
- 배지를 교체하기 전에 적어도 1-2 일 동안 세포를 자라게하십시오. 배지를 제거하고 DPBS를 두 번 세척하여 잔류 파편을 제거하고 신선한 성장 배지로 교체합니다. 2-3 일마다 배지를 보충하십시오. VIC는 섬유 아세포 모양으로 성장합니다 (그림 3B, 오른쪽 패널).
- VIC가 >90%의 컨플루언시에 도달하면 DPBS로 두 번 세척하여 과도한 배지를 제거하고 플레이트를 덮기 위해 적절한 양의 예열된 해리 시약을 추가하여 세포를 분리합니다(즉, 10cm 접시당 2-3mL). 접시를 37 °C 인큐베이터에서 배양하십시오. VIC는 2-3 분의 배양 후에 접시에서 분리됩니다. 예열된 배지 4-6mL를 추가합니다.
알림: 세포가 플레이트에서 들어 올리는 데 3분 이상 걸리면 해리 시약이 효능을 잃었을 수 있습니다. 필요한 경우 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 들어 올릴 수 있습니다. - 세포 현탁액을 튜브로 옮기고 180 x g 에서 5분 동안 부드럽게 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후, 예열된 VIC 성장 배지에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시키고, 혈구계 및 트립판 블루를 사용하여 생존 세포의 수를 결정한다. 생존 가능한 세포를 원래 접시의 1:2 밀도(즉, 10cm 접시당 ~ 1 × 106 세포 또는 1.3 x 104 세포/cm2)로 시드합니다.
- αSMA, CNN 또는 SM22α와 같은 면역형광 마커에 대한 양성 염색과 CD31, CDH5 또는 vWF와 같은 VEC 마커에 대한 음성 염색으로 VIC 표현형을 평가합니다(그림 4, 오른쪽 패널).
참고: 여기에 제시된 프로토콜 워크플로는 VEC 및 VIC 격리를 위해 하나의 전단지를 편향 없이 선택하고 나머지 전단지는 Von Kossa 염색(섹션 5) 및 스냅 동결에 사용됩니다.
8. 장기 세포 저장
- 확장되면 장기 보관을 위해 세포를 동결시킵니다. 2-5mL DPBS로 세포를 두 번 세척한 다음 6.8단계 및 7.6단계와 같이 세포를 분리하기에 충분한 해리 시약을 추가합니다. 동일한 부피의 VEC 또는 VIC 성장 배지를 추가하여 분해를 중지하고 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 혈구계 및 트리판 블루를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 결정한다.
- 180 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 냉각된 조절 성장 배지에 세포를 ~3 × 106 cells/mL의 세포 밀도로 재현탁합니다.
- 소용돌이 치면서 부드럽게 식힌 2x 냉동 보존 배지를 같은 부피로 첨가하십시오. 이것은 세포 농도를 ~ 1.5 × 106 세포 / mL로 가져옵니다.
- 냉동 보존 바이알에 1mL를 분취합니다. 바이알을 세포 냉동 용기에 넣고 닫고 5-6 번 뒤집어 세포가 부유 상태로 유지되도록합니다. 용기를 -80°C에서 6-72시간 동안 또는 냉동 용기 프로토콜에 따라 놓습니다. -80 ° C에서 바이알을 제거하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
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Representative Results
위의 프로토콜은 인간 판막 조직의 취급 및 이러한 조직으로부터 생존 가능한 세포주의 분리 및 확립에 필요한 단계를 설명합니다. 대동맥 판막의 전단지는 파라핀 포매를 위해 처리되고, 생화학 적 또는 유전 적 분석을위한 장기 보관을 위해 스냅 냉동되고, VEC와 VIC의 분리를 위해 소화됩니다 (그림 1). 수술 표본은 대동맥 협착증의 임상 진단을 받을 가능성이 높으며 육안으로 볼 수 있는 석회화의 무거운 결절을 나타낼 수 있지만 대동맥 판막 석회화는 상당수의 노인(>65세)32명에게 존재하며, 이러한 유병률로 인해 모든 조직(수술 및 사체)은 석회화가 있는지 여부를 평가하기 위해 Von Kossa 염색 또는 유사한 절차를 거칩니다(그림 2).
