Summary
Detta protokoll beskriver insamlingen av humana aortaklaffar extraherade under kirurgiska aortaklaffersättningsprocedurer eller från kadavervävnad, och efterföljande isolering, expansion och karakterisering av patientspecifika primära ventilendotel- och interstitiella celler. Inkluderat är viktiga detaljer om de processer som behövs för att säkerställa cellviabilitet och fenotypspecificitet.
Abstract
Calcific aortaklaffsjukdom (CAVD) finns i nästan en tredjedel av den äldre befolkningen. Förtjockning, förstyvning och förkalkning av aortaklaffen orsakar aortastenos och bidrar till hjärtsvikt och stroke. Sjukdomspatogenes är multifaktoriell, och spänningar som inflammation, extracellulär matrisombyggnad, turbulent flöde och mekanisk stress och belastning bidrar till osteogen differentiering av ventilendotel- och ventilinterstitiella celler. De exakta initieringsfaktorerna som driver den osteogena övergången av en frisk cell till en förkalkande cell är dock inte helt definierade. Vidare är den enda nuvarande behandlingen för CAVD-inducerad aortastenos aortaklaffbyte, varigenom den ursprungliga ventilen avlägsnas (kirurgisk aortaklaffbyte, SAVR) eller en helt hopfällbar ersättningsventil sätts in via en kateter (transkateter aortaklaffbyte, TAVR). Dessa kirurgiska ingrepp kommer till en hög kostnad och med allvarliga risker; Därför är det absolut nödvändigt att identifiera nya terapeutiska mål för läkemedelsupptäckt. För detta ändamål utvecklar den aktuella studien ett arbetsflöde där kirurgiskt borttagna vävnader från patienter och donatorkadavervävnader används för att skapa patientspecifika primära linjer av klaffceller för in vitro-sjukdomsmodellering. Detta protokoll introducerar användningen av en kylförvaringslösning, som vanligtvis används vid organtransplantation, för att minska skadorna som orsakas av den ofta långa tillvaratagandetiden mellan vävnadsexcision och laboratoriebearbetning med fördelen av kraftigt stabiliserande celler i den utskurna vävnaden. Resultaten av den aktuella studien visar att isolerade ventilceller behåller sin proliferativa kapacitet och endotel- och interstitiella fenotyper i odling uppemot flera dagar efter ventilavlägsnande från givaren. Genom att använda dessa material möjliggörs insamling av kontroll- och CAVD-celler, från vilka både kontroll- och sjukdomscellinjer är etablerade.
Introduction
Calcific aortaklaffsjukdom (CAVD) är en kronisk patologi som kännetecknas av inflammation, fibros och makroförkalkning av aortaklaffblad. Progressiv ombyggnad och förkalkning av broschyrerna (kallad aortaskleros) kan leda till obstruktion av blodflödet (aortastenos) vilket bidrar till stroke och leder till hjärtsvikt. För närvarande är den enda behandlingen för CAVD kirurgisk eller transkateter aortaklaffbyte (SAVR respektive TAVR). Det finns inget icke-kirurgiskt alternativ för att stoppa eller vända CABD-progressionen, och utan ventilbyte närmar sig dödligheten 50% inom 2-3 år 1,2,3. Att definiera de underliggande mekanismerna som driver denna patologi kommer att identifiera potentiella nya terapeutiska tillvägagångssätt.
Hos en frisk vuxen är aortaklaffbladen ungefär en millimeter tjocka, och deras huvudsakliga funktion är att upprätthålla det enkelriktade blodflödet ut ur vänster ventrikel4. Var och en av de tre broschyrerna består av ett lager av ventilendotelceller (VEC) som kantar bipacksedelns yttre yta och fungerar som en barriär. VEC upprätthåller ventilhomeostas genom att reglera permeabilitet, inflammatorisk celladhesion och parakrin signalering 5,6,7. Ventilinterstitiella celler (VICs) utgör majoriteten av cellerna i ventilbroschyren8. VICs är ordnade i tre distinkta lager i bipacksedeln. Dessa lager är kända som ventricularis, spongiosa och fibrosa9. Ventricularis vetter mot vänster kammare och innehåller kollagen och elastinfibrer. Mellanskiktet, spongiosa, innehåller högt proteoglykaninnehåll som ger skjuvflexibilitet under hjärtcykeln. Det yttre fibrosaskiktet ligger nära utflödesytan på aortasidan och är rikt på typ I och typ III fibrillärt kollagen som ger styrka för att upprätthålla koaptation under diastol10,11,12. VICs ligger i vilande tillstånd, men faktorer som inflammation, ombyggnad av den extracellulära matrisen (ECM) och mekanisk stress kan störa VIC-homeostas 8,9,13,14,15,16. Med förlust av homeostas aktiverar och förvärvar VICs en myofibroblastliknande fenotyp som kan proliferera, sammandragning och utsöndring av proteiner som omformar den extracellulära millieu17. Aktiverade VICs kan övergå till förkalkande celler som påminner om differentieringen av en mesenkymal stamcell (MSC) till en osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Förkalkning verkar initieras i det kollagenrika fibrosaskiktet från bidrag från både VEC och VICs men expanderar och invaderar de andra lagren i bipacksedeln8. Således är det uppenbart att både VEC och VICs svarar på stimuli för att upregulate uttrycket av osteogena gener, men de exakta händelserna som driver aktiveringen av osteogena gener, liksom det komplexa samspelet mellan cellerna och bipacksedelns extracellulära matris, förblir dåligt definierade. Murinmodeller är inte en idealisk källa för att studera icke-genetiska drivkrafter för CABD-patogenes, eftersom möss inte utvecklar CAVD de novo26,27, varför användningen av primära mänskliga vävnader och de primära cellinjerna isolerade från dessa vävnader är nödvändig. I synnerhet är det absolut nödvändigt att erhålla dessa celler i stort antal och god kvalitet, eftersom fältet för 3D-cellkulturer och organoidmodellering expanderar och sannolikt kommer att bli ett ex vivo människobaserat alternativ till murina modeller.
