Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af primære ventilceller til in vitro-sygdomsmodellering

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62439
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

Summary

Denne protokol beskriver samlingen af humane aortaklapper ekstraheret under kirurgiske aortaklapudskiftningsprocedurer eller fra kadavervæv og den efterfølgende isolering, ekspansion og karakterisering af patientspecifikke primære ventilendotel- og interstitielle celler. Inkluderet er vigtige detaljer om de processer, der er nødvendige for at sikre cellelevedygtighed og fænotypespecificitet.

Abstract

Calcific aorta valve disease (CAVD) er til stede i næsten en tredjedel af den ældre befolkning. Fortykkelse, afstivning og forkalkning af aortaklappen forårsager aortastenose og bidrager til hjertesvigt og slagtilfælde. Sygdomspatogenese er multifaktoriel, og spændinger som betændelse, ekstracellulær matrixombygning, turbulent strømning og mekanisk belastning og belastning bidrager til den osteogene differentiering af ventilendotel- og ventilinterstitielle celler. Imidlertid er de præcise initierende faktorer, der driver den osteogene overgang af en sund celle til en forkalkningscelle, ikke fuldt defineret. Endvidere er den eneste aktuelle behandling for CAVD-induceret aortastenose udskiftning af aortaklappen, hvorved den oprindelige ventil fjernes (kirurgisk udskiftning af aortaklappen, SAVR) eller en fuldt sammenklappelig udskiftningsventil indsættes via et kateter (udskiftning af transkateter aortaklappen, TAVR). Disse kirurgiske procedurer har en høj pris og med alvorlige risici; Det er derfor bydende nødvendigt at identificere nye terapeutiske mål for lægemiddelopdagelse. Til dette formål udvikler denne undersøgelse en arbejdsgang, hvor kirurgisk fjernet væv fra patienter og donorkadavervæv bruges til at skabe patientspecifikke primære linjer af valvulære celler til in vitro sygdomsmodellering. Denne protokol introducerer brugen af en køleopbevaringsopløsning, der almindeligvis anvendes til organtransplantation, for at reducere skaden forårsaget af den ofte lange indkøbstid mellem vævsudskæring og laboratoriebehandling med fordel for stærkt stabiliserende celler i det udskårne væv. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at isolerede ventilceller bevarer deres proliferative kapacitet og endotel- og interstitielle fænotyper i kultur op til flere dage efter ventilfjernelse fra donoren. Brug af disse materialer giver mulighed for indsamling af kontrol- og CAVD-celler, hvorfra både kontrol- og sygdomscellelinjer etableres.

Introduction

Calcific aorta valve disease (CAVD) er en kronisk patologi præget af inflammation, fibrose og makrokalcifikation af aortaklappens foldere. Progressiv ombygning og forkalkning af indlægssedlerne (kaldet aortastelerose) kan føre til obstruktion af blodgennemstrømningen (aortastenose), som bidrager til slagtilfælde og fører til hjertesvigt. I øjeblikket er den eneste behandling for CAVD kirurgisk eller transkateter aortaklappen udskiftning (henholdsvis SAVR og TAVR). Der er ingen ikke-kirurgisk mulighed for at standse eller vende CAVD-progression, og uden udskiftning af ventil nærmer dødeligheden sig 50% inden for 2-3 år 1,2,3. Definition af de underliggende mekanismer, der driver denne patologi, vil identificere potentielle nye terapeutiske tilgange.

Hos en sund voksen er aortaklap brochurer cirka en millimeter tykke, og deres hovedfunktion er at opretholde den ensrettede strøm af blod ud af venstre ventrikel4. Hver af de tre foldere består af et lag af ventilendotelceller (VEC'er), der linjer den ydre overflade af indlægssedlen og fungerer som en barriere. VEC'er opretholder ventilhomeostase ved at regulere permeabilitet, inflammatorisk celleadhæsion og parakrin signalering 5,6,7. Ventil interstitielle celler (VICs) omfatter størstedelen af cellerne i ventilfolderen8. VICs er arrangeret i tre karakteristiske lag i brochuren. Disse lag er kendt som ventricularis, spongiosa og fibrosa9. Ventricularis vender mod venstre ventrikel og indeholder kollagen og elastinfibre. Det midterste lag, spongiosa, indeholder højt proteoglycanindhold, der giver forskydningsfleksibilitet under hjertecyklussen. Det ydre fibrosalag er placeret tæt på udstrømningsoverfladen på aortasiden og er rig på type I og type III fibrillært kollagen, som giver styrke til at opretholde coaptation under diastol10,11,12. VICs befinder sig i en hvilende tilstand, men faktorer som betændelse, ombygning af den ekstracellulære matrix (ECM) og mekanisk stress kan forstyrre VIC-homeostase 8,9,13,14,15,16. Med tab af homeostase aktiverer VICs og erhverver en myofibroblastlignende fænotype, der er i stand til proliferation, sammentrækning og sekretion af proteiner, der ombygger den ekstracellulære millieu17. Aktiverede VIC'er kan overgå til forkalkningsceller, der minder om differentieringen af en mesenkymal stamcelle (MSC) til en osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Forkalkning ser ud til at starte i det kollagenrige fibrosalag fra bidrag fra både VEC'er og VICs, men udvider og invaderer de andre lag i folderen8. Det er således klart, at både VEC'er og VIC'er reagerer på stimuli for at opregulere ekspressionen af osteogene gener, men de præcise begivenheder, der driver aktiveringen af osteogene gener, såvel som det komplekse samspil mellem cellerne og brochurens ekstracellulære matrix, forbliver dårligt defineret. Murine-modeller er ikke en ideel kilde til at studere ikke-genetiske drivere af CAVD-patogenese, da mus ikke udvikler CAVD de novo26,27, hvorfor brugen af primære humane væv og de primære cellelinjer isoleret fra disse væv er nødvendig. Især er det bydende nødvendigt at opnå disse celler i stort antal og god kvalitet, da området for 3D-cellekulturer og organoidmodellering udvides og sandsynligvis vil blive et ex vivo menneskebaseret alternativ til murinemodeller.

