Summary
Her beskriver vi en protokol til generering af nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller (hPSC'er). Denne protokol genererer nyreorganoider inden for to uger. De resulterende nyreorganoider kan dyrkes i store spinnerkolber eller magnetiske omrøringsplader med flere brønde til parallelle lægemiddeltestmetoder.
Abstract
Nyreorganoider genereret fra hPSC'er har givet en ubegrænset kilde til nyrevæv. Humane nyreorganoider er et uvurderligt redskab til at studere nyresygdom og skade, udvikle cellebaserede terapier og teste nye terapier. Til sådanne anvendelser er der behov for et stort antal ensartede organoider og stærkt reproducerbare assays. Vi har bygget videre på vores tidligere offentliggjorte nyreorganoidprotokol for at forbedre organoidernes generelle sundhed. Denne enkle, robuste 3D-protokol involverer dannelsen af ensartede embryoide kroppe i minimumskomponentmedium indeholdende lipider, insulin-transferrin-selen-ethanolamintilskud og polyvinylalkohol med GSK3-hæmmer (CHIR99021) i 3 dage efterfulgt af dyrkning i knock-out serumerstatning (KOSR)-holdige medium. Derudover giver agiterende assays mulighed for reduktion i sammenklumpning af embryoidlegemerne og opretholdelse af en ensartet størrelse, hvilket er vigtigt for at reducere variabiliteten mellem organoider. Samlet set giver protokollen en hurtig, effektiv og omkostningseffektiv metode til generering af store mængder nyreorganoider.
Introduction
I de senere år er der udviklet en række protokoller til differentiering af humane pluripotente stamceller til nyreorganoider 1,2,3,4,5. Nyreorganoider har været et vigtigt redskab til at hjælpe forskningen i nye regenerative medicinske tilgange, modellere nyrerelaterede sygdomme, udføre toksicitetsundersøgelser og udvikling af terapeutiske lægemidler. På trods af deres brede anvendelighed har nyreorganoider begrænsninger såsom manglende modning, begrænset langsigtet dyrkningskapacitet in vitro og en mangel på flere celletyper, der findes i den menneskelige nyre 6,7,8. Nyligt arbejde har fokuseret på at forbedre niveauet af organoid modning, udvide kulturperioderne og udvide kompleksiteten af nyrecellepopulationer ved at ændre de eksisterende protokoller 9,10,11,12. I denne nuværende iteration af vores etablerede protokol 5,13 har vi modificeret mediumkomponenterne i protokollens første fase til et serumfrit basismedium suppleret med insulin-transferrin-selen-ethanolamin (ITSE), lipider, polyvinylalkohol (E5-ILP) og CHIR99021 (figur 1). Disse ændringer giver et fuldt defineret, serumfrit, proteinfattigt medium med færre komponenter end vores tidligere mediumsammensætning 5,13 og uden yderligere vækstfaktorer. Som følge heraf er det første trinmedium mindre arbejdskrævende at forberede end vores tidligere offentliggjorte version og kan reducere batch-til-batch-variabiliteten5. Tidligere undersøgelser har vist, at både insulin og transferrin er vigtige i serumfri kultur 14,15, men høje niveauer af insulin kan være hæmmende for mesodermdifferentiering16. Vi har opretholdt de lave insulinniveauer som angivet i den oprindelige protokol og yderligere reduceret niveauet af KOSR (indeholdende insulin) i anden fase af analysen. I overensstemmelse med andre protokoller for dannelse af nyreorganoider er lavere niveauer af KOSR gavnlige for at opretholde en balance mellem spredning og differentiering afnyrevævet 17. Derudover har vi sænket glukosekoncentrationen i vores fase II medium13.
Vores metode beskriver en opsætning til suspensionsassay af nyreorganoider, der giver op til ~ 1.000 organoider fra en indledende ~ 60% sammenflydende hPSC 100 mm kulturplade som beskrevet i den oprindelige publikation 5,13. Denne protokol kan let skaleres op til at starte med flere 100 mm eller 150 mm plader for yderligere at øge organoidtallene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med hPSC'er blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og blev udført i en klasse II biosikkerhedshætte med passende personlige værnemidler. Alle reagenser er cellekultur-grade, medmindre andet er angivet. Alle kulturer inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2-luftatmosfære . På alle stadier af analysen kan embryoide legemer eller nyreorganoider indsamles og fastgøres eller forberedes til analyse. De hPSC-linjer, der bruges til at generere disse data, er blevet fuldt karakteriseret og offentliggjort18.