Syftet med den nuvarande metoden är att dela ett arbetsflöde som har etablerat förutsättningarna för att effektivt isolera och odla VEC och VICs erhållna från kirurgiskt borttagna ventiler från mänskliga givare. Tidigare studier har visat framgångsrik isolering av VEC och VIC från svin28 och murina ventiler29, vad vi vet är detta den första som beskriver isoleringen av dessa celler i mänskliga vävnader. Protokollet som beskrivs här är tillämpligt på mänskliga utskurna ventiler och kringgår och förbättrar kraftigt skadorna som orsakas av den ofta långa tillvaratagandetiden mellan vävnadsexcision och laboratoriebearbetning genom att införa användningen av en kylförvaringslösning, en buffrad lösning som kliniskt används vid organtransplantationer som kraftigt stabiliserar cellerna i den utskurna vävnaden. Protokollet som beskrivs här visar också hur man bestämmer cellfenotyp och garanterar hög effektivitet för cellöverlevnad med minimal cellkorskontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla patientprover samlas in från personer som deltar i studier som godkänts av den institutionella granskningsnämnden vid University of Pittsburgh i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Kadaveriska vävnader som erhållits via Center for Organ Recovery and Education (CORE) godkändes av University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).
1. Godkännande och säkerhet
- Få institutionell granskningsnämnds (IRB) godkännande eller ett undantaget memo för insamling av patientprover eller kadavervävnader i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
- Ta nödvändig institutionell utbildning för att arbeta med mänskliga vävnader som blodburna patogener, biomedicinsk forskning om mänskliga ämnen, integritet och informationssäkerhet och transport och frakt av biologiskt material.
2. Logistik och förberedelser
- Kirurgiska prover
- Se till att ett kylskåp är tillgängligt och ligger nära operationssalen. Förvara 50 ml koniska rör förmärkta med avidentifierad nomenklatur som innehåller 40 ml sterila alikvoter av kylförvaringslösning i detta kylskåp för användning av kirurgisk personal. Dessa rör är stabila vid 4 °C fram till utgångsdatumet på originalförpackningen.
- Vid extraktion, placera ventilvävnad i dessa rör. Placera rören i en förseglad sekundär behållare, t.ex. en läckagesäker plastpåse eller en plastbehållare som är märkt med en biohazard-etikett. Vävnader plockas upp och transporteras på is enligt institutionella protokoll för transport av biologiska faror.
- Kadaveriska prover
- Sänk ner återvunna organ i kylförvaringslösning, placera i ett förseglat sekundärt inneslutningskärl och transportera på is enligt institutionella protokoll för transport av biologiska faror.
3. Beredning av reagenser
- Gör kollagenbelagda plattor åtminstone dagen innan.
- Blanda 5 ml isopropylalkohol, 8,7 ml ättiksyra och 0,5 μg kollagen I-pulver i ett 50 ml koniskt rör. Ta upp till 50 ml med sterilt vatten. Blanda och filtrera genom ett 0,45 μm filter.
- Under en steril cellodlingshuv, tillsätt tillräckligt med kollagenlösning till 6 brunnsplattor och 10 cm diskar för att bara täcka hela botten. Täck plattan och låt sitta i 4-6 timmar vid rumstemperatur. Ta bort överskottslösningen med en steril pipett, placera i ett nytt sterilt 50 ml koniskt rör och spara vid 4 °C för att göra ytterligare plattor. Lösningen kan förvaras vid 4 °C i flera månader.