Formålet med denne metode er at dele en arbejdsgang, der har etableret betingelserne for effektivt at isolere og dyrke VEC'er og VIC'er opnået fra kirurgisk fjernede ventiler fra humane donorer. Tidligere undersøgelser har vist vellykket isolering af VEC'er og VIC'er fra svin28 og murinventiler29, så vidt vi ved, er dette den første til at beskrive isoleringen af disse celler i humant væv. Den her beskrevne protokol gælder for udskårne ventiler til mennesker og omgår og forbedrer i høj grad skaderne forårsaget af den ofte lange udtagningstid mellem vævsudskæring og laboratoriebehandling ved at indføre anvendelse af en køleopbevaringsopløsning, en bufferopløsning, der klinisk anvendes i organtransplantationer, der i høj grad stabiliserer celler i det udskårne væv. Protokollen beskrevet her viser også, hvordan man bestemmer cellefænotype og garanterer høj effektivitet af celleoverlevelse med minimal cellekrydskontaminering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle patientprøver indsamles fra personer, der er indskrevet i undersøgelser, der er godkendt af det institutionelle gennemgangsudvalg ved University of Pittsburgh i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Kadavervæv opnået via Center for Organ Recovery and Education (CORE) blev godkendt af University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).

1. Godkendelse og sikkerhed

  1. Få godkendelse fra Institutional Review Board (IRB) eller et fritaget notat for enhver indsamling af patientprøver eller kadavervæv i overensstemmelse med Helsingforserklæringen.
  2. Tag den nødvendige institutionelle uddannelse til at arbejde med humane væv såsom blodbårne patogener træning, biomedicinsk human subjects forskning, privatliv og informationssikkerhed og transport og forsendelse af biologiske materialer.

2. Logistik og forberedelse

  1. Kirurgiske prøver
    1. Sørg for, at et køleskab er tilgængeligt og placeret i nærheden af operationsstuen. Opbevar 50 ml koniske rør formærket med afidentificeret nomenklatur indeholdende 40 ml sterile alikvoter af køleopbevaringsopløsning i dette køleskab til brug for kirurgisk personale. Disse rør er stabile ved 4 °C indtil udløbsdatoen på den originale emballage.
    2. Ved ekstraktion placeres ventilvæv i disse rør. Anbring rørene i en forseglet sekundær beholder, såsom en lækagesikker plastpose eller en plastbeholder, der er mærket med en biohazard-etiket. Væv samles op og transporteres på is i henhold til institutionelle protokoller for transport af biohazards.
  2. Kadaveriske prøver
    1. Nedsænkning af genvundne organer i køleopbevaringsopløsning, anbringes i et forseglet sekundært indeslutningsfartøj, og transport på is i henhold til institutionelle protokoller for transport af biohazarder.

3. Forberedelse af reagenser

  1. Lav kollagenbelagte plader mindst dagen før.
    1. I et 50 ml konisk rør blandes 5 ml isopropylalkohol, 8,7 ml eddikesyre og 0,5 μg kollagen I-pulver. Bring op til 50 ml med sterilt vand. Bland og filtrer gennem et filter på 0,45 μm.
    2. Under en steril cellekulturhætte tilsættes nok kollagenopløsning til 6 brøndplader og 10 cm skåle til bare at dække hele bunden. Dæk pladen og lad den sidde i 4-6 timer ved stuetemperatur. Den overskydende opløsning fjernes med en steril pipette, anbringes i et nyt sterilt 50 ml konisk rør, og der spares ved 4 °C for at fremstille yderligere plader. Opløsningen kan opbevares ved 4 °C i flere måneder.
    3. Pladerne tørres i en 37 °C inkubator natten over, og de opbevares derefter i en genlukkelig pose ved 4 °C. Kollagenbelagte tallerkener og tallerkener kan opbevares i flere måneder.
  2. Autoklave følgende elementer: vævstang, vævssaks, vatpinde og gasbind.
  3. VEC-vækstmedier: Forbered og brug endotelcellevækstmedium i henhold til producentens protokoller. Opbevares i mørke ved 4 °C. Varm til 37 °C lige før brug på celler, lad ikke medier stå i opvarmningsbad længere end nødvendigt (10-15 min er tilstrækkeligt). Brug medierne inden for en måned efter forberedelsen.
  4. VIC-vækstmedier: Supplement DMEM-basismedium (4,5 g / l glucose, L-glutamintilskud, 110 mg / l natriumpyruvat)30 med 10% varmeinaktiveret FBS og 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin. Opbevares i mørke ved 4 °C i op til 3 måneder. Varm til 37 °C lige før brug på celler, lad ikke medier stå i opvarmningsbad længere end nødvendigt (10-15 min er tilstrækkeligt).
  5. Lav steril skylleopløsning lige før brug. Suppler sterilt PBS med 2,5 μg/ml fungicid, 0,05 mg/ml gentamicin og 5 μg/ml baktericid.
  6. Lav steril collagenaseopløsning lige før brug. Der tilsættes 5 mg collagenase II til 5 ml sterilt frisk DMEM-basismedium. Bland godt og steriliser opløsningen ved at passere gennem et 0,45 μm filter. Opbevares på is indtil brug.