1. Forberedelse af kulturplader
BEMÆRK: Ca. 1 time før opdeling af hPSC'er belægges 2 x 100 mm vævskulturplader med et stamcellekvalificeret kældermembranmatrixekstrakt (BME). Man kan forbelægge pladerne, forsegle dem med en paraffinfilm og opbevare dem ved 4 °C i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
- Forbered 2 x 100 mm vævskulturbehandlede plader (1 til nyreorganoidassay, 1 til opretholdelse af cellelinjen) og et 15 ml konisk rør i biosikkerhedshætten i klasse II.
- Aliquot 8 ml koldt, serumfrit Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) i et 15 ml konisk rør og ~ 4 ml i hver af de 100 mm plader, nok til at dække bunden af hver plade med medium.
- Tag en Alikvote på 100 μL ud af fryseren (-20 °C). Brug en 2 ml serologisk pipette til at tage ~ 1 ml kold DMEM fra det 15 ml koniske rør. Optø langsomt BME-aliquoten ved forsigtigt at pipettere op og ned med den kolde DMEM, så du undgår at lave bobler.
BEMÆRK: Lad ikke BME aliquot sidde ved stuetemperatur. Brug straks. - Overfør den optøede DMEM/BME tilbage til det 15 ml koniske rør med det resterende DMEM. Med en 10 ml serologisk pipette blandes forsigtigt den fortyndede BME ved at pipettere op og ned mindst 8 gange for jævnt at sprede BME'en og undgå at lave bobler.
- Overfør 4 ml af den fortyndede BME til hver plade med DMEM og hvirvl forsigtigt pladen, så BME fordeles jævnt. Inkuber den belagte plade i 1 time ved stuetemperatur eller 30 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Brug 50 μL BME pr. 100 mm plade. Anvendelse af andre hPSC-kulturmedier og cellelinjer kan kræve forskellige koncentrationer af BME.
2. Passaging hPSC'er
BEMÆRK: Til rutinemæssig hPSC-kultur, passage cellelinjer ved 70-80% sammenløb.
- Aspirer kulturmediet fra hPSC-pladen, der skal passeres. Tilsæt ~ 8 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS) til hPSC-pladen og hvirvl forsigtigt for at vaske cellerne.
- Aspirat DBPS og tilsæt 2 ml blidt celle dissociationsreagens (GCDR) til 100 mm pladen, dråbe for dråbe ovenpå for at dække cellerne.
BEMÆRK: Andre dissociationsreagenser kan også anvendes. Juster i overensstemmelse hermed. - Inkuber ved stuetemperatur i ~ 6-8 minutter, indtil kolonierne bryder op, og cellerne er brydningsaktive under fasekontrast (figur 2A).
BEMÆRK: Timingen kan variere mellem cellelinjer. Juster i overensstemmelse hermed. - Under inkubation skal du forberede et 50 ml konisk rør. Der tilsættes 16 ml hPSC-medium (8 ml pr. 100 mm plade), og Der tilsættes Rho-associeret kinasehæmmer (ROCKi) til en endelig koncentration på 5 μM.
- Aspirat DMEM fra de BME-belagte plader, og tilsæt 8 ml hPSC-medium plus ROCKi til hver plade.
- Når cellerne er klar (som beskrevet i punkt 2.3, figur 2A), aspirerer GCDR og vipper pladen ~45° mod eksperimentatoren og skraber cellerne med en celleløfter.
BEMÆRK: Hvis celler detatcher, skal du udelade aspirerende GCDR og fortsætte. - Drej pladen ~ 90 ° og skrab igen for at løfte de resterende celler. Hold pladen ~ 45 ° og vask cellerne ned med 3 ml hPSC-medium ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette.
- Pipetter forsigtigt op og ned for at bryde store klumper op (højst 2-3 gange) og frø cellerne i det passende forhold til cellelinjen af interesse på de forberedte plader. Placer pladen med cellerne i inkubatoren og flyt pladen forsigtigt i figur otte bevægelser for at fordele cellerne jævnt.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev hPSC-linjer opdelt i et forhold på 1: 5, dette kan variere for andre cellelinjer og betingelser. Lad pladen stå uforstyrret natten over. - Efter ~ 24 timer skal du undersøge cellerne for fastgørelse. Kig efter små individuelle kolonier vedhæftet. Aspirer det brugte medium og genopfyld med 8 ml frisk hPSC-medium (ingen ROCKi tilsat).