- Torka plattorna i en 37 °C inkubator över natten och förvara dem därefter i en återförslutningsbar påse vid 4 °C. Kollagenbelagda tallrikar och rätter kan lagras i flera månader.
- Autoklav följande föremål: vävnadspinne, vävnadssax, bomullspinne och gasbindor.
- VEC-tillväxtmedia: Förbered och använd endotelcelltillväxtmedium enligt tillverkarens protokoll. Förvaras i mörker vid 4 °C. Värm till 37 °C strax före användning på celler, lämna inte media i värmande bad längre än nödvändigt (10-15 min räcker). Använd media inom en månad efter förberedelserna.
- VIC tillväxtmedia: Tillägg DMEM basmedium (4.5 g / L glukos, L-glutamin tillägg, 110 mg / L natriumpyruvat)30 med 10% värmeinaktiverad FBS och 100 I.U./ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin. Förvaras i mörker vid 4 °C i upp till 3 månader. Värm till 37 °C strax före användning på celler, lämna inte media i värmande bad längre än nödvändigt (10-15 min räcker).
- Gör steril sköljlösning strax före användning. Komplettera steril PBS med 2,5 μg/ml fungicid, 0,05 mg/ml gentamicin och 5 μg/ml baktericid.
- Gör steril kollagenaslösning strax före användning. Tillsätt 5 mg kollagenas II till 5 ml sterilt färskt DMEM-basmedium. Blanda väl och sterilisera lösningen genom att passera genom ett 0,45 μm filter. Håll på is tills det används.
4. Beredning och bearbetning av vävnader
OBS: Institutionellt godkännande för användning av mänskliga vävnader måste erhållas innan arbetet påbörjas. Vid hantering av vävnader ska följande personliga skyddsutrustning bäras: en engångsklänning för vätskebarriäromslutning eller en särskild knapp på framsidan med en vätskebarriärlindning runt förkläde och engångshylsor; ett fullständigt ansiktsskydd eller skyddsglasögon med kirurgisk mask; dubbla handskar; nära skor; och kläder för att täcka benen. Omfattande arbetsflödesdiagram över vävnadspreparatet för förkalkningsbedömning (avsnitt 5) och cellisolering (avsnitt 6 och 7) illustreras i figur 1A,B respektive.
- Vid mottagande av kadaveriskt organprov, skär ut aortaroten och sänk ner i ett 50 ml koniskt rör med steril sköljlösning. Vid mottagande av kirurgiskt prov, ta bort det från transportkärlen och sänk ner i ett 50 ml koniskt rör med steril sköljlösning. Placera röret som innehåller vävnaden i ishink på vippan och blanda i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
OBS: Bearbetning av vävnader så nära extraktionstiden som möjligt kommer att ge den bästa cellåtervinningen, men livskraftiga celler kan samlas upp till 61 timmar efter excision, och data visar att VICs är mer robusta än VEC när tiden ökar. Om vävnaden inte kan bearbetas omedelbart, när så är möjligt, avlägsna vävnaden, utför steg 4.1 och sätt sedan tillbaka vävnaden i en ny steril kylförvaringslösning och förvara den vid 4 °C tills den är klar att fortsätta. Ventiler som samlas in under natt- eller helgoperationer kan förvaras i 40 ml kylförvaringslösning vid 4 ° C och kan fortfarande ge livskraftiga celler mer än 2 dagar efter extraktion. - Spraya ner rör med 70% etanol och flytta till en steril huva. Ta bort vävnad och punktskattepliktiga två ventilblad (figur 2A). Placera en bipacksedel i en kryogen injektionsflaska (eller 2-3 injektionsflaskor om flera mindre bitar behövs för framtida analys) och snäppfrys genom att släppa i flytande kväve och förvara sedan vid -80 °C.
- Om ventilen är bicuspid, skär bara en bipacksedel. Skär bipacksedeln i hälften från knölen till gångjärnet med sax. Använd ena halvan av bipacksedeln för snäppfrysning och den andra halvan för steg 4.3.
- Bearbeta den andra bipacksedeln för paraffinbäddning för att bedöma förkalkningsinnehållet genom att skära den i hälften från knöl till gångjärn. Placera båda bitarna i en kassett som är nedsänkt i 4% paraformaldehyd (PFA) och lägg sedan på en vippa vid RT i minst 2 timmar men högst 4 timmar.
OBS: Längre fixeringstider skapar mer bakgrund med immunofluorescerande färgning. När steg 4.2 och 4.3 har utförts, gå omedelbart till avsnitt 6 och kom tillbaka till steg 4.4 efter steg 6.12. - Tvätta vävnaderna efter fixering genom att sänka ner i färsk PBS i 1 timme 3-4 gånger. Efter dessa tvättar kan proverna stanna i PBS vid 4 °C i flera månader om det behövs. Fortsätt till nästa steg precis innan du bäddar in.