4. Vævsforberedelse og -behandling

BEMÆRK: Institutionel godkendelse til brug af humant væv skal indhentes, inden arbejdet påbegyndes. Under håndtering af væv skal følgende personlige værnemidler (PPE) bæres: en engangs flydende barriere wrap-around kjole eller en dedikeret knap front lab frakke med en væskebarriere wrap omkring forklæde og engangs ærmekløver; et fuldt ansigtsskærm eller sikkerhedsbriller med en kirurgisk maske; dobbelt handsker; tæt-toed sko; og tøj til at dække benene. Omfattende arbejdsgangsdiagrammer over vævspræparatet til forkalkningsvurdering (afsnit 5) og celleisolering (afsnit 6 og 7) er illustreret i henholdsvis figur 1A, B .

  1. Ved modtagelse af kadaverorganprøve skal du fjerne aortarden og nedsænkes i et 50 ml konisk rør med steril skylleopløsning. Ved modtagelse af kirurgisk prøve fjernes fra transportbeholdere og nedsænkes i et 50 ml konisk rør af steril skylleopløsning. Læg røret indeholdende vævet i isspand på vippen og bland i 10 min ved stuetemperatur (RT).
    BEMÆRK: Behandling af væv så tæt som muligt på ekstraktionstidspunktet vil give den bedste cellegenvinding, men levedygtige celler kan indsamles op til 61 timer efter udskæring, og data viser, at VIC'er er mere robuste end VEC'er, når tiden stiger. Hvis vævet ikke kan behandles med det samme, skal vævet fjernes, så trin 4.1 udføres, og vævet anbringes derefter tilbage i frisk steril køleopbevaringsopløsning og opbevares ved 4 °C, indtil det er klar til at fortsætte. Ventiler indsamlet under nat- eller weekendoperationer kan opbevares i 40 ml køleopbevaringsopløsning ved 4 ° C og er stadig i stand til at give levedygtige celler mere end 2 dage efter ekstraktion.
  2. Sprøjt ned rør med 70% ethanol og flyt til en steril hætte. Fjern væv og udskaf to ventilfoldere (figur 2A). Anbring en folder i et kryogent hætteglas (eller 2-3 hætteglas, hvis der er behov for flere mindre stykker til fremtidig analyse) og fastfrys ved at droppe flydende nitrogen og opbevares derefter ved -80 °C.
    1. Hvis ventilen er bicuspid, skal du kun udskære en folder. Brug saks til at skære brochuren i halvdelen fra knuden til hængslet. Brug den ene halvdel af indlægssedlen til snapfrysning og den anden halvdel til trin 4.3.
  3. Behandl den anden folder til paraffinindlejring for at vurdere forkalkningsindholdet ved at skære det i halve fra knude til hængsel. Anbring begge stykker i en kassette, der er nedsænket i 4% paraformaldehyd (PFA), og anbring derefter på en vippe ved RT i mindst 2 timer, men ikke mere end 4 timer.
    BEMÆRK: Længere fikseringstider skaber mere baggrund med immunfluorescerende farvning. Når trin 4.2 og 4.3 er udført, skal du straks gå til afsnit 6 og vende tilbage til trin 4.4 efter trin 6.12.
  4. Efter fiksering vaskes vævene ved at nedsænke i frisk PBS i 1 time 3-4 gange. Efter disse vaske kan prøverne forblive i PBS ved 4 °C i flere måneder, hvis det er nødvendigt. Fortsæt til næste trin lige før indlejring.
  5. Skift gradvist fra PBS til 70% ethanol. Vask 30-60 min hvert trin med 1:4 70% ethanol:PBS; 1:1 70% ethanol:PBS, 4:1 70% ethanol:PBS; 70% ethanol.
  6. Integrer vævet således, at sektioner afslører de tre lag af indlægssedlen (figur 1A) i henhold til etablerede protokoller31. Alternativt, og hvis det er tilgængeligt, bringe vævet til en patologikerne til indlejring og skæring.
  7. Efter håndtering af væv skal du bortskaffe eller opbevare personlige værnemidler efter behov og vaske hænderne med det samme. Dekontaminere alt udstyr, overflader og fast og flydende affald med en 1:10 fortynding af blegemiddel eller vaskemiddel desinfektionsmiddel. Tillad 20 minutter til dekontaminering, og følg derefter med en 70% ethanolskylning. Behandl cellekulturhætten med mycoplasmaspray i henhold til producentens anvisninger.