냉장 보관 용액을 사용하면 절제된 판막 조직의 세포가 크게 안정화되는 것으로 나타났습니다. 냉장 보관 용액은 살아있는 장기 이식에 사용됩니다. 그것은 기증자로부터 제거되기 전후에 장기를 통해 플러시되고 얼음 위에서 운송하는 동안 해당 기관의 혈관 구조에 남아 있습니다. VEC 라인은 수술 조직보다 기증자 표본에서 더 쉽게 확립되었으며, 기증자 라인은 더 많은 계대 동안 내피 세포 형태를 유지할 가능성이 더 높았습니다. 기증자 조직은 종종 사후 12-24시간 동안 실험실에 도착하지 않는 반면 수술 조직은 2시간에서 4시간 사이에 얻었기 때문에 이것은 당혹스러웠습니다. 수술 표본 튜브를 PBS 대신 냉장 보관 용액으로 포장하면 세포 회복이 크게 증가했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 실행 가능한 VEC와 VIC는 모두 밸브 추출 후 61시간 이상 얻을 수 있습니다. 판막 절제 후 최대 하루까지 세포를 분리할 때 VEC보다 약간 더 높은 비율의 라이브 VIC가 얻어지지만, 절제 후 48시간 후에도 세포는 생존 가능한 상태로 유지됩니다. 회수 된 총 세포의 최대 40 %가 살아있는 세포에 해당하며 생물학적 복제물간에 일관된 수치를 관찰했습니다. 또한, 형태학 검사는 또한 세포 정체성을 확인합니다. VEC는 패킹, 조약돌 모양 및 성장 접촉 억제 세포로 나타나지만 VIC 형태는 스핀들 모양의 근섬유아세포와 유사합니다. 검체의 면역 염색 결과 확장 VEC의 1.8 (n = 3)± 91.8 %가 내피 마커 vWF에 대해 양성 인 반면, 확장 VIC의 92.0 % ± 5.0 (n = 3)은 간질 세포 마커 αSMA에 대해 양성임을 확인했습니다 (그림 4). 이 수치는 이전에 보고된 결과와 일치합니다.33.
그림 1: 판막 조직 처리 및 인간 통제 및 CAVD 판막으로부터의 세포 분리. (A) 판막의 석회화 수준 평가를 위한 조직 처리의 개략적 표현. (B) 대조군 및 CAVD 조직으로부터 인간 판막 내피 세포(VEC) 및 판막 간질 세포(VIC)의 분리 및 특성화를 위한 시간 경과 및 단계의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 석회화 평가. (A) 인간 기증자의 대조군(상단) 및 석회화된(하단) 판막 조직의 대표 이미지. CAVD 조직의 석회화 결절은 형태와 전단지를 깨끗하게 절제하는 능력을 심각하게 변경할 수 있습니다. (b) 대표 폰 코사 대조군 (왼쪽) 및 CAVD (오른쪽) 인간 판막 조직의 고정 및 추가 처리 후의 판막 조직 염색. 석회화는 전단지 조직에 어두운 침전이 존재함으로써 나타납니다. 밸브 이미지는 실험실 카메라로 캡처되었습니다. Von Kossa 염색 밸브는 10x 대물렌즈, 스케일 바 200μm로 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세포 생존(A) VEC 및 VIC 생존 곡선 평가. 5 개의 밸브 시편에서 3 개의 전단지를 얻었습니다. 각 밸브의 첫 번째 전단지는 즉시 처리되었고(추출 후 3-12시간), 두 번째 전단지는 약 24시간 후(22-35시간), 세 번째 전단지는 조직을 얻은 후 약 48시간 후에 처리되었습니다(45-61시간). 