- Byt gradvis från PBS till 70% etanol. Tvätta 30-60 min varje steg med 1:4 70% etanol:PBS; 1:1 70% etanol:PBS, 4:1 70% etanol:PBS; 70% etanol.
- Bädda in vävnaden så att sektioner kommer att avslöja de tre skikten i bipacksedeln (figur 1A) enligt fastställda protokoll31. Alternativt, och om tillgängligt, ta vävnaden till en patologikärna för inbäddning och skärning.
- Efter hantering av vävnader, kassera eller förvara personlig skyddsutrustning efter behov och tvätta händerna omedelbart. Dekontaminera all utrustning, ytor och fast och flytande avfall med en 1:10 utspädning av blekmedel eller tvättmedel. Låt 20 min för dekontaminering och följ sedan med en 70% etanolsköljning. Behandla cellodlingshuven med mykoplasmaspray enligt tillverkarens instruktioner.
5. Von Kossa-färgning för kalciumhalt
OBS: Detta kan göras bra efter cellisolering och linjeetablering men var noga med att koppla vävnadens förkalkningsnivå till dokument som rör den primära cellinjen som upprättats.
- Skär 5 eller 10 μm tjocka paraffinskivor på glasskivor och grädda glasskivor vid 65 °C i 1 h, svalna sedan till RT.
- Använd färska lösningar, deparaffinisera bilder genom att sänka ner enligt följande: 100% xylen i 30 min, 2x; 100% etanol i 3 min, 2x; 90% etanol i 3 min; 80% etanol i 3 min; 70% etanol i 3 min; 50% etanol i 3 min; ultrarent vatten i 3 min; Håll i ultrarent vatten tills nästa steg.
OBS: Tiderna ovan är minimala, varje steg kan gå längre. - Fortsätt med Von Kossa-färgning enligt tillverkarens protokoll.
- Bedöm hela ventilområdet mikroskopiskt och tilldela en kontrollvävnad (inget tecken på förkalkning) eller CAVD (eventuella tecken på förkalkning, figur 2B).
6. Ventilendotelcell (VEC) isolering, expansion och bekräftelse
- Öppna det koniska röret som innehåller den återstående ventilbroschyren i en steril cellodlingshuv och placera bipacksedeln i ett nytt 50 ml koniskt rör fyllt med iskall PBS. Lockrör och vänd försiktigt eller placera på en vippa i 2 min vid RT.
- Ta bort vävnaden till en 60 mm skål fylld med 5-7 ml kall kollagenaslösning. Doppa båda sidor av bipacksedeln i lösningen 3-4 gånger med pincett. Inkubera vävnaden i 5-10 min i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C och gunga vävnaden försiktigt var 2:e minut 3-4:e gång.
- Ta bort 2 ml av lösningen från skålen och placera i ett sterilt 15 ml koniskt rör. Placera pincett vid knölen och använd en torr steril bomullspinne för att svepa från pincetten till gångjärnet och snurra pinnen medan du flyttar den längs bipacksedeln. Mellan varje svep, swisha pinnen i lösningen i 15 ml koniskt rör för att ta bort cellerna. Upprepa för att helt svabba ytan på vävnaden, vänd sedan och upprepa på andra sidan.
- Håll ventilbladet med pincett i ena handen och en 1 ml pipett i den andra, skölj ytorna på bipacksedeln med lösningen i skålen. När den har sköljts, överför all lösning som innehåller VEC i skålen till samma 15 ml koniska rör med cellerna från vattpinnen och fortsätt till steg 6.5. Placera den återstående ventilvävnaden i ett nytt 15 ml koniskt rör med 7 ml steril kollagenaslösning och fortsätt till steg 7.1.
- Centrifugera röret som innehåller VEC vid 180 x g i 5 minuter för att pelletera de isolerade vecerna. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 3 ml VEC-tillväxtmedia. Centrifugera en gång till och ta bort supernatanten. Återsuspendera cellerna i 1 ml tillväxtmedia och bestäm antalet celler med hjälp av en hemocytometer och trypanblå.
- Återsuspendera VEC-pellet i 2 ml VEC-tillväxtmedium och plåta cellerna i en kollagenförbelagd brunn av en 6-brunnsplatta vid cirka 5 x 105 celler / cm2. Låt cellerna växa minst 3-4 dagar, ta sedan bort media och fyll på med färska medier. Upprepa media som ändras var 4: e dag. VEC kommer att växa i kullerstensformade fläckar (figur 3B, vänstra paneler).
- När VEC-plåster täcker >80% av plattan, dela celler vid cirka 1,3 x 104 celler / cm 2 beroende på hur snabbt de växer (om de når 80% på mindre än 1 vecka split vid ett något lägre antal celler / cm2).