5. Von Kossa-farvning for calciumindhold

BEMÆRK: Dette kan gøres godt efter celleisolering og linjeetablering, men sørg for at forbinde vævets forkalkningsniveau med dokumenter vedrørende den primære cellelinje, der er etableret.

  1. Skær 5 eller 10 μm tykke paraffinskiver på glasglas og bag dias ved 65 °C i 1 time, og afkøl derefter til RT.
  2. Ved hjælp af friske opløsninger deparaffiniseres dias ved at nedsænke som følger: 100% xylen i 30 min, 2x; 100% ethanol i 3 min, 2x; 90% ethanol i 3 minutter; 80% ethanol i 3 min; 70% ethanol i 3 minutter; 50% ethanol i 3 minutter; ultrarent vand i 3 minutter; opbevares i ultrarent vand indtil næste trin.
    BEMÆRK: Tiderne ovenfor er minimum, hvert trin kan gå længere.
  3. Fortsæt med Von Kossa-farvning i henhold til producentens protokoller.
  4. Vurder hele ventilområdet mikroskopisk, og tildel et kontrolvæv (intet tegn på forkalkning) eller CAVD (ethvert bevis på forkalkning, figur 2B).

6. Ventilendotelcelle (VEC) isolering, ekspansion og bekræftelse

  1. I en steril cellekulturhætte åbnes det koniske rør, der indeholder den resterende ventilfolder, og indlægssedlen placeres i et nyt 50 ml konisk rør fyldt med iskold PBS. Hætterør og vend forsigtigt eller placer på en vippe i 2 minutter ved RT.
  2. Fjern væv til en 60 mm skål fyldt med 5-7 ml kold collagenaseopløsning. Brug tang til at dyppe begge sider af indlægssedlen i opløsningen 3-4 gange. Inkuber vævet i 5-10 minutter i cellekulturinkubatoren ved 37 °C, og vug vævet forsigtigt hvert 2. minut 3-4 gange.
  3. Fjern 2 ml af opløsningen fra fadet og læg det i et sterilt 15 ml konisk rør. Placer tang ved knuden, og brug en tør steril vatpind til at stryge fra tangen til hængslet, og drej vatpinden, mens du bevæger den langs indlægssedlen. Mellem hvert stryg skal du svinge vatpinden i opløsningen i det 15 ml koniske rør for at fjerne cellerne. Gentag for at pode vævets overflade helt, vend derefter om og gentag på den anden side.
  4. Hold ventilfolderen med tang i den ene hånd og en 1 ml pipette i den anden, skyl indlægssedlens overflader med opløsningen i skålen. Når den er skyllet, overføres al opløsningen indeholdende VEC'erne i skålen til det samme 15 ml koniske rør med cellerne fra vatpinden og fortsæt til trin 6.5. Det resterende ventilvæv anbringes i et nyt konisk 15 ml konisk rør med 7 ml steril collagenaseopløsning, og fortsæt til trin 7.1.
  5. Centrifuge røret indeholdende VEC'erne ved 180 x g i 5 minutter for at pelletere de isolerede VEC'er. Aspirer supernatanten og resuspend i 3 ml VEC-vækstmedier. Centrifuge endnu en gang og fjern supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml vækstmedie og bestem antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblåt.
  6. Resuspender VEC-pellet i 2 ml VEC-vækstmedier, og plade cellerne i en kollagenbelagt brønd med en 6-brøndplade ved ca. 5 x 105 celler/cm2. Lad cellerne vokse mindst 3-4 dage, fjern derefter medier og genopfyld med friske medier. Gentag medieskift hver 4. dag. VEC'er vil vokse i brostensformede pletter (figur 3B, venstre paneler).
  7. Når VEC-plastre dækker >80% af pladen, opdeles celler ved ca. 1,3 x 104 celler / cm 2 afhængigt af hvor hurtigt de vokser (hvis de når 80% på mindre end 1 uge opdelt ved et lidt lavere antal celler / cm2).
  8. For at opdele skal du vaske celler to gange med 2 ml DPBS og derefter tilføje nok dissociationsreagens til bare at dække overfladen af cellerne. Inkuberes i 2-3 minutter ved 37 °C, og kontroller, at cellerne ikke er overinkuberede. Stop fordøjelsen ved at tilføje lige store mængder VEC-vækstmedier og overfør væske til et 15 ml rør. Der centrifugeres ved 180 x g i 5 minutter, supernatanten fjernes, og der resuspenderes i passende medievolumen for det nødvendige antal brønde/plader.
    BEMÆRK: Når de er udvidet til en 10 cm plade, kan VEC'er undertiden miste deres morfologi og ændre fænotype, når de formerer sig. Dette har tendens til at forekomme, når VEC'er sås med en lav sammenløb under etablering og udvidelse af cellelinjen.
  9. For at garantere en ren kultur kan du overveje at bruge CD31+ superparamagnetiske perler ved hver opdeling.
  10. For 1 x 108 eller færre celler (en 10 cm skål eller mindre) skal du forberede 25 μL superparamagnetiske perler ved vask i henhold til producentens protokoller.
    BEMÆRK: Trin 6.10 anbefales at udføres før trypsinisering af VEC'er.
  11. Afmonter celler som i trin 6,8, men resuspenderer i 500 μL PBS med 0,1% BSA, pH 7,4, og anbring i et 2 ml centrifugerør. Der tilsættes 500 μL vaskede og resuspenderede perler til 2 ml cellerøret og inkuberes på en rotator i 20 minutter ved 4 °C.
  12. Placer rør på magneten i 2 min. Mens røret stadig er i magneten, skal du forsigtigt fjerne supernatanten. Fjern rør fra magnet, tilsæt 1 ml frisk PBS med 0,1% BSA, pipetter forsigtigt 2-3 gange, og sæt derefter magneten tilbage i 2 min. Gentag 2 gange mere. Efter endelig fjernelse af buffer skal du suspendere celler i vækstmedier i volumen, der er nødvendigt for replating.
    BEMÆRK: Celler vil stadig have perler, men disse vil ikke påvirke væksten og vil blive fjernet i efterfølgende passager.
  13. Når cellerne er blevet udvidet, ud over morfologi, bekræftes VEC-fænotype ved positiv farvning for immunfluorescerende markører såsom von Willebrand-faktor (vWF), cadherin 5 (CDH5) eller PECAM-1/CD31 og negativ farvning for VIC-markører såsom calponin 1 (CNN) eller alfa-2 glat muskelactin (αSMA, figur 4, venstre paneler).