- Fortsæt med at observere og fodre dagligt, indtil cellerne når ~ 60% sammenløb for at starte nyreorganoidassayet (normalt nået 48 til 72 timer efter passaging). Kolonierne vil ideelt set være diskrete og ikke fusionere (figur 2B).
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at begrænse cellerne til højst 80% sammenløb for at opretholde deres pluripotenstilstand. Sammenflydende kulturer, grov håndtering eller højere passager kan føre til uønsket spontan differentiering eller lav effektivitet af nyreorganoiddannelse.
3. Dag 0 - Opsætning af nyreorganoidassay
- Før du starter, skal du forberede både E5-ILP- og fase II-mediet i henhold til formuleringer (tabel 1 og tabel 2).
BEMÆRK: Mediet kan opbevares i op til 14 dage ved 4 °C. - For et nyreorganoidassay (en 100 mm dyrkningsplade er nødvendig for en 6-brønds plade), skal du forberede komplet E5-ILP-medium i et 50 ml konisk rør: 18 ml E5-ILP suppleret med 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-mercaptoethanol (32,7 μL).
- Anbring 2 ml komplet E5-ILP-medium i hver brønd på en 6 brønd ultralav fastgørelsesplade.
- HPSC'er vaskes ved ~60 % sammenløb (figur 2B) to gange med ~ 8 ml DPBS. Aspirat DPBS tilsættes derefter 2 ml dispase pr. 100 mm plade, dråbe for dråbe for at dække cellerne og inkuberes i 6 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Efter 6 minutter begynder koloniernes kanter at krølle sig sammen (figur 2C, røde pile), mens resten af kolonien forbliver fastgjort. Hvis dette ikke opnås efter 6 minutter, skal cellerne placeres tilbage i inkubatoren i yderligere 30 s. Andre hPSC-medier og -matrix er muligvis ikke kompatible med denne timing. Lamininbaseret BME-belægning er ikke kompatibel med dispase. Hvis lamininbaseret BME er standard hPSC-matrixen, skal en af pladerne i punkt 1 belægges med den BME, der er beskrevet i denne metode, og som skal anvendes til nyreorganoidassay. - Vask celler 3x med ~ 10 ml DPBS. Aspirer DPBS vipper derefter pladen ~ 45 ° og skraber ned med en celleløfter.
BEMÆRK: Dispase er ikke deaktiveret, derfor skal den vaskes grundigt ud. Reducer ikke antallet af vaske. - Vask kolonierne ned fra toppen med 6 ml komplet E5-ILP-medium ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Pipette forsigtigt op og ned for at bryde op i store kolonier (2 eller 3 gange er normalt nok).
- Fordel koloniklyngerne jævnt ved at tilsætte 1 ml pr. Brønd i 6-brøndspladen. Anbring pladen på en orbital shaker (indstillinger: orbital = 30, gensidig = 330 °, vibration = 5 ° - 2 s), der er placeret i 37 ° C inkubatoren (figur 2D).
BEMÆRK: Vibrationsfunktionen er vigtig for tilstrækkelig fordeling af organoider og for at forhindre klumpning.
4. Dag 2 - Fodring ved halv medium ændring
BEMÆRK: Inden for de 48 timer vil koloniklynger danne embryoide kroppe.
- Forbered det komplette medium: Til en 6-brønds plade forberedes 12 ml E5-ILP medium + 8 μM CHIR99021 i et 15 ml konisk rør.
BEMÆRK: Beta-mercaptoethanol og ROCKi er ikke påkrævet. - Lad embryoidlegemerne sætte sig i bunden af pladen, vip pladen ~ 45 ° og aspirer derefter mediet langsomt fra toppen, lad ~ 1 ml pr. Brønd.
BEMÆRK: Embryoide kroppe på dette stadium klumper sig hurtigt. Lad dem ikke nøjes med > 5 min. - Der tilsættes 2 ml tilberedt komplet medium (punkt 4.1) pr. brønd. Sæt pladen tilbage på rysteren.
5. Dag 3 - Overførsel af embryoide kroppe til fase II-medium
- Forbered et 50 ml konisk rør og DMEM (lav glukose). Lad embryoidlegemerne slå sig ned i bunden af pladen. Vip pladen ~ 45 ° og aspirer mediet langsomt fra toppen, efterlad ~ 1 ml pr. Brønd.
- Saml alle embryoide kroppe omhyggeligt fra hver brønd ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette og overfør dem til det 50 ml koniske rør.