밸브 전단지는 처리될 때까지 4°C에서 냉장 보관 용액에 보관하였다. y축은 살아있는 세포의 백분율을 나타냅니다. (B) VEC (왼쪽 패널) 및 VIC (오른쪽 패널)의 건강한 배양 형태. 그래프는 n = 5 판막 조직으로부터 분리된 세포의 평균 ± SD 라이브 세포 비율을 보여준다. 이미지는 4x 및 10x 대물렌즈, 스케일 바가 각각 200μm 및 100μm로 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: VEC 및 VIC에 대한 대표적인 면역형광 염색. VEC는 내피 마커 폰 빌레브란트 인자(vWF, 왼쪽 패널)에 대해 양성인 반면 VIC는 간질 마커 αSMA에 대해 양성입니다. 당사의 격리 프로토콜은 높은 격리 효율을 보장합니다. VEC와 VIC 간의 교차 오염은 감지되지 않습니다. 이미지는 10x 대물렌즈, 스케일 바 100μm로 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간으로부터 제어 및 질병 조직을 얻는 것은 시험관 내 및 생체 외 질병 모델링에 중요합니다. 그러나 벤치와 침대 옆 사이의 간격을 메우는 어려움에 대해 자주 이야기하는 반면, 수술실에서 벤치로 이동하는 역순은 종종 그 격차를 벅차게 만듭니다. 기초 과학자가 1차 인체 조직 표본을 얻는 데 필수적인 것은 간호사, 외과 기술자, 의사 보조, 의대생 및 레지던트, 임상 프로토콜 관리자로 구성된 팀을 보유한 투자한 외과의사 과학자와의 협력으로, 환자를 등록 및 동의하고, 절제된 조직의 적절한 취급에 참여하고 지원하며, 조직 픽업에 필요한 물류를 조정합니다. 절제에서 세포 분리까지의 시간을 줄이기 위해 관련된 모든 사람의 최대한의 노력이 없으면 중요한 세포 물질과 그 안에 포함 된 정보가 돌이킬 수 없을 정도로 변경되거나 손실됩니다.
조직 표본의 생존력을 유지하는 데 중요한 것은 냉장 보관 용액을 사용하는 것입니다. 이것은 UPMC 및 기타 이식 의료 센터의 장기 이식 팀에서 사용하는 것과 동일한 솔루션입니다. 수술실에서 더 빨리 얻었지만 차가운 PBS에 보관된 조직보다 기증자로부터 여러 시간 전에 절제된 사체 조직에서 더 나은 세포 수율을 얻었습니다. 이 우연한 발견은 인간 조직에서 세포를 조달하는 데 필수적이었습니다. 조직 절제에서 실험실에서의 전달까지의 조달 시간은 수술 조직의 경우 1-5시간, 사체 조직의 경우 24시간 이상입니다. 이에 비해 동물 조직의 조달 및 처리는 종종 안락사 후 몇 분 이내에 완료 될 수 있으며 이는 세포 생존력에 이상적입니다. 냉장 보관 용액의 부재하에서, 세포의 배양에 적합한 배지가 또한 PBS보다 더 잘 수행될 수 있을 가능성이 있지만, 이 배지는 생체 장기 이식에서 냉장 저장 용액의 성공 및 이 용액에서 사체 조직의 수령으로 인해 본원에서 시험되지 않았다. 이 용액은 수술실에 보관하기에 이상적인 상온에서 안정적이며 아데노신과 같은 특정 성분은 허혈/저산소증과 같은 세포 스트레스에 대한 유익한 반응을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다21,34.