7. Ventil Interstitial Cell (VIC) isolering, ekspansion og opbevaring

  1. Som angivet i trin 6.4 anbringes indlægssedlen i et 15 ml konisk rør med 7 ml collagenaseopløsning efter fjernelse af VEC'er fra ventilvævet. Inkuber i 12 timer i cellekulturinkubatoren med hætten let åben for at tillade gasudveksling. Vellykket isolering af VICs kan stadig forekomme med op til 18 timer i collagenaseopløsning.
  2. Efter inkubation blandes vævet forsigtigt ved pipettering med en serologisk pipette i en steril cellekulturhætte for at sikre frigivelse af VIC'er fra indlægssedlen.
  3. Fjern cellesuspension og før gennem et 0,70 μm filter ind i et 50 ml konisk rør.
  4. Tilsæt 7 ml VIC-vækstmedium til 50 ml røret og centrifuge ved 180 x g i 5 min. Aspirer supernatant og resuspend cellepellet i 1 ml VIC-vækstmedie og bestem cellenummeret. Vic'erne anbringes i en 60 mm vævskulturbehandlet skål med 1,3 x 104 celler/cm2.
  5. Lad cellerne vokse mindst 1-2 dage, før de udskiftes medier. Fjern medier og vask to gange DPBS for at fjerne resterende snavs og udskift med frisk vækstmedium. Genopfyld medium hver 2-3 dage. VICs vil vokse i fibroblast form (figur 3B, højre paneler).
  6. Når VIC'er når en sammenløb på >90%, vaskes to gange med DPBS for at fjerne det overskydende medie og løsne cellerne ved at tilføje passende volumen forvarmet dissociationsreagens til at dække pladen (dvs. 2-3 ml pr. 10 cm skål). Inkuber fadet i en 37 °C inkubator. VICs løsnes fra skålen efter 2-3 minutters inkubation. Tilsæt 4-6 ml forvarmede medier.
    BEMÆRK: Hvis celler tager længere tid end 3 minutter at løfte pladen, kan dissociationsreagenset have mistet styrke. Hvis det er nødvendigt, kan en celleskraber bruges til forsigtigt at løfte cellerne.
  7. Overfør cellesuspensionen til et rør og centrifuger forsigtigt ved 180 x g i 5 min. Efter fjernelse af supernatanten skal du forsigtigt suspendere cellepelleten i forvarmede VIC-vækstmedier og bestemme antallet af levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblåt. Frø de levedygtige celler med en tæthed på 1: 2 af den originale skål (dvs. ~ 1 × 106 celler pr. 10 cm skål eller 1,3 x 104 celler / cm2).
  8. Vurder VIC-fænotype ved positiv farvning for immunfluorescerende markører såsom αSMA, CNN eller SM22α og negativ farvning for VEC-markører såsom CD31, CDH5 eller vWF (figur 4, højre paneler).
    BEMÆRK: Protokolarbejdsgangen, der præsenteres her, vælger upartisk en folder til VEC'er og VICs-isolering, mens de resterende foldere bruges til Von Kossa-farvning (afsnit 5) og snapfrysning.