- För att dela, tvätta celler två gånger med 2 ml DPBS och tillsätt sedan tillräckligt med dissociationsreagens för att bara täcka cellernas yta. Inkubera i 2–3 minuter vid 37 °C och kontrollera att cellerna inte överkuberas. Stoppa matsmältningen genom att tillsätta lika stor volym VEC-tillväxtmedia och överför vätska till ett 15 ml rör. Centrifugera vid 180 x g i 5 minuter, avlägsna supernatanten och återsuspendera i lämplig volym media för det antal brunnar/plattor som behövs.
OBS: När de väl har expanderats till en 10 cm platta kan VEC ibland förlora sin morfologi och ändra fenotyp när de sprider sig. Detta tenderar att inträffa när VEC seedas vid en låg sammanflöde under etableringen och expansionen av cellinjen. - För att garantera en ren kultur överväga att använda CD31 + superparamagnetiska pärlor vid varje splittring.
- För 1 x 108 eller färre celler (en 10 cm skål eller mindre), förbered 25 μL superparamagnetiska pärlor genom att tvätta enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Steg 6.10 rekommenderas att utföras före trypsinisering av VEC. - Lossa celler som i steg 6.8 men återsuspendera i 500 μL PBS med 0,1% BSA, pH 7,4 och placera i ett 2 ml centrifugrör. Tillsätt 500 μl tvättade och återsuspenderade pärlor till 2 ml cellrör och inkubera på en rotator i 20 minuter vid 4 °C.
- Placera rören på magneten i 2 min. Medan röret fortfarande finns i magneten, ta försiktigt bort supernatanten. Ta bort röret från magneten, tillsätt 1 ml färsk PBS med 0,1% BSA, pipettera försiktigt 2-3 gånger och lägg sedan tillbaka på magneten i 2 min. Upprepa ytterligare 2 gånger. Efter slutligt avlägsnande av buffert, återsuspendera celler i tillväxtmedier i volym som behövs för replating.
OBS: Celler kommer fortfarande att ha pärlor, men dessa kommer inte att påverka tillväxten och kommer att tas bort i efterföljande passager. - När cellerna har expanderats, förutom morfologi, bekräfta VEC-fenotyp genom positiv färgning för immunofluorescerande markörer såsom von Willebrand-faktor (vWF), kadherin 5 (CDH5) eller PECAM-1 / CD31, och negativ färgning för VIC-markörer som calponin 1 (CNN) eller alfa-2 glattmuskelaktin (αSMA, figur 4, vänstra paneler).
7. Ventilinterstitiell cell (VIC) isolering, expansion och lagring
- Som anges i steg 6.4, efter avlägsnande av VEC från ventilvävnaden, placeras bipacksedeln i ett 15 ml koniskt rör med 7 ml kollagenaslösning. Inkubera i 12 timmar i cellodlingsinkubatorn med locket något öppet för att möjliggöra gasutbyte. Framgångsrik isolering av VICs kan fortfarande ske med upp till 18 timmar i kollagenaslösning.
- Efter inkubation, i en steril cellodlingshuv, blanda vävnaden försiktigt genom pipettering med en serologisk pipett för att säkerställa frisättning av VICs från bipacksedeln.
- Ta bort cellsuspensionen och passera genom ett 0,70 μm filter i ett 50 ml koniskt rör.
- Tillsätt 7 ml VIC-tillväxtmedium till 50 ml röret och centrifugera vid 180 x g i 5 minuter. Aspirera supernatant och återsuspendera cellpellet i 1 ml VIC-tillväxtmedium och bestäm cellnumret. Plåta VIC:erna i en 60 mm vävnadsodlingsbehandlad skål vid 1,3 x 104 celler/cm2.
- Låt cellerna växa minst 1-2 dagar innan du byter media. Ta bort media och tvätta två gånger DPBS för att ta bort kvarvarande skräp och ersätt med färskt tillväxtmedium. Fyll på medium var 2-3: e dag. VICs kommer att växa i fibroblastform (figur 3B, högra paneler).
- När VICs når en sammanflöde på >90%, tvätta två gånger med DPBS för att avlägsna överskottsmediet och lossa cellerna genom att tillsätta lämplig volym förvärmt dissociationsreagens för att täcka plattan (dvs. 2-3 ml per 10 cm skål). Inkubera skålen i en 37 °C inkubator. VICs lossnar från skålen efter 2-3 minuters inkubation. Tillsätt 4-6 ml förvärmda medier.