생존 가능한 세포를 얻기위한 또 다른 필수 단계는 살균제, 겐타 마이신 및 살균제로 조직을 세척하는 것입니다. 이 짧은 헹굼은 세포가 박테리아와 곰팡이에 의해 오염되지 않은 상태로 유지되도록 도와줍니다. 판막 조직에서 VEC를 소화하는 단계도 마찬가지로 중요한데, 단 몇 분 만에 VEC가 분리된 다음 판막 전단지의 표면에서 면봉으로 제거됩니다. 전단지의 조밀 한 세포 외 기질에 상주하는 VIC의 후속 소화는 지속 시간과 강도에 대해 훨씬 더 많은 흔들림의 공간을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 편향되지 않은 조직 치료는 밸브 전단지, VEC 및 VIC에 존재하는 주요 두 세포 집단의 분리를 허용합니다. 최근의 단일 세포 전사체 분석이 CAVD 조직35 내의 6개의 비-밸브 유래 기질 세포를 포함하여, 인간 판막에 상주하는 적어도 14개의 상이한 세포 아형의 공존을 보여주었지만, 이러한 다양성은 이들 경화된 조직의 처리 및 소화로부터의 효과로 인한 변이를 나타낼 수 있거나, 또는 전단지 세포가 노출되는 상이한 미세환경 때문일 수 있다: VEC는 두 개의 다른 혈류에 노출되는 반면 VIC는 세 개의 다른 세포외 기질 지층 8,9에 내장되어 있습니다. 여기에 설명된 대규모 격리 프로토콜 및 분석은 VEC 및 VIC의 90% 이상이 주요 표현형에 해당하는지 확인합니다. 어느 정도의 이질성이 발견 될 수 있지만, VEC 및 VIC 항상성 8,9,13,14,15,16 연구의 일반적인 결과에는 영향을 미치지 않습니다.
환자와 판막 조직, 따라서 환자로부터 조달 된 세포주가 동일하지 않다는 점도 중요합니다. 유전학, 동반 질환, 수술 및 가공 중 취급, 소화 용액 성분의 신선도는 성장 속도와 심지어 분리된 세포의 행동 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구는 이 절차로 충분한 수의 생존 세포를 수득할 수 있는 능력을 입증하지만, 다운스트림 실험에 영향을 미칠 수 있는 이러한 세포주에는 선천적이거나 유도된 차이가 있을 수 있습니다. 환자 나 기증자로부터 조직이 제거 된 이후의 시간, 특히 후자의 경우 순환이 중단 된 이후의 시간을 정확하게 아는 것은 종종 어렵습니다. 또한, 수득된 생존 가능한 판막 세포의 수, 세포의 증식 능력 및 세포 표현형의 유지와 관련하여 조직 간에 고유한 가변성이 존재한다. 세포주에는 의사와 연구팀이 알지 못하는 선천적 또는 체세포의 유전적 돌연변이가 있을 수 있으며, 조직의 리모델링 및 후속 처리는 세포 표현형 또는 후성유전학을 수정할 수도 있습니다. 따라서 이러한 1차 인간 세포가 사용되는 모든 실험에서 생물학적 복제물, 즉 다른 환자로부터 얻은 세포주를 사용하는 것이 상당한 시간과 비용에도 불구하고 절대적으로 중요합니다. 이는 모든 결과가 조직의 조달 및 처리로 인한 교란 효과로 인한 것이 아님을 보장하는 데 도움이 됩니다. 다른 세포주의 가변 증식 속도는 다른 시간에 실험에서 세포를 수집하거나 다른 밀도의 실험을 위해 세포를 파종하여 조정할 수 있습니다. 모든 실험 설계에 가장 적합한 답은 없습니다. 합병증이 중요하지 않은 것은 아니지만, 시험관 내 및 생체 외 실험 모델에 1차 인간 대조군 및 CAVD 조직 유래 세포주를 사용하는 것은 CAVD 발병 기전을 유도하는 개시 인자 및 전파 과정을 정의하는 데 필수적입니다.
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Disclosures
IS는 Atricure와 Medtronic으로부터 기관 연구 지원을 받고 Medtronic Vascular의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. 이러한 갈등 중 어느 것도 이 작업과 관련이 없습니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고에 대한 통찰력 있는 토론과 비판적 읽기에 대해 Jason Dobbins에게 감사드립니다. 우리는 장기 회복 및 교육 센터의 도움과 지원에 감사하고 이 연구를 가능하게 한 조직 기증자와 그 가족에게 감사드립니다. 모든 환자 샘플은 헬싱키 선언에 따라 피츠버그 대학의 기관 검토위원회가 승인 한 연구에 등록 된 개인으로부터 수집됩니다. 장기 회복 및 교육 센터 (CORE)를 통해 얻은 사체 조직은 피츠버그 대학 사망자와 관련된 연구 및 임상 교육 감독위원회 (CORID)의 승인을 받았습니다.
Biorender.com 로 만든 일부 그림.
CSH는 National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 및 R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111에 의해 지원된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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