8. Langtidsopbevaring af celler

  1. Når de er udvidet, fryses celler ned til langtidsopbevaring. Vask celler to gange med 2-5 ml DPBS, og tilsæt derefter nok dissociationsreagens til at løsne celler som i trin 6.8 og 7.6. Stop fordøjelsen ved at tilføje lige store mængder VEC- eller VIC-vækstmedier og overfør cellesuspension til et 15 ml rør.
  2. Bestem antallet af levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblåt.
  3. Centrifuge ved 180 x g i 5 min.
  4. Resuspender celler i kølede konditionerede vækstmedier til en celletæthed på ~ 3 × 106 celler / ml.
  5. Tilsæt forsigtigt med hvirvlende et lige stort volumen kølet 2x kryopræserveringsmedium. Dette vil bringe cellekoncentrationen til ~ 1,5 × 106 celler / ml.
  6. Aliquot 1 ml i kryopræserveringshætteglas. Anbring hætteglas i en cellefrysebeholder, luk og inverter 5-6 gange for at sikre, at cellerne forbliver suspenderede. Beholderen anbringes ved -80 °C i 6-72 timer eller i henhold til frysebeholderprotokollen. Fjern hætteglassene fra -80 °C, og overfør dem til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovennævnte protokol skitserer de trin, der er nødvendige for håndtering af humant ventilvæv og isolering og etablering af levedygtige cellelinjer fra disse væv. Foldere fra aortaklappen behandles til paraffinindlejring, snapsfryses til langtidsopbevaring til biokemisk eller genetisk analyse og fordøjes til isolering af VEC'er og VIC'er (figur 1). Mens kirurgiske prøver sandsynligvis vil have en klinisk diagnose af aortastenose og kan udvise tunge knuder af forkalkning, der kan være synlige med det blotte øje, er forkalkning af aortaklappen til stede hos et betydeligt antal ældre (>65 år) individer32, og på grund af denne forekomst udsættes alle væv - kirurgiske og kadaveriske - for Von Kossa-farvning eller lignende procedure for at vurdere, om forkalkning er til stede (figur 2).

Det blev konstateret, at brugen af køleopbevaringsopløsning i høj grad stabiliserede cellerne i det udskårne ventilvæv. Koldopbevaringsopløsning anvendes i levende organtransplantationer. Det skylles gennem organer enten før eller efter fjernelse fra donoren og efterlades i vaskulaturen af dette organ under transport på is. Det blev observeret, at VEC-linjer var lettere etableret fra donorprøver end kirurgisk væv, og donorlinjerne var mere tilbøjelige til at bevare deres endotelcellemorfologi i flere passager. Dette var forvirrende, da donorvæv ofte ikke ville nå laboratoriet i 12-24 timer postmortem, mens kirurgisk væv blev opnået mellem 2 og 4 timer. Ved pakning af de kirurgiske prøverør med køleopbevaringsopløsning i stedet for PBS steg cellegendannelsen kraftigt. Som det fremgår af figur 3, kan både levedygtige VEC'er og VIC'er opnås op til 61 timer efter ventilekstraktion. Mens en lidt højere procentdel af levende VIC'er opnås end VEC'er, når celler isoleres op til en dag efter ventiludskæring, forbliver celler levedygtige efter 48 timer efter excision. Op til 40% af de samlede genvundne celler svarer til levende celler, og vi har observeret konsistente tal mellem biologiske replikater. Endvidere bekræfter morfologiinspektion også celleidentitet; mens VEC'er fremstår som pakkede, brostenslignende og vækstkontakthæmmede celler, ligner VIC-morfologi myofibroblaster med spindelform. Immunostaining af prøverne bekræftede, at 91,8 % ± 1,8 (n = 3) ekspanderede VEC'er var positive for endotelmarkøren vWF, mens 92,0 % ± 5,0 (n = 3) af ekspanderede VIC'er var positive for den interstitielle cellemarkør αSMA (figur 4). Disse tal er på linje med tidligere rapporterede resultater33.

Figure 1
Figur 1: Ventilvævsbehandling og celleisolering fra human kontrol og CAVD-ventiler . (A) Skematisk repræsentation af vævsbehandling til vurdering af ventilernes forkalkningsniveauer. (B) Skematisk repræsentation af tidsforløbet og trinene til isolering og karakterisering af humane ventilendotelceller (VEC'er) og ventil interstitielle celler (VICs) fra kontrol- og CAVD-væv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vurdering af forkalkning . (A) Repræsentativt billede af kontrolvæv (øverst) og forkalket (nederst) ventilvæv fra humane donorer. Bemærk, at forkalkningsknuderne i CAVD-vævet alvorligt kan ændre morfologien og evnen til rent at skære indlægssedlerne. (B) Repræsentant von Kossa farvning af kontrolkontrol (venstre) og CAVD (højre) ventilvæv efter fiksering og videre behandling af det humane ventilvæv. Bemærk forkalkning afsløres ved tilstedeværelsen af mørk nedbør i brochurevævet. Ventilbilleder blev taget med et laboratoriekamera. Von Kossa farvede ventiler blev fanget med et 10x mål, skalastang 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af celleoverlevelse (A) VEC'er og VICs overlevelseskurver. Tre foldere blev opnået fra fem ventilprøver. Den første folder fra hver ventil blev behandlet straks (3-12 timer efter ekstraktion), den anden folder blev behandlet ca. 24 timer senere (22-35 timer), og den tredje folder blev behandlet ca. 48 timer efter opnåelse af vævet (45-61 timer). Ventilfoldere blev opbevaret i kølerumsopløsning ved 4 °C, indtil de blev behandlet. Y-aksen repræsenterer procentdelen af levende celler. (B) Morfologi af sunde kulturer af VEC'er (venstre paneler) og VICs (højre paneler). Grafer viser gennemsnitlig SD levende celleandel af celler isoleret fra n = 5 ventilvæv ± SD levende celler. Billeder blev taget med et 4x og 10x mål, skalabjælker henholdsvis 200 μm og 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ immunfluorescerende farvning på VEC'er og VICs. VEC'er er positive for endotelmarkøren von Willebrand Factor (vWF, venstre paneler), mens VIC'er er positive for den interstitielle markør αSMA. Bemærk, at vores isolationsprotokol garanterer en høj isolationseffektivitet; der opdages ingen krydskontaminering mellem VEC'er og VIC'er. Billeder blev taget med en 10x mål, skala bar 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