OBS: Om celler tar längre tid än 3 minuter att lyfta från plattan kan dissociationsreagenset ha tappat styrka. Vid behov kan en cellskrapa användas för att försiktigt lyfta cellerna. - Överför cellsuspensionen till ett rör och centrifugera försiktigt vid 180 x g i 5 minuter. Efter att ha tagit bort supernatanten, återsuspendera försiktigt cellpelleten i förvärmda VIC-tillväxtmedier och bestäm antalet livskraftiga celler med hjälp av en hemocytometer och trypanblå. Frö de livskraftiga cellerna med en densitet på 1: 2 av den ursprungliga skålen (dvs ~ 1 × 106 celler per 10 cm skål eller 1,3 x 104 celler / cm2).
- Bedöm VIC-fenotyp genom positiv färgning för immunofluorescerande markörer som αSMA, CNN eller SM22α och negativ färgning för VEC-markörer som CD31, CDH5 eller vWF (figur 4, högra paneler).
OBS: Protokollarbetsflödet som presenteras här väljer opartiskt en broschyr för VEC- och VICs-isolering, medan de återstående broschyrerna används för Von Kossa-färgning (avsnitt 5) och snapfrysning.
8. Långvarig celllagring
- När de har expanderats fryser du ner cellerna för långvarig lagring. Tvätta celler två gånger med 2-5 ml DPBS och tillsätt sedan tillräckligt med dissociationsreagens för att lossa celler som i steg 6.8 och 7.6. Stoppa matsmältningen genom att tillsätta lika stor volym VEC- eller VIC-tillväxtmedium och överför cellsuspension till ett 15 ml rör.
- Bestäm antalet livskraftiga celler med hjälp av en hemocytometer och trypanblå.
- Centrifugera vid 180 x g i 5 min.
- Återsuspendera celler i kylda konditionerade tillväxtmedier till en celldensitet på ~ 3 × 106 celler / ml.
- Försiktigt med virvlande, tillsätt en lika stor volym kylt 2x kryokonserveringsmedium. Detta kommer att ge cellkoncentrationen till ~ 1,5 × 106 celler / ml.
- Alikvotera 1 ml i kryokonserveringsflaskor. Placera injektionsflaskor i en cellfrysningsbehållare, stäng och invertera 5-6 gånger för att säkerställa att cellerna förblir suspenderade. Placera behållaren vid -80 ° C i 6-72 timmar eller enligt frysbehållarens protokoll. Ta bort injektionsflaskorna från -80 °C och överför till flytande kväve för långvarig lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovanstående protokoll beskriver de steg som är nödvändiga för hantering av mänskliga ventilvävnader och isolering och etablering av livskraftiga cellinjer från dessa vävnader. Broschyrer från aortaklaffen bearbetas för paraffinbäddning, snäppfryses för långvarig lagring för biokemisk eller genetisk analys och smälts för isolering av VEC och VIC (figur 1). Medan kirurgiska prover sannolikt kommer att ha en klinisk diagnos av aortastenos och kan uppvisa tunga knölar av förkalkning som kan vara synliga med blotta ögat, är aortaklaffförkalkning närvarande hos ett betydande antal äldre (>65 år gamla) individer32, och på grund av denna prevalens utsätts alla vävnader - kirurgiska och kadaveriska - för Von Kossa-färgning eller liknande procedur för att bedöma om förkalkning är närvarande (Figur 2).
Det visade sig att användning av kylförvaringslösning kraftigt stabiliserade cellerna i den utskurna ventilvävnaden. Kylförvaringslösning används vid levande organtransplantationer. Det spolas genom organ antingen före eller efter avlägsnande från donatorn och lämnas i kärlen hos det organet under transport på is. Det observerades att VEC-linjer lättare etablerades från donatorprover än kirurgiska vävnader, och givarlinjerna var mer benägna att behålla sin endotelcellmorfologi för fler passager. Detta var förvirrande, eftersom donatorvävnader ofta inte nådde laboratoriet på 12-24 timmar efter döden medan kirurgisk vävnad erhölls mellan 2 och 4 timmar. Vid packning av de kirurgiska provrören med kylförvaringslösning istället för PBS ökade cellåtervinningen kraftigt. Som framgår av figur 3 kan både livskraftiga VEC och VICs erhållas uppemot 61 timmar efter ventilutsug. Medan en något högre andel levande VIC erhålls än VEC när celler isoleras upp till en dag efter ventilexcision, förblir cellerna livskraftiga efter 48 timmar efter excision. Upp till 40% av de totala återvunna cellerna motsvarar levande celler och vi har observerat konsekventa siffror mellan biologiska replikat. Vidare bekräftar morfologiinspektion också cellidentitet; medan VEC uppträder som packade, kullerstensliknande och tillväxtkontakthämmade celler, liknar VIC-morfologi myofibroblaster med spindelform. Immunfärgning av proverna bekräftade att 91,8% ± 1,8 (n = 3) av expanderade VEC var positiva för endotelmarkören vWF medan 92,0% ± 5,0 (n = 3) av expanderade VIC var positiva för den interstitiella cellmarkören αSMA (Figur 4). Dessa siffror är i linje med resultat som tidigare rapporterats33.