- Vask hver brønd for at samle eventuelle resterende embryoide kroppe med ~ 1 ml DMEM (lav glukose) og tilsæt dem til det samme 50 ml koniske rør.
- Lad de embryoide kroppe slå sig ned i bunden af røret, ~ 5 minutter. Mens du venter, tilsættes 2 ml trin II medium til hver brønd på 6-brøndspladen. Udsiv store embryoide kroppe (>300 μm) ved hjælp af en 200 μm cellesil (figur 2E).
- Brug et nyt 50 ml konisk rør og læg 200 μm cellesilen ovenpå. Pipette alle embryoide kroppe ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette forsigtigt over cellesilen.
- Skyl cellesilen med yderligere ~ 5 ml DMEM (lav glukose) for at opsamle eventuelle embryoide kroppe, der sidder fast i cellesilen. Lad embryoidlegemerne slå sig ned til bunden af det koniske rør.
- Når embryoidlegemerne er afgjort, aspireres supernatanten og vaskes med ~ 10 ml DMEM (lav glukose).
- Aspirer DMEM og re-suspendere embryoidlegemerne i 6 ml fase II medium.
- Overfør embryoidlegemerne tilbage til den 6 brønd ultralave fastgørelsesplade, fordel dem jævnt mellem de 6 brønde.
- Der foretages halve mellemstore ændringer som beskrevet i trin 4.2 og 4.3 hver anden dag.
BEMÆRK: Fra dag 3 og fremefter vil embryoidlegemerne have et 'gyldent' og glat, sfærisk udseende (figur 2F). Fra ~ dag 6 vil tubuledannelse i individuelle embryoide kroppe blive tydelig, med stigende antal i løbet af de følgende dage, der når optimale tal og vækst på dag 14 (figur 2G, H). For at eliminere lejlighedsvis klumpdannelse sigtes de <200 og store >500 μm organoider ud med en cellesil på 500 og 5.4.2 ved visuel observation af nyreorganoiderne eller meget små embryoide legemer uden tubuli som beskrevet i trin 5.4.1 og 5.4.2.
6. Overførsel til spinnerkolbe og fodring
BEMÆRK: En spinnerkolbe kan anvendes når som helst fra dag 3 og fremefter til forsøg, der kræver et stort antal organoider. Rutinemæssig overførsel af organoider sker i vores laboratorium mellem dag 6-8. Se afsnittet Diskussion for alternativer, hvis udstyr ikke er tilgængeligt.
- Embryoide legemer overføres til en 125 ml spinnerkolbe med 45 ml fase II-medium. Indstil magnetisk omrørerhastighed til 120 o / min og anbring i inkubatoren (figur 2I).
- For at fodre embryoide kroppe eller nyreorganoider, lad nyreorganoiderne sætte sig kort til bunden af spinnerkolben. Løft låget fra kolbens ene sidearm, og anbring den aspirerende pipette indeni, hvor spidsen berører den modsatte indvendige væg.
- Vinkle langsomt den aspirerende pipette ned og aspirere ca. halvdelen af mediet. Genopfyld med 20 ml frisk fase II-medium ved at pipettere det gennem den samme åbning.
7. Opsætning af 6-brønds magnetisk omrøringsplade (6MSP)
BEMÆRK: 6MSP-formatet kan anvendes i stedet for spinnerkolber, hvis flere betingelser skal testes. Brug 6MSP til forbindelses- eller nefrotoksinbehandlinger. Dette sparer mængden af medium, der anvendes i anden fase, samtidig med at næringsstoftilgængeligheden opretholdes gennem diffusion.
- Rengør de ovale magnetiske omrøringsstænger i et 50 ml konisk rør ved at vaske et egnet rengøringsmiddel i en vævskultur kortvarigt (hvis det aldrig bruges) eller lægge det i blød i > 1 time, hvis det tidligere er brugt.
- Vask kort 3x i sterile DPBS.
- Vask 1x i 5 min i 70% ethanol, 1x i steril DPBS.
- Skyl med anti-adherence opløsning og vask 1x i steril DPBS og aspirat.
- Forsigtigt skal du ved hjælp af lange sterile tang placere en magnetisk omrøringsstang i hver brønd på 6-brøndspladen med embryoide kroppe eller nyreorganoider.
- Placer pladen på 6MSP og indstil hastigheden til 120 o / min (figur 2J). Oprethold nyreorganoider med halv medium ændring i henhold til pkt. 4.2 og 4.3.