At opnå kontrol og sygdomsvæv fra mennesker er afgørende for in vitro- og ex vivo-sygdomsmodellering; Men mens man ofte taler om udfordringerne ved at bygge bro mellem bænk og seng, er den omvendte rækkefølge - at gå fra operationssuite til bænk - ofte lige så skræmmende et hul. Afgørende for en grundforsker for at få primære humane vævsprøver er et samarbejde med en investeret kirurgforsker, der har et team af sygeplejersker, kirurgiske teknikere, lægeassistenter, medicinstuderende og beboere og kliniske protokolledere, der kan tilmelde og samtykke patienter, deltage og hjælpe med korrekt håndtering af udskåret væv og koordinere den logistik, der kræves til vævsopsamling. Uden den største indsats fra alle involverede for at reducere tiden fra udskæring til celleisolering vil vitalt cellulært materiale og de oplysninger, det indeholder, blive uopretteligt ændret eller tabt.

Afgørende for at opretholde levedygtigheden af vævsprøverne er brugen af køleopbevaringsopløsning. Dette er den samme løsning, der bruges af organtransplantationsholdene på UPMC og andre transplantationsmedicinske centre. Bedre celleudbytte blev opnået fra kadavervæv, der var blevet udskåret fra donoren mange timer i forvejen end fra væv, der blev opnået hurtigere fra operationsstuen, men holdt i kold PBS. Denne utilsigtede opdagelse har været afgørende for celleudtagning fra humant væv. Indkøbstiden fra vævsudskæring til levering i laboratoriet varierer fra 1-5 timer for kirurgisk væv og op til 24 timer for kadavervæv. Til sammenligning kan udtagning og forarbejdning af animalsk væv ofte ske inden for få minutter efter eutanasi, hvilket er ideelt til cellelevedygtighed. I mangel af køleopbevaringsopløsning er det sandsynligt, at et medium, der er egnet til dyrkning af celler, også kunne fungere bedre end PBS, men dette medium blev ikke testet heri på grund af køleopbevaringsopløsningens succes i levende organtransplantation og modtagelse af kadavervæv i denne opløsning. Løsningen er hyldestabil, hvilket er ideelt til opbevaring i operationsstuer, og specifikke ingredienser som adenosin er kendt for at fremme gavnlige reaktioner på cellulære belastninger som iskæmi / hypoxi21,34.

Et andet vigtigt skridt til at opnå levedygtige celler er at vaske vævene med fungicid, gentamicin og baktericid. Denne korte skylning hjælper med at sikre, at cellerne forbliver uforurenede af bakterier og svampe. Lige så kritiske er trinene til at fordøje VEC'er ud af ventilvævet, hvor VEC'erne i løbet af få minutter løsnes og derefter podes af overfladen af ventilfolderne. Den efterfølgende fordøjelse af VIC'erne, der ligger på brochurens tætte ekstracellulære matrix, har meget mere plads til varighed og styrke. Den upartiske vævsbehandling, der er beskrevet i denne protokol, tillader isolering af de to vigtigste cellepopulationer, der er til stede i ventilfolderen, VEC'er og VIC'er. Selvom en nylig enkeltcelletranskriptomanalyse har vist sameksistensen af mindst fjorten forskellige celleundertyper, der er bosiddende i den humane ventil, herunder seks ikke-ventilafledte stromale celler i CAVD-væv35, kan denne mangfoldighed repræsentere variationer på grund af virkninger fra behandling og fordøjelse af disse hærdede væv, eller det kan skyldes forskellige mikromiljøer, som indlægsseddelcellerne udsættes for: VEC'er udsættes for to forskellige blodgennemstrømninger, mens VIC'er er indlejret i tre forskellige ekstracellulære matrixlag 8,9. Den omfattende isolationsprotokol og analyse, der er beskrevet heri, sikrer, at over 90% af VEC'er og VIC'er svarer til deres hovedfænotype. Selvom der kan findes en grad af heterogenicitet, påvirker det ikke de generelle resultater af undersøgelsen af VEC og VIC homeostase 8,9,13,14,15,16.