Figur 1: Ventilvävnadsbehandling och cellisolering från mänsklig kontroll och CAVD-ventiler . (A) Schematisk representation av vävnadsbehandling för bedömning av förkalkningsnivåerna för ventilerna. (B) Schematisk representation av tidsförloppet och stegen för isolering och karakterisering av mänskliga ventilendotelceller (VEC) och ventilinterstitiella celler (VIC) från kontroll- och CAVD-vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedömning av förkalkning . (A) Representativ bild av kontrollvävnader (överst) och förkalkade (nedre) ventilvävnader från mänskliga givare. Observera att förkalkningsknutorna i CAVD-vävnaden allvarligt kan förändra morfologin och förmågan att rent skära ut broschyrerna. (B) Representativ von Kossa-färgning av kontrollventilvävnad (vänster) och CAVD (höger) efter fixering och vidare bearbetning av den mänskliga ventilvävnaden. Obsförkalkning avslöjas av närvaron av mörk nederbörd i bipacksedelvävnaden. Ventilbilder togs med en labbkamera. Von Kossa färgade ventiler fångades med ett 10x objektiv, skalstång 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av cellöverlevnad (A) VEC och VICs överlevnadskurvor. Tre broschyrer erhölls från fem ventilprover. Den första bipacksedeln från varje ventil bearbetades omedelbart (3-12 h efter extraktion), den andra bipacksedeln bearbetades ungefär 24 h senare (22-35 h) och den tredje bipacksedeln bearbetades ungefär 48 h efter erhållande av vävnaden (45-61 h). Ventilernas broschyrer förvarades i kylförvaringslösning vid 4 °C tills de bearbetades. Y-axeln representerar procentandelen levande celler. (B) Morfologi för friska kulturer av VEC (vänstra paneler) och VICs (höger paneler). Grafer visar medelvärdet ± SD-levande cellandel av celler isolerade från n = 5 ventilvävnader. Bilder togs med ett 4x och 10x mål, skalstänger 200 μm respektive 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ immunofluorescerande färgning på VEC och VICs. VEC är positiva för endotelmarkören von Willebrand Factor (vWF, vänstra paneler) medan VICs är positiva för den interstitiella markören αSMA. Observera att vårt isoleringsprotokoll garanterar en hög isoleringseffektivitet; ingen korskontaminering mellan VEC och VIC detekteras. Bilder togs med ett 10x mål, skalstreck 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att erhålla kontroll- och sjukdomsvävnader från människor är avgörande för in vitro- och ex vivo-sjukdomsmodellering; Men medan man ofta talar om utmaningarna med att överbrygga klyftan mellan bänk och säng, är den omvända ordningen - att gå från operationssviten till bänken - ofta lika skrämmande en lucka. Viktigt för en grundläggande forskare att få primära mänskliga vävnadsprover är ett samarbete med en investerad kirurgforskare som har ett team av sjuksköterskor, kirurgiska tekniker, läkarassistenter, medicinska studenter och invånare och kliniska protokollchefer som kan registrera och samtycka till patienter, delta och hjälpa till med korrekt hantering av utskurna vävnader och samordna den logistik som krävs för vävnadshämtning. Utan största möjliga ansträngning från alla inblandade för att minska tiden från excision till cellisolering kommer vitalt cellulärt material och den information det innehåller att förändras irreparabelt eller gå förlorat.
Avgörande för att bibehålla vävnadsprovernas livskraft är användningen av kylförvaringslösning. Detta är samma lösning som används av organtransplantationsteamen vid UPMC och andra transplantationsmedicinska centra. Bättre cellutbyte erhölls från kadavervävnader som hade skurits ut från givaren många timmar i förväg än från vävnader som erhållits snabbare från operationssalen men förvarats i kallt PBS. Denna oavsiktliga upptäckt har varit avgörande för celltillvaratagande från mänskliga vävnader. Tillvaratagandetiden från vävnadsexcision till leverans i laboratoriet sträcker sig från 1-5 timmar för kirurgisk vävnad och uppemot 24 timmar för kadavervävnad. I jämförelse kan tillvaratagande och bearbetning av djurvävnader ofta göras inom några minuter efter eutanasi, vilket är idealiskt för cellviabilitet. I avsaknad av kylförvaringslösning är det troligt att ett medium som är lämpligt för odling av celler också kan fungera bättre än PBS, men detta medium testades inte här på grund av framgången med kylförvaringslösningen vid levande organtransplantation och mottagandet av kadavervävnader i denna lösning. Lösningen är hyllstabil vilket är idealiskt för förvaring i operationssalar, och specifika ingredienser som adenosin är kända för att främja fördelaktiga svar på cellulära påfrestningar som ischemi / hypoxi21,34.
Ett annat viktigt steg för att erhålla livskraftiga celler är att tvätta vävnaderna med fungicid, gentamicin och baktericid. Denna korta sköljning hjälper till att säkerställa att cellerna förblir oförorenade av bakterier och svamp. Lika kritiska är stegen för att smälta VEC ur ventilvävnaden, där VEC: erna inom loppet av bara några minuter lossnar och sedan svabbas av ventilbladens yta. Den efterföljande matsmältningen av VIC: erna som ligger på den täta extracellulära matrisen i bipacksedeln har mycket mer svängrum för varaktighet och styrka. Den opartiska vävnadsbehandlingen som beskrivs i detta protokoll möjliggör isolering av de två huvudsakliga cellpopulationerna som finns i ventilbladet, VEC och VICs. Även om en nyligen genomförd transkriptomanalys med en enda cell har visat samexistensen av minst fjorton olika cellundertyper som finns i den mänskliga ventilen, inklusive sex icke-ventilderiverade stromaceller i CAVD-vävnad35, kan denna mångfald representera variationer på grund av effekter från bearbetning och smältning av dessa härdade vävnader, eller det kan bero på olika mikromiljöer som bipacksedelcellerna utsätts för: VEC utsätts för två olika blodflöden medan VICs är inbäddade i tre olika extracellulära matrisstratum 8,9. Det storskaliga isoleringsprotokollet och analysen som beskrivs häri säkerställer att över 90% av VEC och VICs motsvarar deras huvudsakliga fenotyp. Även om en viss heterogenitet kan hittas påverkar den inte de allmänna resultaten av studien av VEC och VIC-homeostas 8,9,13,14,15,16.
Det är också viktigt att notera att patienter och deras ventilvävnader, och därmed cellinjerna som anskaffas från dem, inte är identiska. Genetik, komorbiditeter, hantering under operation och bearbetning och färskhet av matsmältningslösningens ingredienser kan påverka tillväxthastigheten och till och med kanske beteendet eller fenotypen hos cellerna isolerade. Medan den aktuella studien visar förmågan att ge ett tillräckligt antal livskraftiga celler med denna procedur, kan det finnas medfödda eller inducerade skillnader i dessa cellinjer som kan påverka nedströms experiment. Det är ofta svårt att veta exakt när vävnaden har tagits bort från patienten eller donatorn, och särskilt när det gäller den senare har tiden sedan cirkulationen upphört. Vidare finns det inneboende variabilitet bland vävnader när det gäller antalet erhållna livskraftiga ventilceller, cellernas proliferativa kapacitet och retentionen av cellfenotyp. Cellinjer kan innehålla genetiska mutationer - antingen medfödda eller somatiska - som läkaren och forskargruppen inte är medvetna om, och ombyggnad och efterföljande hantering av vävnaderna kan också modifiera cellfenotypen eller till och med epigenetiken. För alla experiment där dessa primära mänskliga celler används är det absolut nödvändigt att biologiska replikat - dvs. cellinjer som erhållits från olika patienter - används, trots den betydande tid och kostnad de ådrar sig. Detta bidrar till att säkerställa att eventuella resultat inte beror på förvirrande effekter från tillvaratagande och bearbetning av vävnaden. Den variabla proliferationshastigheten för olika cellinjer kan justeras genom att antingen samla celler i experiment vid olika tidpunkter eller sådda celler för experiment vid olika densiteter; Inget svar är bäst för alla experimentella mönster. Även om komplikationerna inte är obetydliga, är användningen av primära humana kontroll- och CAVD-vävnadsderiverade cellinjer för in vitro- och ex vivo-experimentella modeller avgörande för att definiera initieringsfaktorerna och förökningsprocesserna som driver CABD-patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IS får institutionellt forskningsstöd från Atricure och Medtronic och fungerar som konsult för Medtronic Vascular. Ingen av dessa konflikter är relaterade till detta arbete. Alla andra författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Jason Dobbins för insiktsfull diskussion och kritisk läsning av detta manuskript. Vi vill uppmärksamma Center for Organ Recovery and Education för deras hjälp och stöd och tacka vävnadsdonatorer och deras familjer för att ha gjort denna studie möjlig. Alla patientprover samlas in från personer som deltar i studier som godkänts av den institutionella granskningsnämnden vid University of Pittsburgh i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Kadaveriska vävnader som erhållits via Center for Organ Recovery and Education (CORE) godkändes av University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).
Några figurer skapade med Biorender.com.
CSH stöds av National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 och R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