BEMÆRK: For at de magnetiske omrøringsstænger skal klikke på plads og begynde at spinde, skal du muligvis først sætte effektniveauet til 100 kort, og derefter når de alle spinder, skal du bringe effektniveauet ned til 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne seneste version af vores protokol indledes nyreorganoiddifferentiering i et defineret, lavt proteinmedium. Assays udføres helt i suspension og er afhængige af hPSC's medfødte evne til differentiering og organisering til initiering af tubulogenese. Et enkelt assay, der stammer fra en 100 mm ~ 60% sammenflydende hPSC-kulturplade, giver rutinemæssigt 500-1.000 nyreorganoider, som vist i vores tidligere publikation5. På grund af et så stort antal genererede organoider er denne protokol velegnet til sammensat testning. Vi bruger rutinemæssigt et 6-brøndsformat til sammensat test, men denne protokol kan let skaleres i anden fase (dag 3 og fremefter) til andre multibrøndeformater til test af forbindelser med højere gennemstrømning. Immunofluorescens af paraffinsektioner viser tilstedeværelse af nefronsegmenter i organoiderne, dvs. nyretubuli, der udtrykker hepatocyt nuklear faktor-1 beta (HNF1B) og Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL) (figur 3A - HNF1B, LTL), og podocytklynger, der udtrykker V-maf Musculoaponeurotisk fibrosarkom onkogen homolog B (MAFB) og nephrin (NPHS1) (figur 3A - MAFB, figur 3B - NPHS1). Desuden kan ændringerne i denne protokol understøtte udvidelse af endotelceller som det ses i figur 3B , der viser farvning med blodplade- og endotelcelleadhæsionsmolekyle 1 (PECAM1) på dyrkningsdag 26.
| Reagens | Lager conc. | Arbejder conc. | Mængde pr. 250 ml |
| TeSR-E5 | Nielsen | Nielsen | 238,48 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 6,25 ml |
| Pen-Strep | 100x | 1x | 2,5 ml |
| ITSE | 100x | 0,1x | 250 μL |
| Kemisk definerede lipider | 100x | 1x | 2,5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 25 μL |
Tabel 1: E5-ILP medium sammensætning. Pipette alle reagenser undtagen de kemisk definerede lipider og anti-mycoplasma reagens direkte ind i det øverste kammer i en 0,22 μm Stericup filtreringsenhed. Efter filtrering tilsættes lipider og anti-mycoplasma reagens. Opbevares ved 4 °C i op til to uger.
| Reagens | Lager conc. | Arbejder conc. | Mængde pr. 500 ml |
| DMEM (lav glukose) | Nielsen | Nielsen | 417,5 ml |
| KOSR | Nielsen | 10% | 50 ml |
| PVA | 10% | 0.25% | 12,5 ml |
| Pen-Strep | 100x | 1x | 5 ml |
| MEM-NEAA | 100x | 1x | 5 ml |
| GlutaMAX | 100x | 1x | 5 ml |
| HEPES | 100x | 1x | 5 ml |
| Plasmocin | 25 mg/ml | 2,5 μg/ml | 50 μL |
Tabel 2: Fase II medium sammensætning. Pipette alle reagenser undtagen og anti-mycoplasma reagens direkte ind i det øverste kammer i en 0,22 μm Stericup filtreringsenhed. Når det er filtreret, tilsættes anti-mycoplasma reagens. Opbevares ved 4 °C i op til to uger.
Figur 1: Oversigt over protokollen. Skematisk oversigt over protokollen, der viser tidspunktet for de to trin og brugen af spinnerkolber og 6MSP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Stadier af protokollen. (A) Lysfeltbillede af hPSC-koloni behandlet med GCDR. (B) Optimal sammenløb og kolonistørrelse for at starte et nyreorganoidassay. C) hPSC'er behandlet med dispase i 6 minutter. Røde pile peger på kanter af kolonierne, der krøller sig sammen. D) Organoidassays på en orbital shaker. (E) Anvendelse af 200 μm cellesil til at udsigte store embryoide kroppe. F) Embryoide kroppe på dag 3 (D3), inden de overføres til fase II-medium. (G) Fremkomsten af tubulidannelse kan observeres på dag 8 (D8) og (H) optimalt tidspunkt for organoidhøst og -behandling på dag 14 (D14). I) Spinnerkolbe, der anvendes til bulkkultur på en magnetplade med flere positioner. J) Assay på en magnetisk omrøringsplade med flere brønde. Skalabjælker, 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forventede resultater. (A) Repræsentative konfokale billeder af immunfluorescerende mærkede paraffinsektioner af dag 14 nyreorganoider, der viser positiv farvning for tubule epithelia (HNF1B og LTL) og podocytklynger (MAFB). (B) Dag 26 nyreorganoidsektioner mærket til podocytklynger (NPHS1) og endotelceller (PECAM1). Vægtstænger, 100 μm (A); 200 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere undersøgelser har vist, at de indledende protokoltrin er kritiske for mellemliggende mesodermdifferentiering 5,19,20, og derfor er det vigtigt at implementere en streng mediumsammensætning på dette stadium. Fjernelse af udefinerede komponenter såsom serum, albumin, proteinfrit hybridommedium II fra protokollens første fase kan bidrage til at forbedre den konsekvente differentieringseffektivitet mellem assays21.
Nyrecellernes metaboliske tilstand er afgørende for deres funktion, og glukoseændringer kan føre til ændret metabolisk tilstand22. Tidligere undersøgelser har beskrevet, at høje niveauer af glukose (op til 25 mM) kan fremkalde endotelcelledysfunktion og ændre vækst og oxidantkapacitet af nyreceller 22,23,24. Høje niveauer af glukose er også blevet beskrevet for at ændre mitokondriefunktion24, hvilket kan være ugunstigt, når man undersøger nyresygdom og nefrotoksicitet eller udfører lægemiddelopdagelse ved hjælp af nyreorganoider. Vi har derfor reduceret niveauet af glukose i vores protokol for at fremme en mere in vivo-lignende metabolisk tilstand af de organoide nyreceller. Som følge heraf giver ændringerne af nyreorganoidassayet en konsekvent, robust protokol, samtidig med at dens enkelhed opretholdes.
Nyreorganoider er umodne, og udvidet dyrkning (>20 dage) kan føre til forekomst af profibrotiske og ikke-nyrecelletyper som tidligere beskrevet 5,25, hvilket efterlader organoider mindre repræsentative for sundt humant nyrevæv. Baseret på vores erfaring er det optimale behandlingsvindue, hvor nyreorganoiderne er sundest, mellem dag 14-18. Anvendelse af spinnerkolber og magnetiske omrørere med flere brønde som beskrevet ovenfor vil øge den ensartede næringsstoftilgængelighed i modsætning til statisk kultur21,26. Hvis udstyret til ophængningskultur såsom rysteren eller magnetiske omrørere ikke er tilgængeligt, kan denne protokol stadig udføres fuldstændigt i de ultralave fastgørelsesplader i statisk kultur. Der kan dog være øget forekomst af embryoide kroppe / organoidfusion, hvilket fører til store prøver med nekrotiske kerner på grund af hypoxi. Alle organoider større end 500 μm kan fjernes ved hjælp af de beskrevne cellesiler. For at reducere risikoen for sammensmeltning af organoiderne i disse tilfælde foreslår vi ikke at så mere end 100 organoider pr. 6-brønd. Derudover skal organoiderne efter fodring fordeles jævnt ved at udføre figur otte bevægelser med pladen.
Lav effektivitet (<50%) af organoiddannelse kan observeres. Dette sker normalt, når hPSC-kulturerne har nået høj sammenløb (>80%) under standard passaging. Det er afgørende, at hPSC-vedligeholdelse er konsistent, og at cellerne ikke overlades til at blive over-sammenflydende. Høj sammenløb og inkonsekvent passaging teknik kan også føre til spontan differentiering og øget celledød. Hvis differentiering er til stede i hPSC-kulturen, anbefaler vi, at de differentierede områder fjernes ved at aspirere med en fin pipettespids, hvis den ikke overstiger 5% af cellepopulationen, inden analysen påbegyndes. Hvis differentieringsområderne overstiger 5 %, anbefaler vi, at et nyt parti hPSC'er optøes og opdeles mindst én gang, inden et nyt assay påbegyndes.
Vi har observeret, at nogle hPSC-linjer er mere tilbøjelige til at danne ikke-nyrecelletyper, såsom hjerte- eller neuralt væv. Hvis dette sker, kan størrelsesfiltrering ved hjælp af cellesilerne bidrage til at fjerne de organoider, der indeholder ikke-renale udvækst. Alternativt kan ændring af hPSC-mediet og/eller matrixen bidrage til at reducere de ikke-renale udvækster. Fra vores erfaring giver alternative hPSC-medier, der indeholder minimumskomponenter, og BME såsom vitronectin en strengere pluripotent niche og hjælper dermed med at generere mere homogene hPSC-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 og P30-DK079307 og ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program til AP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).