Det er også vigtigt at bemærke, at patienter og deres ventilvæv og dermed de cellelinjer, der er indkøbt fra dem, ikke er identiske. Genetik, comorbiditeter, håndtering under operation og forarbejdning og friskhed af fordøjelsesopløsningsingredienser kan påvirke vækstraten og endda måske adfærd eller fænotype af de isolerede celler. Mens denne undersøgelse viser evnen til at give et tilstrækkeligt antal levedygtige celler med denne procedure, kan der være medfødte eller inducerede forskelle i disse cellelinjer, der kan påvirke downstream-eksperimenter. Det er ofte vanskeligt at vide nøjagtigt, hvornår vævet er blevet fjernet fra patienten eller donoren, og især i tilfælde af sidstnævnte er tiden siden cirkulationen stoppet. Endvidere er der iboende variation blandt væv med hensyn til antallet af opnåede levedygtige ventilceller, cellernes proliferative kapacitet og tilbageholdelse af cellefænotype. Cellelinjer kan indeholde genetiske mutationer - enten medfødte eller somatiske - som lægen og forskerholdet ikke er klar over, og ombygning og efterfølgende håndtering af vævene kan også ændre cellefænotypen eller endda epigenetik. For alle forsøg, hvor disse primære humane celler anvendes, er det derfor absolut nødvendigt, at der anvendes biologiske replikater - dvs. cellelinjer fra forskellige patienter - på trods af den betydelige tid og de betydelige omkostninger, de medfører. Dette hjælper med at sikre, at eventuelle resultater ikke skyldes forvirrende virkninger fra indkøb og behandling af vævet. Den variable spredningshastighed for forskellige cellelinjer kan justeres ved enten at indsamle celler i eksperimenter på forskellige tidspunkter eller såceller til eksperimenter ved forskellige tætheder; Intet svar er bedst for alle eksperimentelle designs. Selv om komplikationerne ikke er ubetydelige, er anvendelsen af primære humane kontrol- og CAVD-vævsafledte cellelinjer til in vitro- og ex vivo-eksperimentelle modeller afgørende for at definere de initierende faktorer og formeringsprocesser, der driver CAVD-patogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IS modtager institutionel forskningsstøtte fra Atricure og Medtronic og fungerer som konsulent for Medtronic Vascular. Ingen af disse konflikter er relateret til dette arbejde. Alle andre forfattere har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Jason Dobbins for indsigtsfuld diskussion og kritisk læsning af dette manuskript. Vi vil gerne anerkende Center for Organ Recovery and Education for deres hjælp og støtte og takke vævsdonorer og deres familier for at gøre denne undersøgelse mulig. Alle patientprøver indsamles fra personer, der er indskrevet i undersøgelser, der er godkendt af det institutionelle gennemgangsudvalg ved University of Pittsburgh i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Kadavervæv opnået via Center for Organ Recovery and Education (CORE) blev godkendt af University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).

Nogle figurer skabt med Biorender.com.

CSH er støttet af National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 og R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Thermo Scientific 7211345 Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate Greiner Bio-One 664160 Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet Fisher 14955234 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips VWR 76322-154 Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips VWR 76322-132 Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339650 Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710S Tissue and cell fixative
190 proof ethanol Decon 2801 Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium Gibco 14190250 Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS Fisher BP2944100 Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips VWR 76322-134 Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol Decon 2701 Deparaffinizing tissue samples
2-propanol Fisher A416P 4 Making collagen coated plates
5 mL serological pipet Fisher 14955233 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish GenClone 25-260 VEC isolation
6-well cell culture plate Corning 3516 Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial Fisher BP2401 500 Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin Invitrogen A12379 Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution Bridge to Life BUW0011L Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g Bioworld 220700233 VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody  Abcam ab46794 Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2) Cell Signaling 3528 Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads Invitrogen 11155D VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5 Cell Signaling 2500 Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores Corning 431751 VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein Gibco A1048301 Making collagen coated plates
Collagenase II Worthington Biochemical Corporation LS004176 Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray Decon 4101 Disinfection
Countess II Automated Cell Counter Invitrogen A27977 Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips Invitrogen 2026h Automated cell counter required slide cover
Coverslips Fisher 125485E Mounting valve samples
Cryogenic vials Olympus Plastics 24-202 Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula  Clorox N/A Disinfection
DMEM Gibco 10569044 Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 Lonza Walkersville CC3129 Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit Lonza Walkersville CC4176 Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope Life Technologies Model Number: AME3300 Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope Life Technologies AMEX1000 Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select R&D Systems S11550 VIC expansion
Fine scissors Fine Science Tools 14088-10 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers Fisher 08-100-241 VIC expansion
Fungizone Gibco 15290-026 Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin Gibco 15710-064 Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides Globe Scientific Inc 1358L mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488 Invitrogen A11001 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594 Invitrogen A11005 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488 Invitrogen A11008 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594 Invitrogen A11012 Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide Invitrogen A25750 Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) Invitrogen R37606 Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells HyClone Laboratories, Inc. SR30002 Frozen cell storage
Mounting Medium Fisher Chemical Permount SP15-100 Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container Nalgene 51000001 Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray PromoCell PK-CC91-5051 Disinfection
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin Invivogen ANTMPT Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody Abcam ab14106 Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors Fine Science Tools 14001-14 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab Puritan 25806 10WC VEC isolation
Swingsette human tissue cassette Simport Scientific M515-2 Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm) Fine Science Tools 11016-17 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061 cell counting solution
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021 Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit Polysciences 246331 Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody Abcam ab68545 Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes Fisher Chemical X3S-4 Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody Abcam ab7817 Primary antibody (VIC positive stain)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Tags

Biologi udgave 170
Isolering af primære ventilceller til in vitro-sygdomsmodellering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead… More

Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead III, W. J., Wong, R., Sultan, I., St. Hilaire, C. Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling. J. Vis. Exp. (170), e62439, doi:10.3791/62439 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter